BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
________________________

ĐỖ CAO CƯỜNG

ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ ENZYME ĐỂ TÁCH
CHIẾT VÀ THU NHÂN COLLAGEN TỪ DA CÁ
TRA

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC
Chuyên ngành Công nghệ sinh học

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
PGS.TS : KHUẤT HỮU THANH

HÀ NỘI - 2010


MỤC LỤC
PHẦN I - MỞ ĐẦU ........................................................................................................9
PHẦN II – TỔNG QUAN............................................................................................11
2.1. PROTEIN VÀ CÁC KHÁI NIỆM. ............................................................................... 11
2.1.1. Thành phần các nguyên tố của protein ................................................................... 11
2.1.2. Cấu tạo của phân tử protein .................................................................................... 11
2.1.3. Phân loại Protein..................................................................................................... 12
2.1.4. Một số tính chất cơ bản của protein........................................................................ 12
2.1.4.1. Tính tan của protein......................................................................................... 12
2.1.4.2. Tính ngậm nước của protein............................................................................ 13
2.1.4.3. Độ nhớt của dung dịch protein ........................................................................ 13
2.1.4.4. Hằng số điện môi của dung dịch protein......................................................... 13

2.1.4.5. Tính chất điện li của protein............................................................................ 14
2.1.4.6. Sự kết muối của dung dịch protein .................................................................. 15
2.1.4.7. Biểu hiện quang học của protein ..................................................................... 15
2.1.4.8. Kết tủa thuận nghịch và không thuận nghịch protein...................................... 15
2.1.4.9. Các phản ứng hóa học của protein.................................................................. 16
2.1.4.10. Biến tính protein ............................................................................................ 16
2.2. KHÁI QUÁT VỀ COLLAGEN ................................................................................... 18
2.2.1. Collagen và lược sử nghiên cứu ............................................................................. 18
2.2.2. Đại cương về cấu trúc của collagen........................................................................ 20
2.2.3. Phân loại collagen................................................................................................... 24
2.2.4. Một số tính chất chủ yếu của collagen.................................................................... 27
2.2.5. Sự phân bố collagen trong một số loài động .......................................................... 28
2.2.5.1. Collagen trong động vật thủy sản.................................................................... 28
2.2.5.2. Collagen từ các loài động vật thân mềm ......................................................... 31
2.2.5.3. Collagen từ các loài gia súc , gia cầm ............................................................ 32
2.2.6. Vai trò của collagen trong cơ thể động vật và con người ....................................... 33
2.2.6.1. Ý nghĩa của collagen đối với sinh vật sống và đối với con người ................... 33
2.2.6.2. Các dạng tồn tại của collagen trong cơ thể..................................................... 34
2.2.7. Ứng dụng của collagen ........................................................................................... 37
2.2.7.1. Trong công nghiệp ........................................................................................... 37
2.2.7.2. Ứng dụng trong y học và dược phẩm .............................................................. 39
2.2.8. Tiềm năng nguyên liệu sản xuất collagen từ da cá ở Việt Nam ............................. 41
2.3. CÁC PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT, TINH SẠCH VÀ XÁC ĐỊNH PROTEIN
(COLLAGEN) ...................................................................................................................... 42
2.3.1. Các biện pháp cần thiết để nhận protein nguyên thể .............................................. 42
2.3.1.1. Nhiệt độ............................................................................................................ 43
2.3.1.2. Nồng độ proton (pH)........................................................................................ 43
2.3.1.3. Tác nhân hóa học............................................................................................. 43
2.3.2. Phá vỡ tế bào và chiết rút protein ........................................................................... 43
2.3.2.1. Phá vỡ tế bào ................................................................................................... 43

2.3.2.2. Tách chiết protein ............................................................................................ 43
2.3.3. Tinh sạch protein .................................................................................................... 43
2.3.3.1. Loại các tạp chất ............................................................................................. 43


TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

2.3.3.2. Các kỹ thuật thu nhận và tinh sạch protein ..................................................... 44
2.4. MỘT SỐ KỸ THUẬT TÁCH VÀ TINH SẠCH COLLAGEN.................................... 47
2.4.1. Phương pháp tách chiết và thu nhận collagen ........................................................ 47
2.4.2. Một số quy trình tách chiết collagen thường sử dụng............................................. 49
2.4.2.1. Quy trình tách chiết collagen từ cá da trơn .................................................... 49
2.4.2.2. Tách chiết collagen từ thịt cá chép, cá hồi (1986) ......................................... 50
2.4.2.3. Tách chiết collagen từ thịt cá chép (1987) ..................................................... 51
2.4.2.4. Tách chiết collagen từ vẩy cá ......................................................................... 51
2.4.2.5. Tách chiết collagen từ cá rô phi song Nile (cá Tilapia) ................................. 52
2.4.2.6. Quy trình tách chiết collagen từ da lợn .......................................................... 53
2.4.2.7. Quy trình tách chiết collagen từ xương gà ...................................................... 53
2.4.2.8. Quy trình tách chiết collagen từ xương trâu bò ............................................. 54

PHẦN III – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...............................55
3.1. ĐỐI TƯỢNG VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU ............................................................. 55
3.2. THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT SỬ DỤNG........................................................................ 55
3.2.1. Thiết bị.................................................................................................................... 55
3.2.2. dụng cụ.................................................................................................................... 56
3.2.3. Hóa chất .................................................................................................................. 56
3.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................................. 58
3.3.1. Sơ chế nguyên liệu .................................................................................................. 58
3.3.2. Tách mỡ ................................................................................................................. 58
3.3.3. Thủy phân protein................................................................................................... 59

3.3.4. Thu nhận collagen .................................................................................................. 59
3.3.5. Xác đinh kết quả ..................................................................................................... 60
3.3.6. Xây dựng sơ đồ công nghệ: ...............................................................................63

PHẦN IV – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.................................................................64
4.1.THU THẬP MẪU CÁ TRA........................................................................................... 64
4.2.TÁCH MỠ ...................................................................................................................... 65
4.2.1. Nghiên cứu sự ảnh hưởng của thời gian xử lý (ngâm) mẫu với NaOH 0.1M đến tỷ
lệ mỡ bị loại ...................................................................................................................... 65
4.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NaOH đến khả năng loại mỡ ....................... 67
4.2.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian xử lý (ngâm) mẫu trong C2H5OH 96% (cồn
960) đến khả năng loại mỡ ................................................................................................ 69
4.3. THỦY PHÂN VÀ THU NHẬN.................................................................................... 71
4.3.1. Nghiên cứu sự ảnh hưởng của thời gian đến quá trình thủy phân da cá tra bằng
CH3COOH 0.5M............................................................................................................... 71
4.3.2. Nghiên cứu sự thủy phân da cá tra bằng CH3COOH 0.5M có bổ sung enzyme. ... 73
4.3.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khi thủy phân da cá Tra bằng CH3COOH
0.5M có bổ sung enzyme pepsin....................................................................................... 76
4.3.4. Nghiên cứu sự ảnh hưởng của nồng độ CH3COOH đến quá trình thủy phân da cá
tra có bổ sung enzyme pepsin ........................................................................................... 79
4.4. NGHIÊN CỨU SỰ ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ NaCl ĐẾN HIỆU SUẤT THU
HỒI COLLAGEN TRONG DUNG DỊCH........................................................................... 81
4.5. NGHIÊN CỨU SỰ ẢNH HƯỞNG CỦA QUÁ TRÌNH BẢO QUẢN CHẾ PHẨM CÁ
TRA ĐẾN HIỆU SUẤT TÁCH CHIẾT COLLAGEN ........................................................ 82
LUẬN VĂN THẠC SỸ - CÔNG NGHỆ SINH HỌC

