=

MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY
TRONG IN VITRO


Giới thiệu




Nuôi cấy mô tế bào thực vật là sự nuôi cấy vô
trùng các cơ quan, mô, tế bào thực vật trên môi
trường nuôi cấy được xác định rõ.
Nghiên cứu thành phần để chuẩn bị môi trường
thích hợp cho các yêu cầu nuôi cấy khác nhau sẽ
quyết định sự thành công của công tác nuôi cấy
mô tế bào thực vật.


Thành phần môi trường(Ingredients)
Các thành phần cơ bản

Các thành phần tự chọn

-Nước

-Chelates

-Các nguyên tố khoáng

-Chất thẩm thấu

-Nguồn carbohydrate

-Than

-Vitamins

-Amino acid

-Chất tạo gel

-Đạm hữu cơ

-Chất điều hòa sinh trưởng

Nguyễn Bảo Toàn, PhD, Nhân giống vô tính


*Nước:
Sử dụng nước cất 1 lần, nước cất 2 lần hoặc
nước khử khoáng.

*Nguồn carbohydrate,đường sucrose:
Đường sucrose thường được sử dụng 2-5%.

*Vitamins:
Nicotinic acid, Pyridoxine(vit B6),
Thiamine(vit B1), Myo inositol,
Vit C như là chất chống oxy hóa.


*Chất tạo gel:
Agar thường được sử dụng


Các nguyên tố khoáng
Các nguyên tố đa lượng(mM)
-Nitrogen(amonium và nitrate)
-Lân (P)
-Potassium (K)
-Magnesium (Mg)
-Calcium (Ca)
-Lưu huỳnh (S)
-Sodium (Na)
-Chloride (Cl)

Các nguyên tố vi lượng(µM)
-Iodine (I)
-Bo (B)
-Mangan (Mn)
-Kẽm (Zn)
-Molybdenum (Mo)
-Đồng (Cu)
-Cobalt (Co)
-Aluminium (Al)
-Nickel (Ni)
-Sắt (Fe)

Nguyễn Bảo Toàn, PhD, Nhân giống vô tính



Các nguyên tố khoáng

SPB2, Plant tissue culture, 2/27/2003 4:06 PM Page 37


Các chất điều hòa sinh trưởng
PGR
Auxin
Cytokinin
Gibberellins

Hiệu quả trong nuôi cấy mô
-Kích thích phân chia tế bào
-Kích thích quá trình tạo rễ.
-Kích thích sự thành lập chồi và cơ quan

- Kích thích sinh trưởng kéo dài mô phân sinh chồi

- Tạo phôi vô tính(somatic embryogenesis) và biến đổi
Abscisic acid phôi thành cây con
Ethylene

Ngăn cản sự sinh trưởng và phát triển của mô cấy. Bình
nuôi cấy dậy kín là điều kiện để tích lũy ethylene
Nguyễn Bảo Toàn, PhD, Nhân giống vô tính


Tương tác auxin/cytokinin





Auxin thấp/cytokinin cao
Auxin cao/cytokinin thấp
Trung gian
1

tạo chồi. (2)
tạo rễ. (3)
tạo callus. (1)

2

SPB2, Plant tissue culture, 2/27/2003 4:06 PM Page 37

3


Pradeep Kumar Naik and Sanghamitra Nayak, Different modes of plant regeneration and factors affecting
in vitro bulblet production in Ornithogalum virens, ScienceAsia 31 (2005): 409-414


Pradeep Kumar Naik and Sanghamitra Nayak, Different modes of plant regeneration and factors affecting
in vitro bulblet production in Ornithogalum virens, ScienceAsia 31 (2005): 409-414


Các thành phần tự chọn









Chelate: EDTA, EDDHA ( thành lập phức chất với các
cation kim loại, giúp giữ chúng trong dung dịch).
Tác nhân thẩm thấu ( mannitol là một đường alcohol
không biến dưỡng và chỉ có hiệu quả trong tác nhân thẩm
thấu)
Than hoạt tính (làm tối môi trường, hấp thu kim loại…)
pH ( được điều chỉnh trong khoảng 5.5 – 6)
Acid hữu cơ( acid citric, malic…)
Thành phần bổ sung không xác định (dịch chiết nấm men,
dịch trích cá, dịch trích trái cây…)


Một vài loại môi trường
nuôi cấy mô


Murashige T. and Skoog F. 1962. A revised medium
for rapid growth and bio-assays with tobacco tissue cultures
Physiologia Plantarum. 15 473-497
Macronutrients (mg/l)

Murashige & Skoog
Inorganic Salt Formulation
Micronutrients (mg/l)


Ammonium nitrate (NH4NO3)

1,650mg/l

Calcium chloride (CaCl2*H2O)

440mg/l

Colbalt chloride (CoCl2*6H2O)

0.025mg/l

Magnesium sulfate (MgSO4*7H2O)

370mg/l

Cupric Sulfate (CuSO4*5H2O)

