ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
  
BK
TP HCM
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGHIÊN CỨU CỐ ĐỊNH
ENZYME α-AMYLASE


SVTH : NGUYỄN THỊ VÂN LINH
MSSV : 60601261
GVHD : TS. TRẦN BÍCH LAM
TP Hồ Chí Minh, 1/2011
i
NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN
....................................................................................................................................
....................................................................................................................................
....................................................................................................................................
....................................................................................................................................
....................................................................................................................................
....................................................................................................................................
....................................................................................................................................
....................................................................................................................................
....................................................................................................................................
....................................................................................................................................
....................................................................................................................................
....................................................................................................................................
....................................................................................................................................

Thành phố Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2011
ii
NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN PHẢN BIỆN
....................................................................................................................................
....................................................................................................................................
....................................................................................................................................
....................................................................................................................................
....................................................................................................................................
....................................................................................................................................
....................................................................................................................................
....................................................................................................................................
....................................................................................................................................
....................................................................................................................................
....................................................................................................................................
....................................................................................................................................
....................................................................................................................................
Thành phố Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2011
iii
LỜI CẢM ƠN
Trong suốt khoảng thời gian học tập và rèn luyện dưới mái trường Bách Khoa, nhờ
sự tận tình dạy bảo, giúp đỡ và dìu dắt của quý thầy cô, em đã trưởng thành hơn rất nhiều
trong học tập, trong công việc và trong cuộc sống. Em xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất
đến tất cả các quý thầy cô trong trường Đại học Bách Khoa và đặc biệt là các thầy cô trong
Bộ môn Công nghệ Thực phẩm, những người đã dạy em những kiến thức nền tảng vững
vàng nhất để trở thành một kỹ sư trẻ trong tương lai.
Em cũng xin gửi lời chân thành và sâu sắc đến cô TS. Trần Bích Lam, người cô
đáng kính có ảnh hưởng sâu sắc đến em trong quá trình học tập, vì sự tận tình chỉ bảo và
hướng dẫn em trong suốt khoảng thời gian học tập và làm luận văn, giúp em hoàn thành tốt
nhất luận văn của mình.
Con xin cảm ơn nội và ba luôn ở bên cạnh con, hết lòng yêu thương, chăm sóc và cổ

vũ tinh thần cho con, giúp con vượt qua được những giai đoạn khó khăn nhất trong công
việc cũng như trong cuộc sống.
Tôi xin gửi lời cảm ơn đến bạn bè tôi và các bạn lớp HC06TP, những người đã ở
bên cạnh động viên giúp đỡ tôi rất nhiều để tôi hiểu được giá trị tình bạn chân thành, đẹp
đẽ.
Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 10 tháng 1 năm 2011
Nguyễn Thị Vân Linh
iv
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC BẢNG................................................................................................viii
DANH MỤC CÁC HÌNH....................................................................................................x
MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN...............................................................................................2
1.1.CÁC ENZYME THỦY PHÂN TINH BỘT (AMYLOLYTIC ENZYME) [3, 13, 15]2
1.1.1.Endo-enzyme.......................................................................................................4
1.1.2.Exoamylase.........................................................................................................5
3.1.1.α-1,6 enzymes.....................................................................................................6
5.1.1.Isomerases...........................................................................................................7
5.1.2.Cyclodextrin Glycosyltransferase........................................................................8
5.2.ENZYME CỐ ĐỊNH [3, 9, 16, 31, 32]......................................................................9
5.2.1.Lịch sử nghiên cứu và phát triển..........................................................................9
5.2.2.Định nghĩa.........................................................................................................10
5.2.3.Đặc điểm của enzyme cố định...........................................................................10
5.2.4.Ưu và nhược điểm của enzyme cố định.............................................................11
5.2.5.Một số phương pháp cố định enzyme................................................................11
11.1.1.Những yếu tố ảnh hưởng.................................................................................15
14.1.NHỮNG NGHIÊN CỨU VỀ AMYLASE CỐ ĐỊNH [8, 14, 30, 31].....................16
14.1.1.α-amylase cố định............................................................................................16
14.1.2.β-amylase cố định ...........................................................................................17
v