2

HVTH: ĐỖ CAO CƯỜNG



TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

4.6. KIỂM TRA SẢN PHẨM COLLAGEN: ....................................................................... 86

PHẦN V - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...................................................................88
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...........................................................................................89

LUẬN VĂN THẠC SỸ - CÔNG NGHỆ SINH HỌC

3

HVTH: ĐỖ CAO CƯỜNG


TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU

pHi hay pI (isoeletric-điểm đẳng điện): Điểm đẳng điện của một protein
OD (Optical Density): mật độ quang
CRP (collagen related peptide) : các mối liên kết peptide trong collagen
TEM (Transmission electron microscopy): kỹ thuật kính hiển vi điện tử
AFM (Atomic force microscopy): kính hiển vi năng lượng nguyên tử
RER (rough Endoplasmic Reticulum ): màng lưới nội chất
FACIT (Fibril associated collagen with interrupted triple helices)
MACIT ( Membranne asociated collagen with interrupted triple helices)
BSE (bovine spongiform encephalopathy): bệnh bò điên
RCF(relative centrifugal force): lực ly tâm
ATP (adenosin triphosphat): phân tử mang năng lượng

AND hay DNA (deoxyribonucleic axit)
RNA (Ribonucleic axit)
SDS PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis): kỹ thuật điện
di trên gel polyacrylamide.
PTC : phenylisothyocyanate
HPLC (high performance liquid chromatography): kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao
MS (mass-spectrometry): Phương pháp khối phổ kế tiếp
Gly: Glycine
Pro: Proline
Hyp: Hydroxyproline
Ala: Alanine

LUẬN VĂN THẠC SỸ - CÔNG NGHỆ SINH HỌC

4

HVTH: ĐỖ CAO CƯỜNG


TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Hàm lượng các nguyên tố trong protein ...................................................11
Bảng 2.2 . Độ nhớt của một số protein .......................................................................13
Bảng 2.3. Giá trị pHi của một số protein ...................................................................14
Bảng 2.4. Bảng phân loại collagen ..............................................................................27
Bảng 2.5. Bảng các axit amin trong thành phần collagen cá hồi .............................29
Bảng 2.6. Bảng tính ước tính doanh thu ....................................................................42
Bảng 3.1. Bảng pha chế gel cô và gel tách..................................................................60
Bảng 4.1.1- Phân tích hàm lượng phụ phẩm từ cá tra ............................................64

Bảng 4.2.1 – Tỷ lệ mỡ được loại khi ngâm mẫu trong 8h.........................................65
Bảng 4.2.2 – Tỷ lệ mỡ bị loại khi ngâm mẫu trong 10h............................................65
Bảng 4.2.3 – Tỷ lệ mỡ bị loại khi ngâm mẫu trong 12h............................................66
Bảng 4.2.4 – Tỷ lệ mỡ bị loại khi ngâm mẫu trong NaOH nồng độ 0.05M ............67
Bảng 4.2.5 – Tỷ lệ mỡ bị loại khi ngâm mẫu trong NaOH nồng độ 0.2M ..............68
Bảng 4.2.6 – Tỷ lệ mỡ được loại khi ngâm mẫu với C2H5OH trong 12h ................69
Bảng 4.2.7 – Tỷ lệ mỡ được loại khi ngâm mẫu với C2H5OH trong 18h ................69
Bảng 4.2.8 – Tỷ lệ mỡ được loại khi ngâm mẫu với C2H5OH trong 24h ................70
Bảng 4.3.1 Tỷ lệ collagen thô thu được khi thủy phân da cá trong 24h .................72
Bảng 4.3.2 – Tỷ lệ collagen thô thu được khi thủy phân da cá trong 48h...............72
Bảng 4.3.3 – Tỷ lệ collagen thô thu được khi thủy phân da cá trong 72h...............72
Bảng 4.3.4 – Tỷ lệ collagen thô thu được khi thủy phân da cá trong CH3COOH
0.5M có bổ sung Papain ...............................................................................................74
Bảng 4.3.5 – Tỷ lệ collagen thô thu được khi thủy phân da cá trong CH3COOH
0.5M có bổ sung Pepsin................................................................................................74
Bảng 4.3.6 – Tỷ lệ collagen thô thu được khi thủy phân da cá trong CH3COOH
0.5M có bổ sung endo protease ...................................................................................75
Bảng 4.3.7 – Tỷ lệ collagen thô thu được khi thủy phân da cá trong CH3COOH
0.5M có bổ sung Flavourzyme ....................................................................................75

LUẬN VĂN THẠC SỸ - CÔNG NGHỆ SINH HỌC

5

HVTH: ĐỖ CAO CƯỜNG


TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

Bảng 4.3.8 – Tỷ lệ collagen thô thu được khi thủy phân da cá trong CH3COOH

0.5M có bổ sung pepsin trong 12h. .............................................................................77
Bảng 4.3.9 – Tỷ lệ collagen thô thu được khi thủy phân da cá trong CH3COOH
0.5M có bổ sung pepsin trong 24h:.............................................................................77
Bảng 4.3.10 – Tỷ lệ collagen thô thu được khi thủy phân da cá trong CH3COOH
0.5M có bổ sung pepsin trong 72h ..............................................................................78
Bảng 4.3.11 – Tỷ lệ collagen thu được khi thủy phân da cá trong CH3COOH 0.3M
có bổ sung pepsin trong 24h ........................................................................................79
Bảng 4.3.12 – Tỷ lệ collagen thu được khi thủy phân da cá trong CH3COOH 0.4M
có bổ sung pepsin trong 24h ........................................................................................80
Bảng 4.3.13 – Tỷ lệ collagen thu được khi thủy phân da cá trong CH3COOH 0.6M
có bổ sung pepsin trong 24h ........................................................................................80
Bảng 4.4.1 – Tỷ lệ collagen thu được khi kết tủa dịch thủy phân bằng NaCl:.......82
Bảng 4.5.1 – Tỷ lệ collagen thu được khi sử dụng da cá bảo quản -200C ..............83
Bảng 4.5.2 – Tỷ lệ collagen thu được khi sử dụng da cá bảo quản 00C .................84
Bảng 4.5.3 – Tỷ lệ collagen thu được khi sử dụng da cá bảo quản -200C từ nhà
máy chế biến cá tra. .....................................................................................................84
Bảng 4.5.4 – Tỷ lệ collagen thu được khi sử dụng da cá bảo quản -200C từ viện
nghiên cứu nuôi trồng thủy sản .................................................................................85
Bảng 4.6. Lượng collagen thu được sau khi đông khô..............................................86

