Xác định hoạt độ enzym β Galactosidase bằng phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (503.43 KB, 17 trang )
Xác định hoạt độ enzym
β- Galactosidase
bằng phương pháp quang
phổ hấp thụ phân tử
Giảng viên: PGS.TS Quản Lê Hà
Sinh viên: Nguyễn Thị Thúy Ngân
MSSV: 20132749
Sơ lược về enzym β- Galactosidase
● Chất nền : ganglioside GM1, lactosylceramides, lactose,
và nhiều glycoprotein.
● Nó cũng có thể tách fucosides và arabinosides nhưng với
hiệu quả thấp hơn nhiều
Cấu trúc không gian
● β - galactosidase có nhiều đồng phân như :
beta-galactosidase (EBG), beta-glucosidase ,
6-phospho-beta-galactosidase, beta-mannosidase, và
lactase-phlorizin hydrolase
● . β - galactosidase bị ức chế bởi L-ribose , chất ức chế
không cạnh tranh iốt , và các chất ức chế cạnh
tranh phenylthyl thio-beta-D-galactoside (PETG),
D-galactonolactone , isopropyl thio-beta-D-galactoside
(IPTG) , và galactose.
- Enzym ngoại bào
Tiết ra ngoài môi trường
- Enzym nội bào
Tích tụ trong tế bào, ở dạng tự do hoặc liên kết với màng tế
bào hoặc lyzosome
Vi sinh vật tổng hợp
NẤM MEN
Candida pseudtropicalis, Crypotoccus laurentii,
Kluyverromyces lactics, K.fragilis, K. marxianus, Torulopsis
sphaerica, T versalitis …
NẤM MỐC
Aspergilus awmori, A. cellulosae, Penicilum canescens,
Rhizopus acidus, R.niveus..
VI KHUẨN
Streptococcus pneumoniae SP3-BS71, Clostridium
perfringens, Lactococcus pneumonira…
Mô hình sản xuất enzym từ nấm men trong
đề tài.
A
Two expression Plasmids
Β-galactosidase
Dùng chỉ thị X- Glal
● Nguyên tắc: của phương pháp dựa trên khả năng thủy
phân X-Gal hình thành nên kết tủa màu xanh blue kiểu
indigo của enzym β - galactosidase.
● Ưu điểm: thao tác đơn giản, dễ thực hiện, hóa chất không
quá phức tạp.
● Nhược điểm: Độ chính xác thấp, khả năng sai số cao, chỉ
xác định định tính chứ không áp dụng để định lượng.
Quang phổ hấp thụ phân tử
● Nguyên tắc của phương pháp : để xác định một chất bất
kì, ta có thể tìm cách đo một tín hiệu bất kỳ có quan hệ
trực tiếp hoặc gián tiếp.
● Yêu cầu : +Ánh sáng được sử dụng trong nghiên cứu
là ánh sáng đơn sắc.
+ Trong quá trình đo quang, không xuất hiện
các tương tác giữa chất nghiên cứu với chất lạ hay môi
trường.
Quang phổ hấp thụ phân tử
● Ưu điểm: tính chính xác của kết quả khá cao, áp dụng để
định lượng được chất cần phân tích.
● Nhược điểm: thao tác phức tạp, cần độ chuẩn xác, có sự
đầu tư về thiết bị và hóa chất.
Hóa chất
●
Thiết bị dụng cụ
●
●
●
●
Máy li tâm
Máy so màu quang phổ
Thiết bị ổn nhiệt
Các dụng cụ kèm theo trong quá trình thao tác
Chuẩn bị sinh khối
● + ly tâm 2ml dịch nuôi cấy, ở 4ᵒC với tốc độ 6000 vòng /
●
●
●
●
phút trong 4 phút.
+ loại bỏ phần dịch trong, phần cặn bã được tái tạo huyền
phù bằng cùng một thể tích dung dịch đệm Z đã làm lạnh.
+ Pha loãng dịch huyền phù chứa tế bào vi sinh vật bằng
dung dịch đệm Z
+ Làm tăng tính thấm của các tế bào vi sinh vật đã pha
loãng này bằng cách thêm 100 µl Cloroform và 50 µl dung
dịch SDS 0,1 % vào 1ml huyền phù đã pha loãng.
+ Lắc đều và để ổn định ở 28ᵒC trong 5 phút.
Phân tích
●
●
THANK YOU