14.1.3.Glucosamylase cố định....................................................................................19
14.1.4.Pullulanase cố định..........................................................................................21
14.1.5.Hệ thống 2 enzyme cố định: β-amylase và Pullulanase....................................21
14.2.CHITOSAN [5, 18, 25]..........................................................................................22
14.2.1.Giới thiệu về chitosan......................................................................................22
14.2.2.Tính chất của chitosan:....................................................................................23
CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU........................24
15.1.NGUYÊN LIỆU....................................................................................................24
15.1.1.Enzyme α-amylase ..........................................................................................24
15.1.2.Chitosan...........................................................................................................24
15.2.HÓA CHẤT SỬ DỤNG........................................................................................24
15.3.DỤNG CỤ THIẾT BỊ SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU..................................25
15.4.PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..........................................................................25
15.4.1.Sơ đồ nghiên cứu.............................................................................................25
15.4.2.Phương pháp cố định enzyme..........................................................................26
17.1.1.Phương pháp khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình cố định enzyme.....30
22.1.1.Tối ưu hóa quá trình cố định............................................................................31
22.1.2.Xác định tính chất enzyme cố định:.................................................................33
24.1.1.Xác định hệ số phương trình động học của phản ứng enzyme..........................33
24.1.2.Xác định hiệu suất cố định enzyme..................................................................34
26.1.1.Xác định hoạt tính riêng và hoạt tính còn lại của enzyme α-amylase tự do và cố
định............................................................................................................................36
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN.......................................................................40
vi
29.1.CHẾ PHẨM ENZYME α-AMYLASE TỰ DO.....................................................40
29.2.CHỌN PHƯƠNG PHÁP CỐ ĐỊNH ENZYME.....................................................40
29.3.KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC YẾU TỐ CÔNG NGHỆ ĐẾN HIỆU
SUẤT CỐ ĐỊNH................................................................................................42
29.3.1.Khảo sát thể tích enzyme sử dụng....................................................................42
29.3.2.Khảo sát thời gian cố định...............................................................................45

29.3.3.Khảo sát vận tốc lắc đảo .................................................................................47
29.3.4.Khảo sát kích thước chitosan...........................................................................49
29.3.5.Khảo sát nồng độ glutaradehyde......................................................................51
29.4.TỐI ƯU HÓA QUÁ TRÌNH CỐ ĐỊNH.................................................................53
29.5.KHẢO SÁT TÍNH CHẤT CỦA α-AMYLASE CỐ ĐỊNH...................................58
29.5.1.Ảnh hưởng của pH...........................................................................................58
29.5.2.Ảnh hưởng của nhiệt độ...................................................................................60
29.6.NGHIÊN CỨU TÍNH CHẤT ĐỘNG HỌC CỦA ENZYME CỐ ĐỊNH................63
29.6.1.Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất......................................................................63
29.6.2.Xác định hệ số phương trình động học Michaelis – Menten.............................64
29.7.KHẢO SÁT HIỆU QUẢ TÁI SỬ DỤNG CỦA ENZYME CỐ ĐỊNH..................65
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...................................................................67
30.1.KẾT LUẬN...........................................................................................................67
30.2.KIẾN NGHỊ..........................................................................................................67
TÀI LIỆU THAM KHẢO.................................................................................................69
vii
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1: Phân loại enzyme dùng trong sản xuất syrup tinh bột, maltodextrins và
cyclodextrins[15].................................................................................................3
Bảng 1.2: Một số nghiên cứu cố định glucoamylase.......................................................20
Bảng 2.1: Ma trận quy hoạch cấu trúc có tâm, hai yếu tố.............................................32
Bảng 3.1: Hàm lượng protein và hoạt tính riêng của α-amylase tự do........................40
Bảng 3.2: Hoạt tính riêng của các mẫu α-amylase cố định tương ứng với những thể
tích enzyme sử dụng khác nhau......................................................................44
Bảng 3.3: Hoạt tính riêng của các mẫu α-amylase cố định tương ứng với những thời
gian cố định khác nhau....................................................................................45
Bảng 3.4: Hoạt tính riêng của các mẫu α-amylase cố định tương ứng với những vận
tốc lắc đảo khác nhau.......................................................................................47
Bảng 3.5: Hoạt tính riêng của các mẫu α-amylase cố định tương ứng với những kích
thước chitosan khác nhau................................................................................50