LUẬN VĂN THẠC SỸ - CÔNG NGHỆ SINH HỌC

6

HVTH: ĐỖ CAO CƯỜNG


TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1. Cấu trúc liên kết trong xoắn ba collagen .................................................19
Hình 2.2. Cấu trúc dạng sợi của collagen ..................................................................20
Hình 2.3. Cấu trúc soắn của collagen .........................................................................21
Hình 2.4. Cấu trúc vi sợi collagen...............................................................................22
Hình 2.5. Cấu trúc bó sợi của collagen.......................................................................23
Hình 2.6. Sự hình thành collagen I .............................................................................26
Hình 2.7. Cấu trúc da...................................................................................................35
Hình 2.8. Cấu tạo của mắt ...........................................................................................35
Hình 2.9. Hệ thống tiêu hóa.........................................................................................36
Hình 2.10. Collagen ứng dụng trong thực phẩm.......................................................38
Hình 2.11. Gelatin ứng dụng trong thực phẩm .........................................................38
Hình 2.12. ứng dụng collagen trong miếng dán vết thương ...................................39
Hình 2.13. Ứng dụng collagen trong da nhân tạo .....................................................40
Hình 2.14. Đưa collagen vào hai thành niệu đạo.......................................................40
Hình 2.15. Kem dưỡng da collagen ; son môi collagen và Gel collagen..................41
Hình 2.16. Dầu gội đầu collagen; Sữa tắm collagen; tinh thể đắp mặt collagen....41
Hình 4.1.1 – Tỷ lệ % da cá thô trong nguyên liệu.....................................................64
Hình 4.2.1 - Ảnh hưởng của thời gian đến tỷ lệ mỡ được loại .................................67
Hình 3.1. Sơ đồ tách chiết collagen từ da cá..............................................................81
Hình 4.2.2 - Ảnh hưởng của nồng độ NaOH đến tỷ lệ mỡ được loại ......................68
Hình 4.2.3 - Ảnh hưởng của thời gian đến tỷ lệ mỡ được loại bằng C2H5OH........70
Hình 4.3.1 - Ảnh hưởng của thời gian đến quá trình thủy phân .............................73
Hình 4.3.2. Ảnh hưởng của enzyme đến quá trình thủy phân.................................76
Hình 4.3.3. Ảnh hưởng của thời gian khi thủy phân da cá tra bằng CH3COOH
0.5M có bổ sung pepsin................................................................................................78
Hình 4.3.4. Ảnh hưởng của nồng độ CH3COOH đến quá trình thủy phân ...........81
Hình 4.4.1. Ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến khả năng kết tủa collagen.............82
Hình 4.5.1 Ảnh hưởng của phương pháp bảo quản đến hiệu suất tách chiết ........85
LUẬN VĂN THẠC SỸ - CÔNG NGHỆ SINH HỌC


7

HVTH: ĐỖ CAO CƯỜNG


TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

Hình 4.6.1. Kết quả điện di collagen đã tăng nồng độ. .............................................87
Hình 4.6.2. Collagen trước khi đông khô (có bổ sung endo protease (trái), pepsin
(phải)) ............................................................................................................................87
Hình 4.6.3. Collagen thô đã đông khô ........................................................................87

LUẬN VĂN THẠC SỸ - CÔNG NGHỆ SINH HỌC

8

HVTH: ĐỖ CAO CƯỜNG


TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

PHẦN I - MỞ ĐẦU
Trong những năm đầu của thế kỷ 21, thế giới đã chứng kiến rất nhiều những thành
tựu to lớn trong các lĩnh vực khoa học kỹ thuật, đặc biệt là ngành công nghệ sinh học.
Trong đó nghành công nghệ protein - enzyme đã đạt được nhiều thành tựu đáng kể.
Và có xu hướng phát triển mạnh mẽ trong tương lai.
Trong công nghệ protein – enzyme việc nghiên cứu ứng dụng collagen trong khoa
học và đời sống ngày càng phát triển mạnh. Collagen là loại protein cấu trúc chiếm tới
30% tổng lượng protein trong cơ thể. Còn trong cuộc sống collagen có rất nhiều các
ứng dụng cho các nghành y tế, công nghiệp thực phẩm, nghành công nghiệp mỹ

phẩm…. Thấy được khả năng ứng dụng cao của collagen trong cuộc sống nên hiện nay
trên thế giới đã xuất hiện rất nhiều những nghiên cứu để tăng khả năng chiết xuất
collagen từ nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau. Trong cơ thể động vật chúng chiếm
30% tổng lượng protein và tồn tại chủ yếu trong các bộ phận như: răng, tóc, xương, da,
gân, sụn và các vách cơ.
Trên thị trường thế giới hiện nay thì sản phẩm collagen đã được sử dụng và ứng
dụng rất nhiều trong cuộc sống. Nhưng ở thị trường Việt Nam hiện nay collagen mới
chỉ được biết đến qua các sản phẩm về mỹ phẩm nhập khẩu từ nước ngoài và một số ít
công ty lớn ở Việt Nam cũng đã nhập khẩu collagen từ nước ngoài về để đưa vào sản
xuất. Hầu như tất cả các loại mỹ phẩm có chứa collagen protein đều chiết xuất từ các
loài gia súc, gia cầm. Trong khi đó mỹ phẩm dựa trên collagen từ protein của các loài
gia súc, gia cầm có một tỷ lệ hấp thụ rất thấp cho làn da của con người và đặc biệt dễ bị
ảnh hưởng từ những bệnh mà động vật mắc phải như: bệnh bò điên, các bệnh liên quan
đến hệ thần kinh và xương khớp. Để khắc phục vấn đề hấp thụ này, collagen chiết xuất
từ cá đã được thay thế . Vì collagen từ cá có nhiều ưu điểm tốt hơn về mặt mỹ phẩm và
dược tính. Collagen từ cá được hấp thụ hoàn toàn trên da người. [37]
Việt Nam với điều kiện thuận lợi về địa lý, trong những năm gần đây ngành thủy
hải sản của nước ta đang phát triển mạnh mẽ, sản phẩm thủy hải sản xuất khẩu đứng
thứ 2 trên thế giới. Trong đó thì sản phẩm cá tra, cá basa chiếm tỷ lệ rất lớn. Sản phẩm
LUẬN VĂN THẠC SỸ - CÔNG NGHỆ SINH HỌC

