NUÔI CẤY BAO PHẤN TẠO CÂY ĐƠN BỘI VÀ ĐƠN BỘI KÉP
Tóm tắt
Cây đơn bội là cây có số lượng nhiễm sắc thể thể giao tử và các cây đơn bội kép
là các cây đơn bội đã bị trùng lặp nhiễm sắc thể. Việc tạo ra cây đơn bội và đơn bội
kép thông qua sự phát sinh phôi giao tử cho phép tạo ra các dòng đồng hợp tử hoàn
toàn từ cha mẹ dị hợp tử, rút ngắn thời gian cần thiết để tạo ra các cây đồng hợp so
với các phương pháp nhân giống thông thường sử dụng nhiều thế hệ tự thụ. Việc sản
xuất cây đơn bội và cây đơn bội kép (DHs) cung cấp một công cụ công nghệ sinh học
hấp dẫn đặc biệt và việc phát triển các công nghệ và quy trình nhân giống để sản xuất
các cây đồng hợp đã có tác động đáng kể đến các hệ thống nông nghiệp. Ngày nay,
công nghệ sinh học đại diện cho một phần của các chương trình nhân giống của nhiều
cây trồng quan trọng trong nông nghiệp. Có một số phương pháp có sẵn để có được
cây đơn bội và đơn bội kép (DHs) trong đó nuôi cấy invitro hoặc là hiệu quả nhất và
được sử dụng rộng rãi. Bài báo này đề cập đến tình trạng hiện tại của kiến thức về sản
xuất cây đơn bội và cây đơn bội kép (DHs) thông qua thụ phấn hoa, đặc biệt là nuôi
cấy bao phấn.
Từ khóa
Nuôi cấy bao phấn, cây đơn bội kép, cây đơn bội, đồng hợp tử, phôi hạt phấn
(pollen embrygenis)
Giới thiệu
Cây đơn bội có số lượng NST đơn bội (n thay vì 2n) ,đó là một bộ NST ở thể bào
tử. Khi sự phát sinh quá trình nhân đôi nhiễm sắc thể diễn ra, kết quả của quá trình gọi
là đơn bội kép (DH). Trong so sánh, cây đơn bội kép (2n = 2x) là những cây đơn bội
thu được từ một thể nhị bội kép (4x) (Kasha và Maluszynsky 2003). Đơn bội xảy ra tự
phát ở
tần suất thấp, chúng có thể được gây ra bởi một số phương pháp chẳng hạn như
phương pháp lai, xoá bỏ nhiễm sắc thể, thụ phấn với hạt phấn tia bức xạ ...) và bằng
nuôi cấy invitro thể giao tử. Phát sinh phôi giao tử là một trong những sự khác biệt các


tuyến phôi có trong giới thực vật, và nó bao gồm mật độ của giao tử đực (tiểu bào tử

hoặc hạt phấn non) hoặc giao tử cái (noãn) để chuyển đổi không thuận nghịch từ con
đường phát triển thụ thể hướng tới một loại bào tử. Khác với sự tạo phôi soma, cung
cấp sự nhân giống dòng vô tính của kiểu gen (trừ khi tế bào soma biến thể), kết quả
phôi giao tử di truyền tạo cây đơn bội (trừ khi nhiễm sắc thể tự phát hoặc gây ra sao
chép xảy ra), bởi vì các loại thực vật này có nguồn gốc từ sự tái sinh của giao tử, sản
phẩm của phân bào.
Hạt phấn hoặc phôi hạt phấn (hay còn gọi là cơ quan sinh sản đực ) được coi là
một trong những tác động nổi bật nhất ví dụ về tế bào gốc (Reynolds 1997), nhưng
cũng như một hình thức của lại giống. Nó là một sự thích nghi sinh tồn quan trọng cơ
chế trong giới thực vật chỉ được thể hiện trong những trường hợp nhất định và như là
kết quả của An environmental stress (Bonet và cộng sự, 1998). So với các phương pháp
nhân giống thông thường, phôi tạo mạch làm cho việc sản xuất các dòng đồng hợp tử
khả thi và rút ngắn thời gian cần thiết để sản xuất dòng như vậy, cho phép sự phát triển
đơn bước hoàn toàn đồng hợp tử từ dòng cha mẹ dị hợp tử. Phương pháp thông thường
thực hiện để đạt được sự đồng hợp tử bao gồm việc thực hiện một số phép lai ngược;
Như vậy, chúng tốn nhiều thời gian và khó khăn trong việc thực hiện (Morrison và
Evans 1987).
Việc sản xuất cây đơn bội thông qua sự phát sinh phôi giao tử cho mục đích sinh
sản đã được nhiều người nghiên cứu nhóm nghiên cứu kể từ những năm 1970. Có
nhiều xuất bản đánh giá về việc sản xuất cây đơn bội và DHs, bao gồm nhóm của
Andersen (2005), Dunwell (2010), Germana`1997, 2006, 2007, 2009), Jain et al. (Năm
1996-1997), Kasha1974), Magoon và Khanna (1963), Maluszynski et al.2003a, b),
Palmer et al. (2005), Seguı`-Simarro và Nuez2008a), Seguı'-Simarro (2010), Smykal
(2000), Touraev et al. (2009), Zhang et al. (1990) và Xu et al. (2007). Các kỹ thuật DH
đã được thiết lập tốt trong một các loài cây trồng quan trọng về mặt kinh tế,Ngũ cốc và
cải bắp (Wedzony và cộng sự 2009). Sinh nở là kỹ thuật ít ỏi nhất vào thời điểm hiện


tại vì hiệu quả thấp của nó, nhưng nó đã được áp dụng cho các loài mà không đáp ứng
với các phương pháp hiệu quả hơn (Forster et al.2007). Khả năng để có được cây đơn

bội và DHs là một trong ứng dụng quan trọng nhất của công nghệ sinh học phấn hoa
trong nhân giống cây trồng và di truyền, liên quan đến thao tác và lập trình lại sự phát
triển của phấn hoa và chức năng(Testillano và cộng sự 2000). Tái tạo từ giao tử đực đã
được báo cáo trong hơn 200 loài thuộc các họ Solanaceae, Cruciferae và
Gramineae(Dunwell 1986, Hu and Yang 1986), trong khi nhiều cây họ đậuvà cây thân
gỗ (Sangwan-Norreelet al. 1986; Bajaj 1990; Raghavan 1990; Wenzel et al.1995;
Germana`2006, 2009).
Sự phát triển phôi trong phấn hoa thông thường được tạo ra thông qua bao phấn
hoặc vi nuôi cấy hạt phấn. Nuôi cấy bao phấn là thường là phương pháp được lựa chọn
cho sản xuất DH ở nhiều cây trồng vì tính đơn giản của phương pháp tiếp cận cho phép
thiết lập và áp dụng nuôi cấy bao phấn các kiểu gen (Sopory và Munshi 1996). Kỹ
thuật vi nuôi cấy hạt phấn, được thực hiện bởi loại bỏ các mô mô sẹo, đòi hỏi thiết bị
tốt hơn và nhiều kỹ năng hơn so với nuôi cấy huyền phù, mặc dù trước đây cung cấp
phương pháp tốt hơn để điều tra tế bào,Sinh lý, sinh hóa và phân tử tham gia vào phôi
phấn (Nitsch 1977; ReinertVà Bajaj năm 1977). Pelletier và Ilami (1972) giới
thiệuKhái niệm về "Factor Wall Factor", theo đó các soma các mô của bộ phận bảo vệ
bao phấn đóng một vai trò quan trọng trong quá trình cảm ứng các tiểu bào tử trong hạt
phấn, với sự khuếch tán của chất dinh dưỡng thông qua màng bao phấn thường được
coi là một trong những yếu tố ảnh hưởng đến sự sinhsản của phôi hạt phấn. Số nghiên
cứu về vai trò của màng bao phấn trong sự sinh sản của phôi hạt phấn đã chỉ ra rằng nó
không chỉ hoạt động như một hàng rào đến dòng chất dinh dưỡng nhưng nó cũng cung
cấp cả lợi ích và chất ức chế (Heberle-Bors 1985, 1989). Pulidoet al. (2005), sử dụng
cả hai hệ thống nuôi (anther và cô lậpMicrospore) để tạo ra hạt phấn Sinh phôi ở lúa
mạch, cho thấy rằng giai đoạn đầu của cả hai quá trình đều giống nhau. Những nhà
nghiên cứu này cũng chứng minh rằng thành bao phấn cũng được sử dụng như một bộ
lọc bằng ngăn ngừa nồng độ Fe quá nhiều xung quanh hạt phấn trong bao phấn, ngay


cả khi nồng độ có trong môi trường nuôi cấy cao. Vai trò bảo vệ của thành tế bào chống
lại các yếu tố độc hại như Cd, ZnVà Ni cũng được Kra¨Mer et al. (2000) và Kupperet

