Xác định nồng độ protein bằng phương pháp quang phổ
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (56.81 KB, 2 trang )
Xác định nồng độ protein bằng phương pháp quang phổ
- Nguyên tắc của phương pháp này là các acid amin thơm như tryptophan, tyrosine và
phenylalanine trong chuỗi polypeptide có phổ hấp thụ cực đại ở bước sóng 280nm.
- Sử dụng BSA làm chất chuẩn, biết rằng ở bước sóng 280nm 1ml BSA có nồng độ 1mg/ml sẽ
có mật độ quang học là OD = 0,67. Dựa vào đó có thể xác định hàm lượng protein trong các
mẫu thí nghiệm theo cơng thức sau:
Y(mg) = ([OD].a.V)/0,67
Trong đó:
+ [OD]: mật độ quang học của 1ml dung dịch mầu.
+ V: thể tích dung dịch mầu.
+ a: độ pha loãng dung dịch.
Chú ý:
1. Con số 0,67 là hệ số tắt của BSA. Để xác định nồng độ các loại protein khác thì cần phải
sử dụng hệ số tắt tương ứng đối với mỗi loại protein. Ví dụ: hệ số tắt của protein con A là 1,
2.
2. Lựa chọn các protein tiêu chuẩn cần có cấu trúc tương tự như cấu trúc của các protein cần
đo xét nghiệm ở mẫu nghiên cứu vì các protein thường có hệ số tắt khác nhau ở bước sóng
280nm (Hệ số tắt biểu thị bằng sự hấp thụ của dung dịch 1% protein đối với một tia sáng có
bề dày 1cm). Thêm vào đó, các protein có cấu trúc khác nhau cũng cho khả năng tạo phản
ứng mầu khác nhau với các thuốc thử tạo mầu như thuốc thử folin – ciocalteu, coomassie
brilliant blue G 250.
Sau đây là bảng cho các giá trị hệ số tắt (E2801%, nghĩa là sự hấp thụ của dung dịch 10mg
protein/ml ở bước sóng 280nm) đối với một số loại protein khác nhau:
Bảng 3.1.Hệ số tắt của một số protein ở bước sóng 280nm
(theo Fashman, 1976)
Các protein
E2801%
IgG
13,6
IgM
11,8
IgA
13,2
IgA tiết
13,1
IgD
17,0
IgE
15,3
Chuỗi γ
13,7
Chuỗi µ
13,9
Chuỗi α
15,5
Chuỗi nhẹ
12,3
Fab
15,0
Fc
12,0
VH
27,0
Con A (lectin Canavalia ensiformis)
12,0
Lectin Lens culinaris (LCA)
12,5
BSA
6,7
3. Nếu chưa biết hệ số tắt của protein, hoặc dung dịch gồm hỗn hợp của một số dạng protein
thì nồng độ protein tổng số có thể được tính theo phương trình sau:
Nồng độ protein, tính theo mg/ml = 1,55 x A280 – 0,77 x A260
Trong đó:
+ A280 là giá trị hấp thụ ở bước sóng 280 nm.
+ A260 là giá trị hấp thụ ở bước sóng 260 nm.
4. Nếu tỉ lệ A280/A260 thấp hơn 0,6 nghĩa là dung dịch protein đã lẫn (nhiễm) axit nucleic,
các peptit, chất tẩy rửa hoặc chất kháng khuẩn azit natri (NaN 3). Trường hợp này cần sử
dụng phép đo nồng độ protein theo kỹ thuật Lowry hoặc Bradford.
5. Dung dịch protein có nồng độ thấp hơn 0,1mg/ml thường cho kết quả khơng chính xác.