9

HVTH: ĐỖ CAO CƯỜNG


TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

xuất khẩu của cá tra và cá basa chủ yếu là dạng phile (đã lọc da, xương, vây), vì vậy
khi sản lượng tiêu thụ cá Tra, cá basa ngày càng tăng thì đồng nghĩa với việc các phụ

phẩm kèm theo đó là da, vây, xương … cũng ngày càng tăng. Những phụ phẩm này
một lượng nhỏ được sử dụng làm phân bón, làm thức ăn gia súc còn phần lớn là bỏ đi.
Vì vậy nếu chúng ta tận dụng nguồn phế phẩm đó để tách chiết collagen thì sẽ mang lại
giá trị kinh tế rất cao. Vì lượng phụ phẩm chiếm 70% lượng nguyên liệu ban đầu.
Trong khi giá của 1kg da cá tối đa 0.5USD/kg còn giá collagen thô trên thị trường
khoảng 25 – 30 USD/kg. [38]
Từ những ứng dụng và hiệu quả kinh tế của collagen mang lại trong cuộc sống,
nhận thấy được tiềm năng trong nguồn cung cấp collagen của nước ta. Chúng tôi tiến
hành nghiên cứu đề tài: “ ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ ENZYM ĐỂ TÁCH CHIẾT VÀ
THU NHẬN COLLAGEN TỪ DA CÁ TRA”
Mục đích của đề tài:
-

Nghiên cứu quy trình công nghệ tách chiết và thu nhận collagen từ da cá tra
bằng công nghệ enzyme.

Nội dung:
-

Xác định tỉ lệ da cá thu được từ phụ phẩm chế biến cá tra.

-

Nghiên cứu lựa chọn enzyme trong tách chiết collagen từ da cá tra.

-

Xây dựng quy trình tách chiết và thu nhận collagen.

LUẬN VĂN THẠC SỸ - CÔNG NGHỆ SINH HỌC


10

HVTH: ĐỖ CAO CƯỜNG


TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

PHẦN II – TỔNG QUAN
2.1. PROTEIN VÀ CÁC KHÁI NIỆM.
2.1.1. Thành phần các nguyên tố của protein
Protein là các hợp chất cao phân tử cấu tạo bởi các nguyên tố C, H, O, N, S, đôi
khi còn gặp cả P hoặc các nguyên tố kim loại khác. Khi protein bị thủy phân sẽ chuyển
thành các peptid ngắn hoặc axit amin.
Tùy theo từng loại protein mà tỷ lệ phần trăm của các nguyên tố trong các loại
protein khác nhau.
NGUYÊN TỐ

HÀM LƯỢNG (%)

Cacbon (C)

50 – 55

Hydro (H)

6.5 – 7.3

Nitơ (N)


15 – 18

Oxy (O)

21 – 24

Lưu huỳnh (S)

0 – 2.4

Trơ

0 – 0.5
Bảng 2.1. Hàm lượng các nguyên tố trong protein
Lượng Nitơ (N)% đặc biệt quan trọng, nó chiếm trung bình 16% vì lẽ đó để xác

định hàm lượng protein thông thường có thể sử dụng phương pháp định lượng thông
qua hàm lượng N có trong phân tử protein đó. [5]
2.1.2. Cấu tạo của phân tử protein
Protein cấu tạo từ các nguyên tố như C, H, O, N, S. Ngoài ra, một số loại
protein còn chứa một lượng rất ít các nguyên tố khác như: P, Mn, Fe, Cu, Ca, Zn, …
Đơn vị cấu tạo cơ bản của các phân tử protein là các axit amin ( axit amino cacboxylic)
Các nhóm axit amin trong phân tử protein là:
-

Axit amin trung tính mạch không vòng

-

Hydroxyl axit amin.


-

Các axit amin chứa lưu huỳnh mạch không vòng.

-

Các axit amin và amit của chúng.

-

Các axit amin kiềm.

LUẬN VĂN THẠC SỸ - CÔNG NGHỆ SINH HỌC

11

HVTH: ĐỖ CAO CƯỜNG


TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

-

Iminoaxit (Prolin).

-

Các axit amin thơm và dị vòng thơm.


Ngoài ra trong một số phân tử protein còn chứa một số các axit amin khác, các
axit amin này thường là dạng hiệu chỉnh của các axit amin thường gặp trên. Quá trình
hiệu chỉnh thường xảy ra sau khi chuỗi polypeptide đã được tổng hợp. Ví dụ như:
Collagen có chứa Hidroxylizin và Hidroxyprolin, Protrombin có chứa cacboxyl –
glutamate, nhiều protein khác có chứa photphoxerin.
Các axit amin này có vai trò quan trọng trong cấu trúc và chức năng của các
protein tương ứng. Hidroxyproline làm tăng độ bền sợi của sợi collagen, cacboxyl –
glutamate đảm bảo thực hiện vai trò của protrombin trong quá trình đông máu.
Ngoài ra còn gặp một số axit amin không có trong protein nhưng được tìm thấy
trong cơ thể sống và các axit amin không thay thế ( Là các axit amin mà cơ thể sống
không thể tự tổng hợp được phải đưa vào cơ thể từ nguồn bên ngoài qua đường thức
ăn).
Các axit amin này liên kết với nhau bằng liên kết peptide theo những trình tự
nhất định tạo nên các chuỗi polypeptide có cấu trúc khác nhau đặc trưng cho từng loại
protein.
Trong protein ngoài các axit amin còn có hai hợp chất amid tương ứng với axit
asparaginic và glutamic là asparaginin và glutamine. Trong một vài loại protein còn
phát hiện thấy một số axit amin ít gặp như oxyprolin, oxylizin, octinin. [3,5]
2.1.3. Phân loại Protein
Có rất nhiều cách để phân loại protein, trong đó có những cách sau:
- Phân loại theo hình dạng của protein.
- Phân loại theo chức năng của protein.
- Phân loại theo giá trị dinh dưỡng của protein.
- Phân loại theo cấu tạo hoá học của protein.
2.1.4. Một số tính chất cơ bản của protein
2.1.4.1. Tính tan của protein