Bảng 3.6: Hoạt tính riêng của các mẫu α-amylase cố định tương ứng với những nồng
độ glutaraldehyde khác nhau..........................................................................51
Bảng 3.7: Bảng mã hóa các thông số ảnh hưởng cần khảo sát.....................................55
Bảng 3.8: Kết quả thực nghiệm với ma trận trực giao cấp 2........................................55
Bảng 3.9: Các hệ số phương trình hồi quy Y và kết quả kiểm định Student..............56
Bảng 3.10: Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính α-amylase tự do và cố định...................59
Các giá trị trong bảng biểu thị giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn của 3 mẫu độc lập
.............................................................................................................................59
Bảng 3.11: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính α-amylase tự do và cố định..........60
viii
Các giá trị trong bảng biểu thị giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn của 3 mẫu độc lập
.............................................................................................................................61
Bảng 3.12: Các phương pháp cố định và chất mang dùng để cố định α-amylase......62
ix
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1: Các enzyme thủy phân tinh bột.........................................................................2
Hình 1.2: Vị trí hoạt động của enzyme thủy phân tinh bột.............................................4
Hình 1.3: Cấu trúc của pullulan.........................................................................................7
Hình 1.4: Quá trình chuyển đồng phân glucose thành fructose.....................................8
Hình 1.5: Cơ chế phản ứng thủy phân – liên kết của cyclodextrin
glycosyltransferases............................................................................................8
Hình 2.1: Đường chuẩn albumin......................................................................................36
A 38
Hình 2.2: Đường chuẩn glucose........................................................................................38
Hình 3.1: So sánh hiệu quả các phương pháp cố định...................................................40
Hình 3.2: Cố định enzyme bằng phương pháp liên kết hóa trị.....................................41
Hình 3.3: Cố định enzyme bằng phương pháp hấp phụ và liên kết các enzyme .......41
Hình 3.4: Ảnh hưởng của thể tích enzyme sử dụng lên hiệu suất cố định...................43
Hình 3.5: Ảnh hưởng của thể tích enzyme sử dụng lên lượng enzyme gắn vào
chitosan..............................................................................................................44

Hình 3.6: Ảnh hưởng của thời gian cố định lên hiệu suất cố định enzyme.................45
Hình 3.7: Ảnh hưởng của vận tốc lắc đảo lên hiệu suất cố định enzyme ....................47
Hình 3.8: Ảnh hưởng của kích thước chitosan lên hiệu suất cố định enzyme............50
Hình 3.9: Ảnh hưởng của nồng độ Glutaraldehyde lên hiệu suất cố định enzyme....52
Hình 3.10: Ảnh hưởng của thể tích enzyme và thời gian cố định lên hiệu suất cố định
.............................................................................................................................57
Hình 3.11: Đồ thị vòng dự đoán kết quả quy hoạch thực nghiệm................................57
x
Hình 3.12: Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính α-amylase tự do và cố định...................59
Hình 3.13: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính của α-amylase tự do và cố định....60
Hình 3.14: Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên vận tốc thủy phân ............................64
Hình 3.15: Mối liên hệ giữa và ........................................................................................64
Hình 3.16: Khả năng tái sử dụng của chế phẩm α-amylase cố định............................66
xi

Luận văn nghiên cứu cố định α-amylase GVHD: TS. Trần Bích Lam
MỞ ĐẦU
Amylase rất quan trọng trong quá trình đường hóa tinh bột, đồng thời amylase cũng
có nhiều ứng dụng trong công nghệ thực phẩm như: sản xuất syrup glucose, syrup giàu
fructose, syrup maltose, giảm độ nhớt của sugar syrup, hòa tan và đường hóa tinh bột để lên
men cồn trong công nghiệp rượu bia…Trong hầu hết các trường hợp, quá trình sử dụng
enzyme bị ức chế khi nồng độ cơ chất, sản phẩm cao và khi sử dụng enzyme nhiều lần hoặc
lâu cũng làm enzyme mất ổn định. Chính vì thế quá trình cố định enzyme rất quan trọng để
sử dụng enzyme liên tục và tái sử dụng nhiều lần trong công nghiệp, và dễ dàng tách
enzyme ra khỏi sản phẩm. Điều này rất quan trọng trong việc phát triển thiết bị phản ứng
sinh học có tính khả thi về kinh tế dùng trong công nghiệp thủy phân tinh bột.
Trong thời gian qua, trên thế giới và Việt Nam đã thực hiện nhiều công trình nghiên
cứu cố định α-amylase trên các chất mang khác nhau. Tuy nhiên quá trình thực hiện khá
phức tạp, hạn chế khi ứng dụng trong công nghiệp. Để đáp ứng cho mục tiêu ứng dụng
thuận tiện trong công nghiệp, chúng tôi quyết định tiến hành nghiên cứu cố định

