MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY TRONG LÊN MEN CÔNG NGHIỆP
I.

GIỚI THIỆU
Môi trường nuôi cấy được thiết kế tùy theo yêu cầu của chủng vi sinh vật, phương

pháp lên men và sản phẩm mục tiêu. Trước khi thiết kế môi trường lên men cần khảo sát
chi tiết về nhu cầu dinh dưỡng của chủng, nguồn cơ chất trực tiếp tạo ra sản phẩm và hệ
thống thiết bị công nghệ lên men. Tuy nhiên các môi trường lên men đều có chung một số
yêu cầu căn bản. Toàn bộ các chủng vi sinh vật trong quá trình sinh trưởng, phát triển và
tạo sản phẩm trao đổi chất đều cần nước, nguồn năng lượng, nguồn carbon, nguồn
nitrogen, nguồn khoáng vi lượng, vitamin và oxygen (đối với trường hợp hiếu khí). Đối
với qui mô phòng thí nghiệm thì việc chuẩn bị môi trường tương đối đơn giản vì thường
dùng các hợp chất tinh khiết. Tuy nhiên với qui mô sản xuất công nghiệp thì công đoạn
này khá phức tạp.
Trong công nghiệp người ta dùng các nguồn dinh dưỡng khác nhau để chuẩn bị môi
trường với yêu cầu là thỏa mãn các điều kiện sau đây càng tốt:
• Tăng cường tối đa hiệu suất tạo sinh khối và sản phẩm
• Tăng cường tối đa nồng độ sinh khối hoặc sản phẩm
• Cho phép tạo được tốc độ sản xuất tối đa
• Hạn chế đến mức tối thiểu hiệu suất tổng hợp các sản phẩm không mong muốn
• Ổn định chất lượng và sẵn sàng cho sử dụng quanh năm
• Hạn chế đến mức tối thiểu các vấn đề nảy sinh, gây trở ngại cho việc khuấy trộn, chiết,
tinh sạch và xử lí chất thải.
Cần lưu ý là việc chọn môi trường có liên quan mật thiết đến thiết kế nồi lên men,
ảnh hưởng đến quá trình thu hồi sản phẩm và quá trình xử lí chất thải sau lên men.


Chương 4: Môi trường nuôi cấy trong lên men công nghiệp

II.

PHÂN LOẠI MÔI TRƯỜNG LÊN MEN
Hiện nay, có rất nhiều loại môi trường được sử dụng trong công nghiệp lên men, tùy

vào điều kiện hiện tại và mục đích lên men mà người ta sẽ thiết kế và lựa chọn những loại
môi trường phù hợp.
-

Dựa vào đặc tính vật lý của môi trường mà người ta phân loại thành:

+ Môi trường lỏng: môi trường này chủ yếu phục vụ cho quá trình lên men chìm.
+ Môi trường rắn: môi trường này chủ yếu phục vụ cho quá trình lên men bề mặt.
+ Môi trường bán rắn (hoặc xốp): phục vụ cho lên men bề mặt.
-

Dựa vào thành phần môi trường người ta phân thành:

+ Môi trường tự nhiên: nguyên liệu tự nhiên có nguồn gốc động, thực vật. Thành phần
hoá học chính xác của các nguyên liệu trong môi trường này đến nay chưa biết rõ hoặc
xác định rất khó khăn.
+ Môi trường tổng hợp: môi trường có thành phần xác định thường dùng trong lên men
quy mô phòng thí nghiệm.
+ Môi trường bán tổng hợp: bên cạnh những thành phần tự nhiên còn bổ sung 1 lượng
chính xác các chất dinh dưỡng, chất kích thích tăng trưởng hay các nguyên tố vi lượng.
-

Dựa vào mục đích sử dụng của môi trường người ta phân thành:

+ Môi trường hoạt hóa chủng: các dạng môi trường thạch trong đĩa petri hay môi trường
thạch nghiêng trong ống nghiệm giúp phục hồi các đặc tính vốn có của chủng vi sinh vật.

+ Môi trường nhân giống: thường là môi trường lỏng với quy mô từ 100-500 ml, môi
trường này sẽ giúp tạo một lượng sinh khối đủ lớn để đưa vào qui trình sản xuất.
+ Môi trường lên men sản xuất: sử dụng trong các nồi lên men sản xuất để thu sinh khối
tế bào, sản phẩm biến dưỡng, ...

2


Chương 4: Môi trường nuôi cấy trong lên men công nghiệp

III.

CÁC THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG LÊN MEN
1. Nước
1.1 Yêu cầu nước cho lên men

 Nước dùng cho các xí nghiệp lên men phải đáp ứng được những yêu cầu về nước uống,
không có mùi vị, không màu, trong suốt.
Các yêu cầu về nước uống như sau:
• Độ cứng chung, mg đương lượng không quá 7
• Hàm lượng các chất, mg/l không quá
Cặn khô

1000

Clorit

350

Sunfat


500

Chì

0,1

Acsen

0.05

Fluor

1,5

Đồng

3,0

Kẽm

5,0

• Tổng số lượng vi sinh vật trong 1ml không quá 100 (CFU/ml)
• Số lượng trực khuẩn đường ruột trong 1l nước:
Chuẩn coli, ml, không nhỏ hơn

300

Chỉ số coli, không lớn hơn


3

 Đối với nguồn nước giếng hoặc thủy vực cho phép chuẩn coli không nhỏ hơn 100 (chỉ số
coli là 10). Nói chung về nước uống không cho phép có mặt ammoniac và các muối của
acid nitrit, về các muối của kim loại nặng (thủy ngân, bari…). Độ oxi hóa của nước
không vượt quá 3,0mg O2/l. Trong một số trường hợp riêng biệt, được sự đồng ý của các
cơ quan giám sát vệ sinh cho phép độ cứng chung cũng không quá 14 mg đương lượng.
 Nước dùng cho sản xuất bia, ngoài yêu cầu chung về chất lượng nước còn có những yêu
cầu cụ thể sau:
Carbon với giới hạn nồng độ, mg/l

50

Sunfat

350
3


Chương 4: Môi trường nuôi cấy trong lên men công nghiệp

Clorit

150

Nitrat

40


SiO2

20

Muối Mg

100

Sắt

0,3

Amoniac

0,1

Độ oxy hóa

2 mgO2/l

Độ cứng tạm thời đối với bia sáng màu vào khoảng 0,71 mg đương lượng và độ cứng
vĩnh cửu là 0,36- 0,72 mg đương lượng, đối với bia sẫm màu, độ cứng tạm thời là 2,85 –
4,8 mg đương lượng và độ cứng vĩnh cửu không xác định.
 Nước dùng pha nước ngọt và rượu có độ cứng chung không quá 1,6 mg đương lượng và
độ cứng tạm thời 0.36 mg đương lượng. Nếu nước có chứa các chất rắn lơ lửng, hoặc độ
cứng vượt quá tiêu chuẩn thì cần phải được xử lí trước khi sử dụng.
1.2 Xử lí nước
Với mục đích là loại các chất rắn có trong nước và giảm độ cứng ta có thể sử dụng
các phương pháp sau:
• Lắng và lọc