al. (2000).Đánh giá này đề cập đến các khía cạnh chính của H và DH sản xuất thông
qua nuôi cấy bao phấn invitro .
Sơ lược lịch sử về nuôi cấy bao phấn tạo cây đơn bội và đơn bội kép
Các bào tử đơn bội tự nhiên đầu tiên đã được quan sát thấy trong năm 1921 của
Bergner trong một loài cỏ dại Datura stramonium L. và được báo cáo bởi Blakeslee et
al. (1922). Tầm quan trọng của cây đơn bội trong nhân giống cây trồng và nghiên cứu
di truyền đã ngay lập tức được công nhận. Số lượng đơn bội tự phát được phát hiện đã
phát triển đều đặn, và năm 1974 Kasha ghi nhận sự xuất hiện của hơn100 loài thựcvật
hạt kín. Danh sách các ví dụ đã chọn của các thỉnh thoảng trong một dải loài đã được
báo cáo bởi Dunwell (2010). Tần số của đơn bội tự nhiên là, tuy nhiên, quá thấp cho
ứng dụng thực tế trong sinh sản. Khoảng 40 năm sau nhận dạng của tự nhiên đơn bội
sơ khai, Guha và Maheshwari (1964) phát hiện ra rằng có thể, bằng cách invitro các
bao phấn chưa trưởng thành của loài Solanaceous spe Datura innoxia, để thay đổi sự
phát triển giao tử bình thường của các hạt phấn nhỏ thành dạng bào tử và phôi và thực
vật có số nhiễm sắc thể đơn bội sẽ được sản xuất. Khám phá này đã mở ra cách để tiếp
tục nghiên cứu sâu hơn về nuôi cấy bao phấn đã được đặc biệt thành công trong
Solanaceae, Brassicaceae và Gramineae. Tuy nhiên, không phải tất cả các thực vật hạt
kín có hiệu quả đáp ứng với sự phát triển của phôi cảm ứng, và mặc dù lúa mạch
(Hordeum vulgare L.) cải xoăn (Brassica napus L.), thuốc lá (Nicotiana spp.) và Lúa
mì (Triticum aestivum L.) được coi là mô loài để nghiên cứu phôi bào tử nhỏ do hiệu
quả tái tạo cao (Forster và cộng sự, 2007), các nghiên cứu khác khoa học hoặc kinh tế
thú vị loài, chẳng hạn như Arabidopsis (chi thực vật có hoa trong họ cải, là loài cơ sở
để nghiên cứu gen của các thực vật bậc cao)), nhiều cây gỗ hoặc các họ hàng của cây
họ đậu, vẫn còn ngoan cố với loại in vitro này hình thái học (Sangwan-Norreel và cộng
sự 1986, Bajaj 1990; Raghavan 1990; Wenzel et al. 1995; Germana 2006, 2009). Sinh
phôi giao tử là một công cụ đặc biệt cần thiết để đạt được đồng hợp tử trong cây gỗ,


được đặc trưng bởi sự dị hợp tử gen cao, một chu kỳ thế hệ với thời gian dài chưa
trưởng thành, một kích thước lớn và, thường là, không tương thích với nhau, và nó

không thể có được sự khép chặt bằng các phương pháp thông thường, nghĩa là, một vài
thế hệ của sự tự nguyện (Germana ,2006, 2009).
Sự quan tâm lớn đến cây đơn bội rõ ràng là Tổ chức Hội nghị chuyên đề Quốc tế
lần thứ nhất 'Haploids In Higher Plants ', diễn ra tại Guelph (Canada) vào năm 1974
(Kasha 1974). Vào đầu những năm 1970, cv. Maris Haplona của hạt cải dầu (Brassica
napus) là cây đầu tiên DH cây trồng được thả (Thompson 1972), tiếp theo là cv. giống
Mingo ở lúa mạch (Hordeum vulgare) vào năm 1980 (Hồ và Jones 1980). Kể từ đó, rất
nhiều nghiên cứu đã được thực hiện với mục đích thiết lập hiệu quả kỹ thuật sản xuất
haploid và DH với một tăng số lượng các kiểu gen. Trong một thời gian dài, nhiều giả
thuyết liên quan đến các giao thức phôi phôi đã được dựa trên kinh nghiệm thực tế. Tuy
nhiên, gần đây đổi mới khoa học và công nghệ, sự hiểu biết sâu sắc hơn các cơ chế
kiểm soát bên dưới và một mô hình expan-ứng dụng người dùng cuối đã gây ra sự hồi
sinh của quan tâm đến các haploids ở các cây cao hơn (Forster và cộng sự, 2007). Sự
quan tâm này được thể hiện bằng cách thiết lập COST851, một mạng lưới nghiên cứu
do Liên minh Châu Âu tài trợ mang tựa đề "Các tế bào mầm và sự phân tử của Cải tiến
cây trồng ', kéo dài từ năm 2001 đến năm 2006.
Đến nay, gần 300 chủng loại mới thuộc Một số gia đình của vương quốc thực vật
(đặc biệt là hàng năm Cây trồng) đã được sản xuất. Một loạt các phương pháp đã được
sử dụng để có được các DHs, chẳng hạn như loại bỏ nhiễm sắc thể sau khi lai rộng,
phương pháp '' bulbosum '' Bởi Kasha và Kao (1970), thụ phấn với phấn hoa bức xạ,
lựa chọn cây con sinh đôi, thụ tinh trong cơ thể hoặc in vitro với hạt phấn từ cây bội ba
lá, sinh gynogenesis và phôi hạt phấn qua phôi trong ống nghiệm hoặc isolated
microspore culture (Forster và Thomas 2005).
Trang webHttp://www.scri.sari.ac.uk/assoc/COST851/Default.htm Cung cấp một
danh sách các giống có nguồn gốc cây đơn bội, chủ yếu là măng tây Lúa mạch,
Brassica, cà tím, dưa, tiêu, cải dầu, Gạo, lương thực, thuốc lá, ngũ cốc và lúa mỳ. Ứng


dụng của Bảo vệ sở hữu trí tuệ (IP) và hệ thống bằng sáng chế Của các cây đơn bội
(trong đó các bằng sáng chế cũng bao gồm bao phấn và các kỹ thuật nuôi cấy hạt phấn)

đã được xem xét bởi Dunwell (2009), và sự quan tâm thương mại mạnh mẽ các
phương pháp sản xuất và khai thác các thực vật đơn bội được chứng minh bởi số lượng
được cấp bằng sáng chế và đơn xin cấp bằng sáng chế từ Hoa Kỳ và ở nơi khác, cũng
được báo cáo bởi Dunwell (2009, 2010).
Tổng quát về nuôi cấy bao phấn tạo cây đơn bội và cây đơn bội kép
Việc khai thác các cây đơn bội và DHs như là một sức mạnh công cụ nhân giống
đòi hỏi sự sẵn có của các mô nuôi cấy có thể vượt qua một số phương pháp luận vấn
đề, chẳng hạn như các tần số thấp của cảm ứng phôi, nghiên cứu về bạch tạng ( thiếu
sắc tố melanin), tái sinh thực vật, sự sống còn của cây trồng, gen và phản ứng phụ
thuộc theo mùa, để cải thiện hiệu quả tái tạo trong một phạm vi rộng hơn của các
kiểugen.Maluszynski và cộng sự (2003a) xuất bản một cuốn cẩm nang chi tiết mô tả 44
giao thức cho sản xuất DH, liên quan đến ít nhất 33 loài thực vật. Mặc dù các loài khác
nhau, cũng như các giống khác nhau trong một loài, cho thấy rất đa dạng yêu cầu và
không có điều kiện tiêu chuẩn đơn hoặc hình thức để gây ra sự hình thành cây phấn
hoa, đó là có thể cung cấp các hướng dẫn chung cho nuôi cấy bao phấn, như tóm tắt
trong hình. 1.
Nhiều yếu tố bên ngoài và bên ngoài ảnh hưởng đến phản ứng phôi của các bao
phấn trong nuôi cấy (Atanassov et al. 1995; Datta 2005; Smykal 2000; Wang và cộng
sự 2000).Gen, trạng thái sinh lý và điều kiện tăng trưởng của donor plants, giai đoạn
phát triển phấn hoa, tiền xử lý chồi non hoặc nấm men và môi trường nuôi cấy in vitro
và điều kiện, cùng với các tương tác của họ, là tất cả các yếu tố mà rất nhiều ảnh hưởng
đến phản ứng của bao phấn để nuôi cấy invitro.
Sưu tập tuyển chọn nụ hoa từ các cây bố
Xác định giai đoạn
mẹphát triển của hạt
phấn:
-acetocarmine
-schiffsreagent
-DAPI staining



Tiền xử lý
Khử trùng bề mặt
Tách bao phấn
Đặt bao phấn vào môi trường

Phát triển Morphogenic, phục hồi thực vật

Charactorization of regenertant
Ploidy amalysis

Detection of homozigority

-Công nghệ tế bào học

- Công nghệ Isozyme- based

-Đo hàm lượng DNA bằng kỹ thuật dòng chảy

- Chỉ thị phân tử DNA

-Tế bào bảo vệ và kích thước platid

Hình 1. Sơ đồ mô tả các hướng dẫn chung về phương pháp nuôi cấy bao phấn
Nhiễm sắc thể tăng gấp đôi trong trường hợp đơn bội

