ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ HÀ THU

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH KHÁNG SINH MEROPENEM BẰNG PHƯƠNG
PHÁP QUANG HỌC SỬ DỤNG DUNG DỊCH NANO VÀNG

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

Hà Nội –Năm 2019
1


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

NGUYỄN THỊ HÀ THU

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH KHÁNG SINH MEROPENEM BẰNG PHƯƠNG
PHÁP QUANG HỌC SỬ DỤNG DUNG DỊCH NANO VÀNG

Chun ngành: Hóa phân tích
Mã số : 8440112.03

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC : PGS.TS. PHẠM THỊ NGỌC MAI

Hà Nội –Năm 2019
2

LỜI CẢM ƠN
Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS.Phạm Thị Ngọc Mai, phó chủ nhiệm
Bộ mơn Hóa phân tích-Khoa Hóa- Trường Đại học Khoa học Tự nhiên-Đại học Quốc gia
Hà Nội đã tận tình hướng dẫn về chuyên môn, phương pháp nghiên cứu và tạo điều kiện
giúp đỡ tơi trong suốt q trình học tập và thực hiện đề tài.
Xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu, Phòng đào tạo sau đại học và các thầy, cơ giáo,
các bạn sinh viên Khoa Hóa- Trường Đai học Khoa học Tự Nhiên Hà Nội đã tận tình giúp
đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tơi hồn thành nội dung học tập và thực hiện đề tài thuận
lợi.
Xin trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo công ty, Phụ trách quản lý Phịng Thử Nghiệm 1Cơng ty CP Chứng nhận và giám định Vinacert đã tạo điều kiện, giúp đỡ tơi trong suốt
q trình nghiên cứu đề tài.
Cuối cùng tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, đồng nghiệp và các bạn cùng
lớp Cao học Hóa phân tích K28 (2017-2019) đã giúp đỡ và động viên tơi trong hai năm
học tập và quá trình làm luận văn.
Hà Nội, ngày 04 tháng 09 năm 2019.

3


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
BẢNG KÍ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT
ĐẶT VẤN ĐỀ
CHƯƠNG I- TỔNG QUAN ........................................................................................... 12
1.1.

Tổng quan về kháng sinh .................................................................................. 12


1.2.

Đại cương về nhóm kháng sinh carbapenem .................................................. 13

1.2.1.

Cấu trúc hóa học [14] .................................................................................. 13

1.2.2.

Cơ chế tác dụng ........................................................................................... 14

1.2.3.

Phổ tác dụng của carbapenem ................................................................... 14

1.2.4.

Đánh giá xu hướng sử dụng kháng sinh carbapenem ............................. 15

1.3.

Meropenem ......................................................................................................... 16

1.3.1.

Cấu trúc hóa học ......................................................................................... 16

1.3.2.


Dược lý và cơ chế tác dụng ......................................................................... 17

1.4.

Các phương pháp xác định meropenem. ......................................................... 19

1.4.1.

Phương pháp sắc ký .................................................................................... 19

1.4.2.

Phương pháp điện hóa ................................................................................ 22

1.4.3.

Phương pháp điện di mao quản ................................................................. 22

1.5.

Giới thiệu về vật liệu vàng nano và ứng dụng ................................................. 26

1.5.1.

Vật liệu vàng nano ....................................................................................... 26

1.5.2.

Tính chất quang của hạt nano vàng .......................................................... 27


1.5.3.

Công nghệ sản xuất hạt nano vàng ............................................................ 31

1.5.4.

Ứng dụng của hạt nano vàng ..................................................................... 33

CHƯƠNG II-THỰC NGHIỆM ..................................................................................... 37
2.1. Đối tượng, mục tiêu và nội dung nghiên cứu ...................................................... 37
2.1.1. Mục tiêu ............................................................................................................ 37
2.1.2. Đối tượng .......................................................................................................... 37
4


2.1.3. Nội dung nghiên cứu ....................................................................................... 37
2.2. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị ................................................................................ 38
2.2.1. Hóa chất............................................................................................................ 38
2.2.2. Dụng cụ và thiết bị........................................................................................... 38
2.3. Phương pháp nghiên cứu ...................................................................................... 39
2.3.1. Phương pháp chế tạo hạt nano vàng ............................................................. 39
2.3.2 Phương pháp hấp thụ phân tử UV-Vis xác định hàm lượng meropenem sử
dụng hạt nano vàng ................................................................................................... 40
2.3.3. Đánh giá độ tin cậy của phương pháp ........................................................... 41
2.4. Phương pháp phân tích mẫu ................................................................................ 42
2.4.1 Chuẩn bị tổng hợp dung dịch nano vàng ....................................................... 42
2.4.2. Tối ưu hóa điều kiện phân tích....................................................................... 42
2.4.4. Định lượng meropenem trong mẫu thực tế................................................... 43
CHƯƠNG III-KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN................................................................ 46

3.1. Khảo sát đặc trưng của dung dịch nano vàng .................................................... 46
3.1.1. Khảo sát đặc tính hấp thụ cộng hưởng bề mặt bằng phổ hấp thụ phân tử
UV-VIS ....................................................................................................................... 46
3.1.2. Khảo sát hình thái bề mặt qua ảnh TEM...................................................... 47
3.2. Khảo sát các điều kiện xác định meropenem bằng dung dịch nano vàng ....... 47
3.2.1. Ảnh hưởng của pH .......................................................................................... 48
3.2.2. Ảnh hưởng của nồng độ muối NaCl .............................................................. 49
3.2.3. Ảnh hưởng của nồng độ dung dịch nano vàng. ............................................ 50
3.2.4. Ảnh hưởng của thời gian ................................................................................ 51
3.3. Đánh giá phương pháp phân tích xác định meropenem bằng dung dịch nano
vàng. ............................................................................................................................... 53
3.3.1. Xác định khoảng tuyến tính ........................................................................... 53
3.3.2. Xây dựng phương trình đường chuẩn ........................................................... 54
3.3.4.Xác định độ đúng và độ lặp lại ........................................................................ 56
3.4. Ứng dụng xác định meropenem trong mẫu thực tế ........................................... 58
5


3.4.1. Khảo sát ảnh hưởng của nền mẫu ................................................................. 58
3.4.2.Đánh giá phương pháp phân tích trên nền mẫu thuốc. ................................ 60
3.5. Ứng dụng xác định mẫu thực tế ........................................................................... 62
KẾT LUẬN ...................................................................................................................... 66
DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................... 67
PHỤ LỤC ......................................................................................................................... 71

6


DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU
Bảng 1.1.

