BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO
TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI







TRẦN THỊ LÝ


NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ ENZYME ðỂ
SẢN XUẤT ðƯỜNG CHỨC NĂNG XYLOSE TỪ LÕI NGÔ
DÙNG TRONG CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM


LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP

Chuyên ngành:

Công nghệ Sau thu hoạch
Mã số:

60.54.10

Người hướng dẫn khoa học:
1.

PGS.TS. Nguyễn Duy Lâm
Viện Cơ điện nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch

2.

ThS. Nguyễn Tất Thắng
Viện Cơ điện nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch



HÀ NỘI – 2012
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………


i
LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các số
liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa ñược sử
dụng trong bất kỳ một nghiên cứu nào.
Tôi xin cam ñoan, mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện luận văn này ñã
ñược cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn này ñều ñã ñược chỉ
rõ nguồn gốc.


Hà Nội, ngày 30 tháng 7 năm 2012
Tác giả



Trần Thị Lý

















Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………


ii
LỜI CẢM ƠN

ðể hoàn thành ñề tài tốt nghiệp, ngoài sự cố gắng của bản thân tôi ñã
nhận ñược rất nhiều sự quan tâm giúp ñỡ nhiệt tình của thầy cô, bạn bè và
người thân.
Trước tiên, tôi xin ñược bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Nguyễn
Duy Lâm - Giám ñốc Trung tâm Nghiên cứu và Kiểm tra chất lượng nông sản
thực phẩm - Viện Cơ ñiện nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch ñã tận
tình hướng dẫn, giúp ñỡ tôi trong quá trình thực hiện ñề tài và hoàn thành
bản luận văn này.
ðồng thời, tôi xin ñược cảm ơn Th.S. Nguyễn Tất Thắng - Viện Cơ ñiện
nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch ñã nhiệt tình giúp ñỡ và tạo mọi

ñiều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình làm ñề tài.
Tôi xin ñược gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô giáo trong Khoa
Công nghệ thực phẩm, Viện ðào tạo Sau ñại học - Trường ðại học Nông nghiệp
Hà Nội.
Bên cạnh ñó tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới tất cả người thân,
bạn bè và ñồng nghiệp, những người luôn bên cạnh ñộng viên giúp ñỡ tôi
trong quá trình học tập và thực hiện bản luận văn này.

Hà Nội, ngày 30 tháng 7 năm 2012
Tác giả



Trần Thị Lý

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………


iii
MỤC LỤC
PHẦN I. MỞ ðẦU 1
1.1. Đặt vấn đề

1
1.2. Mục đích và yêu cầu của đề tài

2
1.2.1. Mục đích của đề tài

3

1.2.2. Yêu cầu của đề tài

3
PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

4
2.1. Giới thiệu chung về đường xylose

4
2.1.1. Đặc điểm của đường xylose

4
2.1.2. Các phương pháp sản xuất đường xylose …………………………

6
2.1.3. Ứng dụng của ñường xylose ……………………………………
10

2.2. Enzyme xylanase

12

2.2.1. Cấu tạo và cơ chế xúc tác của enzyme xylanase …………………

12

2.2.2. Nguồn enzyme xylanase ……………………………………………

14


2.2.3. Ứng dụng thực tiễn của xylanase …………………………………

16

2.3. Lõi ngô - nguồn xylan ………………………………………………

19

2.4. Tình hình nghiên cứu và sản xuất đường xylose trên thế giới và ở
Việt Nam ……………………………………………………………

22

2.4.1. Tình hình nghiên cứu và sản xuất đường xylose trên thế giới…… 22

2.4.2. Tình hình nghiên cứu và sản xuất đường xylose ở Việt Nam

24

PHẦN III. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU
26

3.1. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu…………………………………

26

3.1.1. Đối tượng và vật liệu ……………………………………………

26


3.1.2. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất …………………………………

26

3.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu …………………………………

27

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………


iv
3.3. Nội dung nghiên cứu …………………………….………………

27

3.4. Phương pháp bố trí thí nghiệm………………………………………

28

3.4.1. Sơ đồ qui trình xuất đường xylose từ lõi ngô…………………

28

3.4.2. Bố trí các thí nghiệm xác định các thông số công nghệ trong xử lý
nguyên liệu lõi ngô………………………………………………………


30


3.4.3. Bố trí thí nghiệm xác định các thông số quá trình thủy phân dịch
chứa xylan thành đường xylose bằng enzyme xylanase……
31

3.4.4. Bố trí thí nghiệm xác định một số thông số công nghệ của quá trình
tách chiết, làm sạch và thu hồi đường xylose quy mô phòng thí nghiệm
32