Gen
Trong số các yếu tố nội sinh, kiểu gen đóng một vai trò quan trọng, được công
nhận bởi hầu hết các nhà nghiên cứu phôi hạt phấn (pollen embryogenesis). Đã nhiều
lần báo cáo rằng các giống khác nhau trong một loài thể hiện phản ứng đa dạng trong

nuôi cấy bao phấn. Ví dụ, trong 21 giống Triticum Aestivum, các mô đơn bội có thể thu
được từ các bao phấn chỉ có của mười giống, trong khi ở lúa, phân loài japonica đã
được tìm thấy có năng suất cao hơn các phân loài indica (Bajaj 1990). Ngoài ra, nghiên
cứu thực hiện đồng thời trên các bao phấn của một số lượng lớn các kiểu gen Citrus (4


dòng thuộc 2 loại cam quýt, 4 quả cam ngọt, 4 loại chua cam, 5 chanh, 4 quả bưởi) sử
dụng cùng một môi trường nuôi cấy điều kiện và tiền xử lý và 11 hóa chất khác nhau,
thu được sản phẩm mô sẹo đơn bội trong một dòng cây của một giống cam và trong
một giống chanh (Germana,2007).
Sự hình thành của các tiểu bào tử có khả năng trải qua sinh phôi ('' E-grains '',
Sunderland 1978 hoặc '' P-grains '') Heberle-Bors 1982) được kiểm soát bởi sự tương
tác giữa gen tế bào chất và hạt nhân và được cải tiến bởi môi trường (Heberle-Bors
1985). Các nghiên cứu được thực hiện trên Solanum tuberosum cho thấy khả năng trải
qua sinh phôi vi sinh là một đặc điểm lặn có thể di truyền được kiểm soát bởi nhiều
hơn một gen và các gen đó Recessive (Chupeau và cộng sự, 1998, Rudolf và cộng sự,
1999. Smykal 2000). Foroughi-Wehr et al. (1982) phân biệt 4 phương pháp và khác
biệt đặc trưng, cụ thể là, "Kích thích callus", "ổn định callus", "tái sinh cây trồng" và sự
hình thành cây bạch đàn so với sự hình thành cây xanh ". Petolino và Thompson (1987)
đã chứng minh rằng việc nhân giống để đáp ứng tốt hơn về ngô là có thể. Các tỷ lệ
phần trăm các bao phấn sản sinh phôi vi sinh và số lượng các chất tái sinh được sản
xuất cho mỗi bao phấn xuất hiện xác định một cách độc lập (Dunwell 2010).
Giai đoạn phát triển hạt phấn
Giai đoạn phát triển hạt phấn là một yếu tố phức tạp ảnh hưởng mạnh mẽ đến sự
thành công của nuôi cấy bao phấn. Sự phát triển cửa sổ thẩm mỹ phôi khác tùy thuộc
vào loài đã được kiểm tra nhưng nhìn chung là giai đoạn độ nhạy cảm đối với các
phương pháp điều trị quy nạp là khoảng lần đầu tiên sự phân bào hạt phấn-nghĩa là,
giữa các tiểu bào tử không trống (Hình 2a) đến phấn hoa giữa giai đoạn giữa, (Touraev
et al. 2001) - có thể do trạng thái phiên mã tại thời gian vẫn còn tăng dần và chưa được
phân biệt hoàn toàn (Malik và cộng sự, 2007). Sau khi hạt phấn bắt đầu tích tụ dự trữ

trữ lượng, chúng thường mất sinh phôi năng lực và tuân theo sự phát triển về giai đoạn
thụ phấn (Heberle-Bors 1989, Raghavan 1990). Ở Brassica Napus, Telmer et al. (1992)
báo cáo rằng các giai đoạn tốt nhất cho sự cảm ứng xung quanh sự phân bào phấn hoa
đầu tiên, từ những hạt phấn hoa sớm muộn đến các hạt phấn bicellular sớm, nhưng


Binarova et al. (1997), áp dụng thêm một đoạn ngắn và nhiệt độ stress (41 ° C), đã có
thể có được sự phân chia các tế bào thực vật đã hình thành. Trong hạt Nicotiana
tabacumpollen ở giai đoạn bicellular là đáp ứng tốt nhất khi starvation được sử dụng
như tiền xử lý; Khi bị sốc nhiệt được áp dụng thay vào đó,có thể trẻ hơn thời kỳ đơn
nhân bào tử (Touraev và cộng sự, 1996a, b). Sopory và Munshi (1996) báo cáo rằng
giai đoạn bào tử sẽ xuất hiện ảnh hưởng đến mức ploidy của thực vật được tạo ra trong
nuôi cấy bao phấn vì, trong nghiên cứu của họ, cây trồng thu được từ hạt phấn ở giai
đoạn non-nucleate được tìm thấy chủ yếu đơn bội, trong khi thực vật có số nhiễm sắc
thể cao hơn đã được tạo ra bởi các bao phấn ở giai đoạn sau.
Giai đoạn phát triển phấn hoa thường được kiểm tra trong kích thước bao phấn /
nụ mầm bằng phương pháp acetic-carmine(Sharma và Sharma 1972). Các anther được
thu thập từ nụ hoa ở các giai đoạn khác nhau của sự phát triển và nén trong dung dịch
nhuộm acetocarmin (1% acetocarmine trong45% axit axetic) để quan sát dưới kính
hiển vi quang học để xác định giai đoạn phát triển phấn hoa. DAPI(40, 6-diamidino-2phenylindole dihydrochloride) nhuộm huỳnh quang cũng được sử dụng. Tuy nhiên,
khác giai đoạn phát triển và, do đó, không đồng nhất việc bắt đầu quần thể hạt phấn đã
được quan sát thấy trong cùng một bao phấn khác cũng như giữa các bao phấn khác
nhau của cùng một hoa (Hidaka và cộng sự, 1979, 1981, Chen 1985, VasilNăm 1967;
Shull và Menzel năm 1977).
Trạng thái sinh lý và điều kiện tăng trưởng của donor plants
Các điều kiện sinh lý của các donor plants,ảnh hưởng đến số hạt P (Heberle-Bors
1985), mức nội tiết tố nội tiết và tình trạng dinh dưỡng của các tế bào biệt hóa (the
tissues) của bao phấn (Sunderland và Dunwell 1977) tất cả xác định thành công của kỹ
thuật. Qua trình In vivo và / hoặc invitro phôi hạt phấn hoặc P-grains, có đặc trưng bởi
cấu trúc màng ngoài mỏng hơn, yếu nhuộm với acetocarmin, sự hiện diện của một

vòng bào thai và sự vắng mặt của tinh bột ngũ cốc, có vẻ như được kết nối với một
Hiện tượng thiếu nitơ (Heberle-Bors 1983, 1985,1989). Các biến đổi theo mùa đáng kể
theo mùa đã được quan sát thấy ở nhiều kiểu gen. Vasil (1980) quan sát thấy rằng các


loại bao phấn được lấy ra từ các cây trồng trong vườn đã cho một phản ứng tốt hơn so
với những người được chọn từ nhà kính phát triển cây. Ngoài ra, các bao phấn từ lần
mọc đầu tiên của mùa được thấy là phản ứng nhanh hơn (Sunderland 1971). Trong
thuốc lá, tác động của môi trường nuôi cấy là điều tra đầu tiên bởi Dunwell (1981),
người đã chỉ ra rằng cả hai chu kỳ sáng và cường độ ánh sáng ảnh hưởng đến năng suất
phôi bào tử và cây con. Tần suất của hạt P cũng tăng theo điều kiện (ngắn ngày,
thấp,nhiệt độ) của quả mơ (Prunus Armeniaca L.) cv Hình 2 Ninfa tại thời điểm thành
lập bao phấn nền văn hóa (phần màu với toluidine xanh;.. Ảnh chụp tại các phòng thí
nghiệm của MC Risuen~o, CSIS Tây Ban Nha). b phôi phấn hoa có nguồn gốc từ mô
sẹo bở và phôi ở giai đoạn khác nhau đang phát triển bên trong của Citrus Clementina
Hort. cựu Tân. cv. Monreal bao phấn, sau 4 tháng nuôi. c microspore Direct phôi trong
bao phấn Citrus sau 3 tháng nuôi. d bộ phận đối xứng của hạt nhân trong một
microspore ô liu (Olea europaea L.) sau 3 tuần nuôi cấy bao phấn. e hình trái tim phôi
hạt phấn có nguồn gốc từ của C. Clementina cv. Nules. F Microspore có nguồn gốc từ
cây non của clementine thu được từ lúc nảy mầm phôi nhiệt độ) mà là không thuận lợi
cho cây sinh trưởng (Heberle-Bors và Reinert 1981; Heberle-Bors 1989). Sự ảnh
hưởng trên phản ứng văn hóa của nhiệt độ theo đó các cây cho (donor plants) được
trồng đã được chứng minh bởi các nghiên cứu về lúa mạch (Foroughi-Wehr và Mix
1976), hạt cải dầu (Keller và Stringham 1978; Dunwell và Cornish 1985), củ cải
(Keller et al. 1983) và lúa mì (Lazar et al. 1984), bất chấp những điều kiện phát triển
tối ưu xuất hiện khác nhau giữa các loài. Tình trạng nitơ của cây cũng ảnh hưởng đáng
kể năng suất của microspore – giải thích cho hình bên dưới phôi (Sunderland
1978; Tsay năm 1981), với '' nitơ-đói '' cây cung cấp các kết quả tốt hơn so với những
người cung cấp phân bón.
Mặc dù nhà nước sinh lý thực vật của nhà tài trợ đáng kể có thể ảnh hưởng đến