• Đông tụ
• Loại các muối canxi và magie làm mềm bằng phương pháp lắng đọng hoặc
trao đổi ion.
a) Lắng đọng và lọc nước
Để tách nước khỏi các vật thể nhỏ, thường để lắng và lọc. Lắng là quá trình lắng
đọng dưới tác dụng của trọng lực, lọc là quá trình tách vật rắn ra khỏi nước nhờ các lỗ hở
hoặc khe hở của các vật liệu lọc giữ lại các vật thể rắn có kích thước lớn hơn lỗ màng vật
liệu. Lắng cặn thường chậm, yêu cầu phải có các bể với diện tích mặt bằng lớn, do vậy ít
được sử dụng. Phương pháp phổ biến cho việc tách các vật thể rắn nhỏ ra khỏi nước là
lọc với vật liệu lọc là cát vàng, sỏi, than đá đập nhỏ.
b) Đông tụ hay keo tụ
4


Chương 4: Môi trường nuôi cấy trong lên men công nghiệp

Khi trong nước có thể keo thì rất khó cho việc lọc bình thường. Trong trường hợp
này, cần bổ sung chất keo tụ làm cho các thể keo kết lại với kích thước lớn hơn và sau đó
để lắng cặn. Quá trình này được họi là đông tụ. Những chất làm đông tụ là sunfat nhôm,
sunfat sắt. Sunfat nhôm còn được gọi là phèn. Có hai dạng phèn đơn và phèn kép. Ngày
nay người ta còn tạo ra các dạng polymer của các dạng phèn này có khả năng đông tụ
cao. Sunfat nhôm được cho vào nước phản ứng với các bicarbonat canxi và magie:
Al2(SO4)3 + 3Ca(HCO3)2 = 2Al(HCO3)3 + 3CaSO4
Al(HCO3)3 không bền và phân hủy thành nhôm và carbonic
Al(HCO3)3 = Al(OH)3 + CO2
Hydroxit nhôm tạo thành các dạng dịch keo, các dịch thể trong keo mang điện
dương, xảy ra sự keo tụ các thể keo của nước và hydroxit nhôm, tạo thành cặn lắng
xuống đáy. Cặn lắng này kéo theo các vật thể rắn nhỏ ở dạng huyền phù, để lắng và lọc.
c) Làm mềm nước
Làm mềm nước được tiến hành bằng các phương pháp với vôi, xút vôi và trao đổi

ion. Phương pháp dùng vôi làm mềm nước thường dùng với nước có độ cứng tạm thời
cao và độ cứng vĩnh cửu thấp. Phản ứng xảy ra như sau:
Ca(HCO3)2 + Ca(OH)2 = 2CaCO3 + 2H2O
Mg(HCO3)2 + Ca(OH)2 = CaCO3 + MgCO3 + 2H2O
MgCO3 hòa tan khá tốt trong nước và lại phản ứng với hydroxyt canxi thành
Mg(OH)2 không tan
MgCO3 + Ca(OH)2 = Mg(OH)2 + CaCO3
Sau đó đem lọc
Để làm giảm độ cứng tạm thời và độ cứng vĩnh cửu của nước, người ta sử dụng
phương pháp xút vôi (hydroxyt canxi và natri carbonat): hydroxyt canxi làm kết lắng các
muối trong độ cứng tạm thời, còn natri carbonat – các muối của độ cứng vĩnh cửu.
CaSO4 + Na2CO3 = CaCO3 + Na2SO4
MgSO4 + Na2CO3 = MgCO3 + Na2SO4
MgCO3 + Ca(OH)2 = Mg(OH)2 + CaCO3
Các cặn lắng được lọc bỏ.
5


Chương 4: Môi trường nuôi cấy trong lên men công nghiệp

d) Phương pháp trao đổi ion
Trao đổi ion là sự trao đổi ion của nước với nhựa ionit. Nhựa ionit là các vật liệu rắn
không tan trong nước, có khả năng trao đổi ion. Nếu nhựa có khả năng trao đổi với các
cation thì được gọi là catinoit, ngược lại là anionit.
Ionit có thể là chất hữu cơ hay vô cơ, có trong tự nhiên hoặc nhân tạo. Các cationit có
nguồn gốc vô cơ tự nhiên là nhóm các silicat alumin (nhôm silicat), như xeolit, đất sét,
glaucolit (kali sắt alumino silicat),… Những ionit tổng hợp nhân tạo là permunit
(aluminat silicat acid yếu). Ionit hữu cơ trong tự nhiên là acid humic có trong đất, có tác
dụng điều chỉnh dinh dưỡng thực vật và acid humic của than đá, than nâu.
Trong xí nghiệp lên men hay dùng than lưu huỳnh để làm mềm nước. Khi lọc nước

qua than lưu huỳnh (Na – cation) sẽ xảy ra các phản ứng sau:
Na2R + CaSO4 = CaR + CaSO4
Na2R + CaCl2 = CaR + 2NaCl
Na2R + MgSO4 = MgR + Na2SO4
Na2R + MgCl2 = MgR + 2NaCl
Na2R + Ca(HCO3)2 = CaR + 2NaHCO3
Na2R + Mg(HCO3)2 = MgR + 2NaHCO3
R là phức cationit
Làm mềm nước bằng than lưu huỳnh hoặc các cationit khác có thể được thực hiện
trong các ống lọc đứng. Các ống này là các ống kim loại hình trụ và kín. Dưới đáy ống
lọc để một lớp lót bông những hạt than đá có kích thước xác định.Trên lớp lót đổ đầy
nhựa cationit. Sau đó cho nước chảy từ từ qua cột. Trong đó sẽ xảy ra sự trao đổi ion: tất
cả các ion Na+ sẽ trao đổi với ion Ca 2+ và Mg2+. Khả năng trao đổi ion của nhựa sẽ giảm
dần theo thời gian. Để phục hồi khả năng này ta cho chảy vào cột dung dịch NaCl:
CaR + 2NaCl = Na2R + CaCl2
MgR + 2NaCl = Na2R + MgCl2
6


Chương 4: Môi trường nuôi cấy trong lên men công nghiệp

Dùng Na- cation làm cho nước giảm độ cứng đáng kể, nhưng phương pháp này
không làm giảm độ kiềm của nước. Nếu yêu cầu làm giảm độ kiềm, có thể acid hóa nước
đã mềm bằng acid sunfuric hoặc acid clohydric.
Phản ứng trung hòa xảy ra như sau:
2NaHCO3 + H2SO4 = Na2SO4 + 2H2O + 2CO2
Có thể làm mềm nước bằng cách kết hợp hai phương pháp với vôi và Na – cationit.
Vôi sẽ khử độ cứng tạm thời, còn Na – cationit loại các muối vĩnh cửu. Cũng có thể dùng
H- cationit làm mềm nước. Ion H + được trao đổi với ion Ca 2+ và Mg2+. Nước chảy qua
phin lọc chứa nhựa H – cationit và các phản ứng xảy ra như sau:

H2R + Ca(HCO3)2 = CaR + 2H2O + 2CO2
H2R + + Mg(HCO3)2 = MgR + 2H2O + 2CO2
H2R + CaSO4 = CaR + H2SO4
H2R + CaCl2 = CaR + 2HCl
H2R + MgSO4 = MgR + H2SO4
H2R + MgCl2 = MgR + 2HCl
Trong dung dịch H – cationit, các acid vô cơ tự do sẽ tạo thành (acid sunfuric và
clohydric). Các acid này sẽ ăn mòn kim loại. Do vậy, người ta thường dùng H – Na –
cationit liên tiếp hoặc đồng thời. Khi sử dụng đồng thời thì một phần nước cho chảy qua
phin lọc chứa Na – cationit, một phần nước khác chảy qua phin H – caionit. Nước qua Na
– cationit sẽ kiềm hóa, còn qua H – cationit – acid hóa. Cho hai loại nước này chảy chung
với nhau sẽ xảy ra phản ứng trung hòa. Cũng có thể cho nước chảy qua 2 phin lọc liên
tiếp và cũng thu được nước trung hòa:
H2SO4 + Ca(HCO3)2 = CaSO4 + 2H2O + 2CO2
2HCl + Ca(HCO3)2 = CaCl2 + 2H2O + 2CO2
Để khử muối cho nước, người ta cho nước chảy liên tiếp vào lọc H – cationit và lọc
anionit. Trong phin lọc thứ nhất có các ion trong nước như Ca 2+, Mg2+, Na+ và những ion
khác sẽ trao đổi với ion H + của cationit, CO2 sẽ thoát ra. Để khử các anion trong nước,
người ta cho nước qua lọc chứa các anion ở dạng OH- và phản ứng xảy ra như sau:
2ROH + H2SO4 = R2SO4 + 2H2O
7


Chương 4: Môi trường nuôi cấy trong lên men công nghiệp

ROH + HCl = RCl + H2O
Vì vậy, nếu cho nước chảy qua cả 2 phin lọc thì có thể loại bỏ được tất cả các cation
cũng như anion trong nước. Tái sinh phin lọc H – cationit bằng cách cho dung dịch
H2SO4 hoặc HCl chảy qua, còn tái sinh lọc anionit dạng OH- bằng dung dịch xút.
1.3 Khử khuẩn cho nước

Nước cung cấp cho lên men nếu nhiễm khuẩn vượt quá mức cho phép cần phải tiến
hành diệt khuẩn. Diệt khuẩn có thể bằng phương pháp hóa học hoặc phương pháp vật lí,
cũng có thể kết hợp 2 phương pháp:
a) Khử khuẩn bằng Clo
Phương pháp clorit diệt khuẩn, dùng với khí clo hoặc clorua vôi (hypoclorit vôi –
Ca(ClO)2) và nước Javel (hypoclorit Natri – NaClO)
Trong nước Cl và OCl- có tính sát khuẩn và được gọi là Clo hoạt tính
Cl2 + H2O = HOCl + HCL
HOCl  H+ + OCl- (ion OCl-này không bền dễ bị phân hủy thành H và Cl)
H và Cl có tác dụng diệt khuẩn
Cl2 + 2NaOH = NaClO (nước Javel) + NaCl + H2O
NaClO  Na+ + OCl- (dễ phân ly thành Cl và O)
Cl2 + 2Ca(OH)2 = Ca(ClO)2 + CaCl2 + H2O
Sát khuẩn cho nước thường dùng hơn cả là khí clo (Cl 2) trong bình thép và clo hóa
nước chỉ cần với nồng độ 0,1 – 0,2 mg/l.
Nước Javel ở dạng lỏng là chất oxy hóa rất mạnh, có tính sát khuẩn cao. Clorua vôi ở
dạng bột: hòa tan thành dịch 3 – 5% rồi cho vào nước. Hiện nay diệt khuẩn người ta hay
dùng hợp chất của clo là các viên cloramin B (CH 3C6H4SO2NaNCl). Dung dịch cloramin
B 0,02% có thể ức chế được tụ cầu vàng và diệt khuẩn đường ruột. Các viên này thường
có 20 – 40% lượng clo hoạt động.Thời gian khử khuẩn khoảng 20 – 40 phút.
Dùng clo diệt khuẩn cho nước thường còn dư một chút hóa chất này trong nước và
làm cho nước có mùi clo. Để khắc phục, người ta thường gia nhiệt hoặc thổi khí cho
nước. Dùng clo còn có nhược điểm yếu nữa là nếu trong nước có mặt các hợp chất
8


Chương 4: Môi trường nuôi cấy trong lên men công nghiệp

phenol thì clo dễ kết hợp với phenol và tạo thành clophenol. Hợp chất này với một nồng
độ vô cùng nhỏ cũng làm cho nước có mùi khó chịu.

Một điều cần lưu ý: dùng clo diệt khuẩn cho nước chỉ với điều kiện nước chứa ít
hoặc không có chất hữu cơ. Nếu nồng độ các chất hữu cơ cao dễ tạo thành phức chứa clo
ở dạng AOX. Dạng này gây độc và có thể là tác nhân gây ung thư.
b) Khử khuẩn bằng ozon
Ozon có công thức là O3 và dễ bị phân hủy thành O 2 và O. O là nguyên tử có tác
dụng diệt khuẩn.
Dưới tác dụng của tia lửa điện giữa 2 điện cực, oxy trong không khí tạo thành ozon.
Nồng độ ozon ra khỏi thiết bị tạo ozon là 1 – 2% hỗn hợp khí và đưa vào nước để sát
khuẩn. Ozon dễ hòa tan vào trong nước, liều diệt khuẩn là 2- 15mg/l. Khi mới hòa vào
nước, tác dụng diệt khuẩn chưa rõ ràng, khi đủ lượng, ozon diệt khuẩn trong 3 – 8s.
Phương pháp này tiện lợi, nhưng cần phải trang bị thiết bị sinh ozon với tần số khá
cao.
Ngoài hai phương pháp trên, người ta còn sử dụng ion bạc sát khuẩn nước. Dịch chứa
ion này với nồng độ cực kì thấp cũng đã có khả năng sát khuẩn.
c) Khử khuẩn bằng tia cực tím (UV)
Trong ánh nắng mặt trời có tia cực tím. Đèn thủy ngân – thạch anh áp lực cao và đèn
thủy ngân – argon áp lực thấp sẽ sinh ra tia cực tím. Tia cực tím được phát ra từ các đèn
được chiếu qua nước. Yêu cầu nước phải trong và ít, hoặc không có chất hữu cơ. Nhược
điểm của tia cực tím là không xuyên qua được vật rắn.
Với nước, diệt khuẩn bằng ozon và clo có chi phí cao, phần nhiều chi phí là do thiết
bị.
2. Nguồn năng lượng
Năng lượng cho sự tăng trưởng của vi sinh vật bắt nguồn hoặc là từ sự oxy hóa các
thành phần dinh dưỡng trong môi trường hoặc là từ ánh sáng. Hầu hết trong công nghiệp
vi sinh, các chủng thường dùng là hóa dưỡng. Do vậy, nguồn năng lượng thông dụng nhất
được dùng là từ nguồn carbon như các carbohydrate, lipid và protein. Một vài chủng còn
9