3.5. Phương pháp phân tích ……………………………………………….

33

3.5.1. Các phương pháp vật lý …………………………………………….

33

3.5.2. Phương pháp phân tích chỉ tiêu hóa học …………………………
34

3.5.3. Phương pháp đánh giá cảm quan…………………………………
36

3.5.4. Phương pháp xử lý số liệu………………………………………

36

PHẦN IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ……………………………


37

4.1. Xác định các thông số công nghệ trong xử lý nguyên liệu lõi ngô …
37

4.1.1. Lựa chọn dung môi xử lý …………………………………………
37

4.1.2. Xác định tỷ lệ nguyên liệu/dung môi thích hợp trong xử lý lõi ngô
38

4.1.3. Xác định nhiệt độ thủy phân axit thích hợp trong xử lý lõi ngô……
40

4.1.4. Xác định thời gian thủy phân axit thích hợp trong xử lý lõi ngô…
42

4.2. Xác định các thông số của quá trình thủy phân dịch xylan thành
đường xylose bằng enzyme xylanase ……………………………………


43

4.2.1. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme xylanase đến hiệu quả thủy phân
xylan ………………………………………………………………………

43

4.2.2. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hiệu quả thủy phân xylan … 45


4.2.3. Ảnh hưởng của thời gian thuỷ phân đến hiệu quả thủy phân xylan

47

4.2.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu quả thủy phân xylan ……………

49

4.2.5. Ảnh hưởng của pH đến hiệu quả thủy phân xylan ………………… 51

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………


v
4.3. Nghiên cứu công nghệ tách chiết, làm sạch và thu hồi đường xylose
quy mô thí nghiệm ………………………………………………………


52

4.3.1. Ảnh hưởng của tỷ lệ than hoạt tính đến hiệu quả tinh sạch dịch
đường sau thủy phân ……………………………………………………

52

4.3.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ tinh thể đường xylose bổ sung để làm mồi đến
quá trình kết tinh thu hồi đường xylose ………………………………….

54


4.3.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ tới quá trình sấy khô đường … 56

4.4. Đánh giá chất lượng của đường xylose thành phẩm và đưa ra quy
trình sản xuất xylose từ lõi ngô …………………………………………

57

PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ …………………………………

60

5.1. Kết luận ………………………….………………………………… 60

5.2. Đề nghị ………………………….…………………………………… 60

TÀI LIỆU THAM KHẢO ………………………….………………… 61

PHỤ LỤC ………………………….…………………………………

66












Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………


vi
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.6. Khả năng sinh enzyme xylanase trên phế phụ phẩm nông
nghiệp của một số chủng Aspergillus


16

Bảng 2.7. Tình hình sản xuất ngô Việt Nam …………………………
20

Bảng 2.8. Thành phần các hợp chất của lõi ngô

22

Bảng 2.9. Thành phần hemicellulose trong sinh khối thực vật 20

Bảng 2.10. Lượng sản xuất và giá cả các loại đường trên thế giới 23

Bảng 4.1. Hiệu quả thủy phân nguyên liệu lõi ngô bằng axit 37

Bảng 4.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu trên dung môi tới hiệu quả
xử lý lõi ngô

39


Bảng 4.3. Ảnh hư
ởng của nhiệt độ thủy phân axit tới hiệu quả xử lý
lõi ngô


41

Bảng 4.4. Ảnh hưởng thời gian thủy phân axit tới hiệu quả xử lý lõi ngô.

42

Bảng 4.5. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme xylanase đến hiệu quả thủy
phân dịch xylan lõi ngô

44

Bảng 4.6. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hiệu quả thủy phân dịch
xylan lõi ngô


46

Bảng 4.7. Ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến hiệu quả thủy phân
dịch xylan lõi ngô


48

Bảng 4.8. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu quả thủy phân xylan …… 50


Bảng 4.9. Ảnh hưởng của pH đến hiệu quả thủy phân xylan ……………

52

B
ảng 4.10. Ảnh h
ư
ởng của tỷ lệ than hoạt tính đến hiệu quả tinh sạch
53

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………


vii
dịch đường sau thủy phân
Bảng 4.11. Ảnh hưởng của tỷ lệ mầm tinh thể đường xylose bổ sung để
làm mồi đến hiệu suất kết tinh

55

Bảng 4.12. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới quá trình sấy khô đường 56

Bảng 4.13. Thành phần của đường xylose sản xuất

57




Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………



viii
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 2.1. Công thức cấu tạo của đường xylose

4
Hình 2.2. Công thức cấu tạo của Xylan

5
Hình 2.3. Công thức cấu tạo hóa học của một số loại xylan

6
Hình 2.4. Ứng dụng chính của đường Xylose

11

Hình 2.5. Tác ñộng của các loại enzyme xylanase lên mạch xylan ……
14



DANH MỤC CÁC SƠ ðỒ
Sơ đồ 3.1. Quy trình dự kiến sản xuất đường xylose bằng enzyme
xylanase ………………………………………………………………….