phản ứng của các bao phấn nền văn hóa trong ống nghiệm, tham số này đã được nghiên
cứu chỉ có ở cây do những khó khăn liên quan đến việc xác định nó thuộc dạng cây
thân gỗ. Trong thực tế, các điều kiện phát triển và các trạng thái sinh lý thực vật nhà tài


trợ có thể không được chuẩn hóa vào văn hóa bao phấn cây lâu năm được trồng ở ngoài
trời và bị ảnh hưởng bởi khí hậu (nhiệt độ, photoperiod và cường độ ánh sáng), văn hóa
(cắt tỉa, tưới tiêu, thụ tinh, vv) và các điều kiện pedological (đặc biệt là trong thời gian
hoa cảm ứng và sự khác biệt). Điều này có thể giải thích tại sao các phản ứng với các
nền văn hóa của các thực vật thân gỗ bao phấn rất mùa là phụ thuộc vào ngay cả khi
cùng một giao thức được áp dụng (Germana' năm 2009).
Pretreatment- tiền xử lí
Nó đã được quan sát ở nhiều kiểu gen vật lý hay hóa học trước văn hóa phương pháp
điều trị áp dụng cho sự cắt bỏ ( excised) nụ hoa, toàn bộ cụm hoa hoặc các cắt bỏ bao
phấn (excised )trước hành động như là một kích hoạt cho cảm ứng ( inducing )đường
sporophytic, do đó ngăn ngừa sự phát triển của phấn hoa màu mỡ (gametophytic
đường). Những tiền xử kí như lạnh, nhiệt độ cao, độ ẩm cao, nước căng thẳng, kỵ khí
điều trị, số, sucrose và nitơ đói, ethanol, chiếu xạ c, microtubuli đại lý gây rối,
electrostimulation, pH trung bình cao, các kim loại nặng điều trị là phương pháp tiếp
cận đặc biệt phổ biến ở bao phấn và tiểu bào tử (microspore), như gần đây được nhận
xét bởi Shariatpanahi et al. (2006), đã phân loại chúng thành ba loại: được sử dụng
rộng rãi, bỏ rơi .
Cú sốc nhiệt độ được coi là điều trị hiệu quả nhất để tạo ra phấn hoa
embryogenesis phát triển. Nhiệt độ tối ưu và thời gian của tiền xử lí pretreatment khác
nhau với kiểu gen. Ví dụ, một trong ba giống cây trồng (tháp, Willi và Duplo)
(Brassica napus ssp. oleifera), Dunwell et al. (1983) thấy rằng năng suất cao nhất
(tương đương 1,1 phôi cho nuôi cấy bao phấn) nhận được từ bao phấn var. Duplo sau
khi điều trị 3 ngày một lúc 35C, trong khi sản lượng từ các giống cây trồng khác thấp
hơn nhiều và tương đối không bị ảnh hưởng bởi điều trị 35C. Tiền xử lí Lạnh (4C trong
2 – 3 tuần) được sử dụng thường xuyên trong các bao phấn nền văn hóa của nhiều loại

cây trồng và hiệu quả của nó cũng phụ thuộc vào kiểu gen (Osolnik et al. 1993; Powell
năm 1988). Ở các loài Brassica, một điều trị ngắn, cao nhiệt độ (30-35C) trước khi
thêm văn hóa tại 25C là cần thiết để hiệu quả chuyển đổi con đường phát triển. Dinh


dưỡng đói, đặc biệt là cho đường và nitơ, đã được thường xuyên sử dụng để tạo ra phấn
hoa embryogenesis trong thuốc lá (Kyo và Harada 1986). Touraev et al. (1996b 1997)
đã cho thấy rằng nó đã có thể để thay thế cho tiền xử lí (pretreatment )đói bởi một điều
trị sốc nhiệt. Hóa học và vật lý mutagens (ví dụ như tia gamma) áp dụng để cây hoặc
hạt giống từ đó M1 cây đã thu được kết quả là sự gia tăng trong các phản ứng nội tiết
tố của giống đực (androgenic), theo báo cáo của Aldemita và Zapata (1991) trong
giống ương ngạnh lúa, bởi Vagera et al. (2004) ở lúa mạch và Kopecky và Vagera
(2005) Solanum nigrum. Ngoài việc được sử dụng để tạo ra nhiễm sắc thể tăng gấp đôi,
colchicine cũng đã được sử dụng để tạo ra bộ phận tiểu bào tử hay bào tử đực
(microspore) và để thúc đẩy sự phát sinh phôi giao tử (gametic embryogenesis) ở một
vài loài, bao gồm củ cải đường (Levan 1945), Miến (Sanders và Franzke năm
1962; Simantel và Ross 1964), ngô (Hu et al. 1991), Brassica (Mollers et al. năm
1994), lúa mì (Barnabas et al. 1991) và gạo (Alemano và Guiderdoni 1994). Tuy nhiên,
tác dụng kích thích gây đột biến (mutagenic) trị bao phấn nền văn hóa hiệu quả trong
ương ngạnh kiểu gen là cũng đánh giá cao kiểu gen và phụ thuộc liều. Số và tiếp xúc
với giảm áp suất không khí hoặc nước căng thẳng là các tiền xử lí (pretreatments )được
sử dụng trước khi bao phấn (Sopory và Munshi 1996
Mặc dù cơ chế tác động chưa bền vững phấn là cách phân biệt lập, nó dường như
bằng cách thay đổi sự phân cực của liên quan bộ xương tế bào tái tổ hợp đầu tiên của
phân bào. Các tế bào đơn bội (Nitsch và norreel 1973; Reynolds 1997), đẩy lùi với
phấn hoa có kích thước bằng nguyên phân (hai loại dinh dưỡng của thực vật hạt nhân
không phải là một người tạo ra), ngăn chặn sản xuất tinh bột hoặc hòa tan vi ống
(Muar, 1977) hay giữ sống (đất huấn luyện p-grains Bos 1985).
Khử trùng bề mặt cắt, bao phấn
Cắt bỏ trong bao phấn, trước khi khử trùng bề mặt, phải thông qua loại bỏ chất

thải (vi khuẩn và nấm).Nhiều giao thức được sử dụng để khử trùng không bị ô nhiễm
bao phấn, chủ yếu có thể đơn bội được tìm thấy ở cây trồng sản xuất: một cuốn sổ tay,
biên tập bởi Maluszynski et al.(2003a, B).


Nói chung, được xử lý sau khi khử trùng bề mặt, chồi ngâm anh khỏe (v/v) vài
phút ethanol, sau đó ngâm trong dung dịch natri hypoclorit (khoảng 1.5% hoạt độ nước
của clo) bao gồm 10 – 15 phút nhỏ vài giọt 20 và ba phút rửa nước tinh khiết vô
trùng.Ở bước cuối cùng trong cơ thể không có sợi nấm, bao phấn từ và đặt lên môi
trường.Một ngoại lệ là cho lớn, đó là rượu chỉ qua sự phun khử trùng (cistue anh khỏe
không et al.2003) hay ngâm 5 phút trong ethanol, anh khỏe, và sau đó ở vô trùng chưng
cất nước tẩy trắng (dệt nổi chờ.2003).
Tổn thương cắt bỏ các ngăn bao phấn nên tổ chức tổ chức sản xuất antherwall ( và
1977).Khi bao phấn kích thước phân, như măng tây, cải bắp, Clover và dầu được chiết
xuất được tiến hành dưới 3 chiều của kính hiển vi (Bhojwani và Razdan 1983; cistue
Sê et al.2003; người Đức là Et Al, unpublished).
Thành phần Medium
Medium tạo phôi với xảy ra gây tác dụng hết sức quan trọng. Kiểu gen khác nhau
thể hiện rất khác nhau trên cơ sở Medium đòi hỏi nguồn gốc thực vật, gây hạt phấn
được hình thành. Bao phấn với cách cơ thể dinh dưỡng hơn yêu cầu đơn giản hơn
nhiều ( và 1977; Ba - Jacques Jay, 1990).
Thường dùng nhất là bao phấn Medium N6 medium (đầu năm 1978), (sửa đổi)
ms medium (Murashige - 1962), Nitsch và Nitsch (1969) và phương tiện trung B5
(Gamborg et al.1968), nhưng vẫn còn nhiều người khác.Nói chung, đề nghị cho họ Cà
nửa độ MS muối hỗn hợp, cho ngũ cốc N6 medium (Hồ 1978).
Nguồn carbonhydrate là không thể thiếu trong bao phấn phát triển sản xuất phôi,
bởi vì chúng có tác dụng chống xâm nhập và dinh dưỡng (Powell 1990).Đường nồng
độ có thể là ảnh hưởng gây áp lực thẩm thấu trong giai đoạn điều chỉnh về (Sunderland
và 1977; Sangwan và Sangwan norreel 1990) sau thời kỳ , tập trung cao độ của nguồn
carbon là có hại (Keller, et al.1975).Đường sucrose là tổ chức vận chuyển chính ở thực