α-amylase trên chitosan. Từ trước đến nay, chitosan chỉ được hoạt hóa xử lý ở dạng dung
dịch, do đó cần thêm quá trình tạo hạt hoặc tạo màng, nhưng ở đây chúng tôi tiến hành sử
dụng chitosan ở dạng rắn để thuận tiện tạo cột thủy phân tinh bột. Chitosan là chất mang
được ưu tiên chọn lựa vì chitosan là một polymer có cấu trúc siêu lỗ dễ dàng hấp phụ
enzyme đồng thời trong phân tử chitosan có các nhóm amino hoạt động dễ dàng liên kết
cộng hóa trị với một nhóm aldehyde của glutaraldehyde, tạo cầu nối để liên kết cộng hóa trị
với nhóm amino của enzyme.
Trong nghiên cứu này chúng tôi sẽ xác định điều kiện để cố định α-amylase và
khảo sát tính chất của α-amylase cố định. Nội dung nghiên cứu gồm có:
Khảo sát những yếu tố ảnh hưởng đến quá trình cố định.
Tối ưu hóa 2 yếu tố ảnh hưởng nhiều nhất đến quá trình cố định.
Khảo sát tính chất của enzyme cố địnhvà xác định hiệu quả sử dụng enzyme cố
định.
1
Luận văn nghiên cứu cố định α-amylase GVHD: TS. Trần Bích Lam
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. CÁC ENZYME THỦY PHÂN TINH BỘT (AMYLOLYTIC ENZYME) [3,
13, 15]
Có 5 nhóm enzyme cơ bản tham gia thủy phân tinh bột:
Nhóm endoamylase và exoamylase thủy phân chủ yếu ở liên kết α–1,4 glycoside.
Nhóm enzyme cắt mạch nhánh (debranching enzyme) thủy phân liên kết α–1,6
glycoside.
Nhóm isomerase xúc tác phản ứng chuyển đồng phân hóa từ glucose thành fructose,
được ứng dụng trong công nghiệp sản xuất syrup fructose từ syrup glucose.
Nhóm cyclodextrin glycosyltransferase thủy phân tinh bột đồng thời xúc tác quá
trình tạo vòng cyclodextrin.
Hình 1.1: Các enzyme thủy phân tinh bột
2
Các enzyme chuyển hóa tinh bột
α–1,4–glucanases α–1,6–glucanases

Endo– Exo– Endo– Exo–
α–amylase
β–amylase
GlucoamylaseI
sopullulanaseα
–glucosidase
Pullulanase
Isoamylase
Exopullulanase
Hình 1: Các enzyme thủy phân tinh bột
Luận văn nghiên cứu cố định α-amylase GVHD: TS. Trần Bích Lam
Bảng 1.1: Phân loại enzyme dùng trong sản xuất syrup tinh bột, maltodextrins và
cyclodextrins[15]
Loại Nguồn Vị trí xúc tác pH
opt
T
opt
(
o
C)
Endoamylase
Bacillus subtilis α-1,4-glycoside 6,0 65 – 70
B. licheniformis α-1,4-glycoside 5,0 – 7,0 90
Exoamylase
Aspergillus oryzae α-1,4-glycoside 4,5 50 – 60
A.niger
α-1,4-glycoside
α-1,6-glycoside
4,0 – 5,0 60
Bacillus sp. α-1,4-glycoside 5,0 55 – 60

Clostridium sp. α-1,4-glycoside 5,5 – 6,0 75 – 85
α-1,6-amylase
Klebsiella aerogenes α-1,6-maltotrioside 5,0 60
Pseudomonas sp. α-1,6-heptasacch 4,0 50 – 55
Exo-α-amylase
Streptomyces griseus α-1,4-glycoside – –
B.subtilis α-1,4-glycoside – –
B.circulans α-1,4-glycoside – –
Pseudomonas stutzeri α-1,4-glycoside – –
Pseudomonas sp. α-1,4-glycoside – –
B.subtils α-1,4-glycoside – –
B.circulans α-1,4-glycoside – –
Isomerase B.circulans
Aldo/keto pentose
Aldo/keto hexose
8,2 65
Glucanotransferase
B.macerans α-1,4-glycoside 5,0 50
Thermoanaerobacter sp. α-1,4-glycoside 4,5 90
Endo/Exocellulase Trichoderma reesei β-1,4-glycoside – –
Endoprotease B.licheniformis – 6,5 90
3
Luận văn nghiên cứu cố định α-amylase GVHD: TS. Trần Bích Lam
Hình 1.2: Vị trí hoạt động của enzyme thủy phân tinh bột
Chú thích:
A: α-amylase. O: gốc glucose.
D: Enzyme cắt mạch nhánh. O-O: liên kết α-1,4.
B: β-amylase. →O: liên kết α-1,6.
G: glucoamylase. Ø, đầu tận cùng khử.
1.1.1. Endo-enzyme