29

Sơ đồ 4.14. Quy trình công nghệ sản xuất đường xylose từ lõi ngô……


58



Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………


ix
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt Chữ viết thường
CNTP
g
l
ml
mg
Xyl
FOS
XOS
DNS

Công nghiệp thực phẩm
gam
lit
mililit
miligam
Xylose
Fructooligosaccharide
Xylooligosaccharide
Dinitro Salicylic



Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………


1
PHẦN I. MỞ ðẦU
1.1. ðặt vấn ñề
Thực phẩm chức năng là loại thực phẩm được chế biến từ các nguyên
liệu tự nhiên như các nguồn thực vật và động vật giàu hoạt chất sinh học.
Thực phẩm chức năng giúp cho con người duy trì và tăng cường sức khỏe,
kéo dài tuổi thọ, phòng và chữa được nhiều bệnh hiểm nghèo. Trong các
nhóm thực phẩm chức năng thì đường chức năng là một bộ phận quan trọng,
được tập trung nghiên cứu nhiều trong những năm gần đây do có các đặc tính
sinh học có lợi cho sức khỏe như phòng chống bệnh tiểu đường, không gây
béo phì, có khả năng kích thích hoạt động của hệ tiêu hóa… Các loại đường
chức năng phổ biến hiện có là đường xylooligosaccharide, panatinose,
maltitol, fructooligosaccharide, xylose, lactitol, galactooligosaccharide. Trong
số đó, đường xylose đang có xu hướng gia tăng ở nhiều quốc gia trên thế giới
với các ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm và dược phẩm như
làm chất phụ gia thực phẩm, bổ sung vào các loại đồ uống dinh dưỡng, làm
nguyên liệu đầu của thuốc tổng hợp điều trị bệnh ung thư, phòng chống một
số bệnh (tiểu đường, mất ngủ, đường ruột,…).
Xylose là một đường năm cacbon có công thức phân tử C
5
H
10
0
5
còn

được gọi là “đường gỗ” vì có mặt trong nhiều loại gỗ. Xylose là thành phần
chủ yếu của đường pentose - một trong hai nhóm đường chính thu được khi
thủy phân hemicellulose trong nguyên liệu gỗ và các chất thải xơ nông nghiệp
như rơm lúa mỳ, lúa nước, thân và lõi ngô. Khi thuỷ phân rơm rạ thu được
khoảng 18% pentose và 26,8% hexose [4]. Chính vì vậy, hiện nay trên thế
giới đã có nhiều công trình nghiên cứu sản xuất đường xylose bằng cách lên
men các nguyên liệu giàu xylan như các chất thải nông nghiệp. Với phương
pháp này, xylose được sản xuất từ các nguyên liệu giàu xylan. Các nguyên
liệu này trước hết được thủy phân axit để tạo thành dịch chứa xylan. Sau đó,
dùng các vi sinh vật sử dụng xylan làm nguồn cacbon để lên men tạo dịch
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………


2
thủy phân enzyme chứa xylose [16]. Đường xylose được thu hồi trong một số
ần công đoạn tiếp theo rồi thường được sấy phun. Sản xuất xylose theo
phương pháp thủy phân enzyme nhờ vi sinh vật có nhiều ưu điểm so với
phương pháp sản xuất hóa học.
Việc nghiên cứu sản xuất đường xylose ở Việt Nam còn rất mới mẻ và
chưa có nhiều kết quả được công bố. Trong khi nước ta là một nước nông
nghiệp rất phong phú nguồn tài nguyên chất thải xơ, trong đó có lõi ngô. Hầu
hết các chất thải nông nghiệp đều chưa được khai thác hoặc khai thác chưa
hợp lý dẫn tới lãng phí tài nguyên và gây ô nhiễm môi trường. Nếu sử dụng
lõi ngô làm nguyên liệu để sản xuất được đường xylose thì sẽ mang lại tác
động kép vì không những tạo ra sản phẩm mới có giá trị mà còn hỗ trợ giảm
thiểu ô nhiễm môi trường do phải thải hoặc đốt.
Theo hướng này, năm 2009 nhóm nghiên cứu Nguyễn Tất Thắng và
cộng sự tại Viện Cơ điện nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch đã tiến
hành nghiên cứu thăm dò với trọng tâm là tuyển chọn chủng giống vi sinh vật
có khả năng sinh tổng hợp enzyme cao [4]. Kết quả của nhóm đã tuyển chọn

được chủng Aspergillus niger DL1 cho hiệu suất chuyển hóa xylan thành
đường xylose đạt 70,38% [4]. Từ năm 2011, nhóm tác giả của Viện đang có
những nghiên cứu sâu rộng trong khuôn khổ thực hiện đề tài cấp Nhà nước
với mục tiêu xây dựng được qui trình công nghệ sản xuất đường xylose từ lõi
ngô bằng phương pháp của công nghệ sinh học.
Được sự đồng ý của Viện Cơ điện nông nghiệp và Công nghệ sau thu
hoạch cho tham gia thực hiện một phần đề tài nêu trên, chúng tôi đã tiến hành
nghiên cứu với chủ đề “Nghiên cứu ứng dụng công nghệ enzyme ñể sản
xuất ñường chức năng xylose từ lõi ngô dùng trong công nghiệp thực
phẩm”
1.2. Mục ñích và yêu cầu của nghiên cứu
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………


3
1.2.1. Mục ñích của nghiên cứu
Xác định được các thông số cơ bản của các công đoạn chính trong quy
trình sản xuất đường xylose từ lõi ngô bằng phương pháp thủy phân enzyme
dùng trong công nghiệp thực phẩm.
1.2.2. Yêu cầu của nghiên cứu
- Xác định các điều kiện xử lý nguyên liệu tạo dịch xylan;
- Xác định các điều kiện thủy phân dịch xylan bằng enzyme xylanase;
- Xác định một số thông số công nghệ của quá trình thu hồi và làm sạch
đường xylose quy mô phòng thí nghiệm;
- Đánh giá chất lượng của đường xylose thành phẩm và đưa ra quy
trình sản xuất xylose từ lõi ngô.













Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………


4

PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Giới thiệu chung về ñường xylose
2.1.1. ðặc ñiểm của ñường xylose
Xylose là một đường 5 cacbon, có công thức phân tử là C
5
H
10
O
5
.
Xylose còn có tên gọi là “đường gỗ”, là đường có mặt trong nhiều loại gỗ.
Khi thủy phân hemicellulose trong thân lúa mì người ta thu được 31% xylose,
59% glucose và khoảng vài phần trăm các đường khác (arabinose, galactose,
mannose…). Khi thuỷ phân rơm rạ thu được khoảng 18% pentose và 26,8%
hexose [1]. Công thức cấu tạo của đường xylose được thể hiện ở hình 2.1.

Hình 2.1. Công thức cấu tạo của ñường xylose

Xylose là thành phần chủ yếu thuộc đường pentose, cùng với glucose là
hai nhóm đường chính thu được khi thủy phân hemicellulose trong nguyên liệu
gỗ và chất thải nông nghiệp. Khi thủy phân hemicellulose bằng axit có thể giải
phóng ra nhiều loại đường khác nhau ngoài đường xylose như D - galactose, D -
glucose, D - mannose và L - arabinose. Kèm theo đó còn là các sản phẩm thủy
phân khác như fucfural, 5 - hydroxymethyl fucfural, axit acetic, axit syringic
[32].
Khi một chuỗi các nhóm xylose liên kết với nhau qua liên kết β - (1 - 4)
glycoside và phân nhánh bởi các chuỗi carbonhydrate ngắn như axit D -
glucuronic hoặc đồng phân của nó 4 - O - methylether, α - arabinose hoặc các
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………


5
Oligosaccharide tạo thành từ D - xylose, L - arabinose, D - hay L - galactose
và D - glucose sẽ tạo thành xylan.
Cấu tạo của xylan được thể hiện qua hình 2.2.

Hình 2.2. Công thức cấu tạo của xylan
Thành tế bào thực vật là một vật liệu phức tạp trong đó cellulose chiếm
35-50%, hemicellulose chiếm 20-30%. Xylan là thành phần chính cấu tạo nên
hemicellulose. Xylan được tìm thấy chủ yếu trong cấu trúc thứ cấp của thành
tế bào thực vật và tạo thành pha giữa giữa lignin và các hợp chất
polysaccharide khác [28].
Xylan gồm nhiều loại khác nhau, có thể được chia thành homoxylan và
heteroxylan bao gồm: glucuronoxylan, (arabino) glucuronoxylan, (glucurono)
arabinoxylan, arabinoxylan và tổ hợp heteroxylan. Homoxylan có cấu tạo bao
gồm các xylopyranose được liên kết với nhau bởi liên kết β - (1 - 3) glycoside
hoặc hỗn hợp β - (1 - 3, 1 - 4) glycoside. Cấu tạo kiểu homoxylan được tìm
thấy trong tảo biển Palmariales và Nemaliales. Heteroxylan có cấu tạo là các

mạng lưới β - (1 - 4) - D xylopyranose gắn với chuỗi mono và oligoglycosy.
Heteroxylan có mặt ở trong các loại ngũ cốc, hạt cây, mủ và nhựa cây.
Xylan đa dạng về cấu trúc và khối lượng phân tử. Trong tự nhiên,
chúng được thay thế một phần bằng acetyl 4 - 0 - methyl - d - glucuronosyl và
arabinofuranosyl tạo thành cấu trúc polymer không đồng nhất. Việc tách chiết
xylan từ các nguyên liệu trong tự nhiên không thể tránh khỏi những biến đổi
về cầu trúc vì vậy tác động của xylan về mặt cấu trúc vẫn chưa được xác định
rõ ràng [6].
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………


6
Vi sinh vật tham gia tích cực vào việc phân hủy xylan, đặc biệt là vi
sinh vật tiết ra enzyme xylanase [16].

a) Heteroxylan

b) (4 - O - Methyl - α - D - glucurono) - D - Xylan
Hình 2.3. Công thức cấu tạo hóa học của một số loại xylan
2.1.2. Các phương pháp sản xuất ñường xylose
Có hai phương pháp chủ yếu để sản xuất đường xylose là phương pháp
hóa học và phương pháp lên men nhờ vi sinh vật [1,4].
2.1.2.1. Sản xuất xylose bằng phương pháp hoá học
Sản xuất xylose bằng phương pháp hoá học dựa trên quá trình hydro
hóa dịch thủy phân hemicellulose (chứa thành phần chủ yếu là xylan) thành
xylose. Trong quá trình hydro hoá có khoảng 60% lượng xylan ban đầu
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………