LUẬN VĂN THẠC SỸ - CÔNG NGHỆ SINH HỌC

12


HVTH: ĐỖ CAO CƯỜNG


TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

Các loại protein khác nhau có khả năng hoà tan dễ dàng trong một số loại dung
môi nhất định, chẳng hạn như albumin dễ tan trong nước; globulin dễ tan trong muối
loãng; prolamin tan trong ethanol, glutelin chỉ tan trong dung dịch kiềm hoặc axit
loãng .v.v.. [4,7]
2.1.4.2. Tính ngậm nước của protein
Trong môi trường nước, protein kết hợp với nước trương lên trở thành dạng keo
hay nói cách khác protein ở trạng thái hydrate hoá, các phân tử nước bám vào các
nhóm ưa nước trong phân tử protein như –NH2, -COOH..., lớp áo nước bao quanh
phân tử protein là một trong các yếu tố làm bền vững cấu trúc, ngăn cách các phân tử
protein không cho chúng dính vào nhau để tạo thành trạng thái kết tủa. [4,7]
2.1.4.3. Độ nhớt của dung dịch protein
Khi protein hoà tan trong dung dịch, mỗi loại dung dịch của những protein khác
nhau có độ nhớt khác nhau (bảng 1). Người ta có thể lợi dụng tính chất này để xác định
khối lượng phân tử của protein (độ nhớt càng cao thì khối lượng phân tử càng cao).
[3,4]
Protein

Nồng độ %(trong nước)

Độ nhớt tương đối (của nước =1)

Gelatin

3.0


4.54

Albumin trứng

3.0

1.2

Gelatin

8.0

14.2

Albumin trứng

8.0

1.57

Bảng 2.2 . Độ nhớt của một số protein
2.1.4.4. Hằng số điện môi của dung dịch protein
Khi thêm các dung môi hữu cơ trung tính như ethanol, aceton vào dung dịch
protein trong nước thì độ tan của protein giảm tới mức kết tủa do giảm mức độ hydrate
hoá của các nhóm ion hoá của protein, lớp áo mất nước, các phân tử protein kết hợp
với nhau thành tủa. Như vậy, hằng số điện môi của dung môi làm ngăn cản lực tĩnh
điện giữa các nhóm tích điện của protein và nước. Mối liên hệ đó được đặc trưng bởi
biểu thức:
LUẬN VĂN THẠC SỸ - CÔNG NGHỆ SINH HỌC


13

HVTH: ĐỖ CAO CƯỜNG


TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

Trong đó:
D - hằng số điện môi của dung dịch
F- lực tĩnh điện giữa các ion tích điện
L1 , l2 - điện tích các ion, r - khoảng cách giữa các ion
Ở đây lực tĩnh điện giữa các ion tỷ lệ nghịch với hằng số điện môi và khoảng cách giữa
các ion protein. [3,4, 7]
2.1.4.5. Tính chất điện li của protein
Cũng như các amino axit, protein là chất điện li lưỡng tính vì trong phân tử protein có
nhiều nhóm phân cực mạnh (gốc bên R) của amino axit ví dụ: nhóm COOH thứ hai của
Asp, Glu; nhóm NH2 của Lys; nhóm OH của Ser, Thr, Tyr v.v..

Trạng thái tích

điện của các nhóm này phụ thuộcvào pH của môi trường. Ở một pH nào đó mà tổng
điện tích (+) và điện tích (-) của phân tử protein bằng không, phân tử protein không di
chuyển trong điện trường thì giá trị pH đó gọi là pHi (isoeletric-điểm đẳng điện) của
protein.
Bảng 2.3. Giá trị pHi của một số protein
Protein

Phi


Protein

pHi

Pepsin

1.0

Hemoglobin

6.8

Albumin trứng

4.6

Ribonuclease

7.8

Casein

4.7

Tripsin

10.5

Albumin huyết thanh


4.9

Cytochrom C

10.6

Gelatin

4.9

Prolamin

12.0

Globulin sữa

5.2

Trong môi trường có pH = pHi , protein dễ dàng kết tụ lại với nhau vì thế người
ta lợi dụng tính chất này để xác định pHi của protein cũng như để kết tủa protein. Mặt
khác do sự sai khác nhau về pHi giữa các protein khác nhau, có thể điều chỉnh pH của
môi trường để tách riêng các protein ra khỏi hỗn hợp của chúng. [3,4, 7]

LUẬN VĂN THẠC SỸ - CÔNG NGHỆ SINH HỌC

14

HVTH: ĐỖ CAO CƯỜNG



TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

2.1.4.6. Sự kết muối của dung dịch protein
Muối trung tính có ảnh hưởng rõ tới độ hoà tan của protein hình cầu: với nồng
độ thấp chúng làm hoà tan nhiều protein. Tác dụng đó không phụ thuộc vào bản chất
của muối trung tính, mà phụ thuộc vào nồng độ muối và số điện tích của mỗi ion trong
dung dịch. Khi tăng đáng kể nồng độ muối trung tính thì độ tan của protein bắt đầu
giảm và ở nồng độ muối rất cao, protein có thể bị tủa hoàn toàn.
Các protein khác nhau tủa ở những nồng độ muối trung tính khác nhau. Người ta sử
dụng tính chất này để chiết xuất và tách riêng từng phần protein khỏi hỗn hợp. [3,4]
2.1.4.7. Biểu hiện quang học của protein
Cũng như nhiều chất hoá học khác, protein có khả năng hấp thụ và bức xạ ánh
sáng dưới dạng lượng tử hγ. Vì vậy có thể đo cường độ hấp thụ của protein trong dung
dịch hay còn gọi là mật độ quang thường ký hiệu bằng chữ OD (Optical Density).
Trong thực tế thường đo độ hấp thụ của dung dịch protein ở bước sóng 220nm-240nm.
Ở bước từ 250nm-300nm là vùng hấp thụ các amino axit thơm (Phe, Tyr, Trp) có trong
phân tử protein hấp thụ cực đại ở 280nm. Có thể sử dụng phương pháp đo độ hấp thụ
của dung dịch protein ở bước sóng 280nm để định tính và định lượng các protein có
chứa các amino axit thơm. Ngoài ra có nhiều chất khác trong dung dịch cũng có ảnh
hưởng đến độ hấp thụ protein. Vì vậy, các phương pháp đo độ hấp thụ ở vùng ánh sáng
tử ngoại thường được dùng để định lượng protein đã được tinh sạch hoặc để xác định
protein trong các phân đoạn nhận được khi sắc ký tách các protein qua cột. [4]
2.1.4.8. Kết tủa thuận nghịch và không thuận nghịch protein
Khi protein bị kết tủa đơn thuần bằng dung dịch muối trung tính có nồng độ
khác nhau hoặc bằng alcohol, aceton ở nhiệt độ thấp thì protein vẫn giữ nguyên được
mọi tính chất của nó kể cả tính chất sinh học và có thể hoà tan trở lại gọi là kết tủa
thuận nghịch. Các yếu tố gây kết tủa thuận nghịch được dùng để thu nhận chế phẩm
protein. Ngược lại, kết tủa không thuận nghịch là khi phân tử protein sau khi bị kết tủa
không thể phục hồi lại trạng thái ban đầu. Sự kết tủa này thường được sử dụng để loại
bỏ protein ra khỏi dung dịch, làm ngưng phản ứng của enzyme. [3,4, 35]