Cơ chế tác dụng: Endo-enzyme thủy phân liên kết α-1,4 glycoside trong amylose,
amylopectin, và các polysaccharide tương tự nhưng không thủy phân liên kết α-1,6
glycoside trong amylopectin. Sản phẩm thủy phân là các oligosaccharide có độ dài chuỗi
khác nhau và có cấu tạo α trên carbon C
1
của nhóm khử trong phân tử glucose.
Có hai endoamylase khác nhau (EC 3.2.1.1): bền nhiệt và không bền nhiệt.
α-Amylase bền nhiệt có nguồn gốc vi khuẩn và thu nhận từ chủng Bacillus. Hiện nay, hai
loại α-amylase thương mại quan trọng là:
Amylase từ B.subtilis nếu có mặt ion Ca
2+
thì enzyme này sẽ có nhiệt độ tối ưu trong
khoảng từ 65 đến 70
o
C.
4
Luận văn nghiên cứu cố định α-amylase GVHD: TS. Trần Bích Lam
Amylase từ B.licheniformis hoạt động và ổn định trong dung dịch tinh bột ở nhiệt độ
trên 90
o
C, sự ổn định tương đối độc lập với ion Ca
2+
, và enzyme này hoạt động
tốt hơn với khoảng pH rộng.
1.1.2. Exoamylase
Cơ chế tác dụng: Một số có thể cắt liên kết α-1,6 glycoside (hình 1.2), nhưng tốc độ
phản ứng chậm hơn so với khi thủy phân liên kết α-1,4 glycoside. Exoamylase hoạt động
trên các liên kết bên ngoài từ đầu tận cùng không khử và tạo ra các sản phẩm khối lượng
phân tử thấp.
Hai loại exoenzyme quan trọng trong thủy phân tinh bột được ứng dụng trong công

nghiệp là: glucoamylase và β-amylase.
2. Glucoamylase
Glucoamylase (EC 3.2.1.3) có nguồn gốc từ nấm. Enzyme này thủy phân liên kết
α-1,4 glycoside từ đầu tận cùng không khử, giải phóng ra phân tử ᴅ-glucose cấu hình β.
Glucoamylase cắt phân tử ᴅ-glucose ở đầu nhánh phân tử amylopectin, bắt đầu thủy phân ở
liên kết α-1,6 glycoside, nhưng chậm hơn nhiều khi thủy phân liên kết α-1,4 glycoside.
Enzyme này là một trong những enzyme công nghiệp quan trọng đã được ứng dụng rộng
rãi trên thế giới. Glucoamylase sử dụng quan trọng nhất là sản xuất syrup giàu glucose (96
– 98% glucose) và syrup giàu fructose (55% fructose).
Ở nồng độ glucose cao, glucoamylase tái tổng hợp các phân tử glucose hình thành
maltose và isomaltose. Hiện tượng này xảy ra rõ hơn ở nồng độ cơ chất cao và nồng độ
enzyme cao. Trong dung dịch glucoamylase thô thường có mặt transglucosidase (EC
2.4.1.24), enzyme này cũng có khả năng trùng hợp glucose.
3. β-amylase
Enzyme β-amylase (EC 3.2.1.2), có nguồn gốc thực vật. Lúa mạch, lúa mì, khoai tây
và đậu nành là những nguồn phổ biến để thu nhận β-amylase. Tuy nhiên, β-amylase cũng
tồn tại như một enzyme ngoại bào trong Bacillus sp. và Pseudomonas sp.
5
Luận văn nghiên cứu cố định α-amylase GVHD: TS. Trần Bích Lam
β-amylase hoạt động theo kiểu exo, thủy phân từ đầu tận cùng không khử của chuỗi
bên ngoài phân tử tinh bột hoặc polysaccharide tương tự, và mạch ngắn dần tạo β-maltose.
Amylose được chuyển hoàn toàn thành maltose, ngược lại amylopectin và các polymer
mạch nhánh khác được thủy phân thành nhiều sản phẩm khác nhau phụ thuộc vào mức độ
phân nhánh, kết quả quá trình thủy phân này khoảng 50 – 60% chuyển thành maltose. Kết
quả này là do β-amylase không thể thủy phân liên kết α-1,6 glycoside. Enzyme β-amylase
đạt hoạt tính cao nhất ở pH 5. Nhiệt độ tối ưu trong khoảng giữa 55 và 60
o
C.
3.1.1. α-1,6 enzymes
Các enzyme α-1,6 (hay còn gọi là các enzyme cắt nhánh - debranching enzyme), vài