7

chuyển thành xylose. Sau phản ứng dịch hydro hóa được kết tinh để thu hồi
đường xylose. Phương pháp này có ưu điểm là hiệu suất thuỷ phân cao, ít yêu
cầu về công nghệ nhưng có nhược điểm là gây hao mòn thiết bị, tạo sản phẩm
có độ tinh khiết thấp và không an toàn cho người sử dụng nếu chưa xử lý hết
lượng acid dùng để thuỷ phân, gây ô nhiễm môi trường bởi lượng acid thải ra.
Các nghiên cứu trước đây đưa ra quy trình sản xuất đường xylose từ
nguyên liệu lignocellulose có chứa hemicellulose, quy trình bao gồm các
bước như sau:
- Thủy phân lignocellulose với nước để tạo ra phần hoà tan và phần
không hoà tan. Phần hoà tan có chứa đường xylose, phần không hoà tan có
chứa lignin và cellulose.
- Tách phần không tan từ dịch thuỷ phân.
- Xử lý phần hoà tan có chứa đường xylose để dịch chuyển các chất
hữu cơ và các ion ra ngoài.
- Tập trung phần có chứa đường xylose thành dạng sirô có chứa 20% -
40% nước.
- Trộn sirô với ethanol để tạo thành dạng ethanolic hòa tan và kết tinh
đường xylose từ dạng ethanolic hòa tan.
Trong sản xuất xylose từ nguyên liệu lignocellulose quy mô thương
mại, vấn đề quan trọng là phải giảm thiểu tối đa lượng xylose bị mất đi khi
tách xylose ra khỏi sản phẩm sau thủy phân. Quy trình sản xuất đường xylose
từ nguyên liệu lignocellulose quy mô thương mại gồm các bước như sau:
Bước 1: Thủy phân nguyên liệu bằng dung dịch axit để tạo ra hai phần.
Phần hoà tan chứa xylose và phần không hòa tan chứa lignin và cellulose.
Dung dịch axit nên được sử dụng ở nồng độ 0,5 - 5%. Có thể sử dụng axit vô
cơ (như axit H
2
SO
4
, HCl hoặc H

3
PO
4
) hoặc axit hữu cơ (như acetic hoặc
trifluoracetic). Trong quá trình thủy phân hỗn hợp phản ứng được duy trì ở
nhiệt độ từ 70 - 270
o
C. Thời gian thủy phân từ 2 phút đến 2 giờ. Quá trình
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………


8
thủy phân được tiến hành trong sự kết hợp của cả 3 yếu tố: nhiệt độ, nồng độ
axit và thời gian.
Bước 2: Tách phần không hòa tan.
Bước 3: Xử lý phần dung dịch xylose để loại bỏ những hợp chất hữu cơ
(gồm protein, lipit và chất màu). Các hợp chất này được loại bỏ bằng phương
pháp xử lý với thuốc thử (như than hoạt tính hoặc chất hấp phụ polymer).
Những tạp chất ion chủ yếu là axit sử dụng ở bước 1 được loại bỏ bằng thiết
bị điện phân, sau đó được cho qua thiết bị có chứa nhựa trao đổi ion.
Bước 4: Dung dịch xylose được cô đặc thành dạng siro có hàm lượng
nước dao động từ 20 - 40 % về khối lượng. Cô đặc xylose ở hàm lượng vừa
đủ để xylose có thể kết tinh khi nó được trộn với ethanol ở bước 5. Điều kiện
cô đặc thích hợp nhất là sử dụng quá trình bay hơi bằng thiết bị bay hơi có
màng hay quay. Siro thu được sau bước 4 này đem bảo quản và sử dụng cho
bước 5.
Bước 5: Trộn siro với ethanol để tạo dung dịch hòa tan và kết tinh
đường xylose từ dạng ethanolic hòa tan. Tiến hành kết tinh ở điều kiện nhiệt
độ thường. Bổ sung ethanol ở nồng độ không quá 2 lần ethanol so với lượng
dịch (nên chọn lượng ethanol bằng lượng dịch siro). Hỗn hợp ethanol và siro

được giữ trong thời gian 10 - 18 giờ, thỉnh thoảng lắc để xylose kết tinh.
Phản ứng thủy phân ở bước 1 có thể được tiến hành ở dạng liên tục
hoặc gián đoạn. Sự có mặt của những oligosaccharide có thể ảnh hưởng đến
quá trình kết tinh của xylose. Chính vì vậy, dịch thuỷ phân cần phải loại bỏ
hoặc khử bớt lượng oligosaccharide có trong dịch bằng cách gia nhiệt dịch
xylose đến nhiệt độ 50 - 150
o
C duy trì trong khoảng 2 phút đến 2 giờ có bổ
dung axit ở nồng độ 0,5 - 5%. Tinh thể xylose được sản xuất ra từ bước 5
được rửa sạch bằng dung dịch ethanol có nồng độ 90% để nâng cao độ tinh
sạch và đáp ứng tiêu chuẩn chế biến tốt hơn.
2.1.2.2. Sản xuất ñường xylose bằng phương pháp lên men nhờ vi sinh vật
a) Sản xuất xylose bằng phương pháp lên men nhờ vi sinh
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………