Chương 4: Môi trường nuôi cấy trong lên men công nghiệp


dùng được cả hydrocarbon hay methanol làm nguồn C và năng lượng cho quá trình tăng
trưởng và trao đổi chất. Chu trình TCA vừa cung cấp các acid hữu cơ làm khung C để
hình thành các chất quan trọng khác cung cấp cho tế bào mặt khác còn cung cấp các chất
mang năng lượng lớn như NADH, FADH, các chất này sau đó di vào chuỗi chuyển điện
tử để tổng hợp ATP cung cấp nguồn năng lượng lớn cho hoạt động của tế bào.
Các carbohydrate thường được sử dụng: glucose, lactose, succrose, xylose.
Các protein: lysine, tryptophan, glycine
 Đường phân (Embden, Meyerhof và Parnas [EMP] Pathway)
Đây là con đường phổ biến nhất trong các vi khuẩn dị hóa đường (nó cũng được tìm
thấy trong hầu hết các tế bào động thực vật). Một loạt các quá trình chuyển đổi đường
thành pyruvate, tạo ra ATP (adenosine triphosphate) và NADH (nicotinamide adenine
dinucleotide). Năng lượng hóa học cần thiết cho các mục đích sinh tổng hợp được lưu trữ
trong các hợp chất mới được thành lập (ATP và NADH)

*

đề cập đến số lượng nguyên tử carbon trong phân tử

Có những lựa chọn thay thế cho con đường này cho việc chuyển hóa đường để sản
xuất năng lượng được lưu trữ trong ATP. Chúng bao gồm các con đường pentose
phosphate được tìm thấy trong hầu hết các tế bào động thực vật. NADPH được tạo ra
bằng con đường này. Một con đường khác, con đường Entner-Doudoroff thường chỉ được
tìm thấy trong các tế bào vi khuẩn nhất định.
 Hô hấp kỵ khí
Hô hấp kỵ khí bao gồm đường phân và lên men. Trong giai đoạn sau của quá trình
này NADH (tạo ra trong quá trình đường phân) được chuyển đổi trở lại NAD do mất một
10



Chương 4: Môi trường nuôi cấy trong lên men công nghiệp

nguyên tử hydro. Hydro được thêm vào pyruvate và tùy thuộc vào loài vi khuẩn, một loạt
các trao đổi chất sản phẩm cuối cùng được sản xuất.

 Hô hấp hiếu khí
Hô hấp hiếu khí liên quan đến đường phân và chu trình acid tricarboxylic
(Krebs). Pyruvate hoàn toàn bị phá vỡ thành carbon dioxide (C1) và trong quá trình này,
NAD được chuyển thành NADH. Vì vậy, trong quá trình lên men hiếu khí, NADH được
tạo ra từ hai nguồn (đường phân và chu trình Krebs). Phosphoryl hóa oxy hóa chuyển đổi
NADH dư thừa trở lại NAD và trong quá trình sản xuất hơn ATP (lưu trữ năng
lượng). Ubiquinone và cytochrome là những thành phần của chuỗi vận chuyển điện tử
tham gia vào quá trình sau này. Chuyển đổi oxy cho nước là bước cuối cùng trong tiến
trình.
Chu trình Krebs (hợp chất C4-C6 trung gian)

Phosphoryl hóa oxy hóa

Chu trình Krebs có 4 và 6 carbon trung gian. Pyruvate (C3) có thể được đưa vào chu
trình Krebs trong một cách mà các số C4/C6 trung gian vẫn giữ nguyên hoặc tăng.
a) Sự mất CO2 (C1) từ pyruvate thành acetyl CoA, tiếp theo là thêm vào một thành
phần cho C4 của chu kỳ (oxaloacetate) sản xuất một thành phần C6 (acid citric). Do đó số
11


Chương 4: Môi trường nuôi cấy trong lên men công nghiệp

lượng của các phân tử của C6 sản xuất tương đương với số lượng của các phân tử của C4
đầu xuất hiện.
b) Nhờ vào sự thêm CO 2 thành pyruvate, một hợp chất C4 được sản xuất. Trong

trường hợp này, các phân tử bổ sung của C4 (một thành phần chu kỳ) được hình thành.
Vì vậy, nếu một số thành phần chu kỳ được loại bỏ để sử dụng trong con đường sinh tổng
hợp khác, chúng có thể được bổ sung thông qua phản ứng này.
Chuyển hoá các axit béo
Các acid béo được cắt thành các nhóm acetyl (C2) và tham gia chu trình TCA nhờ
việc kết hợp với một chất trung gian C4 để tạo thành C6. Trong suốt chu trình, C2 được
giải phóng dưới dạng CO2 còn C4 được tái tạo. Về toàn thể phản ứng, không xảy ra sự
tăng lên về số lượng phân tử các sản phẩm trung gian. Vì thế nếu các acid béo là nguồn
C, không có chất trung gian chu trình TCA nào có thể bị loại bỏ mà không làm dừng chu
trình.
Thay vào đó, vi khuẩn sử dụng chu trình glyoxylate, trong đó nhờ các bước xúc
tác enzyme sẽ phóng thích 2 phân tử CO 2 từ chất trung gian C6. Chất trung gian C6 này
sau đó được chuyển thành hai hợp chất C4. Vì vậy đối với nhóm acetyl từ các acid béo,
chất trung gian thêm vào chu trình có thể được tạo thành. Con đường glyoxalte thường
hiếm khi tìm thấy ở tế bào động vật do việc sử dụng các tiền acid béo – chủ yếu từ thức
ăn.

12


Chương 4: Môi trường nuôi cấy trong lên men công nghiệp

13


Chương 4: Môi trường nuôi cấy trong lên men công nghiệp

3. Nguồn carbon
a)
−

−
−

Vai trò: carbon là nguồn dinh dưỡng quan trọng
Thành phần cấu trúc tế bào (50% vật chất khô).
Cung cấp năng lượng
Nguồn carbon được sử dụng thường có ảnh hưởng đến sự tổng hợp sinh khối hay

các sản phẩm trao đổi sơ cấp và thứ cấp.
b) Nguồn cung cấp
Các nguồn C thường dùng là carbohydate: bột ngô, bột ngũ cốc, khoai tây, bột mì.
Các loại trên được dùng nhiều trong sản xuất bột ngọt, rượu…

 Từ các nguyên liệu đường:
Mật rỉ: là chất lỏng đặc sánh còn lại sau khi đã rút đường bằng phương pháp cô và
kết tinh. Chứa các loại đường như sucrose, glucose, fructose. Thường dùng để sản suất
rượu rum.
• Mật rỉ mía: còn có chứa các hợp chất nitrogen, các vitamin và các hợp chất vô cơ.
Ngoài ra trong rỉ đường còn chứa một số chất keo, vi sinh vật tạp nhiễm bất lợi
cho quá trình lên men sau này, vì vậy tùy theo mục đích sử dụng khác nhau mà
người ta cần xử lý rỉ đường trước khi đưa vào sử dụng làm môi trường nuôi cấy vi
sinh vật trong công nghiệp lên men.
• Mật rỉ củ cải đường: là nước cốt sinh ra trong quá trình sản xuất đường từ củ cải
đường. Dịch này được cô đặc có thể dùng lâu dài.