0.025mg/l

Potassium phosphate (KH2PO4)

170mg/l

Ferrous sulfate (FeSO4*7H2O)

27.8mg/l

Manganese sulfate (MnSO4*4H2O)


22.3mg/l

Potassiom Iodine (KI)

0.83mg/l

Sodium molybdate (Na2MoO4*2H2O)

0.25mg/l

Zinc Sulfate (ZnSO4*7H2O)c

8.6mg/l

Potassium nitrate (KNO3)

1,900mg/l

Boric Acid (H3BO3)

Na2EDTA*2H2Oa

6.2mg/l

37.2mg/lb

Murashige & Skoog
Common Organic Additives
i-Inositol


100mg/l

Nicotinic Acid

0.5mg/l

Pyridoxine*HCl

0.5mg/l

Thiamine *HCl

0.1mg/l

IAA

1-30mg/l

Kinetin

0.04-10mg/l

Glycine (recrytallized)

2.0g/l

Edamine

1.0g/l


Sucrose

20g/l

Agar

10g/l


Components

MurashigeSkoog
(1962)

White
(1963

Gamborg
(1968)

Nitsch
(1951)

Heller
(1953)

Schenk Hildebrandt
(1972)


Nitsch Nitsch
(1967)

Kohlenbach Schmidt
(1975)

Knop
(1865)

-

-

134

-

-

-

-

-

-

370

720


500

250

250

400

125

185

250

Na2SO4

-

200

-

-

-

-

-


-

-

KC1

-

65

-

1,500

750

-

-

-

-

440

-

150


25

75

200

-

166

-

NaNO3

-

-

-

-

600

-

-

-


-

KNO3

1,900

80

3,000

2,000

-

2,500

125

950

250

-

300

-

-


-

-

500

-

1,000

1,650

-

-

-

-

-

-

720

-

NaH2PO4× H2O


-

16.5

150

250

125

-

-

-

-

NH4H2PO4

-

-

-

-

-


300

-

-

-

KH2PO4

170

-

-

-

_

-

125

68

250

FeSO4× 7H2)


27.8

-

27.8

-

-

15

27.85

27.85

-

Na2EDTA

37.3

-

37.3

-

-


20

37.25

37.25

-

MnSO4× 4H2O

22.3

7

10 (1
H2O)

3

0.1

10

25

25

-


ZnSO4× 7H2O

8.6

3

2

0.5

1

0.1

10

10

-

CuSO4× 5H2O

0.025

-

0.025

0.025


0.03

0.2

0.025

0.025

-

H2SO4

-

-

-

0.5

-

-

-

-

-


Fe2(SO4)3

-

2.5

-

-

-

-

-

-

-

NiC12× 6H2O

-

-

-

-


0.03

-

-

-

-

CoC12× 6H2O

0.025

-

0.025

-

-

0.1

0.025

-

-


(NH4)2SO4
MgSO4× 7H2O

CaC12× 2H2O

Ca(NO3)2× 4H2O
NH4NO3


Components

MurashigeSkoog
(1962)

White
(1963

Gamborg
(1968)

Nitsch
(1951)

Heller
(1953)

Schenk Hildebrandt
(1972)

Nitsch Nitsch

(1967)

Kohlenbach Schmidt
(1975)

Knop
(1865)

A1C13

-

-

-

-

0.03

-

-

-

-

FeC13× 6H2O


-

-

-

-

1

-

-

-

-

FeC6O5H7× 5H2O

-

-

-

10

-


-

-

-

-

K1

0.83

0.75

0.75

0.5

0.01

1.0

-

-

-

H3BO3


6.2

1.5

3

0.5

1

5

10

10

-

Na2M0O4× 2H2O

0.25

-

0.25

0.25

-


0.1

0.25

0.25

-

30,000
-

20,00
0
-

20,000
-

50,000
or
36,000

20,000
-

30,000
-

20,000~30
,000

-

10,000
-

-

Myo-Inositol

100

-

100

-

-

1,000

100

100

-

Nicotinic
Acid


0.5

0.5

1.0

-

-

0.5

5

5

-

Pyridoxine
HC1

0.5

0.1

1.0

-

-


0.5

0.5

0.5

-

Thiamine HC1

0.1-1

0.1

10

1

1

5

0.5

0.5

-

CaPantothenate


-

1

-

-

-

-

-

-

-

Biotin

-

-

-

-

-


-

0.05

0.05

-

Glycine

2

3

-

-

-

-

2

2

-

Cysteine HC1


-

1

-

10

-

-

-

-

-

Folic Acid

-

-

-

-

-


-

0.5

0.5

-

Glutamine

-

-

-

-

-

-

-

14.7

-

Sucrose

Glucose

Originated by: Agriculture and Consumer Protection (FAO). Dr. Masanaru Misawa Bio Inernational Inc.Toronto, Canada
Title: PLANT TISSUE CULTURE: AN ALTERNATIVE FOR PRODUCTION OF USEFUL METABOLITE (chapter 4)