9
Với phương pháp sản xuất xylose bằng phương pháp lên men nhờ vi sinh
vật xylose được sản xuất từ các nguyên liệu giàu xylan. Nguyên liệu trước hết
được thủy phân để tạo thành dung dịch chứa xylan. Sau đó các vi sinh vật sử
dụng xylan làm nguồn cacbon để lên men dịch thủy phân [32]. Đường xylose
được thu hồi bằng phương pháp cô quay chân không và sấy phun. Sản xuất
xylose theo phương pháp lên men xylan nhờ vi sinh vật có nhiều ưu điểm hơn
so với phương pháp hóa học như tạo ra sản phẩm an toàn hơn, không gây ô
nhiễm môi trường hay làm hao mòn thiết bị. Phương pháp này có nhược điểm
là công nghệ yêu cầu cao hơn, hiệu suất thuỷ phân thấp hơn so với phương
pháp hoá học. Việc thu nhận và tinh sạch đường xylose gặp nhiều khó khăn
do dịch lên men ngoài đường xylose còn lẫn rất nhiều tạp chất như đạm, muối
vô cơ, acid amin. Đường xylose lại dễ tạo phản ứng Maillard với axit amin
tạo sản phẩm có màu sẫm.

Haltrich cùng các cộng sự đã chỉ ra một số vi sinh vật có thể sử dụng để
lên men xylan bao gồm vi khuẩn, nấm men, nấm mốc như Aspergillus,
Trichoderma, Bacillus, Cryptococcus, Penicillium, Aureobasidium, Fusa-
rium, Chaetomium, Phanerochaete, Rhizomucor, Humicola, Talaromyces
[32]. Các loại vi sinh vật này có khả năng sinh enzyme xylanase vào môi
trường lên men có chứa nhiều xylan. Hiện nay đã có khá nhiều nghiên cứu về
các chủng vi sinh vật trên trong đó các nghiên cứu tập chung chủ yếu vào sử
dụng nấm mốc Aspergillus nige để lên men xylan [29]. Pang Pei Kheng và
cộng sự đã sử dụng phần mềm của thực vật ngọt làm chất nền để phân lập và
tuyển chọn được chủng nấm mốc Aspergillus niger USA AI 1. Sau đó sử
dụng chủng nấm mốc này để lên men xylan. Theo Pang Pei Kheng, sử dụng
Aspergillus niger để lên men không những nâng cao được năng suất, hiệu quả
lên men mà còn tận dụng được các phế phụ phẩm của ngành nông nghiệp như
lõi ngô, bã mía, rơm rạ [34].
b) Sản xuất xylose bằng phương pháp enzyme
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………


10
Phương pháp sản xuất đường xylose bằng enzyme tách riêng hai quá
trình là tổng hợp và thu nhận enzyme qua lên men. Sau đó dùng enzyme để
thuỷ phân dịch xylan thành đường xylose. Với phương pháp này ta có thể
khắc phục được nhược điểm của phương pháp sản xuất đường xylose nhờ vi
sinh vật.
Xylanase là enzyme thủy phân xylan nó có thể được tách chiết, thu hồi
từ vi khuẩn (Clostridium, Cellulomonas, Bacillus và Thermonospora…) hoặc
nấm (Trichoderma, Aspergillus, Schizophyllum và Penicillium…). Tuy nhiên,
do phát triển trong điều kiện yếm khí nên enzyme xylanase do vi khuẩn sinh
ra thường có hàm lượng và hoạt tính thấp hơn enzyme xylanase sinh ra bởi
nấm mốc. Hiện nay người ta thường sử dụng enzyme xylanase sinh ra từ các

chủng mấm mốc để sản xuất đường xylose [28].
Năm 1986 Allenza và cộng sự đã nghiên cứu sản xuất xylose bằng
enzyme xylanase sinh ra từ chủng Aureobasidium plll/ulam Y-2JII·1 trên hai
dạng enzyme xylanase cố định và tự do ở nhiệt độ 40
o
C, pH =4,5 - 4,75 [30].
Kết quả nghiên cứu cho thấy khả năng thủy phân xylan thành xylose ở cả hai
dạng là gần như nhau (0,16% khối lượng đối với xylanase ở dạng tự do và
0,21% khối lượng đối với xylanase ở dạng cố định). Hoạt tính enzyme ở dạng
tự do sau 16 giờ còn 54% trong khi hoạt tính của xylanase dạng cố định chỉ
còn 47% sau 16 giờ.
Năm 2009 Goldman nghiên cứu quá trình thủy phân xylan thành đường
xylose bằng enzyme xylanase [29]. Kết quả nghiên cứu cho thấy enzyme
xylanase từ các chủng nấm mốc khác nhau ảnh hưởng khác nhau đến khả
năng thuỷ phân xylan. Enzyme xylanase sinh ra bởi chủng Aspergillus niger
AN-1.15, sau 5 giờ có 70% saccharide chuyển thành xylan. Enzyme xylanase
sinh ra bởi chủng Thermobifida fusca sau 30 phút ở 70
o
C chuyển hóa được
10% xylan. Enzyme xylanase sinh ra bởi chủng Trichoderma sp. K930 chỉ có
1,4% saccharide chuyển thành xylan [29].
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………


11
2.1.3. Ứng dụng của ñường xylose
Xylose là một loại đường tự nhiên có nhiều ứng dụng trong thực tế.
Hiện nay, xylose đã và đang được sử dụng rộng rãi trong nhiều loại sản phẩm
khác nhau ở nhiều quốc gia trên thế giới. Phạm vi ứng dụng của xylose chủ
yếu thuộc về hai lĩnh vực chính là công nghiệp thực phẩm và dược phẩm [13].

