Các phương pháp tách chiết, định lượng và định tính axít
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (2.34 MB, 20 trang )
Cỏc phng phỏp tỏch chit, nh lng
v nh tớnh axớt nucleic
Nguyên tắc: Chiết tách ADN là cần thiết bởi
các thực nghiệm của công nghệ gen đều tiến
hành với ADN (hay ARN)
ADN chiết tách cần đ m b o về độ tinh khiết
và độ nguyên vẹn về cấu trúc với độ dài từ
50-100 kb để thực hiện được các khâu nghiên
cứu tiếp theo trong công nghệ gen thực vật.
Tuỳ thuộc mục đích nghiên cứu mà lựa chọn
phương pháp chiết tách ADN cho phù hợp
1.1. Các phương pháp tách chiết axít nucleic
•
Mục tiêu: Thu nhận được các phân tử axít
nucleic còn nguyên vẹn tối đa không bị đứt gãy
bởi các tác nhân cơ học và hoá học.
-
Tác nhân cơ học (bị đứt, gãy do nghiền, lắc
mạnh).
-
Tác nhân hoá học ( bị cắt đứt do enzyme nội
bào như desoxyribonuclease – DNase và
ribonuclease- RNase).
1.1.1. Phương pháp tách chiết DNA
-
DNA có kích thước lớn do đó cần tránh các tách
nhân gây đứt gãy.
-
DNA genome (ĐV, TV) sau khi tách chiết phải có
kích thước lớn (15kb-300kb).
•
Phương pháp tách chiết cơ bản gồm 4 bước
chính sau:
Bước 1. Phá vở màng tế bào và màng nhân. Ở tế
bào ĐV hoặc TV, bằng cách nghiền tế bào hoặc mô
trong nitơ lỏng – 196
0
C hoặc dùng hỗn hợp chất
tẩy (SDS, Sarcosyl) và proteinase K.
Bước 2. Loại bỏ thành phần không mong muốn
trong mẫu, như các protein, polysaccharide. Mẫu
được bổ sung hỗn hợp dung dịch (phenol:
chloroform: isoamine tỉ lệ 25:24:1), lắc mạnh cho
đến khi dung dịch có dạng trắng sữa.
-
Protein sẽ bị biến tính và kết tủa
-
DNA, RNA được hoà tan trong nước.
Sau ly tâm cao tốc hỗn hợp dung dịch chia làm 3 pha:
+ Pha trên cùng là pha nước chứa DNA, RNA.
+ Pha giữa là pha chứa protein và các chất thứ cấp bị
kết tủa.
+ Phá dưới là dung dịch phenol: chloroform: isoamine
Bước 3. Tủa axít nucleic
+ Tủa bằng ethanol tuyệt đối (tỉ lệ 2:1), tủa tốt nhất ở
- 20
o
C trong 30 phút hoặc ở 0
o
C qua đêm. Hầu như toàn
bộ các phân tử axít nucleic đều kết tủa.
+ Tủa bằng isopropanol (tỉ lệ 1:1) ở 0
o
C, các phân tử
DNA có trọng lượng phân tử thấp không bị kết tủa.
>>> Sau đó ly tâm ta sẽ thu được cặn (DNA, RNA), cặn
được rửa bằng cồn 70% để loại bỏ muối và isopropanol
còn lại.
Bước 4. Hoà tan căn (DNA, RNA) và xử lý loại bỏ
RNA bằng enzyme Rnase. Sau đó kết tủa lại được DNA.
1.1.2. PP tách chiết RNA tổng số và mRNA
-
Chú ý:
+ Phân tử RNA không bền, dễ bị phân huỷ bởi
enzyme Rnase.
+ Rnase lại có mặt khắp nơi (ở đầu ngón tay, trong
nước bọt, trong không khí…).
+ Rnase là một enzyme có hoạt tính cao, bền nhiệt.
Do đó: Thao tác tách chiết RNA tốt nhất là ở điều
kiện vô trùng, tránh tiếp xúc bằng tay trần.
