Phương pháp xác định trình tự axit nucleic bằng phương pháp của sanger
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (607.67 KB, 4 trang )
Họ và tên: Đỗ Thị Minh Phương
Lớp : K33C_Khoa Sinh
Trường : Đại học sư phạm Hà Nội
----------------------------------------***---------------------------------------------
BÀI TIỂU LUẬN MÔN CÔNG NGHỆ GEN
1. Nguyên lý:
*) Phương pháp này còn có tên gọi khác là dideoxynucleotid do Frederick
Sanger đề xuất năm 1977.
*) Nguyên lý:
+ Dựa vào hoạt động của enzyme ADN polymerase và
dideoxynucleotid (ddNTP) trong quá trình tổng hợp ADN. Dideoxy là các
nucleotid mất cả 2 nhóm OH ở vị trí C số 2 và 3 trên phân tử đường pentose.
+ Khi ADN polymerase gặp các ddNTP thì dừng lại.Cụ thể là: Enzyme
ADN polymerase xúc tác gắn các nucleotid vào mạch đơn đang tổng hợp ở vị trí
3'OH (vị trí này cần cho việc hình thành liên kết phosphodiester ở chuỗi
polynucleotid đang hình thành với các nucleotid kế tiếp), khi gặp nucleotid không
có nhóm 3'OH ở ddNTP, phản ứng tổng hợp bị dừng lại và tạo ra các đoạn ADN
chênh lệch nhau 1 nucleotid.
Ví dụ : . Nếu ta thêm ddCTP vào hỗn hợp phản ứng đang tổng hợp ADN thì quá
trình tổng hợp chỗi polipeptid sẽ dừng lại ở vị trí C.
. Nếu thêm ddGTP vào hỗn hợp thì khi gặp ddGTP chuỗi polynucleotit sẽ
dừng lại ở vị trí G
+ Điện di các đoạn ADN này với việc bổ sung 1% các loại ddNTP riêng
biệt (ddATP, ddCTP, ddTTP) sẽ được 4 bản điện di khác nhau. Các băng ADN
xác định nhờ việc gắn đồng vị phóng xạ vào mồi, hoặc các ddNTP. Dựa vào đó để
đọc trình tự ADN.
2. Các bước tiến h ành:
- Cắt ADN bằng enzyme cắt giới hạn, tách các đoạn ADN đã cắt thành
sợi đơn và nhân dòng (clothing) chúng (lượng ADN > µg) bằng vectơ mạch đơn:
phage M13 để tạo đủ ADN làm nguyên liệu nghiên cứu.
- Bổ sung mồi có đánh dấu phóng xạ P
32
, Taq polymerase, bổ sung đủ các
loại dNTPcho vào dung dịch đệm thích hợp để thực hiện phản ứng tổng hợp ADN,
sau đó chia làm 4 lô.
- Bổ sung mỗi lô 1 loại ddNTP với tỷ lệ 1% (ống A thêm 1% ddATP, ống
T thêm 1% ddTTP, ống C thêm 1% ddCTP và ống G thêm 1% ddGTP). Với tỷ lệ
này thỉnh thoảng mới có 1 ddNTP được gắn ngẫu nhiên. Trường hợp không đánh
dấu bằng P
32
ở mồi có thể đánh dấu P
32
, S
35
ở ddNTP.
- Chạy điện di để tách các đoạn ADN đã được tổng hợp trong mỗi lô phản
ứng. Điện di riêng rẽ kết quả của 4 phản ứng trên cùng 1 bản gel. Tức là điện di
các nhóm phản ứng bằng phương pháp điện di trên gel polyacrylamid ở điều kiện
biến tính để được các băng của các đoạn oligonucleotid có kích thước khác nhau.
- Thu kết quả bằng phương pháp tự ghi, chụp ảnh, làm phim phóng xạ tự
ghi cho bản gel điện di và đọc trình tự của nucleotid trên điện di đồ lần lượt trên cả
4 mẫu từ cực âm của bản gel lên cực dương theo nguyên tắc: Đoạn ADN càng
ngắn càng dịch chuyển xa hơn so với điểm xuất phát ban đầu trên bản điện di đồ.
Kết quả điện di phản ứng dideoxy với ddNTP
-----------------------------------***-----------------------------------