Bảng 1.2.
Bảng 1.3.
Bảng 1.4.
Bảng 2.1.
Bảng 2.2.
Bảng 3.1.
Bảng 3.2.
Bảng 3.3.
Bảng 3.4.
Bảng 3.5.
Bảng 3.6.
Bảng 3.7.
Bảng 3.8.
Bảng 3.9.
Bảng 3.10.
Bảng 3.11.
Bảng 3.12.

Phân loại kháng sinh theo cấu trúc hóa học
Một số phương pháp xác định meropenem
Kích cỡ các hạt nano vàng sử dụng hiện nay
Một số ứng dụng của hạt nano vàng trong phân tích
Danh mục hóa chất sử dụng trong nghiên cứu
Danh mục thuốc tiêm chứa meropenem được sử dụng trong nghiên cứu
Ảnh hưởng của pH đến tỉ lệ độ hấp thụ quang
Ảnh hưởng của nồng độ muối đến tỉ lệ độ hấp thụ quang
Ảnh hưởng của nồng độ dung dịch AuNPs đến tỉ lệ độ hấp thụ quang
Sự phụ thuộc giữa nồng độ meropenem và tỉ lệ độ hấp thụ quang
Nồng độ meropenem và tỉ lệ độ hấp thụ quang A660/A520
Giới hạn phát hiện của một số phương pháp xác định meropenem

Kết quả đánh giá độ đúng và độ lặp lại của phương pháp
Kết quả đo sự ảnh hưởng của đường đến tỉ lệ độ hấp thụ quang
Khảo sát sự phụ thuộc nồng độ meropenem và tỉ lệ A660/A520 trên nền mẫu
Độ lặp lại trên nền mẫu thuốc trong ngày và khác ngày
Kết quả đánh giá độ đúng trên nền mẫu thuốc
Kết quả phân tích meropenem trong một số mẫu dược phẩm

7


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1.
Hình 1.2.
Hình 1.3.
Hình 1.4.
Hình 1.5.
Hình 1.6.
Hình 2.1.
Hình 2.2.
Hình 3.1.
Hình 3.2.
Hình 3.3.
Hình 3.4.
Hình 3.5.
Hình 3.6.
Hình 3.7.
Hình 3.8.
Hình 3.9.
Hình 3.10.
Hình 3.11.

Hình 3.12.
Hình 3.13.
Hình 3.14.
Hình 3.15.

Cấu trúc phân tử của các kháng sinh nhóm carbapenem
Cơng thức cấu tạo và cấu trúc phân tử của meropenem
Hạt nano vàng (Au) với 2 liên kết điên tích bề mặt và dạng sản xuất tiêu thụ
trên thế giới
Hiện tượng cộng hưởng plasmon bề mặt
Hiện tượng SPR của nano vàng dạng cầu
Sự phân bố điện tích trên một thang nano dưới kích thước của ánh sáng tới
Phương pháp Turkevick tổng hợp hạt nano vàng
Cơ chế phát triển mầm của phương pháp Turkevick
Phổ hấp thụ phân tử của dung dịch nano vàng khi có mặt meropenem
Hình thái hạt nano vàng thơng qua ảnh TEM
Ảnh hưởng của pH
Ảnh hưởng của nồng độ muối NaCl
Ảnh hưởng của nồng độ dung dịch AuNPs
Ảnh hưởng của thời gian
Ảnh hưởng của nồng độ meropenem
Biểu đồ sự phụ thuộc giữa nồng độ meropenem và tỉ lệ độ hấp thụ quang
Đồ thị khảo sát khoảng tuyến tính xác định meropenem
Đường chuẩn xác định meropenem
Biểu đồ thể hiện sự ảnh hưởng của Na2CO3
Ảnh hưởng của đường đến kết quả đo
Đường chuẩn xác định meropenem trên nền mẫu
Phổ UV-Vis của một số mẫu thuốc chứa meropenem
So sánh tương quan giữa hai phương pháp HPLC-DAD và UV-Vis


8


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Kí hiệu

Tiếng Việt

Tiếng Anh

AOAC

Hiệp hội các cộng đồng phân tích
chính thức

Association of Official Analytical
Communities

AuNPs

Hạt nano vàng

Gold nano particles

CZE

Điện di mao quản vùng

Capillary Electropherosis Zone


DAD

Đầu dò mảng diot

Diode array detector

EMA

Cơ quan quản lý Dược phẩm Châu
Âu

European Medicines Agency

FDA

Cơ quan quản lý thực phẩm và dược
phẩm Hoa Kỳ

Food and Drug Administration

HILIC

Sắc ký lỏng tương tác thân nước

Hydrophilic interaction liquid
chromatography

HPLC


Sắc ký lỏng hiệu năng cao

High Performance Liquid
Chromatography

HPLC-UV

Sắc kí lỏng hiệu năng cao ghép nối
đầu dò UV

High Performance Liquid
Chromatography- Ultraviolet

LC

Sắc ký lỏng

Liquid Chromatography

LC-MS/MS

Sắc ký lỏng ghép nối khối phổ hai
lần

Liquid Chromatography tandem mass
spectrometry.