thập niên qua đã được biết đến nhưng chưa phổ biến, như pullulanase (EC 3.2.1.41) và
isoamylase (EC 3.2.1.68). Gần đây các enzyme này thu hút nhiều sự chú ý, do có thể cải
thiện hiệu suất thủy phân khi có mặt một enzyme cắt nhánh trong hệ thống.
Các enzyme cắt nhánh có 2 nhóm, có hoạt tính endo có thể thủy phân liên kết α-1,6
glycoside ở điểm nhánh của amylose, glycogen, pullulan và các oligosaccharide tương tự:
Nhóm đầu tiên là pullulanase, thủy phân đặc hiệu liên kết α-1,6 glycoside, giải
phóng các oligosaccharide mạch thẳng gồm các nhóm glucose liên kết bằng liên
kết α-1,4 glycoside.
Nhóm thứ hai là neopullulanase và amylopullulanase, có hoạt tính nhắm vào cả liên
kết α-1,6 và α-1,4 glycoside.
4. Pullulanase
Pullulanse được phát hiện đầu tiên vào năm 1961 và thu hút sự chú ý vì nó hoạt
động đặc hiệu trên liên kết α-1,6 glycoside của pullulan (pullulan là một polymer ᴅ-glucose
mạch thẳng bản chất gồm các đơn phân maltotriosyl liên kết với nhau bằng liền kết α-1,6
glycoside), tinh bột, amylopectin, và các oligosaccharide tương tự.
Pullulanase thủy phân tinh bột tạo các sản phẩm có DP trung bình thay đổi từ 115
đến 2300. Enzyme này thường dùng kết hợp với glucoamylase, α- hoặc β-amylase.
6
Luận văn nghiên cứu cố định α-amylase GVHD: TS. Trần Bích Lam
Hình 1.3: Cấu trúc của pullulan
Chú thích:
O: gốc glucose. O-O: liên kết α-1,4.
→O: liên kết α-1,6.
5. Isoamylase
Isoamylase được phát hiện vào năm 1949, được thu nhận ở phòng thí nghiệm từ một
số vi sinh vật như K. aerogenes và Pseudomonas sp. Enzyme này thủy phân liên kết α-1,6
glycoside trong amylopectin và có hoạt tính rất thấp hoặc không có hoạt tính trên pullulan.
Trong phản ứng thủy phân tinh bột, khi sử dụng isoamylase trước glucoamylase,
phần amylopectin được tách khỏi polymer nhanh chóng và vì thế rất dễ bị hồ hóa. Thời
điểm cho isoamylase vào hệ thống thủy phân rất quan trọng.

5.1.1. Isomerases
Glucose isomerase (EC 5.3.1.5) được ứng dụng quan trọng nhất trong công nghiệp
thực phẩm là dùng để chuyển glucose thành fructose (hình 1.4).
Cobalt được biết đến là chất hoạt hóa glucose isomerase, nhưng glucose isomerase
từ một số nguồn lại không cần ion cobalt. Magnesium là một chất hoạt hóa khác của những
enzyme này. Ngược lại, calcium và oxygen có tác động ức chế, tác động ức chế của
calcium có thể khắc phục bằng cách cho magnesium vào, ngược lại tác động của oxygen
được khắc phục nhờ quá trình nhiệt. Vì thế, việc tinh sạch cơ chất (glucose syrup) rất quan
trọng để enzyme ổn định.
7
Luận văn nghiên cứu cố định α-amylase GVHD: TS. Trần Bích Lam
Hình 1.4: Quá trình chuyển đồng phân glucose thành fructose
5.1.2. Cyclodextrin Glycosyltransferase
Cyclodextrin glycosyltransferase (CGTase; EC 2.4.1.19) thủy phân một loạt đầu
không khử cyclomaltooligosaccharides chuyển thành cyclodextrin, gồm 6, 7 hoặc 8 nhóm
ᴅ-glucopyranol. Các enzyme cyclodextrin glycosyltransferase thủy phân cắt mạch nhánh
của tinh bột và xúc tác tạo vòng.
Hình 1.5: Cơ chế phản ứng thủy phân – liên kết của cyclodextrin glycosyltransferases.
Chú thích:
→, vị trí thủy phân O-O, liên kết α-1,4.
O, gốc glucose. →O, liên kết α-1,6..
CGTase được sản xuất chủ yếu bởi giống Bacillus. CGTase từ B. macerans khi thủy
phân tinh bột chủ yếu tạo ra α-cyclodextrin, ngược lại CGTase bền nhiệt từ B.
8
Glucose
isomerase
Glucose Fructose
α-cyclodextrin
β-cyclodextrin
γ-cyclodextrin

