Phương pháp xác định trình tự ADN
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (605.53 KB, 19 trang )
•
Là các phương pháp dùng để xác định trình tự sắp
xếp các nucleotides trong một chuỗi hoặc 1 đoạn DNA.
•
Sử dụng các phương pháp :
Maxam-Gilbert (1977)
Sanger (1977)
Xác định trình tự tự động
Phương pháp xác định
trình tự ADN
I.Phng phỏp Maxam-Gilbert
1.Nguyờn lý
L phng phỏp phõn gii húa hc (do Allan Maxam và
Walter Gilbert ở đại học Haward đã đề xuất năm1977).
S dng húa cht phõn hy ADN cỏc v trớ base
c hiu to ra cỏc on cú chiu di khỏc nhau 1
nucleotid.
Điện di các đoạn ADN này và nhận biết vị trí của
chúng nhờ đánh dấu phóng xạ. Dựa vào đó để đọc được
trình tự của ADN
2. Các bước tiến hành
Chuỗi ADN kép được đánh dấu phóng xạ với
32
P tại đầu cuối 5
nhờ enzym polynucleotit kinase và
32
P - dATP
Dùng dimethyl sunphoxit đun nóng đến 90
0
C để tách ADN
thành 2 sợi đơn và điện di tách dời từng loại sơi đơn
Các sợi đơn được chia thành 4 mẫu riêng rẽ và được xử lý với
các hoá chất đặc hiệu để phá hỏng 1 hay 2 trong 4 bazơ nitơ:
Dimethylsun phat phá hỏng G
Glicosidic phá hỏng A+G
Hydrazin phá hỏng C+T
hydrazin + NaCl phá hỏng C
I.Phng phỏp Maxam-Gilbert
Phng phỏp Maxam-Gilbert
Xử lý tiếp các mẫu này với piperidin để bẻ gẫy ADN tại vị
trí bazơ nitơ đã bị phá hỏng
iện di riêng rẽ 4 mẫu trên cùng 1 gel điện di, làm phim
phóng xạ tự ghi v đọc vị trí của các nucleotit lần lượt trên
4 mẫu từ cực dương của gel lên cực âm theo nguyên tắc:
đoạn ADN càng ngắn càng dịch chuyển xa so với điểm xuất
phát ban đầu trên bản điện di đồ.
Ví dụ
•
Đoạn mạch đơn ADN đánh dấu đầu 5‘ ở
nucleotid A có trình tự:
P
32
TAGTCGCAGT3‘
-
Xử lý G: tạo 3 đoạn
-
Xử lý A+G: tạo 5 đoạn
-
Xử lý T+C: tạo 5 đoạn
-
Xử lý C: tạo 2 đoạn