LOD

Giới hạn phát hiện


Limit of Detection

LOQ

Giới hạn định lượng

Limit of Quantification

LSPR

Hiện tượng cộng hưởng plasmon bề
mặt cục bộ

Local surface plasmont resonance

SWV

Vonampe sóng vng

Square wave vonampe

TEM

Kính hiển vi điện tử truyền qua

Transmission electron microscopy

UHPLC


Sắc ký lỏng siêu hiệu năng

Utra Performance Liquid
Chromatography

9


ĐẶT VẤN ĐỀ
Sự ra đời của kháng sinh peniciline vào thể kỷ 20 đã đánh dấu một kỷ nguyên mới của
y học về điều trị các bệnh nhiễm khuẩn, từ đó đến nay đã có hàng trăm loại thuốc và kháng
sinh tương tự đã được phát minh và đưa vào sử dụng. Tuy nhiên việc lạm dụng kháng sinh
đã dẫn tới tỉ lệ kháng kháng sinh gia tăng và trở thành một thách thức lớn trên toàn thế giới.
Theo số liệu của Cơ quan quản lý Dược phẩm Châu Âu (EMA), ước tính hàng năm có
khoảng 25000 trường hợp tử vong do nhiễm khuẩn vi khuẩn đa kháng thuốc và gánh nặng
kinh tế của đề kháng kháng sinh lên đến 1,5 tỷ Euro mỗi năm [33]
Trước tình trạng này, nhiều cơ sở y tế đã đưa các nhóm kháng sinh phổ kháng khuẩn
mạnh như carbapenem vào để chữa trị cho bệnh nhân có các triệu chứng kháng kháng sinh
quá mạnh, trong đó meropenem được sử dụng nhiều nhất vì có phổ tác dụng rộng [29].
Meropenem hiệu quả trong điều trị một loạt các nhiễm trùng gây ra bởi trực khuẩn Gram
âm và Gram dương, các mầm bệnh hiếu khí mẫn cảm với thuốc. Meropenem hoat động
bằng cách liên kết với các protein và phá vỡ sự toàn vẹn và thống nhất của thành tế bào vi
khuẩn. Meropenem được tiêm trực tiếp vào tĩnh mạch và đã cho hiệu quả lâm sàng trong
điều trị một loạt các bệnh nhiễm trùng nghiêm trọng do vi khuẩn như viêm phổi, nhiễm
trùng huyết, nhiễm trùng ổ bụng , viêm phổi…[22].Ngoài ra meropenem là kháng sinh
thuộc nhóm carbapenem duy nhất được chấp thuận sử dụng như một liệu pháp thay thế cho
viêm màng não do ít gây nguy cơ động kinh và an toàn cho phụ nữ có thai [19].
Được coi là một trong các loại kháng sinh mạnh nhất hiện nay, việc định lượng
meropenem trong dược phẩm và dịch sinh học của bệnh nhân nhằm đánh giá hiệu quả điều
trị bệnh vì thế rất quan trọng.

Hiện nay các phương pháp phổ biến để xác định hàm lượng meropenem như phương pháp
sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC [22][19][20], phương pháp điện di mao quản[32],[26],
phương pháp điện hóa[14] .v.v đều có chung một số nhược điểm như thiết bị , hóa chất đắt
tiền, vận hành phức tạp, do đó việc phát triển một phương pháp phân tích mới có độ nhạy
và độ chính xác cao nhưng lại đơn giản và có chi phí thấp là hết sức cần thiết. Nhận thấy
dung dịch nano vàng có hiệu ứng plasmon bề mặt (SPR) với khả năng thay đổi màu sắc từ
đỏ sang xanh khi có mặt meropenem, chúng tôi đã lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu xác định
10


kháng sinh meropenem bằng phương pháp quang học sử dụng dung dịch nano vàng”.
Phương pháp này sẽ được áp dụng để phân tích hàm lượng meropenem trong một số
mẫu dược phẩm hiện có trên thi trường và một số mẫu dịch sinh học của bệnh nhân.

11


1.1.

CHƯƠNG I- TỔNG QUAN
Tổng quan về kháng sinh
Sự ra đời của kháng sinh là một thành tựu lớn của thế kỷ 20, giúp giảm thiểu đáng kể

tỷ lệ mắc bệnh và tử vong do nhiễm khuẩn, đặc biệt đối với Việt Nam, với đặc trưng khí
hậu thuận lợi cho sự phát triển của vi sinh vật. Đây là nhóm thuốc quan trọng vì bệnh lý về
nhiễm khuẩn nằm trong tốp những bệnh đứng đầu về tỷ lệ mắc bệnh cũng như tỷ lệ tử vong
[7].
Kháng sinh ( antibiotics) được định nghĩa: “ là những chất kháng khuẩn (antibacterial
substaces) đươc tạo ra bởi các chủng vi sinh vật (vi khuẩn, nấm, Actinomycetes) có tác
dụng ức chế sự phát triển của các vi sinh vật khác.

Hiện nay, từ kháng sinh được mở rộng đến cả những chất kháng khuẩn có nguồn gốc
tổng hợp như các sulfonamide và quinolon [4].
Các nhóm kháng sinh được phân loại theo cấu trúc hóa học thành các nhóm như sau:
Bảng 1.1. Phân loại kháng sinh theo cấu trúc hóa học
STT

Tên nhóm

Phân nhóm
Các penicilin
Các cephalosorin

1

Các beta-lactam khác

Beta-lactam

Carbapenem
Monobactam
Các chất ức chế beta-lactamase

2

Aminoglycosid

3

Macrolid


4

Lincosamid

5

Phenicol

6

7

Thế hệ 1

Tetracyclin

Thế hệ 2
Glycopeptid

Peptid

Polypetid

12


Lipopeptid
8

Quinolon


9

Các nhóm kháng sinh khác

Thế hệ 1
Các fluoroquinolon: Thế hệ 2,3,4

Sulfonamid
Oxazolidinon
5-nitroimidazol

1.2.