 Nguồn carbon từ tinh bột và cellulose:
• Tinh bột được sử dụng dưới dạng hạt hoặc bột của khoai, sắn, lúa, đại mạch...
Dạng nguyên liệu này trước khi sử dụng làm môi trường lên men vi sinh vật phải
qua khâu xử lý và đường hóa. Đối với các chủng vi sinh vật có hệ enzyme amylase
phát triển có thể sử dụng trực tiếp tinh bột không thông qua khâu đường hóa.

• Cellulose được sử dụng là rơm rạ, giấy, mùn cưa...Tùy từng loại vi sinh vật khác
nhau mà có biện pháp xử lý nguyên liệu khác nhau sao cho phù hợp.

 Nguồn carbon từ dầu mỡ:
14


Chương 4: Môi trường nuôi cấy trong lên men công nghiệp

• Dầu olive, dầu bắp, dầu cotton, dầu đậu phộng … mỡ (các acid béo, oleic, linoleic,
linolenic,…), có thể cung cấp năng lượng cao hơn nhiều so với từ glucose.

 Nguồn carbon từ dịch kiềm sulfite:
• Là một loại phế phẩm của công nghiệp sản xuất cellulose. Dịch kiềm sulfite có
80% chất khô là đường hexose (glucose, mannose, galactose), ngoài ra trong dịch
kiềm sulfite có chứa acid ligninsulfuric, acid này chưa được vi sinh vật sử dụng.
• Một điều đáng lưu ý là dịch kiềm sulfite có đặc tính hấp phụ nhiều O 2, cho nên khi
nuôi cấy vi sinh vật hiếu khí có thể giảm mức cung cấp O 2 tới 60% so với mức
bình thường.

 Từ Hydrocarbon
• Người ta đã biết có nhiều vi sinh vật có khả năng sống được ở mỏ dầu, mỏ khí đốt,
ở đáy bồn chứa dầu, mặt đường nhựa... Nhiều công trình nghiên cứu cho thấy nparaffin là loại nguyên liệu tương đối vạn năng để nuôi cấy vi sinh vật. Theo số
liệu của Fuch (1961) có 26 giống vi sinh vật, trong đó 75 loài có khả năng phân
hủy hydrocarbon mạch thẳng.
4. Nguồn Nitrogen
a) Vai trò và nguồn gốc
Hầu hết các chủng vi sinh vật sử dụng trong công nghiệp có thể dùng được cả hai
nguồn nitrogen là vô cơ (ammonia, nitrate, nitrite) và hữu cơ (amino acid, urea, cao nấm
men, dịch chiết thịt, dịch chiết cao bắp, dịch thủy phân đậu nành, peptone, dịch thủy

phân cá–nước mắm,…). NH3 được dùng vừa để hiệu chỉnh pH vừa là nguồn cung cấp N
trong môi trường nuôi cấy S.cerivisiae để sản xuất công nghiệp dịch albumin người
(Collins, 1990). Các muối của ammonium như ammonium sulphate, thường gây nên tính
acid khi vi sinh vật sử dụng NH4+ và giải phóng gốc acid tự do. Mặt khác, khi gốc nitrate
được sử dụng thì gây nên sự thay đổi dần sang điều kiện kiềm. Ban đầu, ammonium
nitrate tạo nên pH acid khi NH4+ được sử dụng và sẽ gây ức chế quá trình đồng hóa
nitrate. Sau đó khi nguồn NH4+ bị cạn kiệt, có sự chuyển dần sang điều kiện kiềm khi
nitrate được dùng làm nguồn N. Tuy nhiên có một ngoại lệ cho kiểu trao đổi chất nguồn
15


Chương 4: Môi trường nuôi cấy trong lên men công nghiệp

N này là đối với chủng Gibberella fujikuroi (Borrow và cộng sự, 1961, 1964). Ở pH 2,8
-3,0, nitrate ức chế sự đồng hoá NH 4+của vi sinh vật. Khi pH tăng dần đến giá trị thích
hợp, sự đồng hoá nitrate của vi sinh vật chuyển dần qua NH 4+. Nguồn N hữu cơ được sử
dụng có thể từ các nguồn amino acid, protein, urea. Trong nhiều trường hợp, sự tăng
trưởng của chủng sẽ nhanh hơn nếu chúng ta cung cấp nguồn N là hữu cơ, và một số
chủng vi sinh vật đòi hỏi một số amino acid nhất định cho tăng trưởng. Trong lên men
amino acid công nghiệp, cần bổ sung một lượng nhất định amino acid đối với các chủng
đột biến khuyết dưỡng các amino acid này. Tuy nhiên, các amino acid dùng để bổ sung
vào môi trường nuôi cấy là nguồn N hữu cơ phức tạp, thường không đồng nhất, rẻ tiền,
ổn định. Trong công nghiệp lên men sản xuất lysine, người ta sử dụng methionine và
threonine thu nhận từ dịch thủy phân đậu nành để bổ sung vào môi trường nuôi cấy thay
thế cho loại tinh khiết, đắt tiền.
Các hợp chất N dùng làm nguồn cung cấp amino acid là dịch chiết cao bắp, dịch đậu
nành, đậu xanh, từ hạt coton, cao nấm men. Ngoài ra các dịch này còn bổ sung các yếu tố
khác như vitamin, khoáng. Trong quá trình cất giữ các sản phẩm này, chất lượng của
chúng có thể bị ảnh hưởng bởi tác động của yếu tố môi trường như độ ẩm, nhiệt độ và
thời gian lưu giữ.

Trong sản xuất vaccines cho người, cần phải sử dụng nguồn amino acid tinh khiết để
chuẩn bị môi trường, không nên dùng amino acid từ protein. Khi chọn lựa nguồn nitơ cần
quan tâm đến các yếu tố sau:
• Cơ chế kiểm soát việc sử dụng nguồn nitrogen tồn tại bởi enzyme khử nitrate, một
enzyme liên quan đến việc chuyển hoá nitrate thành ion NH 4+, bị ức chế khi có sự
hiện diện của ammonia. Nguyên nhân của quá trình này là do ammonia hoặc ion NH 4+
là nguồn N được sử dụng thích hợp hơn. Người ta đã có các thí nghiệm khảo sát trên
nấm cho thấy rằng NH4+ ức chế sự hấp thụ các amino acid nói chung và các amino
acid màng nói riêng. Đối với Aspergillus nidulans, ammonia điều hoà sự sản xuất các
protease kiềm tính và trung tính. Vì thế, trong một hỗn hợp nguồn N, từng thành phần
của N có ảnh hưởng đến sự điều hòa trao đổi chất và do vậy có sự chọn lựa nguồn N
thích hợp để sử dụng trước cho đến khi nguồn này cạn kiệt.
16