vật trong tinh bột (Powell 1990), nó là dùng để huấn luyện các bao phấn thường dùng
nhất nguồn carbon, thông thường ở mức 2 – 4% ( và 1977).Mức độ cao của sucrose (6
–, là 17 phần trăm.) là một trong những yêu cầu của họ (ví dụ, Gramineae, Cruciferae)


chín phấn hoa là hạng ba điều kiện ( và 1985), trong khi những người trưởng thành cho
hai trong phấn hoa (ví dụ, Solanaceae) cấp thấp hơn, chẳng hạn như 2-5%, thường có
lợi (Dunwell 2010). Sucrose là nhiệt không ổn định, và phương tiện truyền thông hấp
chứa một hỗn hợp sucrose, D-glucose và D-fructose (Powell, 1990). Maltose đã thành
công được sử dụng để thay thế sucrose trong lúa mạch nuôi cấy bao phấn, thường là ở
nồng độ 62 g / l trong môi trường cảm ứng và một nửa số tiền này trong môi trường tái
sinh (Wedzony et al. 2009). Maltose cũng đã được bổ sung vào môi trường nuôi cấy
bao phấn lúa mì, lai lúa mì, lúa mạch đen và lúa ở nồng độ khác nhau, từ 60 đến 90 g /
l (Wedzony et al. 2009). Fructose và glucose đều đã được chứng minh là ức chế để phôi
phấn hoa trong Petunia nuôi cấy bao phấn (Raquin 1983). Lactose ở mức 18 g / l và
galactose lúc 9 g / l thường xuyên được sử dụng trong clementine nuôi cấy bao phấn
(Germana` 2003). Sucrose được tìm thấy là nguồn carbon tốt nhất, so với glucose,
trong văn hóa bao phấn của hai clementine và hai cây quýt (Germana` et al. 1994),
trong khi glucose hơn là sucrose đã được chứng minh là kích thích trong lúa mạch đen
(Wenzel et al. 1977). Glycerol kết hợp với sucrose đã được tìm thấy để kích thích sản
xuất mô sẹo trong clementine (Germana` et al. 2000a).
Ảnh hưởng của điều hòa sinh trưởng thực vật đã được nghiên cứu rộng rãi trong
nuôi cấy bao phấn. Mặc dù một vài loài mô hình (ví dụ, hầu hết các thành viên của họ
Solanaceae) không yêu cầu bổ sung một auxin vào môi trường cảm ứng, và cảm ứng
không xảy ra trên các phương tiện đơn giản, sự hiện diện của điều hòa sinh trưởng
(auxin, cytokinin hoặc kết hợp) là rất quan trọng phục vụ sản xuất phôi microspore có
nguồn gốc từ trong phần lớn các loài thực vật, đặc biệt là những người ngoan cố
(Maheshwari et al. 1982). Loại và nồng độ auxin dường như để xác định con đường
phát triển microspore (Ball et al. 1993), với 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D)
gây hình thành mô sẹo (Hình. 2b) và indole-3 axit axetic (IAA) và một

naphthaleneacetic axit (NAA) thúc đẩy phôi trực tiếp (2c Hình.) (Armstrong et al
1987;.. Liang et al 1987). Giberellins và acid abscissic đã được thỉnh thoảng thêm vào
phương tiện truyền thông.


Việc bổ sung than hoạt tính (0,5-2 g / l) vào môi trường làm tăng hiệu quả của
microspore phôi ở một số loài (Bajaj 1990). Bajaj et al. (1977) thu được sự gia tăng
bao phấn thuốc lá đáp ứng, 41-91%, bằng cách bổ sung các phương tiện cơ bản với 2%
than. Nó sẽ xuất hiện rằng than đã hành động bằng cách loại bỏ các chất ức chế từ môi
trường và, có lẽ, từ các bức tường bao phấn và bằng cách quy định mức điều chỉnh tăng
trưởng nội sinh và ngoại sinh (Reinert và Bajaj 1977; Vasil 1980; Heberle-Bors
1985). Việc bổ sung các chất chống oxy hóa và than hoạt tính thường rất hữu ích với
một số kiểu gen vì nó làm giảm các màu nâu mô do phenol.
Bổ sung các chất khác, chẳng hạn như glutamine, casein, proline, biotin,
inositol, nước dừa, bạc nitrat (ethylene đối kháng) và polyvinylpyrolidone, đã là báo
cáo (Reinert và Bajaj 1977; Powell 1990; Achar năm 2002). Hơn nữa, việc bổ sung các
ngoại sinh polyamines béo (PAs) để các phương tiện văn hóa đã được tìm thấy để tăng
số lượng phấn hoa có nguồn gốc phôi trong khoai tây (Tiainen 1992), ở một số lúa mì
Ấn Độ giống cây trồng (xu et al. 1995), dưa chuột (Ashok Kumar ctv. 2004) và trong
clementine (Chiancone et al. 2006). PAs, chẳng hạn như putrescine, cadaverine,
spermidine và spermine, là polycations khối lượng phân tử thấp, hiện diện trong tất cả
các sinh vật sống; chúng được phân loại như là điều chỉnh tốc độ tăng trưởng và tham
gia vào trong ống nghiệm organogenesis và embryogenesis (Bagni và Tassoni năm
2001; Kumar et al. năm 1997). Trong văn hóa bao phấn, amino axit, liên quan đến
thoái hóa các mô tường, đã được quan sát để nâng cao tỷ lệ cảm ứng.
Trong nuôi cấy bao phấn nhiều loài ngũ cốc, một tác dụng có lợi của đồng canh
tác với các mô buồng trứng đã được tìm thấy (Broughton 2008), do stimulatory vai trò
của arabinogalactans (Letarte et al. 2006).
pH là một yếu tố khác mà có thể ảnh hưởng đến quá trình embryogenic gametic
(Stuart et al. 1987). Trong văn hóa bao phấn, độ pH của các phương tiện truyền thông ở

dãy axít và thường được điều chỉnh để 5.7 – 5,8 trước khi khử trùng.
Nuôi cấy bao phấn truyền thống thường được củng cố bằng cách thêm agar,
nhưng hiệu quả mang lại lợi ích của các đại lý solidifying khác như tinh bột (khoai tây,


lúa mì, ngô, hay lúa mạch tinh bột), gelrite, agarose và ficoll, đã được báo cáo. Hệ
thống chất lỏng, pho và two-phase mà bao phấn được lưu hành trên phương tiện chất
lỏng nằm phía trên một phương tiện kiên cố hóa thạch đã được thử nghiệm với kết quả
khác nhau (Dunwell 2010).
Nuôi cấy '' kho microspore'' là một sửa đổi đơn giản của Nuôi cấy bao phấn mà
bao phấn được kích thích để dehisce và thả microspores của họ, thường thành một
phương tiện chất lỏng cao osmolarity. Các phương pháp đã được tìm thấy để thành
công ở một số loài, bao gồm cả lúa mạch (Ziauddin et al. 1990), lúa mì (Touraev et al.
1996b, 1997), thuốc lá (Dunwell 1985) và hạt tiêu (Supena et al. 2006).
Điều kiện nuôi cấy
Nuôi cấy bao phấn thường được ủ ở 24-27C và tiếp xúc với ánh sáng ở một
cường độ khoảng 2.000 lux trong 14 h mỗi ngày 24 h (Reinert và Bajaj 1977), nhưng
điều kiện văn hóa khác đã được báo cáo. Ví dụ, Vasil (1973) báo cáo sử dụng trong
thời gian xen kẽ của ánh sáng (12-18 h; 5.000-10.000 lux / m2) tại 28C và bóng tối
(12-6 h) tại 22C. Tuy nhiên, điều kiện tối ưu cần phải được xác định cho mỗi hệ thống
cá nhân (Bhojwani và Razdan 1983). Ánh sáng là một tín hiệu môi trường điều chỉnh
phấn hoa hình thái tinh trong ống nghiệm (Reynolds và Crawford 1997). Đối với ảnh
hưởng của chất lượng ánh sáng vào nuôi cấy bao phấn với, cảm ứng phôi của bào tử bị
ức chế bởi ánh sáng trắng cường độ cao, trong khi bóng tối hay ánh sáng trắng cường
độ thấp ít ức chế (Nitsch 1981; Wenzel và Foroughi-Wehr 1984; Bjørnstad et
al. 1989). Ủ của bao phấn liên tục trong bóng tối đã, nhân dịp, được tìm thấy là rất cần
thiết. Một thời gian chiếu sáng xen kẽ và bóng tối cũng đã được chứng minh là có lợi
sau giai đoạn cảm ứng ở một số loài: Hyoscyamus niger (Corduan 1975), cà độc dược
gai tù (Sopory và Maheshwari 1976), Nicotiana tabacum (Sunderland 1971) và Citrus
Clementina Hort. cựu Tân. (Germana` et al., 2005b).