Đại cương về nhóm kháng sinh carbapenem
Nghiên cứu biến đổi cấu trúc hóa học của peniciline và celphalosporin đã tạo thành

một nhóm kháng sinh beta-lactam mới, có phổ kháng khuẩn rộng, kháng β-lactamase đặc
biệt của vi khuẩn Gram âm, tác dụng mạnh trên trực khuẩn mủ xanh. Nhóm kháng sinh
này bao gồm: imipenem, meropenem, ertapenem, doripenem, , lần lượt được cơ quan quản
lý thuốc và thực phẩm Hoa Kỳ (FDA) phê chuẩn đưa vào sử dụng vào các năm
1985,1996,2001 và 2007. Imipenem và meropenem có phổ hoạt động rộng nhất chống lại
hầu hết các chủng Pseudomonas và các chủng β-lactamase; ertapenem và doripenem có
hoạt phổ hẹp hơn các carbapenem khác trên P.aeruginosa và Acinetobacter [3][8][9]
Các kháng sinh nhóm này có vai trò nhất định trong điều trị bao vây cũng như điều trị
theo mục tiêu những trường hợp nhiễm khuẩn nặng nghi ngờ do vi khuẩn đa kháng sinh,
đặc biết là những trường hợp đa đề kháng có liên quan đến trực khuẩn gram âm hoặc trong
trường hợp các phác đồ điều trị kháng sinh khác khơng cịn hiệu quả[39].
1.2.1. Cấu trúc hóa học [14]
Carbapenem thc nhóm β-lactamase bán tổng hợp, cấu trúc phân tử khác các kháng

sinh peniciline đó là có một nguyên tử cacbon thay thế cho nguyên tử lưu huỳnh trong cấu
trúc vịng thiazollidin và có liên kết đơi giữa C-2 và C-3, ngồi ra carbapenem có thêm
nhóm ethylhydroxyl liên kết với vịng beta-lactam, cịn ở nhóm penicillin là nhóm
acylamino.

13


Hình 1.1. Cấu trúc phân tử của các kháng sinh nhóm carbapenem
1.2.2. Cơ chế tác dụng
Carbapenem có cơ chế tác dụng chung của kháng sinh họ β-lactamase .Chúng tiêu diệt
vi khuẩn bằng cách gắn PBPs (penicillin binding proteins ) làm ức chế quá trình tổng hợp
vách tế bào vi khuẩn làm gián đoạn quá trình sinh tổng hợp thành tế bào vi khuẩn do đó
vi khuẩn khơng có thành tế bào che chở sẽ bị tiêu diệt. Những protein này thực tế là các
enzyme tham gia vào quá trình tạo liên kết chéo peptidoglycan-thành phần chính của vách
tế bào vi khuẩn. Mỗi carbapenem có ái lức đặc biệt với một nhóm PBPs khác nhau, vì vậy
tác dụng của mỗi loại là khác nhau và khác với các β-lactamase khác [9][25][41]. Vì vậy,
thuốc có phổ kháng khuẩn rộng và khơng bị kháng chéo với các thuốc khác trong nhóm βlactamase [15].
1.2.3. Phổ tác dụng của carbapenem
Carbapenem là nhóm kháng sinh phổ rộng, có tác dụng trên cả vi khuẩn Gram dương
và Gram âm hiếu khí và kị khí, bền với các vi khuẩn sinh β-lactamase [41]. Các thuốc trong
nhóm carbapenem có phổ tác dụng tương tự nhau.
Tất cả các thuốc trong nhóm đều tác dụng tốt trên cầu khuẩn Gram dương, có tác dụng
kém trên MRSA (Methine- resistant Staphylococcal aureus hay tụ cầu vàng kháng
Methiciline) và tràng cầu khuẩn (enterococcal infections) bởi khả năng đề kháng nội tại
14


của các lồi vi khuẩn này.
Trên vi khuẩn hiếu khí Gram âm: carbapenem thể hiện hoạt lực in vitro mạnh, tất cả

các kháng sinh trong nhóm đều thể hiện hoạt tính kháng khuẩn mạnh trên các vi khuẩn
Gram âm [7][11].
Các thuốc thuộc nhóm kháng sinh carbapenem cũng có tác dụng khá tốt trên các vi
khuẩn kị khí và khơng có tác dụng với các vi khuẩn khơng điển hình.vì những lồi vi khuẩn
này khơng có thành tế bào (vốn là đích tác động của kháng sinh carbapenem).
1.2.4. Đánh giá xu hướng sử dụng kháng sinh carbapenem
Trước tình hình vi khuẩn đa đề kháng như hiện nay, carbapenem là nhóm kháng sinh
được ưu tiên lựa chọn trong điều trị nhiễm khuẩn do vi khuẩn Gram âm sinh β-lactamase
phổ rộng, vi khuẩn Gram âm đa kháng, các nhiễm khuẩn nặng và trong các trường hợp sốt
giảm bạch cầu trung tính [8].
Kết quả khảo sát lượng tình hình sử dụng kháng sinh tại bệnh viện Bạch Mai trong
giai đoạn 2012-2016 cho thấy từ năm 2012, số liều DDD/100 ngày nằm viện của kháng
sinh carbapenem tăng dần 5 năm, đạt mức gấp đôi vào năm 2016. Trong đó meropenem là
hoạt chất được sử dụng nhiều nhất, sau đó đến imipenem, ertapenem, nguyên nhân có thể
do ưu điểm về hiệu quả cũng như độ an toàn của thuốc này trong lâm sàng. Đồng thời, một
phân tích gộp kết quả nghiên cứu lâm sàng đã chỉ ra tỷ lệ đáp ứng lâm sàng, đáp ứng vi
sinh của nhóm dùng meropenem cao hơn nhóm dùng imipenem trong khi tỷ lệ gặp biến cố
bất lợi của nhóm sử dụng meropenem lại thấp hơn đáng kể.
Năm 2016 Doripenem được đưa vào sử dụng với số liều DDD/100 ngày nằm viện
thấp nhất. Kết quả phân tích tiêu thụ của từng đơn vị điều trị trong bệnh viện cho thấy,
nhóm kháng sinh này được sử dụng rộng rãi ở tất cả các Khoa lâm sàng, Trung tâm hoặc
Viện. Ba đơn vị có lượng tiêu thụ vượt trên 10 DDD/100 ngày nằm viện bao gồm Khoa
hồi sức tích cực, Trung tâm hơ hấp và khoa truyền nhiễm [1].
Theo báo cáo của Nguyễn Thị Lệ Minh, tại khoa Hồi sức tích cực, Truyền nhiễm và
Huyết học, tỷ lệ giảm nhạy cảm của các chủng vi khuẩn phân lập đạt mức 64% với
imipenem và 62% với meropenem vào năm 2011[10].