Explant material, methods and results of published works on
the in vitro culture of Antirrhinum majus
Medium

pH

Sucro
se
(g/l)

Agar
(g/l)

Plant Growth
Regulators (mg/l)

Results

Author

Leaf and
stem
segments


Murashige &
Skoog (1962)

5.8

30

8

1 (2,4-D)

Callus formation

Rao et al.
(1976)

Stem
internode

Sangwan &
Harada (1975)

Callus formation

Pfister &
Widholm
(1984)

Seedling
root


Sangwan &
Harada (1975)

5.5

20

6

0.25 (NOA)

Callus formation

Pfister &
Widholm
(1984)

Shoot tips

Murashige &
Skoog (1962)

5.7

30

7

1 (BAP)


Callus formation

Atkinson et
al. (1989)

Seedling
root

Sangwan &
Harada (1975)

0.25 (NOA)

Shoot
regeneration via
callus

Pfister &
Widholm
(1984)

0.4 (2,4-D)

Shoot
regeneration via
callus

Pfister &
Widholm

(1984)

6

0.5-2 (2,4-D)

Embryoids via
callus

PoirierHamon et
al. (1974)

Liquid

1 (2,4-D) + 0.5
(BAP)

Embryoids via
colonies

PoirierHamon et
al. (1974)

Explant

Root callus

Syono & Furuya
(1972)


Stem
internode

Poirier-Hamon et
al. (1974)

Protoplasts

Poirier-Hamon et
al. (1974)

5.5

5.5

5.8

5.5

---

20

20

30

20

20.5


6

6

Liquid

0.25 NOA


Explant material, methods and results of published works on
the in vitro culture of Antirrhinum majus
Explant
Internode
stem
segments
Callus

Medium

pH

Sucro
se
(g/l)

Agar
(g/l)

Plant Growth

Regulators (mg/l)

Results

Author

Friable green
callus
embryogenesis

Sangwan &
Harada
(1975)

Nitsch et al
(1967)

5.5

20

7

0.25-0.5 (NOA) or
0.5 (2,4-D)

Murashige &
Skoog (1962)

5.8


30

8

1 (2,4-D) + 0.5
(BAP)

Indirect
embryogenesis

Rao et al.
(1976)
Sangwan &
Harada
(1975)

Internode
stem
segments

Nitsch et al.
(1967)

5.5

20

7


2 (IAA) + 4 (Kin)

Roots & multiple
shoots

Shoot tips

Murashige &
Skoog (1962)

5.7

30

7

1 (BAP)

Multiple shoots

Atkinson et
al. (1989)

Nodal
segments

Murashige &
Skoog (1962)

8


0.5 (NAA) + 1
(BAP)

Multiple shoots

GonzálezBenito et al
(1996)

Rooted plantlets

Pfister &
Widholm
(1984)

Rooted plantlets

GonzálezBenito et al.
(1996)

Shoots

Bourgin & Nitsch
(1967)

Shoots

Murashige &
Skoog (1962)


5.8

5.5

5.8

30

10

30

8

8

None

None

Micropropagation of snapdragon,J.M. Iriondo and E. Torres Dpto. Biología Vegetal
E.U.I.T. Agrícola,Universidad Politécnica de Madrid,E-28040 Madrid, Spain


IN VITRO SEED GERMINATION AND
SEEDLING DEVELOPMENT OF
Calopogon tuberosus AND Sacoila
lanceolata var. lanceolata: TWO FLORIDA
NATIVE TERRESTRIAL ORCHIDS
By PHILIP KAUTH

MASTER OF SCIENCE
UNIVERSITY OF FLORIDA,2005


IN VITRO SEED GERMINATION AND SEEDLING DEVELOPMENT OF Calopogon tuberosus AND Sacoila lanceolata var. lanceolata:
TWO FLORIDA NATIVE TERRESTRIAL ORCHIDS
By PHILIP KAUTH, MASTER OF SCIENCE, UNIVERSITY OF FLORIDA,2005


Sự phát triển của Calopogon tuberosussau 12 tuần trên 3 loại môi trường.

(IN VITRO SEED GERMINATION AND SEEDLING DEVELOPMENT OF Calopogon tuberosus AND Sacoila lanceolata var. lanceolata:
TWO FLORIDA NATIVE TERRESTRIAL ORCHIDS
By PHILIP KAUTH, MASTER OF SCIENCE, UNIVERSITY OF FLORIDA,2005)


Kết luận






Môi trường muôi cấy là yếu tố quan trọng quyết
định thành công của công tác nuôi cấy mô.
Có nhiều loại môi trường khác nhau mà mỗi loại
sẽ đáp ứng với những mục đích nuôi cấy khác
nhau.
Chuẩn bị môi trường thích hợp với mục đích nuôi
cấy thì mới đạt được kết quả mong muốn.



Xin chân thành cám ơn !