LUẬN VĂN THẠC SỸ - CÔNG NGHỆ SINH HỌC

15

HVTH: ĐỖ CAO CƯỜNG


TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

2.1.4.9. Các phản ứng hóa học của protein
Cũng như các amino axit và peptide protein có các phản ứng hoá học tương tự
đó là: phản ứng của các nhóm -COOH, -NH2, gốc R và phản ứng tạo màu đặc trưng
của liên kết peptide như phản ứng biure. Ngoài ra, còn một số phản ứng màu đặc trưng
khác, có ý nghĩa quan trọng trong phát hiện protein và các gốc amio axit trong chuỗi
polypeptide:
- Phản ứng với thuốc thử Folin-Ciocalteau
Thuốc thử Folin-Ciocalteau có chứa axit phosphomolipdic và axit phos
phovolframic. Các chất này làm tăng độ nhạy của phản ứng biure, mặt khác phản ứng
với gốc Tyr và Trp trong phân tử protein. Các gốc amino axit này tham gia trong quá
trình tạo phức chất màu xanh da trời.
- Phản ứng với ninhydrin
Tất cả các amino axit trong phân tử protein đều phản ứng với hợp chất ninhydrin tạo
thành phức chất màu xanh tím.
Protein cũng có thể tham gia nhiều phản ứng tạo màu khác như:
phản ứng xanthproteic, các gốc amino axit Tyr, Trp, Phe trong protein tác dụng với
HNO3 đặc tạo thành màu vàng và sau khi thêm kiềm sẽ chuyển thành màu nâu; phản
ứng Pauli; các gốc Tyr, His trong protein tác dụng với diasobenzosulfate axit tạo thành
màu đỏ anh đào; phản ứng Milon gốc Tyr tác dụng với thuỷ ngân nitrate trong HNO3
đặc tạo thành kết tủa màu nâu đất v.v.. [3,4,7,35]

2.1.4.10. Biến tính protein
- Khái niệm chung
Sau khi protein bị kết tủa, nếu loại bỏ các yếu tố gây kết tủa mà protein vẫn mất
khả năng tạo thành dung dịch keo bền như trước và mất những tính chất ban đầu,
chẳng hạn độ hoà tan giảm, tính chất sinh học bị mất gọi là sự biến tính protein. Vì
vậy, đối với việc bảo quản protein, người ta thường để dung dịch protein ở nhiệt độ
thấp thường là 0-40C. Song ở nhiệt độ này dung dịch protein dần dần cũng bị biến tính,
biến tính càng nhanh khi dung dịch protein càng loãng. Sự biến tính ở nhiệt độ thấp

LUẬN VĂN THẠC SỸ - CÔNG NGHỆ SINH HỌC

16

HVTH: ĐỖ CAO CƯỜNG


TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

của dung dịch protein loãng được gọi là sự biến tính “bề mặt”. Protein bị biến tính bề
mặt tạo nên một lớp mỏng trên bề mặt dung dịch, phần dưới lớp mỏng là những nhóm
ưa nước nằm trong dung dịch, phần trên lớp mỏng là những gốc kỵ nước của amino
axit kết hợp với nhau bởi lực Van der Waals. Ở dung dịch đặc các phân tử protein kết
hợp với nhau chặt chẽ hơn do đó làm giảm bớt và hạn chế sự biến tính bề mặt. Để bảo
quản tốt các chế phẩm protein như enzyme, hormon, g-globulin kháng độc tố v.v..
người ta tiến hành làm đông khô (làm bốc hơi nước của dung dịch protein ở áp suất và
nhiệt độ thấp), bột thu được có thể bảo quản được ngay cả ở nhiệt độ phòng thí nghiệm
trong các ống hàn kín.
- Các yếu tố gây biến tính
Có nhiều yếu tố tác động gây ra sự biến tính protein như: nhiệt độ cao, tia tử
ngoại, sóng siêu âm, axit, kiềm, kim loại nặng. Vì vậy, trong thực tế người ta rất chú ý

tới ảnh hướng của các yếu tố có khả năng làm biến tính protein, ví dụ: khi chiết xuất và
tinh chế protein, đặc biệt là các protein enzyme, cũng như khi xác định hoạt độ của
chúng, phải chú ý đề phòng biến tính. Muốn vậy phải đảm bảo những điều kiện thích
hợp nhất cho qui trình kỹ thuật, như tiến hành thí nghiệm trong lạnh và đảm bảo pH
thích hợp của các dung dịch sử dụng.
+ Tác nhân lý học
Tác dụng của nhiệt độ: Khi đun nóng Protein rất dễ làm cho chúng bị biến tính.
Tác dụng cơ học sự làm đông lạnh: đa số Protein không bị làm biến chất trong quá
trình làm đông lạnh trừ albumin trứng và lipoprotit…
Tác dụng của sóng âm thanh: sóng âm thanh có tần số cao hoặc sóng siêu âm có thể
làm biến tính Protein.
Tác dụng của lực căng bề mặt.
Tác dụng của lực nghiền cơ học.
Tác dụng của tia tử ngoại.
+ Tác nhân hóa học:
Tác dụng của dung môi hữu cơ: axeton, etylic.

LUẬN VĂN THẠC SỸ - CÔNG NGHỆ SINH HỌC

17

HVTH: ĐỖ CAO CƯỜNG


TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

Tác dụng của ure, muối guanidin. Ure gây biến tính Protein ở nồng độ 8M, muối
guanidin mạnh hơn ure.
- Tính chất của protein biến tính
Nghiên cứu cấu trúc không gian cho thấy khi bị biến tính phân tử protein không