15



1.3.

Meropenem
1.3.1. Cấu trúc hóa học
Meropenem ( tên IUPAC : (4R,5S,6S)-3-[(3S,5S)-5-(dimethylcarbamoyl)pyrrolidin-

3-yl]sulfanyl-6-[(1R)-1-hydroxyethyl]-4-methyl-7-oxo-1-azabicyclo[3.2.0]hept-2-ene-2carboxylic acid) là một axit hữu cơ có cơng thức phân tử là 𝐶15 𝐻25 𝑁3 𝑂5 𝑆, M=383,46

g/mol [37]. Meropenem có 𝑝𝑘𝑎1 = 2,9 và 𝑝𝑘𝑎2 = 7,4. Meropenem có chứa nhóm thio
có ái lực mạnh với kim loại như vàng, có thể hình thành liên kết S-Au thơng qua liên kết
cộng hóa trị. Cơng thức cấu tạo và cấu trúc phân tử của meropenem được cho trong Hình
1.2.

Hình 1.2: Công thức cấu tạo và cấu trúc phân tử của meropenem
Meropem thuộc họ kháng sinh β-lactamase, không ổn định về mặt vật lý và hóa học.
Cấu trúc phân tử của meropenem có vịng β-lactam dễ bị mở vịng bởi nhiều tác nhân như
axit-base, ion kim loại, tác nhân oxy hóa và thậm chí là các dung mơi như nước, ancol. Độ
ổn định ở nhiệt độ phòng (khoảng thời gian sự phân hủy dưới 10%) của meropenem là 9h.
Do đó các dung dịch chuẩn và mẫu trong các nghiên cứu thường được pha trong các dung
dịch

bảo

quản

như

3-morpholinopropanesulfonic

(MOPS)


hoặc

acid

2-[N-

morpholino]ethansulfonic (MES) để đảm bảo độ ổn định của mẫu. Meropenm thường tồn
tại dưới dạng bột tinh thể màu trắng đến vàng nhẹ, tan trong nước, methanol, thực tế không
tan trong ethanol 95% và diethyl ete…

16


1.3.2. Dược lý và cơ chế tác dụng
1.3.2.1.

Dược lực

Meropenem là một kháng sinh tổng hợp nhóm carbapenem, có cấu trúc và tác dụng
dược lý tương tự các thuốc trong nhóm như imipenem và ertapenem. Khác với imipenem,
meropenem bền vững với tác dụng thủy phân của dehydropeptidase (DHP-1) có ở vi nhung
mao của tế bào ống lượn gần thận, vì vậy không cần dùng cùng với chất ức chế DHP-1[1].
1.3.2.2.

Cơ chế tác dụng

Thuốc có tác dụng diệt khuẩn thơng qua sự ức chế sinh tổng hợp vách tế bào bằng cách
thấm qua thành tế bào của hầu hết vi khuẩn Gram âm và Gram dương, gắn vào các protein
liên kết penicillin (PBP) và làm bất hoạt các protein này. Thuốc có ái lực mạnh nhất với

PBP 2,3 và 4 của Escherichia và Pseudomanas aeruginosa, PBP 1,2 và 4 của
Staphylococcus aureus.
1.3.2.3.

Phổ kháng khuẩn[1]

Phổ kháng khuẩn của meropenem tương tự imipenem bao gồm hầu hết các vi khuẩn
Gram dương, Gram âm và một số vi khuẩn kỵ khí. Tuy nhiên tác dụng của meropenem có
phần mạnh hơn imipenem trên Enterbacteriaceae và có phần kém hơn imipenem trên vi
khuẩn Gram dương. Nồng độ diệt khuẩn điển hình gấp một hoặc hai lần nồng độ kìm
khuẩn, ngoại lệ với Listeria monocytogenes, nồng độ diệt khuẩn chưa được xác định.
Meropenem bền vững với nhiều loại β-lactamase phổ rộng; nhưng không bền với tác dụng
thủy phân của metallo-beta lactamase.
Meropenem có phổ hoạt tính in vitro và trên lâm sàng với các vi khuẩn sau đây:
Vi khuẩn Gram dương và hiếu khí khơng bắt buộc: Streptococcus pneumonia (chủng nhạy
cảm penicillin), S.pyogenes, S. agalactiae, Staphylococcus aureus (kể cả các chủng tiết βlactamase , không bao gồm các chủng kháng oxacilin/methicillin), Enterococcus faecalis (
không bao gồm chủng kháng vancomycin) và S.viridans.
Vi khuẩn Gram âm hiếu khí và hiếu khí khơng bắt buộc : Escherichia coli,
Haemophilus ifnluenzae (kể cả chủng tiết β-lactamase) , Klebsiealla pneumonia, Neisseria
meningitides, Proteus mirabilis và Pseudomonas aeruginosa.
Các vi khuẩn kị khí: Bacteroides fragilis, B. thetaiotaomicron và Peptostreptococcus.
17