Thành phần của khí quyển trong bình nuôi cấy đã không được trọng tâm của
nhiều sự chú ý, mặc dù các thí nghiệm trên thuốc lá đã chỉ ra tầm quan trọng của nó
(Dunwell 1979). Mật độ của nền văn hóa (số ví dụ của bao phấn mạ mỗi lượng tàu văn


hóa hoặc mỗi đơn vị thể tích của trung bình) và cách thức sắp xếp mẫu cấy vào môi
trường cũng đã được tìm thấy là quan trọng trong việc nuôi cấy bao phấn (Sopory và
Munshi 1996). Nghiên cứu trước đây đã xem xét ảnh hưởng của bao phấn hướng trong
thuốc lá (Sunderland và Dunwell 1972;. Misoo et al 1981), cà độc dược gai tù (Sopory
và Maheshwari 1976), gạo (Yangn và Zhou 1979) và lúa mạch (Shannon et al 1985.).
Phát triển Morphogenic, tái lập trình các biểu hiện gen và phục hồi
Sau khi tiền xử lý và trong thời gian văn hóa, các bào tử có thể làm theo các tuyến
đường khác nhau, cụ thể là, để bắt giữ phát triển của họ và / hoặc chết, để trở thành
một hạt phấn hoa trưởng thành, để phân chia tạo thành một đa bào mô sẹo giống như
cấu trúc hoặc biến thành một phôi microspore có nguồn gốc từ (MDE) (Hosp et al
2007;. Seguı`-Simarro và Nuez 2008a). Một số thay đổi, dao động từ hình thái để biểu
hiện gen, phân biệt bào tử sau khi cảm ứng và trong quá trình phát triển phôi. Việc mua
lại tiềm năng của phôi bởi sự căng thẳng được đi kèm với phản ứng của tế bào
stressrelated, sự đàn áp của sự phát triển gametophytic, việc mua lại của một tình trạng
totipotent và dedifferentiation của các tế bào với sự sắp xếp lại tế bào chất và hạt
nhân. thay đổi hình thái và sinh hóa liên quan đến việc mở rộng, tế bào chất
dedifferentiation và thanh toán bù trừ, sự hiện diện của một không bào trung tâm lớn và
một sự thay đổi pH đối alkalinization (Huang 1996; Hoekstra et al

năm

1992; Maraschin et al. năm 2003; Touraev et al. 2001). Không bào trung tâm lớn sau
đó được chia thành các đoạn, xen kẽ bởi sợi tế bào chất toả tròn định hướng, dẫn đến
một cấu trúc ký hiệu là '' ngôi sao giống như '' trong đó khung tế bào tái tổ hợp có liên
quan đến (Barnabas et al 1991;. Zaki và Dickinson năm 1995; Zhao et al 1996;..

Gervais et al 2000; Obert và Barnaba's 2004). Sau khi cảm ứng, các bào tử cũng được
đặc trưng bởi một tổng hợp thay đổi và sự tích lũy của RNA và protein, và có vẻ như
rằng các gen tham gia vào việc tái lập trình này là căng thẳng liên quan và / hoặc liên
quan đến phôi zygotic (Seguı`-Simarro và Nuez 2008a).
Giai đoạn tiếp theo được đặc trưng bởi phân chia tế bào với sự hình thành cấu trúc đa
bào (MCSS) bên trong tường exine. quan sát tế bào học và siêu cấu trúc đã chỉ ra rằng


sự hình thành của MCSS từ bào tử sao giống như liên quan đến con đường phát triển
khác nhau mà được định nghĩa bởi tính đối xứng của bộ phận đầu tiên và số phận của
các tế bào con (Maraschin et al. 2005a).
Theo Raghavan (1997), có những tuyến đường khác nhau của sự hình thành phôi phấn
hoa có nguồn gốc từ: 1. phận Lặp đi lặp lại của tế bào sinh dưỡng ( '' A '' con
đường). Phân chia hạt nhân mà không cytokinesis có thể sản xuất một multinuclear
pro-phôi. Callus hơn là phôi có thể thu được.
2. Phân chia tế bào sinh sản hoặc cả hai tế bào sinh sản và sinh dưỡng ( '' E '' con
đường). Tế bào phản ứng tổng hợp có thể dẫn đến nhiễm sắc thể số phi đơn bội
(Sunderland 1974).
3. phân chia đối xứng của bào tử ( '' B '' con đường) (Hình. 2d), một con đường lớn của
sự hình thành phôi thai khi bào tử được thu thập trước khi phân bào phấn hoa đầu tiên
(Smykal 2000).
Ưu thế của một con đường hơn những người khác có vẻ là phụ thuộc vào các yếu tố
khác nhau, chẳng hạn như các giai đoạn phát triển và các loại hình căng thẳng áp dụng
như tiền xử lý (Zaki và Dickinson năm 1995; Rihova và Tupy 1999; Kasha et al
2001.).
Trong giai đoạn sau, các cấu trúc phôi giống như (ELS) được giải phóng ra khỏi tường
exine, với điểm vỡ tại miền sinh sản, nằm ở phía đối diện với lỗ chân lông phấn hoa
mầm (Seguı`-Simarro và Nuez 2008a). Chia rẽ Periclinal của các tế bào bao quanh
ELS sau đó xảy ra, dẫn đến biểu bì khác biệt (Telmer et al 1995;.. Yeung et al 1996), và
sau đó ELS tiến hành thông qua Ưu thế của một con đường hơn những người khác có

vẻ là phụ thuộc vào các yếu tố khác nhau, chẳng hạn như các giai đoạn phát triển và
các loại hình căng thẳng áp dụng như tiền xử lý (Zaki và Dickinson năm 1995; Rihova
và Tupy 1999; Kasha et al 2001.). Trong giai đoạn sau, các cấu trúc phôi giống như
(ELS) được giải phóng ra khỏi tường exine, với điểm vỡ tại miền sinh sản, nằm ở phía
đối diện với lỗ chân lông phấn hoa mầm (Seguı`-Simarro và Nuez 2008a). Chia rẽ
Periclinal của các tế bào bao quanh ELS sau đó xảy ra, dẫn đến biểu bì khác biệt


(Telmer et al 1995;.. Yeung et al 1996), và sau đó ELS tiến hành thông qua Ưu thế của
một con đường hơn những người khác có vẻ là phụ thuộc vào các yếu tố khác nhau,
chẳng hạn như các giai đoạn phát triển và các loại hình căng thẳng áp dụng như tiền xử
lý (Zaki và Dickinson năm 1995; Rihova và Tupy 1999; Kasha et al 2001.). Trong giai
đoạn sau, các cấu trúc phôi giống như (ELS) được giải phóng ra khỏi tường exine, với
điểm vỡ tại miền sinh sản, nằm ở phía đối diện với lỗ chân lông phấn hoa mầm
(Seguı`-Simarro và Nuez 2008a). Chia rẽ Periclinal của các tế bào bao quanh ELS sau
đó xảy ra, dẫn đến biểu bì khác biệt (Telmer et al 1995;.. Yeung et al 1996), và sau đó
ELS tiến hành thông qua Kasha et al. 2001). Trong giai đoạn sau, các cấu trúc phôi
giống như (ELS) được giải phóng ra khỏi tường exine, với điểm vỡ tại miền sinh sản,
nằm ở phía đối diện với lỗ chân lông phấn hoa mầm (Seguı`-Simarro và Nuez
2008a). Chia rẽ Periclinal của các tế bào bao quanh ELS sau đó xảy ra, dẫn đến biểu bì
khác biệt (Telmer et al 1995;.. Yeung et al 1996), và sau đó ELS tiến hành thông
qua Kasha et al. 2001). Trong giai đoạn sau, các cấu trúc phôi giống như (ELS) được
giải phóng ra khỏi tường exine, với điểm vỡ tại miền sinh sản, nằm ở phía đối diện với
lỗ chân lông phấn hoa mầm (Seguı`-Simarro và Nuez 2008a). Chia rẽ Periclinal của
các tế bào bao quanh ELS sau đó xảy ra, dẫn đến biểu bì khác biệt (Telmer et al 1995;..
Yeung et al 1996), và sau đó ELS tiến hành thông qua những trái tim-(hình 2e) và
phóng ngư lôi, hình dạng các giai đoạn trong cách tương tự như zygotic phôi (Hause et
al. 1994).
Ngay cả khi calli và phôi đã thu được, họ chuyển đổi thành plantlets (hình 2f) không
phải là một kết luận đa chấm. Đã có nhiều báo cáo trong thấp tái tạo tỷ lệ ngay cả với

một tỷ lệ cao cảm ứng (Wedzony et al. 2009). Do đó, tiếp tục nghiên cứu được yêu cầu
để nâng cao hiệu quả tổng thể của các giao thức có sẵn. Nói chung, tái tạo thực vật là
chủ yếu là trước bởi callusing, mà làm tăng nguy cơ biến thể gametoclonal. Thông
thường, tùy thuộc vào kiểu gen, nhân bản của gen haploid là quan sát, thường xuyên
hơn trong các đơn vị đầu tiên của embryogenic microspore và trên tất cả các thông qua
một cơ chế phản ứng tổng hợp hạt nhân (Gonzalez-Melendi và ctv. 2005; Shim et al.