Những ứng dụng chính của đường xylose được thể hiện ở hình 2.4.

Hình 2.4. Ứng dụng chính của ñường Xylose
2.1.3.1. Trong công nghiệp thực phẩm
Xylose được sử dụng để sản xuất bánh kẹo, dùng làm chất phụ gia thực
phẩm và là sản phẩm được bổ sung vào các loại đồ uống. Nhờ xylose có độ
ngọt tương đương với đường sucrose (Vị ngọt của đường xylose tương ứng
khoảng 67% so với đường sucrose) và do đặc điểm mất nhiệt khi hoà tan nên
tạo cảm giác mát lạnh trong miệng. Đặc tính này làm cho xylose rất hấp dẫn
trong một số sản phẩm thực phẩm, đặc biệt là đồ uống. Xylose còn được sử
dụng làm tăng hương vị trong chế biến một số sản phẩm cao cấp như: trong
Xylose
Công nghiệp thực phẩm Dược phẩm
- Thành phần của các thực
phẩm chức năng: sử dụng
cho người bệnh tiểu đường,
người béo phì,…
- Phụ gia thực phẩm: tạo
hương vị, tạo màu trong chế
biến một số thực phẩm,…
- Nguyên liệu đầu cho các
loại thuốc điều trị ung thư,
AIDS, bệnh tiểu đường, béo
phì,…
- Nguyên liệu cho sản xuất
đường xylitol: dùng cho
người mắc bệnh tiểu đường,
viêm loét dạ dày,…
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………



12
chế biến thịt quay, bánh mì…. Vì xylose là một nguồn saccharide lý tưởng
cho các phản ứng Maillard để sản xuất các chất tăng cường hương vị với thời
gian phản ứng ngắn hơn so với các đường 6 cacbon khác [11].
2.1.3.2. Trong lĩnh vực y dược
Không giống như đường glucose và fructose, đường xylose là nguồn
năng lượng lý tưởng để sản xuất nước uống giàu năng lượng không gây cao
đường huyết. Xylose bị hấp thu rất ít ở ruột non, đến ruột già xylose bị hấp
thu vào tế bào của vi sinh vật đường ruột. Tại ruột già xảy ra phản ứng lên
men lên sinh ra axit hữu cơ khiến pH hạ thấp ức chế nhóm vi khuẩn có hại,
kích thích vi khuẩn có lợi Bifidobacteria phát triển giúp cải thiện hệ tiêu hoá
của con người, giảm huyết áp, lipid và cholesterol trong máu [11].
2.2. Enzyme xylanase
2.2.1. Cấu tạo và cơ chế xúc tác của enzyme xylanase
2.2.1.1. Cấu tạo của enzyme xylanase
Các xylanase có cấu tạo gồm nhiều chuỗi polypeptide xoắn lại với nhau
tạo cấu trúc bậc 2 và tiếp tục cuộn xoắn trong không gian để tạo thành cấu
trúc bậc 3. Các chuỗi có cấu trúc bậc 3 kết hợp với nhau tạo cấu trúc bậc 4
[31]. Ở mức phân tử protein, xylanase gồm vùng chức năng, vùng không chức
năng và vùng nối. Vùng nối thường có nhiều amino axit, hydroxyl được
glycosyl hóa ở vị trí O. Sự glycosyl hóa này giúp chúng không bị enzyme
protease phân cắt. Vùng chức năng được chia thành vùng xúc tác và vùng
bám cơ chất, hai vùng này có thể tách biệt nhau về cấu trúc hoặc không. Tính
chất của xylanase có mối tương quan rất lớn đến các gốc hydro liên kết với
các xylanase. Nếu xylanase có tính bazơ thì amino axit là asparagines,
xylanase có tính axit thì amino axit là aspartic [28].
2.2.1.2. Cơ chế xúc tác của enzyme xylanase
Cơ chế hoạt động của xylanase bao gồm các bước sau [6, 29]:
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………



13
Bước 1: Enzyme xylanase nhận mặt xylan và liên kết với nó bằng cách
thay đổi cấu hình ở phần cánh trái cuộn xoắn lại 3 lần.
Bước 2: Gốc xylosyl ở vị trí thứ nhất bị vặn méo và hút về phía gốc xúc
tác, liên kết glycoside bị kéo căng và bị bẻ gãy và tạo thành dạng trung gian
đồng hóa trị enzyme-cơ chất.
Bước 3: Dạng trung gian bị tấn công bởi một phân tử nước hoạt động.
Phân tử nước này tách thành ion H
+
và OH
-
. Ion H
+
gắn vào gốc glycosyl vừa
được tách ra trong khi ion OH
-
gắn vào đầu khử của mạch xylan vừa tạo ra
theo cơ chế thủy phân glycosyl, nhờ đó sản phẩm được giải phóng, đồng thời
enzyme tiếp tục xúc tác cho phản ứng khác.
Sơ đồ tóm tắt của quá trình như sau:
Xylanase + xylan xylan-xylanase xylanase + sản phẩm
Đầu tiên cơ chất xylan xoắn ốc được đặt vào vị trí đối diện với khe giữ
Tyr 65 và Tyr 69. Axit glutamic 172 là chất xúc tác axit/bazơ và axit
Glutamic 78 là chất cho điện tử (nucleophile). Cơ chất bám vào vị trí
Glutamic 78 tạo thành dạng sản phẩm trung gian và được giữ vững trong suốt
quá trình phản ứng chuyển glycosylate. Một phân tử nước thay thế vị trí của
chất cho điện tử (nucleophile). Có sự phân tách và phân tán các đường
(xylobiose) cho phép enzyme di chuyển đến một vị trí mới trên cơ chất [2].