Kháng chéo có thể xảy ra giữa meropenem và các kháng sinh carbapenem khác. Cơ chế
kháng thuốc có thể là: Giảm tính thấm của màng ngồi vi khuản gram âm( do giảm sản
xuất porin); giảm ái lực đối với PBP; tăng vận chuyển tích cực thuốc ra ngồi tế bào vi
khuẩn; sản xuất β-lactamase có thể thủy phân các carbapenem. Khơng có kháng chéo giữa
meropenem và các kháng sinh họ quinolone, aminosid, macrolid và tetracyclin. Tuy nhiên,
một số chủng vi khuẩn có thể kháng nhiều hơn một nhóm kháng sinh do cơ chế giảm tính

thấm màng tế bào và tăng vận chuyển thuốc ra ngoài.
1.3.2.4.

Dược động học :

Hấp thu: Meropenem được sử dụng thông qua đường tiêm tĩnh mạch, không hấp thu
qua đường uống. Sau khi tiêm tĩnh mạch 0,5g và 1g meropenem trong 5 phút, nồng độ đỉnh
trong huyết tương đo được lần lượt là 50 và 112 microgam/ml. Nếu truyền trong 30 phút,
nồng độ đỉnh thu được tương ứng là 23 và 49 mcirogram/ml [1][31].
Phân bố: Thuốc phân bố rộng rãi trong các tổ chức của cơ thể , bao gồm dịch não tủy
và mật, cơ, da, van tim, dịch phúc mạc, thể tích phân bố của người lớn 15-20 lít, trẻ em
0,3-0,4 lit/kg. Thuốc liên kết với protein huyết tương khoảng 2%.
Chuyển hóa: Meropenem được chuyển hóa bởi phản ứng thủy phân vịng β-lactamase tạo
thành chất khơng có hoạt tính. Các thí nghiệm in vitro đã cho thấy meropenem bền với
enzyme DHP-1 so với imipenem vì vậy meropenem không cần dùng kèm chất ức chế DHP1 [1].
Thải trừ: Thời gian bán thải trong huyết thanh của thuốc khoảng 1h, kéo dài hơn ở người
suy thận. Độ thanh thải trung bình là 287 ml/phút với liều 250 mg và 205ml/phút với liều
2g. Meropenem thải trừ chủ yếu nhờ bài tiết qua ống thận và lọc qua cầu thận. Khoảng
70% liều dùng được tìm thấy ở dạng khơng đổi trong nước tiểu trong khoảng 12h. Khoảng
2 % liều dùng thải trừ qua phân. Thuốc có thể được loại trừ bởi thẩm tách máu [1].
1.3.2.5.

Chỉ định

Meropenem được chỉ định cho các trường hợp nhiễm khuẩn gây ra bởi vi khuẩn Gram
âm và Gram dương nhạy cảm với thuốc ở người lớn và trẻ em tư 3 tháng tuổi trở lên. Bao
gồm:
• Viêm phổi (viêm phổi cộng đồng hoặc mắc phải tại bệnh viện)
18



• Nhiễm khuẩn đường tiết niệu có biến chứng
• Nhiễm khuẩn trong ổ bụng
• Nhiễm khuẩn phụ khoa, như niêm nội mạc tử cung và các bệnh lý viêm vùng chậu
• Viêm phế quản-phổi ở bệnh nhân xơ hang
• Nhiễm khuẩn trong và sau khi sinh
• Nhiễm khuẩn da và tổ chức dưới da có biến chứng
• Viêm màng não nhiễm khuẩn cấp tính, bênh nhân sốt do giảm bạch cầu.
• Nhiễm khuẩn huyết
Meropenem đơn hoặc phối hợp với các thuốc kháng khuẩn khác đã được chứng minh
là hiệu quả trong điều trị nhiễm khuẩn hỗn hợp. Chưa có kinh nghiệm sử dụng thuốc ở trẻ
em giảm bạch cầu trung tính hay suy giảm miễn dịch nguyên phát hoặc thứ phát.
1.3.2.6.

Tác dụng phụ của meropenem

Tác dụng phụ không mong muốn của meropenem thường gặp nhất là chứng rối loạn
tiêu hóa như buồn nôn, nôn và tiêu chảy. Đôi khi xảy ra phản vệ, tăng bạch cầu ưa eosin,
nổi mề đay, viêm đại tràng. Động kinh hoặc co giật có thể xảy ra, đặc biệt ở người bệnh đã
từng có tổn thương hệ thần kinh trung ương và/hoặc người suy thận.
Phản ứng tại chỗ tiêm như đau hoặc viêm tĩnh mạch huyết khối có thể xả ra sau khi
tiêm. Người có bệnh dị ứng với những kháng sinh β-lactamase khác có thể có phản ứng
mẫn cảm khi dùng meropenem.
1.4.