còn cuộn chặt như trước mà thường duỗi ra, kết quả là do bị phá vỡ cấu hình không
gian của protein. Sự biến tính không làm đứt liên kết peptide mà làm đứt các liên kết
hydro vì vậy cấu trúc của nhóm kỵ nước của protein bị đảo lộn, các nhóm kỵ nước
quay ra phía ngoài và các nhóm ưa nước quay vào trong, sự hydrate hoá của protein
giảm (protein mất lớp áo nước) các phân tử protein dễ kết hợp với nhau, độ tan giảm và
có thể kết tủa. Sự biến đổi cấu trúc khiến protein biến tính dễ được tiêu hoá hơn protein
nguyên thuỷ. [1,4,7]
2.2. KHÁI QUÁT VỀ COLLAGEN
2.2.1. Collagen và lược sử nghiên cứu
- Collagen là gì
Là một nhóm protein tự nhiên dạng sợi chỉ có ở động vật và là protein dồi dào
nhất ở trong thịt, mô liên kết của động vật có vú. Và nó là thành phần chính của mô
liên kết. Chiếm khoảng 25% tới 35% toàn bộ lượng protein trong cơ thể. Collagen ở
dạng sợi kéo dài chủ yếu tồn tại trong các mô xơ của gân, dây chằng và da. Ngoài ra
còn tập trung rất nhiều ở giác mạc, sụn xương, mạch máu, ruột và các đĩa đệm.
Collagen tạo nên 1% tới 2% của mô cơ, và chiếm 6% về trọng lượng của gân, xương,
dây chằng, sụn và răng trong cơ thể
- Lược sử nghiên cứu collagen
Cấu trúc phân tử collagen và cấu trúc các bó collagen đã gây được nhiều sự chú
ý của các nhà khoa học trong nhiều thập kỷ qua. Và cấu trúc phân tử đầu tiên được
công bố vào giữa năm 1930. Kể từ đó rất nhiều các nhà khoa học nổi tiếng, trong đó có
cả những người đã đoạt giải nobel như Crick, Pauling, Rich, Yonath, Brodsky, Berman
và Ramachandran đã tập trung nghiên cứu về cấu tạo của phân tử collagen ở dạng đơn
thể. Năm 1940, Astbury và Bell đã đưa ra cấu trúc phân tử collagen gồm có một chuỗi
peptide đơn kéo dài với tất cả các liên kết amide trong dang Cis. Một tiến bộ đáng kể
LUẬN VĂN THẠC SỸ - CÔNG NGHỆ SINH HỌC

18

HVTH: ĐỖ CAO CƯỜNG



TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

đã đạt được trong năm 1951, tại học viện khoa học quốc gia Mỹ, Pauling và Corey đã
đưa ra cấu trúc đúng của chuỗi xoắn - α và dạng “ tờ”-β của collagen. Trong đó cấu
trúc 3 sợi polypeptide được kết hợp với nhau thành một dạng xoắn ốc nhờ các liên kết
hidro. Trong mỗi bộ 3 amino axit, các liên kết hidro chiếm 4 trong số 6 liên kết chính
với các nguyên tử khác. Và cấu trúc của chúng cần thỏa mãn điều kiện là 2 trong số 3
liên kết peptide phải ở dạng Cis. Trong năm 1954, Ramachandran và Kartha đã đưa ra
cấu trúc cao cấp hơn đó là các cấu trúc xoắn ba trên cơ sở của kỹ thuật nhiễu xạ sợi.
Cấu trúc của chúng là dạng xoắn ba theo chiều từ phải sang so le nhau, Polyproline loại
II xoắn theo chiều từ trái sang với tất cả các liên kết peptide ở dạng Trans và hai liên
kết hidro trong mỗi bộ ba. Vào năm 1955 Rich, Crick cùng các đồng nghiệp đã đưa ra
một cấu trúc và đã được chấp nhận cho đến nay. Trong cấu trúc đó có một sợi liên kết
đơn N – H (Gly)….O = C (Xaa) là liên kết hidro cho mỗi bộ ba.
Sử dụng phương pháp nhiễu xạ sợi nghiên cứu không thể phát hiện được cấu
trúc nguyên tử của collagen, và cấu trúc thứ bậc phức tạp của collagen đã gây rất nhiều
khó khăn khác cho việc phân tích hóa sinh của collagen. Khi đó có một cách tiếp cận là
phương pháp đơn giản hóa chuỗi xoắn ba, các mối liên kết peptide trong collagen
(CRPs) đã được sử dụng rộng rãi từ cuối thập niên 1960.
Đến năm 1994, Berman và các đồng nghiệp đã lần đầu tiên công bố cấu trúc
tinh thể cấp độ phân tích cao của chuỗi soắn ba (CRP)

.
Hình 2.1. Cấu trúc liên kết trong xoắn ba collagen (a,b,c)

LUẬN VĂN THẠC SỸ - CÔNG NGHỆ SINH HỌC

19


HVTH: ĐỖ CAO CƯỜNG


TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

Đây là cấu trúc đã chứng minh liên kết N – H (Gly) và H – N….C = O là liên kết hidro.
(hình 2.1b, 2.1c) [16,17,36]
2.2.2. Đại cương về cấu trúc của collagen
- Cấu trúc phân tử collagen:

Hình 2.2. Cấu trúc dạng sợi của collagen

Collagen có kết cấu rất phức tạp. là những sợi protein không tan, cấu tạo từ
những tiểu đơn vị hòa tan là tropocollagen. Tropocollagen hay "phân tử Collagen" là
một đơn vị lớn hơn của Collagen gọi là các sợi. Tropocollagen là những phân tử không
đối xứng có trọng lượng phân tử khoảng 285 kDal, dài khoảng 300 nm và đường kính
là 1,5 nm; gồm 3 dãy polypeptide, mỗi dãy có cấu hình xoắn ốc bên trái được tạo bởi
các đoạn lặp lại của tripeptide là Gly-Hyp-Pro. Ba chuỗi xoắn ốc này xoắn lại thành
một cuộn xoắn theo chiều xoắn phải gọi là siêu xoắn, lúc này chiều dài của chúng chỉ
bằng 1/4 so với lúc đầu (67 nm). Khoảng cách giữa các axit amin trong chuỗi xoắn là
2,9 A0 và cấu hình này đòi hỏi số gốc axit amin trong một vòng xoắn là 3,3 chứ không
phải là 3 axit amin.
Các phân tử tropocollagen sau khi được thành lập sẽ di chuyển ra môi trường ngoài tế
bào, tập hợp lại một cách đều đặn tạo thành collagen. Ba chuỗi polypeptide của
collagen gồm: 2 chuỗi α có cùng thành phần axit amin và một chuỗi β có thành phần
axit amin khác nhau.

LUẬN VĂN THẠC SỸ - CÔNG NGHỆ SINH HỌC


20

HVTH: ĐỖ CAO CƯỜNG


TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

Hình 2.3. Cấu trúc chuỗi soắn đơn của collagen
Gần một nửa lượng amino axit của collagen là glycine và alanine. Ở những vị trí
có liên kết – NH – và = O của glycine và alanine của chuỗi này sẽ liên kết nhóm

–

NH – và = O của chuỗi kia ở vị trí tương ứng bởi liên kết hydro. Cứ 3 chuỗi
polypeptide sẽ xoắn ốc lại với nhau tạo thành một chuỗi lớn hơn, đó chính là sợi
collagen rắn chắc trong mô sống của động vật. Ngoài ra, collagen cũng là một protein
rất giàu proline và hydroxyproline. Cấu trúc của hydroxyproline tuân theo nguyên tắc
lập lại hai lần trong chuỗi.
Một đặc điểm đặc trưng của collagen là sự sắp xếp đều đặn của các amino axit
trong mỗi mắt xích của từng chuỗi xoắn ốc collagen này. Thông thường các chuỗi theo
mẫu sau: Gly-Pro-Y hoặc Gly-X-Hyp, ở đây X và Y là các axit amin còn lại, Gly-ProHyp là mô hình xuất hiện nhiều nhất. Proline hoặc hydroxyproline tạo nên khoảng 1/6
tổng số chuỗi. (Chuỗi α ). Glycine chiếm 1/3 số chuỗi, điều này có nghĩa là khoảng
nửa chuỗi collagen không chứa glycine, proline hoặc hydroxyproline, các nhóm GXY
khác thường trong các chuỗi peptit collagen anfa. Sự phân bố đều đặn với hàm lượng
glycine cao được tìm thấy ở một số ít loại prôtêin dạng sợi, như sợi tơ tằm. Chiếm 7580% của tơ tằm là: Gly - Ala – Gly- Ala với 10% serine và elastin nhiều trong glycine,