2.2.1.3. Enzyme xylanase và sự thuỷ phân xylan
Thủy phân xylan bằng enzyme là quá trình để phá vỡ chuỗi xylan thu
được từ quá trình tiền xử lý lõi ngô thành các phân tử đường xylose bằng tác
dụng của các enzyme thủy phân. Quá trình này còn được gọi là quá trình
đường hóa. Xylan có cấu tạo phức tạp và nguồn xylan phong phú nên các
enzyme xylanase có cấu tạo cũng rất phức tạp. Mỗi loại vi sinh vật khác nhau
sẽ thu được sẽ khác nhau. Hầu hết enzyme xylanase từ các chủng vi sinh vật
đều chứa trên một hoạt tính. Để phân giải xylan thành xylose cần tác dụng
đồng thời của 2 loại enzyme chính bao gồm: endoxylanase (còn được gọi là β-
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………


14
1,4-xylanase, β-D-xylanase hay Endo-1,4-β-D-xylanase) và β-xylosidase.
Endo-xylanase thường cắt mạch chính của xylan ở những điểm bất kỳ tại giữa
mạch và giải phóng olygoxylose. Sau đó, β-xylosidase cắt các đoạn
olygoxylose để giải phóng đường đơn xylose. Ngoài ra còn cần thêm các loại
enzyme để phân cắt đường chuỗi bên như α-L-arabinofuranosidase, α-
glucuronidase…[28]. Nguyên tắc các enzyme thuỷ phân mạch xylan được mô
tả trong hình 2.5.

Hình 2.5. Tác ñộng của các loại enzyme xylanase lên mạch xylan
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………


15
2.2.2. Nguồn enzyme xylanase
Trong thời gian gần đây việc nghiên cứu sản xuất enzyme xylanase đã
thu hút được sự quan tâm của nhiều nhà khoa học, trong đó các công trình
nghiên cứu sản xuất enzyme xylanase chủ yếu từ vi sinh vật như nấm và vi

khuẩn [6].
Enzyme xylanase từ vi khuẩn: Là một trong số rất nhiều enzyme
xylanase được nghiên cứu và ứng dụng trong công nghiệp. Trong số đó, chi
Bacillus và Streptomyces là hai chi sản sinh enzyme xylanase khá phổ biến đã
được công bố và sử dụng rộng rãi. Xylanase của các họ vi khuẩn thường hoạt
động tối ưu ở pH từ 5,0 - 8,0, ở nhiệt độ 50 - 80
o
C. Nakamura và cộng sự khi
nghiên cứu enzyme xylanase của Bacillus sp. 41-1 cho thấy chúng hoạt động
tốt ở nhiệt độ 50
o
C [28].
Enzyme xylanase từ nấm: Enzyme xylanase được sản xuất từ nấm đặc
biệt là các loại nấm sợi được ứng dụng rất nhiều trong công nghiệp. Khả năng
sinh enzyme xylanase của nấm sợi cao hơn nhiều so với khả năng sinh
enzyme xylanase của vi khuẩn và nấm men. Ngoài ra, nấm sợi thường sản
sinh một hệ enzyme phân giải xylan bao gồm endoxylanase, β-xylosidase và
các enzyme phân cắt nhóm thế khác. Các enzyme xylanase của nấm sợi
thường là các enzyme ngoại bào. Với những ưu thế về khả năng sinh enzyme
xylanase như vậy nên hiện nay trên thị trường các chế phẩm enzyme xylanase
chủ yếu sản xuất từ nấm sợi. Đặc tính chung của đa số các xylanase từ nấm là
hoạt động hiệu quả nhất ở nhiệt độ 35 - 50
o
C, pH 3,0 - 5,5 và bền ở dải pH từ
4,0 - 8,0 [40].
Trong số các chi nấm sợi thì các chi Aspergillus và Trichoderma là hai
chi sinh enzyme xylanase được nghiên cứu nhiều nhất. Đặc biệt Aspergillus là
một chi nấm sợi có ý nghĩa công nghiệp cao do có khả năng sinh nhiều loại
enzyme thủy phân ngoại bào. Chính vì khả năng sinh đồng thời nhiều loại
enzyme thủy phân ngoại bào nên đa số các loài của các chi nấm này đều có

khả năng sinh ra nhiều enzyme xylanase trên các cơ chất tự nhiên, phế phụ