Các phương pháp xác định meropenem.
1.4.1. Phương pháp sắc ký
Phương pháp sắc ký là một trong các phương pháp phổ biến để xác định các chất có

hoạt tính sinh học. Để xác định meropenem có thể sử dụng các loại detector khác nhau như

detector UV (DAD), MS,.v.v.
Áp dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC sử dụng detector UV, M.A.
Al-Meshal và nhóm cộng sự đã tiến hành nghiên cứu xác định meropenem trong huyết
tương và so sánh với phương pháp vi sinh[22]. Thuốc được tách ra khỏi huyết tương bằng
cách tủa protein bằng TCA 15% (Trichloroacetic axit). Chuẩn nội được sử dụng là

19


pheniamine.
Pha động sử dụng: 21,22% acetonitrile, 78% H2O và 0,8% axit axetic băng. Cột sắc
ký sử dụng là cột C 18(3,9 x300 nm). Tốc độ dòng 1,2ml/phút. Meropenem được định lượng
bằng detector UV ở bước sóng 296nm. Một lượng meropenem được thêm chính xác vào
0,5ml huyết tương trắng lần lượt ở các nồng độ 50,100,250,500,1000 và 2500 ng/ml, 70 µl
chuẩn nội được thêm vào hỗn hợp và 50 µl TCA 15%, lắc 30s, sau đó ly tâm 800 vịng/phút
trong 5 phút, 10-30 µl dịch lọc sau ly tâm được bơm vào cột. Khoảng tuyến tính của
meropenem trong phương pháp này từ 50ng/ml đến 2500ng/ml. Phương trình tuyến tính
Y=0,0161( ± 0,0058)+1,4963 (± 0,00293) X, hệ số r= 0,9998. Đường cong hiệu chuẩn
được xây dựng trong khoảng thời gian hơn 2 tuần để xác định độ biến thiên của độ dốc
đường chuẩn (slope) và hệ số chặn (intercept), kết quả độ biến thiên là 2% cho thấy độ ổn
định và độ chính xác cao.
Giới hạn phát hiện của phương pháp trong huyết tương là 25ng/ml. Kết quả được so
sánh với phép thử khuếch tán vi sinh sử dụng Escherischia coli ATCC 25922 là sinh vật
thử nghiệm, cho kết quả độ nhạy thấp hơn phương pháp HPLC-UV khoảng 5ng/ml.
Nhóm tác giả Liusheng Huang, Janus Haagensen, Davide Verotta, Patricia Lizak,
Francesca Aweeka và Katherine Yang đã xây dựng thành cơng mơ hình mơ phỏng PK/PD
cho nhiễm trùng qua màng sinh học và nghiên cứu tính ổn định của meropenem đồng thời
phát triển và xác nhận meropenem trong vi khuẩn bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu
năng cao ghép nối khối phổ LC-MS/MS [24]. Phương pháp LC-MS/MS có lợi thế là tính
chọn lọc cao và thời gian phân tích ngắn, điều này đặc biệt có lợi cho các thuốc không ổn

định như meropenem, chỉ ổn định trong vài giờ tại nhiệt độ phòng.
Ba cột khác nhau đã được thử nghiệm: cột RP cực Synergi (2.0 × 50 mm, 4μm,
Phemonenex Inc. Torrance, CA, USA), Zorbax XDB-C18 và XDB-C8 (2.1 × 50 mm, 5μm,
cơng nghệ Agilent. Inc., Santa Clara, CA, Hoa Kỳ). Zorbax XDB C8 đã được sử dụng làm
vật lưu giữ thời gian cho meropenem và ceftazidime (IS) tương tự nhau (1,7 và 1,9 phút,
tương ứng) trong các điều kiện rửa giải gradient LC cuối cùng. Thời gian chạy trên mỗi
mẫu là 6,6 phút. Trong khi trên hệ thống API5000, IS đã khử màu (MP-d6) đã được sử
dụng và thời gian chạy được rút ngắn 1,4 phút. 100µl dịch mẫu được trộn với dung dịch
20


chuẩn nội ceftazidime, sau đó lọc. Dịch lọc được bơm trực tiếp lên cột C18 (50x2, 1mm).
Đệm A: dung dịch NH4FA 10mM ở pH=4,0
Đệm B: MeCN trong 0,1% axit formic.
Chương trình Gradient: 7% dung mơi B (0-1 phút), từ 7-90% dung môi B (1-2,5 phút),
90% dung môi B ( 2,5-3,5 phút), 90% đến 7% dung môi B( 3,5-6 phút) và 7% dung môi B
( 3,6-6,6 phút), rửa giải bằng amoni formate (10mM, pH=4) và acetonitrile (chứa 0,1% axit
formic), tốc độ dòng 0,3ml/phút.
Chiều cao cực đại của meropenem cao hơn khoảng 10 lần trong API5000 so với
API2000. Mẫu được tiêm là (50ng/ml/40)x 5µl=6,25 pg cho hệ thống API5000 so với
(50ng/ml/8)x 10 µl =62,5pg cho hệ thống API2000. Do đó, độ nhạy của meropenem trên
API5000 cao hơn khoảng 100 lần so với API2000
Khoảng tuyến tính xây dựng từ 50-25000 ng/ml, độ chính xác và phần trăm độ lệch
chuẩn đều dưới 15% chứng tỏ phương pháp có độ tin cậy cao, giới hạn định lượng của
phương pháp là 50ng/ml.
Trong các phương pháp sắc ký phổ biến hiện nay, sắc ký hiệu suất cực cao (UHPLC)
với detector mảng diode là một phương pháp ít tốn kém hơn khối phổ đồng thời cải thiện
được độ phân giải, thông lượng và độ nhạy so với phương pháp HPLC-UV thơng thường.
Dựa trên những ưu điểm đó, nhóm nghiên cứu của Gregori Casals đã xây dựng quy trình
định lượng meropenem trong huyết tương người bằng phương pháp sắc ký lỏng siêu hiệu

năng UHPLC sử dụng detector mảng diode [16]
Pha động: dung dịch đệm chứa Na2HPO4.2H2O 0,1M, chỉnh pH=7 bằng H3PO4 85%,
hòa trộn với methanol (chiếm 13% pha động). Tốc độ dòng 0,25ml/phút , nhiệt độ cột được
đặt 30oC. Hiệu quả của cột tách được theo dõi bằng một detector mảng diode trong khoảng
270-320nm, định lượng meropenem được ghi nhận ở bước sóng 295nm.
Đường chuẩn được xây dựng từ 0,5-2-5-10-25-50-100 µg/ml . Dung dịch làm việc
được chuẩn bị bằng cách hòa tan dung dịch trung gian trong đệm MES ( MES 1M, pH=6)
và 20 µg/ml chuẩn nội ceftazidime.
Tương tự đối với dung dịch mẫu 100µl chuẩn nội (20 µg/ml) được thêm vào hỗn hợp
chứa 100 µl đệm MES với 100 µl mẫu huyết tương. Sau đó thêm 500 µl acetonitrile, ly
21


