Trình bày phương pháp xác định trinh tự axitnucleic bằng phương pháp hoá học của Maxam- Gilbert
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (77.09 KB, 2 trang )
Họ và Tên : Phạm Thị Phụng
Lớp : K33C
Khoa : Sinh – KTNN
Trường : ĐHSP Hà Nội 2
Bài kiểm tra học phần: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Đề bài: Trình bày phương pháp xác định trinh tự axitnucleic bằng phương
pháp hoá học của Maxam- Gilbert.
Trả lời:
Hiện nay có một số phương pháp giải trình tự AND khác nhau.Trong đó có
phương pháp giải trình tự các nucleotit của A.Maxam và W.Gilbert ( còn được
gọi là phương pháp hoá học).
1. Nguyên lí của phương pháp:
- Đây là phương pháp phân giải hoá học của A.Maxam và W.Gilbert.
- Sử dụng hoá chất để phân huỷ AND ở các vị trí bazơ đặc hiệu, tạo ra các đoạn
có chiều dài khác nhau 1 nucleotit.
Hoá chất tác dụng Bazơ bị đứt gãy
Dimethylsunphat G
Glicôsidic A + G
Hyđrazin C + T
Hyđrazin + NaCl C
- Điện di các đoạn AND này và nhận biết vị trí của chúng nhờ đánh dấu phóng
xạ. Dựa vào đó để đọc được trình tự của AND.
2. Các bước tiến hành
- Chuỗi AND kép được đánh dấu phóng xạ với
32
P tại đầu cuối 5’ nhờ enzim
Poli nucleotit kinaz và
32
P-dATP
- Dùng Dimethylsunphoxit đun nóng đến 90
0
và điện di để biến tính và tách dời
2 sợi đơn
- Chia các sợi đơn thành 4 mẫu riêng rẽ và được xử lí với các hoá chất đặc hiệu
để phá hỏng một hoặc hai trong bốn bazơ nitơ.
- Sử lí tiếp các mẫu này với Piperidin để bẻ gãy AND tại vị trí bazơ đã phá
hỏng.
- Điện di riêng rẽ 4 mẫu trên cùng 1 gel điện di, làm phim phóng xạ tự ghi và
đọc vị trí của các nu lần lượt trên 4 mẫu từ cực dương lên cực âm của gel theo
nguyên tắc: Đoạn AND càng ngăn càng chạy xa so với điểm xuất phát trên bản
điện di đồ.
3. Ví dụ:
Cho đoạn mạch đơn AND
5’ ATTGACTTAGCC 3’
↓Gắn
32
P vào đầu 5’
1
* ATTGACTTAGCC
↓xử lí hoá chất
G
* ATT
* ATTGACTTA
* ATTGACTTAGCC
A+ G
* ATT
* ATTG
* ATTGACTT
* ATTGACTTA
* ATTGACTTAGCC
C+T
* A
* AT
* ATTGA
* ATTGAC
* ATTGACT
* ATTGACTTAG
* ATTGACTTAGC
* ATTGACTTAGCC
C
* ATTGA
* ATTGACTTAG
* ATTGACTTAGC
* ATTGACTTAGCC
↓ điện di trên 1 gel + chụp phóng xạ
Trình tự AND: 5’ ATTGACTTAGCC 3’
2