Chương 4: Môi trường nuôi cấy trong lên men công nghiệp

• Người ta đã chứng minh rằng việc sản xuất kháng sinh bởi nhiều chủng vi sinh vật
khác nhau chịu ảnh hưởng bởi loại và nồng độ nitrogen trong môi trường nuôi cấy.
Nguồn N dễ đồng hóa NH4+, NO3-, các amino acid có thể ức chế sự sinh tổng hợp các
chất kháng sinh. Sự sản xuất kháng sinh chỉ bắt đầu tăng trong môi trường nuôi cấy
sau khi toàn bộ nguồn N đã được sử dụng hết.
Trong thí nghiệm nuôi cấy lắc trong bình tam giác, muối của các acid yếu
(ammonium succinate) được bổ sung vào làm nguồn N và để hạn chế sự thay đổi pH, có
thể dùng muối ammonium của các acid mạnh như Cl - hoặc SO42-. Theo cách này, người ta
có thể dùng muối phosphate có nồng độ thấp hơn trong môi trường để làm hệ đệm pH,
nhưng nếu nồng độ muối phosphate cao có thể gây ức chế việc sản xuất nhiều chất trao
đổi thứ cấp.
Trong lên men sản xuất gibberellin, nguồn N ảnh hưởng lên việc định hướng sản xuất
các loại gibberellin và tỷ lệ tương quan giữa các loại này (Jefferys, 1970). Năm 1963,

Rhodes đã chứng minh rằng nồng độ tối thích của nguồn N cho sản xuất griseofulvin có
sự biến thiên tùy thuộc vào kiểu cấy giống và loại nồi lên men đang sử dụng. Như vậy,
các yếu tố này cần phải được đề cập khi giải thích các kết quả các chương trình nghiên
cứu phát triển các loại môi trường nuôi cấy vi sinh vật. Một số nguyên liệu có chứa
nguồn N phức tạp, vi sinh vật không thể sử dụng được và gây trở ngại với các qui trình
thu hồi và qui trình xử lý chất thải.
b) Con đường chuyển hóa

17


Chương 4: Môi trường nuôi cấy trong lên men công nghiệp

5. Các nguyên tố khoáng trung-vi lượng
a) Vai trò
− Các nguyên tố trung - vi lượng là nguồn chất dinh dưỡng không thể thiếu đối với sự
sinh trưởng của vi sinh vật. Chúng có các chức năng sinh lý chủ yếu là: tham gia vào
thành phần của các trung tâm hoạt tính ở các enzyme của vi sinh vật, duy trì tính ổn
định của kết cấu của đại phân tử và tế bào, điều tiết và duy trì cân bằng áp suất thẩm
thấu của tế bào, khống chế điện thế oxy hoá khử của tế bào và là nguồn vật chất sinh
năng lượng đối với một số loài vi sinh vật.
− Hầu hết các chủng vi sinh vật đòi hỏi một số nguyên tố trung - vi lượng nhất định cho
sự tăng trưởng và trao đổi chất. Trong nhiều môi trường nuôi cấy Mg, P, K, S, Ca,
Chlorine là các thành tố rất cần thiết. Những nguyên tố này cũng có vai trò quan trọng
mặc dầu chỉ cần với số lượng rất nhỏ, khoảng 10-8-10-6 mol/ L môi trường nuôi cấy.

18


Chương 4: Môi trường nuôi cấy trong lên men công nghiệp


− Tùy từng loại môi trường mà nồng độ yêu cầu cũng khác nhau và do vậy chúng
thường được bổ sung vào môi trường từ các thành phần riêng biệt.
− Các nguyên tố khác như Co, Cu, Mn, Mb và Zn cũng là những nguyên tố đóng vai trò
quan trọng thường có sẵn trong các thành phần nguyên liệu nhưng chỉ với hàm lượng
rất nhỏ nên cần phải phân tích môi trường nuôi cấy để nếu cần thiết thì phải bổ sung
thêm nhằm đảm bảo rằng các nguyên tố vi lượng đạt hàm lượng theo nhu cầu của vi
sinh vật trong môi trường nuôi cấy. Nguyên tố vi lượng tham gia vào thành phần
enzyme và làm hoạt hoá enzyme.
− Trong lên men người ta đặc biệt chú ý đến vai trò của phosphor, vì nó ảnh hưởng đến
chất lượng của quá trình lên men. Nồng độ phosphate vô cơ trong môi trường cũng
ảnh hưởng đến sự sản xuất của bacitracins, citric acid (trong nuôi cấy bề mặt), ergot,
monomycin,

novobiocin,

oxytetraclin,

polyenes,

ristomycin,

rifamycin

Y,

streptomycin, vancomycin và viomycin.
Bảng 4.1 Vai trò các nguyên tố vi lượng
Nguyên tố kim loại
Coban (Co)

Molypden (Mo)

Đồng (Cu)

Mangan (Mn)
Niken (Ni)
Tungsten và Selen
Sắt (Fe)
Kẽm (Zn)

Vai trò
Cần để tạo vitamin B12, transcarboxylase của vi khuẩn lên men
propionic.
Có trong cấu trúc của molybdoflayvoprotein tham gia khử nitrate
và trong nitrogenase khử N2.
Có trong một số enzyme tham gia hô hấp như cytochrome C; có
trong enzyme tham gia quang hợp như plastocyanin và một số
superoxide dismutase.
Hoạt hóa nhiều enzyme, có trong một số superoxide dismutase, là
những enzyme rất quan trọng để khử độc dạng độc O2.
Có trong các enzyme hydrogenase có chức năng nhận hoặc phóng
thích H2.
Có vai trò trong định dạng cấu trúc enzyme dehydrogenase
Có trong nhiều enzyme trong tế bào đặc biệt là các enzyme hô hấp
Đóng vai trò trong cấu trúc nhiều enzyme: carbonic anhydrase,
alcol dehydrogenase, DNA polymerase, RNA polymerase.
Thường đóng vai trò nối các tiểu đơn vị protein trong sự sắp xếp
19



Chương 4: Môi trường nuôi cấy trong lên men công nghiệp

cấu hình đặc biệt cho hoạt động của enzyme.
b) Nguồn cung cấp
− Khi lên men công nghiệp người ta thường bổ sung P dưới dạng bột đậu, bột bắp, bã
rượi, hay ở dạng phosphate vô cơ.
− Với các chất khác như Mg, Na, Fe... vi sinh vật sẽ nhận từ môi trường dinh dưỡng ở
dạng muối hoặc ngay cả trong nước pha môi trường dinh dưỡng. Vì vậy khi pha môi
trường người ta thường dùng nước máy mà không dùng nước cất.
− Các nguyên tố như Mn, Mo, Co... thường có mặt trong các nguyên liệu tự nhiên ban
đầu khi đưa vào môi trường lên men như dịch trái cây, nước chiết từ các loại hạt,…
c) Nồng độ sử dụng
− Khi dùng môi trường tổng hợp để nuôi cấy vi sinh vật, cần phải bổ sung một lượng
chính xác các nguyên tố vi lượng.
Bảng 4.2 Khoảng nồng độ thích hợp của một số thành phần khoáng
Thành phần
KH2PO4