LUẬN VĂN THẠC SỸ - CÔNG NGHỆ SINH HỌC

21


HVTH: ĐỖ CAO CƯỜNG


TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

proline và alanine (Ala), mà nhóm phụ này chiếm ít và là nhóm trơ với methyl. Lượng
Glycine cao và lặp lại thường xuyên như vậy không tồn tại trong các protein hình cầu
để đảm bảo cho các đoạn ngắn trong chuỗi của nó. [16,17,36]
- Cấu trúc vi sợi:
Với các đoạn cuối được đặt so le đều nhau, phần đơn nguyên tropocolagen tự
lắp ráp một cách tự nhiên thành các mảng lớn hơn trong không gian ngoại bào của các
mô. Trong các sợi nhỏ collagen được tạo thành, các phân tử được đặt so le nhau
khoảng 67 nm (một đơn vị được gọi là “D” và thay đổi phụ thuộc vào độ hydrat hóa
toàn bộ phân tử). Mỗi đoạn D có chứa 4 phân tử collagen và một phần nhỏ collagen
nữa. Điều này là do 300 nm chia cho 67 nm không ra một số nguyên ( độ dài của các
phân tử collagen được chia cho các khoảng cách đặt D so le). Vì vậy trong mỗi giai
đoạn lặp lại D của vi sợi, có một vùng chứa 5 phân tử theo mặt cắt ngang gọi là
“Overlap” và một vùng chỉ chứa có 4 phân tử, được gọi là “Gap”. Ba chuỗi xen kẽ vào
nhau cũng được sắp xếp trong khối lục giác hoặc gần như lục giác ở mặt cắt ngang,
trong khoảng cách cả hai khu vực “Gap” và “Overlap”.

Hình 2.4. Cấu trúc vi sợi collagen
LUẬN VĂN THẠC SỸ - CÔNG NGHỆ SINH HỌC

22

HVTH: ĐỖ CAO CƯỜNG


TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI


Có một số liên kết cộng hóa trị chéo trong 3 chuỗi xoắn xen kẽ nhau và một số
liên kết công hóa trị chéo giữa các đường xoắn ốc tropocollagen hình thành lên tập hợp
khối được sắp xếp hợp lý (như dạng sợi). Những bó sợi nhiều thớ hơn được hình thành
với sự trợ giúp của các tầng lớp protein khác nhau (bao gồm các loại collagen khác
nhau), glucoprotein và protein polysacarit hình thành các loại mô trưởng thành khác
nhau từ sự kết hợp thay thế các nhân tố quan trọng như nhau. Collagen không hòa tan
là một trở ngại đối với việc nghiên cứu collagen đơn thể cho đến khi tìm ra rằng
tropocollagen từ những động vật còn non có thể chiết xuất được bởi vì nó chưa đủ liên
kết chéo. Tuy nhiên những tiến bộ trong kỹ thuật kính hiển vi điện tử (EM) và kính
hiển vi năng lượng nguyên tử (AFM) và nhiễu xạ X - quang cho phép các nhà nghiên
cứu có được hình ảnh càng chi tiết về cấu trúc collagen đúng vị trí của nó. Những tiến
bộ sau này đặc biệt quan trọng để hiểu rõ hơn về cách thức mà cấu trúc collagen ảnh
hưởng tới liên kết tế bào - tế bào và tế bào – thể thông tin và bằng cách nào để các mô
được hình thành trong quá trình lớn lên và tái tạo cũng như sự thay đổi khi phát triển
hay bệnh tật. [17]

Hình 2.5. Cấu trúc bó sợi của collagen
LUẬN VĂN THẠC SỸ - CÔNG NGHỆ SINH HỌC

23

HVTH: ĐỖ CAO CƯỜNG


TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

Sợi collagen là 1 bó các sợi nhỏ. Các sợi collagen được bố trí trong các vị trí
khác nhau và có nồng độ khác nhau ở từng các mô khác nhau để tạo nên các đặc tính
riêng của từng loại mô. Trong xương, ba đường xoắn ốc xen kẽ nhau của toàn bộ

collagen đều nằm song song và sắp xếp so le. Khoảng cách 40 nm gữa hai đầu của đơn
nguyên phân tropocollagen ( xấp xỉ vùng “Gap”) phù hợp với vị trí cấu tạo hạt nhân
làm nên sự lắng đọng và đặc tính dài, cứng, khỏe của xương đó là do các tinh thể
khoáng chất Hydroxyapatite, Ca10(PO4)6(OH)2 và một số phân lân phốt phát. Theo
cách này một số loại sụn biến thành xương. Collagen loại I đem lại sức bền cho xương.
- Những amino axit trong phân tử collagen:
Trình tự và vị trí của một số axit amin đáng chú ý trong phân tử collagen.
+ Glycine (Gly) được tìm thấy ở hầu như mọi bộ 3 của các mắt xích.
+ Proline (Pro) chiếm khoảng 9% của collagen
Collagen gồm hai axit amin không cùng dẫn xuất không trực tiếp tham gia vào quá
trình chuyển đổi. Các axit amin được tìm thấy tại các khu vực cụ thể liên quan đến
glycine và bị biến đổi sau khi dịch mã bằng các enzyme khác nhau, chúng đều cần đến
vitamin c như một yếu tố đi cùng.
+ Hydroxyproline (Hyp), được tạo ra từ proline
+ Hydroxylysine (Hyl), được tạo ra từ lysine (Lys). Tùy thuộc vào các loại
collagen, quá trình Glycosy thay đổi số lượng Hydroxylysine ( chủ yếu là do nhóm
disaccharide đính vào)
2.2.3. Phân loại collagen
Collagen tồn tại ở nhiều bộ phận trong cơ thể. Đã có 29 loại collagen được tìm
thấy và thông báo trong các tài liệu khoa học. Trên 90% collagen trong cơ thể là dạng
I, II, III và IV.
• Collagen I: có trong da, gân, mạch máu, các cơ quan, xương ( thành phần chính của
xương)
Sự hình thành collagen loại I:

LUẬN VĂN THẠC SỸ - CÔNG NGHỆ SINH HỌC

24

HVTH: ĐỖ CAO CƯỜNG