2006; xem xét trong năm 2005 Kasha; Seguı'Simarro và Nuez 2008a).
Chuyển đổi từ các gametophytic để con đường embryogenic cũng được đặc trưng bởi
một vườn rộng lớn của biểu hiện gen, với một upregulation gen liên quan đến chính sự
trao đổi chất và sinh tổng hợp của chất béo, carbohydrate và protein (Seguı'-Simarro và
Nuez 2008a). Trong điều kiện toàn cầu, hầu hết các gen differentially thể hiện có thể
được gán cho ba loại chính: (1) di động đáp ứng với căng thẳng với tổng hợp protein bị
sốc nhiệt (HSPs);
(2) ức chế của chương trình gametophytic (tế bào chất làm sạch) (chương trình để trở
về trạng thái undifferentiated, downregulation gen liên quan đến sinh tổng hợp tinh bột
và tích lũy); (3) biểu hiện của các chương trình embryogenic (phân chia đối xứng, các
đơn vị theo định hướng một cách ngẫu nhiên trong cái áo exine, thành lập phân cực,
exine vỡ, protoderm hình) (Maraschin et al. 2005a). Tổng hợp ADN mới trong quá
trình phân chia tế bào phấn hoa và một sự giảm xuống trong RNA nội dung trong đói là
các tính năng đặc trưng của phấn hoa embryogenesis (Bhojwani et al. 1973). Mặc dù
vai trò của hầu hết các dấu hiệu trong androgenesis vẫn được xác định, một số gen
đánh dấu, chẳng hạn như BABY BOOM (BBM), đã bị cô lập trong hạt cải dầu phấn
hoa embryogenesis, đại diện cho người đầu tiên xác định gen liên quan đến androgenic
(Boutilier và ctv. 2002; Maraschin et al. 2005a). Mitogenactivated protein kinase
(MAPK) cascades dường như được tham gia vào quá trình. Ở lúa mạch phấn hoa
embryogenesis, chết tế bào được lập trình (PCD) diễn ra trong suốt quá trình chuyển
đổi cellular nhiều công trình kiến trúc để lúa mạch cầu phôi ở giai đoạn cuối của sự
phát triển phôi thai microspore (Maraschin et al. 2005a, b).

Đặc tính của tái tạo : phân tích bội thể
Số nhiễm sắc thể từ tế bào gốc-tip của phôi tái sinh và cây con đã được tính sử dụng kỹ
thuật tế bào học truyền thống. Mức bội thể có thể được dễ dàng hơn đánh giá bằng
cách phân tích dòng cytometry (Bohanec 2003). Mức bội thể (ploidy) cũng có thể
được ước tính bằng các phương pháp gián tiếp, chẳng hạn như những người dựa trên số
lượng lục lạp trong tế bào khí khổng bảo vệ và kích thước plastid (Lee và Hecht 1975;


Tần và Rotino 1995; Yuan et al 2009.).
Không chỉ đơn bội (haploids )hoặc DHS đã được thu được bằng cách in vitro nuôi cấy
bao phấn. Không đơn bội (lưỡng bội, tam bội, tứ bội, pentaploid, lục bội) phôi và cây
con đã được thu được từ nuôi cấy bao phấn của các kiểu gen khác nhau (D'Amato
1977; Dunwell 2010). Triploids tái sinh từ nuôi cấy bao phấn đã được báo cáo ở cà độc
dược gai tù (Sunderland 1974), Petunia hybrida (Raquin và Pilet 1972) và một số loài
hoa quả (Germana` 2006, 2009). Non-haploids thể phát sinh từ: (1) mô soma của bao
phấn tường, (2) các phản ứng tổng hợp hạt nhân, (3) endomitosis trong hạt phấn hoa,
(4) bào tử bất thường hình thành bởi bất thường phân bào giảm nhiễm (D'Amato 1977;
Sunderland và Dunwell 1977; Narayanaswamy và George 1982; Sangwan-Norreel
1983). Trong một số trường hợp, nguồn gốc của phi haploids dường như xuất phát từ
một hình thành tế bào không đầy đủ giữa thực vật và sinh sản nhân (Dunwell và
Sunderland, 1974a, b, 1975, 1976a, b, c). Tính năng động và cơ chế của diploidization
ở giai đoạn đầu của phôi microspore có nguồn gốc từ đã được nghiên cứu trong lúa
mạch bởi Gonzalez-Melendi et al. (2005) và được xem xét trong Seguı`Simarro và
Nuez (2008b). Sao chép của bộ gen đơn bội của các cá nhân phấn hoa có nguồn gốc từ
đã được cho là xảy ra thông qua ba cơ chế, cụ thể là, endoreduplication, phản ứng tổng
hợp hạt nhân và c-nguyên phân (phân bào diễn ra sau khi điều trị bằng colchicin), trong
khi triploids có nguồn gốc từ một quá trình endoreduplication xảy ra trong các đơn vị
đầu tiên của bào tử trong văn hóa (Sunderland 1974). Nó đã được gợi ý rằng một cơ
chế trục chính hợp nhất hoạt động trong sản xuất rất thường xuyên của cây tam bội
trong Petunia hybrida và cà độc dược gai tù: nhân sinh sản endoreduplicated (n

diplochromosomes) và nhân sinh dưỡng (n nhiễm sắc thể) phân chia trên một trục
chung, cho xứ hai hạt nhân con gái tam bội. Sự hình thành của một nhà máy lục bội
trong D. innoxia (Sunderland 1974) và khảm tam bội-lục bội trong P. hybrida (Raquin
và Pilet 1972) được coi là một thất bại của cơ chế trục hoặc nhiễm sắc thể tăng gấp
đôi. Các loài thực vật lưỡng bội hoặc đa bội có nguồn gốc theo cách này là hoàn toàn
đồng hợp tử.


Do sự tăng gấp đôi nhiễm sắc thể tự phát xảy ra trong mô sẹo đơn bội và phôi, phân
tích mức ploidy không thể lúc nào cũng xác định nhà máy phấn hoa có nguồn gốc
từ. Trong thực tế, cây lưỡng bội có thể đồng hợp tử DHS hoặc diploids soma dị hợp tử
được tạo ra bởi các mô bao phấn tường. Trong thực tế, nuôi cấy bao phấn cũng có thể
được sử dụng để có được phôi soma và trồng nhân giống vô tính trong nhiều kiểu gen
(Germana` 2003, 2005).
Đặc tính của regenerants: phát hiện đồng hợp tử
isozyme phân tích, (RAPD) DNA marker đa hình khuếch đại ngẫu nhiên và
microsatellite có thể được sử dụng để đánh giá homozygosis và để xác nhận nguồn gốc
gametic của vết chai và cây con (Germana` 2006). kỹ thuật isozyme phép mô
androgenetic và soma được phân biệt khi enzyme là heterozygotic trong tình trạng
lưỡng bội của nhà máy nhà tài trợ và các regenerants tỏ ra thiếu một alen. phân tích
isozyme đã được sử dụng để xác nhận nguồn gốc gametic của vết chai và cây con trong
quả lê (Bouvier et al 2002)., táo (Hofer và Grafe 2000) và cam quýt (Germana` et al
1991, 1994, 2000a, b;. Đặng et al. 1992; Germana` và Reforgiato 1997), xác nhận việc
đạt được các regenerants đồng hợp tử đúng. Microsatellite cũng đã được sử dụng để
mô tả regenerants thu được từ cam quýt nuôi cấy bao phấn (Germana` và Chiancone
2003;. Germana` et al 2005a, b) và để đánh giá đồng hợp tử trong lê (Bouvier et al
2002) và táo (KENIS và Keulemans 2000;. Hofer et al 2002).. Gen selfincompatibility
đa alen đơn đã được sử dụng trong táo bởi Verdoodt et al. (1998) để phân biệt đồng hợp
tử từ các cá nhân dị hợp tử thu được bằng cách nuôi cấy bao phấn cũng như bởi đơn
tính tại chỗ.