Phân tử tinh bột
Luận văn nghiên cứu cố định α-amylase GVHD: TS. Trần Bích Lam
stearothermophilus khi thủy phân tinh bột sản xuất cả α- và β-cyclodextrin và B. subtilis
CGTase thì tạo ra chủ yếu là γ-cyclodextrin.
5.2. ENZYME CỐ ĐỊNH [3, 9, 16, 31, 32]
5.2.1. Lịch sử nghiên cứu và phát triển
Năm 1916, Nelson và Griffin quan sát và thấy rằng enzyme invertase của nấm men
khi hấp phụ vào than có khả năng thủy phân đường saccharose.
Năm 1949, Micheal và Iuers đã sử dụng phương pháp azide hóa carboxymethyl
cellulose để cố định những chuỗi protein có hoạt tính.
Năm 1953, Grubhofer và Schleith đã cố định được một số enzyme như carboxy
peptidase, diastase, pepsin và ribonuclease trên polyaminostyrene bằng liên kết đồng hóa trị
và các nghiên cứu trên mới bắt đầu thử nghiệm ứng dụng ở quy mô pilot.
Năm 1954, Chang đã tạo ra được các vi tiểu cầu bán thấm có gắn enzyme để chống
lại dị ứng khi đưa enzyme vào cơ thể.
Năm 1963, Bernfeld và Wan đã thí nghiệm thành công khi nhốt các enzyme như
amylase, trypsin, papain, ribonuclease vào gel polyacrylamide.
Năm 1964, Quiociio và Richards đã mô tả phương pháp liên kết chéo cố định
carboxy peptidase A với glutaraldehyde. Cũng trong năm này, Chang đã triển khai phương
pháp tạo vi nang để nhốt enzyme carbonic anhydrase.
Năm 1969, Wilson đã xây dựng thành công xưởng thực nghiệm để sản xuất glucose
bằng glucoamylase cố định. Cũng trong năm này, Chibata và các cộng sự đã thực hiện
thành công áp dụng enzyme cố định vào sản xuất công nghiệp.
Năm 1970, Mosbach đã tiến hành cố định ba loại enzyme: β-galactosidase,
hexokinase, glucophosphatase bằng liên kết cộng hóa trị với các hạt sephadex.
9
Luận văn nghiên cứu cố định α-amylase GVHD: TS. Trần Bích Lam
Năm 1973, Chibata và các cộng tác viên cũng là những người đầu tiên thành công
trong việc cố định tế bào vi sinh vật để sản xuất L-aspartate từ ammonium fumarate bằng
gel acrylamide. Tế bào E.coli chứa trong gel có hoạt tính aspartase rất cao.

Đến năm 1987, bằng công nghệ ứng dụng enzyme glucoisomerase cố định, đã tiến
hành sản xuất syrup frutose từ glucose theo quy mô công nghiệp.
Ngoài những sản phẩm kể trên, enzyme cố định còn có được những ứng dụng nhiều
trong công nghệ lên men, chống ô nhiễm môi trường và cả trong y học.
5.2.2. Định nghĩa
Enzyme cố định có thể được hiểu theo 2 nghĩa:
Nghĩa hẹp: Enzyme cố định là enzyme được đưa vào những pha riêng rẽ, pha này
được tách riêng với dung dịch tự do. Pha enzyme không hòa tan trong nước và
được gắn với các polymer ưa nước có trọng lượng phân tử lớn.
Nghĩa rộng: các chất xúc tác cố định là các enzyme, tế bào, cơ thể sống ở trạng thái
cho phép sử dụng lại. Như vậy, theo nghĩa rộng, enzyme không hòa tan bao gồm
cả enzyme được cố định vào một chất mang, cả enzyme có trong tế bào sống
được cố định trong các thiết bị phản ứng sinh học có sự gắn kết vào một chất
mang cho phép sử dụng nhiều lần.
5.2.3. Đặc điểm của enzyme cố định
Hoạt tính riêng của enzyme cố định nhỏ hơn hoạt tính riêng của enzyme tự do cùng
loại.
Enzyme cố định hòa toàn tuân theo định luật Michaelis – Menten nhưng có một số
sai khác nhất định.
Enzyme cố định thường bền nhiệt hơn enzyme tự do.
Enzyme cố định có pH
opt
có thể khác với pH
opt
của enzyme tự do cùng loại.
Khả năng bảo quản của enzyme cố định tốt hơn.
10
Luận văn nghiên cứu cố định α-amylase GVHD: TS. Trần Bích Lam
Enzyme cố định dễ dàng tách ra khỏi sản phẩm và có sự ổn định cao hơn enzyme tự
do cùng loại.

