Các phương pháp sắc kí
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.34 MB, 39 trang )
C
C
ÁC PH NG PHÁP S C KÍ ƯƠ Ắ
ÁC PH NG PHÁP S C KÍ ƯƠ Ắ
THU NH N VÀ TINH S CH Ậ Ạ
THU NH N VÀ TINH S CH Ậ Ạ
PROTEIN
PROTEIN
L
L
ê Th H ng Chuyênị ồ
ê Th H ng Chuyênị ồ
D
D
ng Minh Th nhươ ạ
ng Minh Th nhươ ạ
Nguy
Nguy
n Th Đan Thuỳễ ị
n Th Đan Thuỳễ ị
Nguy
Nguy
n Th Thu Trangễ ị
n Th Thu Trangễ ị
Nh
Nh
óm thực hiện:
óm thực hiện:
Khi đã có nguồn cung cấp protein, việc tiếp theo là
tinh sạch và xác định tính chất của nó. Quá trình trên
được thực hiện theo sơ đồ:
Kĩ thuật sắc kí
(Chromatography)
•
Bản chất: tách và thu nhận riêng biệt các phân
tử protein có tính hấp phụ khác nhau (trừ
phương pháp lọc gel) trên chất mang thích hợp
nhồi trong cột sắc kí
•
Ra đời: Tswett, nhà thực vật học Nga, phân
tách các hạt sắc tố (pigments) thực vật với 2
pha lỏng-rắn
Chromatography
SEC-Size exclusion Chro.
(Gel permeation Chro.)
(Gel filtration Chro.)
•
IEC-Ion exchange Chro.
•
Affinity Chro. – IAC
•
Hydrophobic Chro.
•
IE - HPLC
•
HPAC – HPIAC
•
RP – HPLC
•
EBC - Expanded bed Chro.
•
Membrane Chromatography
HP
HP
Nguy
Nguy
ên t cắ
ên t cắ
•
Pha
Pha
động
động
(Mobile phase)
•
Pha t
Pha t
ĩnh
ĩnh
(Stationary phase)
1. Sắc kí lọc gel
(Gel Permeation Chromatography
Size Exclusion Chromatography)
•
Bản chất: Sự tách riêng biệt các phân tử
protein dựa trên sự khác biệt về hình dạng và
MW, khi hỗn hợp protein di chuyển dọc theo
nền chất mang có kích thước lỗ qui định theo
cơ chế thẩm thấu.
sự khuyếch tán chọn lọc
Column
•
Φ= 10mm. L= 500-1000mm
•
Các hạt polymer có kích thước xác định
–
Dextran: Sephadex G & Sephacryl S (Pharmacia)
–
Polyacrylamide: Bio-Gel P (Bio-Rad)
–
Agarose: Sepharose CL & Superose (Pharmacia) hay Biogel A (Bio-Rad).
–
Polyacrylamide-agarose: Ultrogel AcA (LKB Instruments)
–
Ethylene glycol-methacrylate: Fractogel HW (Toyo Soda Company-TSK
……………
•
Dung môi được đưa vào cột với tốc độ 1 ml/phút, áp suất 50 - 200 bar
•
Tăng qui mô tăng Φ cột nhưng vẫn giữ
small depth tăng số cột
•
Kết quả thường làm loãng cô đặc
2. Sắc kí trao đổi iôn
(IEC -Ion Exchange Chromatography)
•
Bản chất: dựa trên sự tương tác hấp dẫn ion
thuận nghịch giữa protein và nền chất trao đổi
ion ở giá trị pH qui định.
Anion Exchange Chromatography
(AEC)
•
anion exchange resins are Q-resin, a
Quaternary amine; and DEAE resin,
DiEthylAminoEthane.
•
primary step (high capacity 10 -
100 mg/ml)
•
pH= 7 -10
- Buffer A = 20 mM Tris, pH= 8
- Buffer B = 20 mM Tris, 1 M NaCl, pH= 8
•
Protein khó tan/ pI cao
- Buffer A = 30 mM Ethanolamine, 8M urea,
pH=10.0
- Buffer B = 30 mM Ethanolamine, 8M urea,
1 M NaCl, pH=10.0
•
Chạy dung dịch theo gradient với
nồng độ muối tăng dần đến 1M NaCl.
Cation Exchange Chromatography
(CEC)
•
cation exchange resins are S-resin &
CM resin
•
primary step (high capacity)
•
Ít phổ biến bằng AEC (P không gắn
resin ở pH sinh lí chuẩn pI)
•
pH= 4 – 7
Buffer A = 30 mM sodium acetate,
pH=4.5
Buffer B = 30 mM sodium acetate, 1
M NaCl, pH=4.5
•
Chạy dung dịch theo gradient với
nồng độ muối tăng dần đến 1M NaCl
Cải tiến
•
Kết hợp chất mang lọc gel và TĐ ion
VD: DEAE sephadex & DEAE sephacel
•
Hãng Merk:
chất mang trao đổi ion nền Fractogel
sản xuất công nghiệp.
chất TĐ ion kiểu tua: tay nối mềm là mạch polymer
(oligoacrylamide) chứa nhóm –OH nền silicagel/
polymer hữu cơ có độ cứng cơ học cao hơn nhiều