Nhiễm sắc thể tăng gấp đôi trong trường hợp đơn bội
Gấp đôi nhiễm sắc thể có thể xảy ra một cách tự nhiên trong quá trình in vitro
nuôi cấy bao phấn, và kiểu gen, giai đoạn phát triển của bào tử, loại tiền xử lý và con
đường phát triển ảnh hưởng đến tỷ lệ tăng gấp đôi (Castillo et al. 2009). Như ví dụ về
gấp đôi tự phát, tỷ lệ trung bình 70-90% đã được báo cáo trong lúa mạch, 25-70%
trong lúa mì bánh mì, 50-60% trong gạo, 50-90% trong lúa mạch đen (Maluszynski et


al. 2003a, b) và 20% trong ngô (Martin và Widholm 1996). Đối với những loài với tỷ lệ
gấp đôi thấp, một giao thức nhiễm sắc thể tăng gấp đôi hiệu quả là cần thiết để chuyển
đổi haploids vô trùng tái sinh từ in vitro bao phấn nuôi cấy thành màu mỡ, cây đơn bội
kép đồng hợp tử. colchicine
Sự phát triển của phôi (đặc biệt là sự thiếu ăn và các kỹ thuật căng thẳng) đã dẫn đến
sự gia tăng tỷ lệ cảm ứng và sự tái tạo của bao phấn đơn bội thông qua nuôi cấy mụn
nhọt, thậm chí ở cây họ đậu như đã được báo cáo gần đây ở đậu chickpea (Cicer
arietinum L.) (Grewal và cộng sự, 2009) Đồng cỏ lupin (Lupinus L.) (Skrzypek và
cộng sự, 2008). Một cải tiến để khắc phục bệnh bạch tạng (sự xuất hiện của chlorophyll
deficient thực vật), đó là một vấn đề chính trong hệ bao phấn một lá mầm (Wedzony và
cộng sự, 2009), đã được thêm CuSO4 vào môi trường mannitol trước khi chế biến
trong lúa mạch (Wojnarowiez et al. 2002), và bổ sung collagen cho môi trường
mannitol '' đói 'ở nhiệt độ 4 ° C vào mùa đông lúa mạch đen nhỏ (Immonen và
Robinson 2000). Danh sách những tiến bộ mới đây trong nuôi cấy mụn được báo cáo
bởi Dunwell (2010), Wedzony et al. (2009), Pratap et al. (2009), Srivastava và
Chaturvedi (2008) và Touraev et al. (2009).
Áp dụng đơn bội và DHs trong nhân giống cây trồng, di truyền và gen hệ gen chức
năng
Các nhà nhân giống đã nhận ra những ưu điểm của công nghệ DH dựa trên kiến thức
rằng một số khía cạnh lý thuyết và thực tiễn của sinh học và di truyền thực vật có thể
tận dụng công nghệ đơn bội(Forster và Thomas 2005). Để cải thiện cây trồng, các dòng
DH được phát triển chủ yếu để đạt được sự đồng hợp tử trong các loài lưỡng bội hoặc

loài đa bội, tiết kiệm được một vài thế hệ trong một chương trình sinh sản và tạo ra
những giống đồng hợp tử mới hoặc dòng bố mẹ cho giống lai F1 (Veilleux 1994). Hơn
280 giống đã được sản xuất với việc sử dụng các phương pháp DH khác nhau trong
một số loại cây trồng, với phần lớn các giao thức được gọi là bao phấn phát triển Ví dụ,
ở Châu Âu, người ta ước tính rằng 50% giống lúa mạch trắng (Hordeum vulgare) hiện
đã được sản xuất thông qua hệ thống DH, trong khi ở Canada, năm 2007, ba trong số 5


giống được trồng phổ biến nhất ở tất cả các cấp Lớp lúa mì Canada Xuân Tây đỏ
(CWRS) là giống DH (Dunwell 2010). Trong các loại rau, một trong những mục đích
chính của DHs là làm cha mẹ cho sản xuất giống lai F1. Do trầm cảm cận huyết, các
dòng này thường không thể được sử dụng trực tiếp nhưng chỉ như các tuyến lai mẹ cho
sản xuất các giống lai thông qua sự giao cắt giữa các con đồng hợp thể được chọn và
con cái. Các cây F1 thường biểu hiện cái gọi là sức mạnh lai (heterosis) (Maluszynski
và cộng sự 2001, Hochholdinger và Hoecker 2007), bao gồm sự gia tăng năng suất so
với bố mẹ. DHs cung cấp một hệ thống duy nhất để cố gắng '' fi xing '' của hiệu suất lai
trong dòng đồng hợp và để tránh bước sản xuất hạt giống lai. Hiện nay có rất nhiều
quan tâm đến việc áp dụng công nghệ DH vào cây trồng có giá trị cao như dược phẩm
và Cây trồng thơm (Ferrie 2009), hoặc các loài bị trầm cảm cận huyết, chẳng hạn như
lúa mạch đen (Secale cereale) (Immonen và Anttila 1996) và cỏ thức ăn gia súc
(Festuca và Lolium, Nitzche 1970), trong đó nó là khó khăn để sản xuất đồng hợp phì
phì bằng Tự thụ phấn. DH đồng hợp tử cũng cung cấp những cơ hội mới cho nghiên
cứu di truyền và nhân giống cây trồng trong các cây gỗ. Trong các loài cây, thường có
đặc điểm là chu kỳ sinh sản dài, độ heterozygosity cao, kích thước lớn và đôi khi
không tương thích với nhau, không thể có được các dòng giống đồng hợp tử thông qua
các phương pháp thông thường liên quan đến một vài thế hệ (Germana `2006, 2009).
Hơn nữa, việc giảm kích thước các cây bồ nông và đồng hợp tử so với các loài lưỡng
bội và dị hợp tử có thể là lợi ích về trồng trọt, ví dụ như các loại cây cảnh hoặc các gốc
rễ ngô cho cây ăn quả. Một cơ hội khác để sử dụng haploid trong cải tiến cây trồng
cũng là sự biến đổi giao tử nhân bản, bao gồm sự khác biệt về đặc điểm hình thái học

và sinh hóa cũng như số lượng và cấu trúc nhiễm sắc thể được quan sát thấy giữa các
cây tái sinh từ các tế bào giao tử nuôi cấy (Evans et al 1984; Morrison và Evans 1987).
Các biến dị khác nhau có thể giải thích sự biến đổi giao tử nuôi cấy, chẳng hạn như sự
biến đổi di truyền mới do quy trình nuôi cấy tế bào, sự thay đổi mới dẫn đến phân chia
và phân loại độc lập, sự thay đổi mới do mầm mủ có thể có tiềm năng thương mại lớn
trong vụ mùa, nơi mà người tiêu dùng mong muốn sự không hạt của trái cây. Các loài


cá ba lá được tái tạo từ môi trường khác đã được ghi nhận trong táo (Ho 1994), Pyrus
pyrifolia Nakai (Kadota và Niimi 2004), Carica papaya L. và Citrus clementina Hort.
Cũ Tân. (Germana và cộng sự 2005a, Germana '2007, 2009). Phân tích ploidy của 94
chất tái sinh từ nuôi cấy dưa hấu bằng cách cho cytometry cho thấy khoảng 82% các
chất tái sinh là tri-haploid, chứ không phải là đơn bội hay DHs như mong đợi
(Germana và cs 2005a). Ngoài việc tăng hiệu quả của các chương trình chọn giống cây
trồng, haploid và DHs đã có ích trong các lĩnh vực nghiên cứu như nghiên cứu đột
biến, lập bản đồ gen và gen và cũng như các mục tiêu chuyển đổi. Họ cung cấp tài liệu
xuất sắc để có được thông tin đáng tin cậy về vị trí của các gen chính và vị trí định tính
lượng (QTLs) đối với những đặc điểm quan trọng về mặt kinh tế (Khush và Virmani
1996) và một số chương trình sắp xếp gen đang sử dụng một bộ gen haploid do sự lắp
ráp đơn giản, Những người liên quan đến nhiều cây lâu năm (ví dụ, đào, cà phê, lê, táo
và cam quýt) (Dunwell 2010). Lựa chọn in vitro trong quá trình thụ phôi vi sinh có thể
đặc biệt có chức năng như là một phương pháp hiệu quả và sàng lọc sớm
Chọn lọc invitro trong suốt quá trình hình thành và phát triển phôi từ tiểu bào tử được
biết đến là một phương pháp sàng lọc sớm những tính trạng đột biến mong muốn mang
lại hiệu quả cao, tiết kiệm thời gian và không gian. Ví dụ như trong hạt cải dầu, không
chỉ những đột biến về khả năng chống chịu bệnh tật, thuốc diệt cỏ dại, khả năng chịu
mặn mà còn những đột biến về tính trạng chất lượng hạt cũng được chọn lựa (Turner
and Facciotti 1990; Wong and Swanson 1991; Huang 1992; Rahman et al.1995; Kott
1998). Trong phương pháp biến nạp, tiểu bào tử đơn bào cũng như những tế bào hoặc
những phôi đơn bội trong tất cả các pha của quá trình hình thành và phát triển phôi từ

tiểu bào tử và tái sinh được sử dụng như là những vật nhận gen, với mục đích thu nhận
trực tiếp từ cây DH là những đồng hợp tử cho gen chuyển. Vi tiêm, biến nạp bằng xung
điện, vi đạn và biến nạp trung gian Agrobacterium tumefaciens- là những kỹ thuật biến
nạp được sử dụng (Touraev et al. 2001). Kasha et al. (2001) đã quan sát phần lớn ở
ngũ cốc, số nhiễm sắc thể nhân đôi xuất hiện khi màng nhân biết mất sau lần phân chia
nhân thứ, điều này rất quan trọng, gen kết gen kết hợp chặt chẽ trước pha này để thu