5.2.4. Ưu và nhược điểm của enzyme cố định
Ưu điểm:
Tái sử dụng nhiều lần.
Điều khiển quá trình tốt hơn.
Sự ổn định gia tăng.
Sản phẩm không chứa enzyme.
Mô hình tốt để nghiên cứu động học của enzyme.
Nhược điểm:
Hoạt tính enzyme bị giảm do chất mang.
Enzyme bị giảm hoặc mất hoạt tính sau quá trình cố định.
5.2.5. Một số phương pháp cố định enzyme
6. Phương pháp hấp phụ (Adsorption)
Nguyên tắc: Enzyme được hấp phụ vào các nguyên liệu, như là than, polymer hữu
cơ, thủy tinh, muối vô cơ, oxide kim loại, hoặc silicagel.
Ưu điểm: Rẻ tiền, quá trình thực hiện đơn giản, enzyme ít bị biến tính trong suốt quá
trình cố định so với quá trình cố định enzyme bằng phương pháp hóa học.
Nhược điểm: Các lực liên kết yếu nên enzyme dễ bị giải hấp phụ khi thay đổi nhiệt
độ, pH, lực ion hoặc sự có mặt của cơ chất. Ngoài ra những chất lạ cũng có khả năng hấp
11
CHẤT MANG
Enzyme
Luận văn nghiên cứu cố định α-amylase GVHD: TS. Trần Bích Lam
phụ vào chất mang, có thể gây ra những vấn đề khác nhau bao gồm cả việc làm biến tính
enzyme.
7. Phương pháp nhốt (Entrapment)
Nguyên tắc: enzyme được nhốt trong cấu trúc mạng gel của các polymer như
polysaccharide, protein, polymer tổng học như polyacrylamide…
Phương pháp này đã được mô tả bởi Bernfeld and Wan. Phương pháp cố định này
chỉ cho phép khuếch tán tự do các cơ chất có khối lượng phân tử thấp, sản phẩm cuối, cơ
chất và những phân tử enzyme tương đối lớn không thể ra khỏi hạt.

Ưu điểm:
Giữa enzyme và chất mang không có liên kết nên enzyme ít bị phá hủy.
Có thể cố định nhiều enzyme.
Nhược điểm:
Nhiều quá trình trùng ngưng giải phóng những phân tử mang điện tích tự do, những
phân tử này có khả năng gây hại đến tính chất enzyme.
Cơ chất sử dụng hạn chế, chỉ những cơ chất có khối lượng phân tử thấp mới được sử
dụng trong quá trình này. Do đó phương pháp này hạn chế sử dụng trong kỹ
thuật thực phẩm vì hệ thống thực phẩm thường chứa các phân tử lớn.
Kích thước lỗ gel nhiều chỗ làm thất thoát enzyme do chúng bị khuếch tán ra ngoài.
8. Phương pháp vi bao (Microencapsulation)
12
Luận văn nghiên cứu cố định α-amylase GVHD: TS. Trần Bích Lam
Phương pháp này được mô tả bởi Chang tương tự phương pháp nhốt, nhưng bản
chất là quá trình hình thành của các hạt rất nhỏ hoặc các màng bao. Cơ chất trong trường
hợp này, cũng như trong phương pháp trên, phải có khối lượng phân tử thấp. Bao phổ biến
dày 200 A
o
, và bán kính lỗ là 18 A
o
.
Phương pháp vi bao khắc phục vấn đề enzyme thoát ra ngoài vì kích thước lỗ đồng
nhất, kích thước lỗ có thể thay đổi.
9. Phương pháp trao đổi ion (Ion-exchange)
Nguyên tắc: Chất trao đổi ion là nguyên liệu không tan chứa các nhóm điện tích tạo
liên kết hóa học và di chuyển đến các ion trái dấu. Các ion trái dấu có thể trao đổi với các
ion khác cùng điện tích mà không có bất kỳ sự thay đổi nào trong chất mang không tan.
Protein và enzyme có thể mang điện tích phụ thuộc vào pH và loại protein. Tính chất này
được Tose và các cộng sự sử dụng để kết nối enzyme với chất trao đổi ion bằng tương tác
điện tích.

Các vật liệu cố định thường sử dụng là: các dẫn xuất trao đổi ion như CM-, AE-,
DEAE-, cellulose, sepadex, chitosan…
Ưu điểm:
Phương pháp đơn giản.
13
Enzyme
Membrane
Enzyme
CHẤT MANG