Khoảng nồng độ thich hợp (g/l)
1,0-4,0

MgSO4.7H2O

0,25-3,0

KCL

0,5-12,0

CaCO3


5,0-17,0

FeSO4.4H2O

0,01-0,1

ZnSO4.8H2O

0,1-1,0

MnSO4.H2O

0,01-0,1

CuSO4.5H2O

0,003-0,01

NaMoO4.2H2O
0,01-0,1
− Vì nhiều nguyên tố khoáng là kim loại nặng cho nên nếu dư thừa sẽ gây hại cho vi
sinh vật, làm giảm hiệu quả lên men, khi thiết kế nồi lên men, người ta chế tạo từ thép
carbon, bên trong nồi còn quét lớp kem bảo vệ. Khi cần bổ sung thêm nguyên tô
khoáng vào môi trường cần lưu ý khống chế chính xác liều lượng.

20


Chương 4: Môi trường nuôi cấy trong lên men công nghiệp


− Nếu thiếu chất khoáng trong quá trình sinh trưởng thì hoạt tính sinh lý của vi sinh vật
bị giảm sút, thậm chí ngừng sinh trưởng. Do nhu cầu dinh dưỡng của vi sinh vật là
không giống nhau cho nên khái niệm về nguyên tố vi lượng chi có ý nghĩa tương đối.
Vi sinh vật thường tiếp nhận nguyên tố vi lượng từ các chất dinh dưỡng hữu cơ thiên
nhiên, các hoá chất vô cơ, nước máy hay ngay từ trong các dụng cụ nuôi cấy bằng
thuỷ tinh. Chỉ trong những trường hợp đặc biệt mới cần bổ sung nguyên tố vi lượng
vào môi trường nuôi cấy vi sinh vật.
6. Chelator (Chất kìm)
a) Vai trò
Đối với nhiều loại môi trường lên men thường có tình trạng là ngay sau khi pha chế
hoặc sau khi thanh trùng có sự hình thành chất lắng cặn ở dạng phức hợp của phosphate
kim loại không tan. Gaunt và cộng sự (1984) đã chứng minh rằng khi thanh trùng môi
trường Mandels và Weber, một chất lắng cặn màu trắng được hình thành có chứa toàn bộ
Fe và hầu hết các kim loại như Ca, Mn, Zn hiện diện trong môi trường. Hiện tượng hình
thành lắng cặn này vừa làm giảm nồng độ các chất cần thiết cho sự phát triển và biến
dưỡng của vi sinh vật vừa gây cản trở cho quá trình thu hồi sản phẩm và vệ sinh thiết bị.
Để giải quyết vấn đề về sự hình thành các phosphote kim loại không tan trong môi
trường lên men, người ta bổ sung các chất chelator nồng độ thấp như ethylene diamine
tetraacetic acid (EDTA), citric acid, polyphosphates,… vào môi trường nuôi cấy. Người
ta thấy rằng khi thêm vào môi trường Mandels và Weber lượng EDTA có nồng độ 25
mg/dm3 thì không tìm thấy có sự xuất hiện của chất lắng cặn sau thanh trùng. Lưu ý việc
chọn lựa các chelator để không gây ức chế các chủng vi sinh vật trước khi đưa vào sử
dụng.
b) Nguồn cung cấp
Đối với môi trường dùng ở quy mô công nghiệp, không cần bổ sung chelator, do các
thành phần phức như dịch chiết nấm men, pepton, sẽ tạo phức với kim loại và đảm bảo
rằng kim loại được giải phóng dần trong quá trình đẳng trương.
7. Nhân tố tăng trưởng
21



Chương 4: Môi trường nuôi cấy trong lên men công nghiệp

a) Vai trò
Một số chủng vi sinh vật không thể tổng hợp toàn bộ các thành tố cấu tạo nên tế bào,
do vậy chúng đòi hỏi cần có một số tiền chất như vitamin, một số aminoacid đặc trưng,
acid béo hoặc sterol… những chất này gọi là nhân tố tăng trưởng.
b) Nguồn cung cấp
Các nhân tố tăng trưởng này thường có trong các nguồn nguyên liệu tự nhiên cung
cấp nguồn C và N dùng trong các công thức môi trường nuôi cấy. Tuy nhiên trong một số
trường hợp thì các nhân tố tăng trưởng này trong môi trường không đủ để đáp ứng nhu
cầu của vi sinh vật nên cần thiết phải bổ sung vào. Ví dụ người ta bổ sung calcium
pentothenate trong công thức môi trường để sản xuất dấm, hay trong quy trình lên men
sản xuất glutamic acid, biotin cũng được bổ sung với nồng độ nhất định.
8. Các chất đệm pH
Muốn thu nhận được sinh khối với năng suất tối đa, độ pH môi trường phải được
kiểm soát ở giá trị tối ưu. Một số hợp chất khi bổ sung vào môi trường nuôi cấy ngoài vai
trò là thành phần dinh dưỡng, còn đóng vai trò đặc trưng là chất đệm nhằm điều chỉnh pH
ở một giá trị ổn định. Nhiều môi trường được kiểm soát pH 7.0 nhờ sự kết hợp của đệm
CaCO3. Khi pH giảm, carbonate bị phân hủy để hiệu chỉnh pH ổn định. Ngoài vai trò
quan trọng đối với dinh dưỡng tế bào, phosphate còn đóng vai trò là chất đệm pH. Tuy
nhiên, nếu nồng độ phosphate cao sẽ gây ức chế sinh tổng hợp các chất trao đổi thứ cấp.
Sự cân bằng về tỷ lệ nguồn C và N trong môi trường cũng hình thành nên một cơ sở cho
việc kiểm soát pH như vai trò của một hệ đệm. Nguồn C và N này thường được cung cấp
bởi protein, peptides, có thể được điều chỉnh bằng các chất như NH 3, NaOH, H2SO4 tùy
theo yêu cầu.
Trong quá trình lên men, pH thay đổi do sự vận chuyển các chất qua màng tế bào và
một số vi sinh vật sinh tổng hợp acid hữu cơ rồi tiết ra bên ngoài tế bào, từ đó làm thay
đổi nồng độ luôn thay đổi. Nếu giá trị pH cao sẽ làm tổn thất trong quá trình lên men tăng

nhanh ion H+ trong môi trường. Khi đó, một số phân tử protein hoà tan trong môi trường
có thể bị đông tụ.
22


Chương 4: Môi trường nuôi cấy trong lên men công nghiệp

Ngoài ra, giá trị pH sẽ ảnh hưởng đến hoạt tính trao đổi chất của vi sinh vật. Trong
quá trình lên men, pH môi trường.
Dung dịch đệm giúp giữ nguyên độ pH cho các enzyme trong các cơ thể sống hoạt
động. Nhiều enzyme chỉ hoạt động trong một điều kiện cố định; nếu độ pH vươn ra xa
mốc ban đầu, enzyme sẽ bị chậm hoá, ngừng làm việc hoặc tệ hơn là bị biến tính, do đó
mãi mãi mất đi khả năng xúc tác.
9. Chất tiền thân
Một số hóa chất khi được bổ sung vào một số loại môi trường lên men sẽ hỗ trợ trực
tiếp cho việc tổng hợp một sản phẩm mong muốn. Ví dụ khi bổ sung cao bắp (corn-steep)
vào môi trường lên men sản xuất penicilin làm tăng sự tích luỹ sản phẩm từ 20 đơn
vị/cm3 lên 100 đơn vị/cm3 dịch môi trường. Trong cao bắp có chứa phenylalanine làm
tăng cường sản xuất benzylpenicillin.
Ở quy mô công nghiệp, cũng như các nguyên tố khoáng, người ta thường bổ sung
vitamin, các chất kích thích sinh trưởng thông qua việc bổ sung các nguyên liệu lên men.
Các nguyên liệu giàu vitamin và chất kích thích sinh trưởng như: cao ngô, rỉ đường, dầu
thực vật và các cơ chất khác, không cần thiết phải cho vitamin nguyên chất vào nồi lên
men.
10. Chất kìm hãm
Khi bổ sung các chất kìm hãm vào môi trường lên men, một sản phẩm đặc trưng
nhất định sẽ được tổng hợp nhiều hơn, hoặc một chất trao đổi trung gian theo con đường
thông thường sẽ được tích lũy dần. Sự sinh tổng hợp glycerol bằng vi sinh vật là một ví
dụ tiêu biểu. Sự sản xuất glycerol phụ thuộc vào biến đổi của ethanol khi loại bỏ
acetaldehyde. Khi thêm sodium bisulphite vào môi trường sẽ dẫn đến sự hình thành

acetaldehyde bisulphite. Do vậy không còn acetaldehyde để tái oxy hoá NADH 2, đóng
vai trò là chất nhận hydrogen của nó bị mất đi bởi dihydroacetone phosphate, sinh ra
trong quá trình glycolysis. Sản phẩm của phản ứng này là glyceral 3-phosphate, sau đó
chuyển thành glycerol. Ứng dụng của các chất kìm hãm đặc trưng trong lên men được ghi
nhận trong bảng sau đây.
23


Chương 4: Môi trường nuôi cấy trong lên men công nghiệp

11. Chất cảm ứng
Đa số các enzyme được sản xuất trong công nghiệp đều là enzyme cảm ứng. Các
enzyme này chỉ được sinh tổng hợp khi có sự đáp ứng với sự hiện diện của chất cảm ứng
trong môi trường nuôi cấy. Những enzyme này được tạo thành trong tế bào vi sinh vật
không phải chỉ phụ thuộc hoạt tính riêng của từng loại vi sinh vật, mà còn phụ thuộc vào
thành phần môi trường nuôi cấy và điều kiện nuôi cấy.
Ví dụ, khi nuôi cấy nấm mốc Aspergillus oryzae, nó có thể sinh tổng hợp enzyme
amylase, protease và cả cellulase tuỳ theo cơ chất cảm ứng mà ta đưa vào. Nếu cần có
hàm lượng protease cao, cho thêm 5% bột đậu nành, nếu cần có hàm lượng pectinase cao
cho thêm 5% bột cà rốt,... để làm cơ chất cảm ứng. Tương tự như vậy, khi nuôi cấy bề
mặt tế bào nấm mốc Aspergillus awamori trên cám sẽ thu nhận một số lượng lớn
glucoamylase, α-amylase, protease, pectinase, cellulose, nhưng khi nuôi cấy chìm trong
môi trường chứa tinh bột và nitrate thì chỉ thu được phức hợp amylase.
Hiện tượng này có thể giải thích bằng lý thuyết sinh tổng hợp. Khi trong môi trường
nuôi cấy có một chất khó đồng hóa, vi sinh vật phải tiết vào môi trường một hoặc những
enzyme tương ứng để phân hủy nó thành chất có thể đồng hóa được.
Một định nghĩa tổng quát hơn có thể nêu lên như sau: Một quá trình sinh tổng hợp
được gọi là cảm ứng, nếu như nó chỉ xảy ra ở mức độ đáng kể khi trong môi trường có cơ
24



Chương 4: Môi trường nuôi cấy trong lên men công nghiệp

chất đặc hiệu của enzyme này hoặc các chất trao đổi có cấu trúc tương tự cơ chất. Các
enzyme thuộc loại này gọi là enzyme cảm ứng. Các cơ chất kích thích quá trình tổng hợp
là chất cảm ứng. Trong công nghiệp sản xuất enzyme cần phải lựa chọn những chất cảm
ứng thích hợp và xác định nồng độ tối ưu của nó trong môi trường để có hiệu suất sinh
tổng hợp cao nhất.
Một ứng dụng nữa là lấy nấm men làm chất cảm ứng trong sản xuất streptomycin.
Trong quá trình lên men, streptomycin và mannosidostreptomycin được sinh tổng hợp.
Bởi vì mannosidostreptomycin chỉ có hoạt tính khoảng 20% so với streptomycin, do vậy
nó là sản phẩm không mong muốn. Chủng Streptomyces griseus có thể được cảm ứng bởi
nấm

men

mannan

để

sinh

β-mannosidase,

enzymee

này

sẽ


chuyển

mannosidostreptomycin thành streptomycin.
12. Yêu cầu về oxygen
Oxygen không được bổ sung vào môi trường như là một thành phần nhưng nó đóng
vai trò quan trọng đối với sự tăng trưởng và sự sinh tổng hợp các sản phẩm trao đổi chất
của vi sinh vật. Tùy theo kiểu lên men chúng ta phải khống chế lượng oxy sao cho phù
hợp. Ví dụ lên men yếm khí như lên men lactic, lên men rựu, bia, cần điều kiện yếm khí
nghiêm ngặt. Lên men hiếu khí như: lên men citric, lên men axit gluconic… cần cung cấp
O2 vào môi trường lên men, hoặc tạo điều kiện thoáng khí tối đa trong môi trường. Trong
cùng một quá trình lên men các giai đoạn khác nhau cũng cần thay đồi yếm khí hay kị
khí.
Tế bào sử dụng oxy để hô hấp và làm giảm lượng oxy trong môi trường. Vì thế trong
nuôi cấy hiếu khí phải cung cấp oxy một cách đều đặn. Thiếu oxy nhất thời tại một thời
điểm nào đó trong môi trường sẽ dẫn đến sự phá vỡ quá trình trao đổi chất của tế bào. Vi
sinh vật sử dụng oxy trong môi trường lỏng, lượng oxy hòa tan thường rất ít, cần phải
cung cấp oxy sao cho tốc độ hòa tan của nó bằng tốc độ tiêu thụ oxy của sinh vật.
Những đặc điểm của môi trường ảnh hưởng lên hàm lượng oxygen là:

25