tâm 13000 vịng trong 5 phút, phần dịch nổi phía trên được chuyển sang lọ thủy tinh hình
nón và bay hơi đế khơ dưới dịng khi nito ở 37oC. Phần dư được hồn ngun trong 200 µl
dung dịch đệm MES, ly tâm 1000 vòng trong 10 phút. Chất nổi trên bề mặt được chuyển
sang vial thủy tinh, tiêm 7 µl vào cột.
Giới hạn dưới của định lượng là 0,5 µg/ml và giới hạn trên của định lượng là 100
µg/ml. Độ lệch chuẩn tương đối không vượt quá 15%.
Jens Martens Lobenhoffer và nhóm nghiên cứu của mình đã nghiên cứu ứng dụng
phương pháp HILIC- phổ khối để định lượng meropenem trong huyết tương người[27].
Mẫu được chuẩn bị chỉ bao gồm thêm đệm, bổ sung chất nội chuẩn, kết tủa protein và ly
tâm. Do đó thời gian phân tích rất nhanh và cho khối lượng công việc hiệu quả. Nhờ độ
nhạy cao của khối phổ, có thể phân tích thể this mẫu huyết tương rất thấp là 10 μl.
Cột sắc ký Hypersil GOLD HILIC được áp dụng trong phương pháp là vật liệu trên
nền silica với lớp phủ polyethylenimide, cho thời gian lưu của meropenem là 4,17 phút.
Khoảng nồng độ tuyến tính của meropenem thu được là khoảng 1 μg/ml – 50 g/ml; hệ số
tương quan R = 0.9997. Giá trị LOQ là 1 μg/ml, đủ để phân tích các mẫu ở mức độ nhạy
cảm thấp hơn của mầm bệnh.
1.4.2. Phương pháp điện hóa

Ali K.Attia và cộng sự đã phát triển và xây dựng phương pháp vonampe sóng vng
(SWV) sử dụng điện cực biến đổi hóa học để xác định nồng độ meropenem trong mẫu
huyết tương[14]. Điện cực biến đổi hóa học này được điều chế từ 15mg MWVNTs 3% ,
485mg than chì, 0,3 ml dầu prafin. Khi sử dụng điện cực làm việc này với điều kiện độ
rộng xung 50ms, độ cao xung 25mV, tốc độ quét 50mVs, khoảng nồng độ tuyến tính thu
được của meropenem nằm trong khoảng từ 8,0.10−7 đến 9,0.10−5 mol/L. Với phương pháp
này có thể xác định được đồng thời linezolid, meropenem, theophylline trong mẫu huyết
tương. Phương pháp này đã được sử dụng để đo mẫu huyết tương của các tình nguyện viên
sau khi sử dụng thuốc 60 phút cho kết quả với độ lặp lại và độ chính xác cao.
1.4.3. Phương pháp điện di mao quản
Phương pháp điện di mao quản là một phương pháp mới để phân tích meropenem.
Phương pháp có ưu điểm hơn so với phương pháp sắc ký lỏng (LC) trong việc chuẩn bị
22


mẫu. Thông thường, để xác định meropenem trong huyết tương bằng LC đều phải kết tủa
thành phần protein trước khi đo. Hơn nữa, phương pháp này có độ lặp lại, độ nhạy cao,
lượng mẫu yêu cầu thấp với thời gian phân tích tương đối ngắn.
Nhóm nghiên cứu của Yahya Mrestani thực hiện nghiên cứu ứng dụng phương pháp
điện di mao quản với tế bào Z có độ nhạy cao (CZE) sử dụng detector UV để xác định
meropenem trong dung dịch nước và mẫu sinh học (nước tiểu, huyết tương).
Xác định meropenem trong nước được thực hiện bằng cách sử dụng mao quản tiêu
chuẩn và mao quản có độ nhạy cao. Kết quả cho thấy rằng, việc áp dụng mao quản độ nhạy
cao cải thiện giới hạn phát hiện khoảng 10 lần so với mao quản tiêu chuẩn.
Với mẫu huyết tương, meropenem được xác định ở pH = 7,2 và được phân tích định
lượng ở hai bước sóng là 200nm và 303nm. Các thành phần của huyết tương hấp thụ UV
ở 200nm vì thế meropenem có thể được xác định trực tiếp ở bước sóng 303nm. Để đo
meropenem trong huyết tương, các mẫu được pha loãng trong nước với tỉ lệ 1:4. Ở bước
sóng này, kết quả của điện di đồ cho thấy meropenem được tách biệt hoàn toàn ra khỏi các
thành phần của huyết tương. Giới hạn phát hiện trong huyết tương thơng qua đo trực tiếp

ở bước sóng 303nm là 4µg/ml, độ lệch chuẩn tương đối của thời gian di chuyển là 5% và
của vùng cực đại là 4% ở nồng độ 10µg/ml. Đường chuẩn có phương trình tuyến tính (y =
10.1x + 20.1) với hệ số tương quan là 𝑅2 = 0,999. Độ thu hồi trung bình từ các mẫu là
98,6% (n = 4) ở nồng độ meropenem là 5 mg/ml và 97,8% (n = 4) ở nồng độ 50 mg / ml
so với các dung dịch chuẩn meropenem có nồng độ tương đương.
Đối với mẫu nước tiểu, mẫu được pha loãng trực tiếp trong dung dịch đệm và được
tiêm mà không cần chuẩn bị mẫu phức tạp. Giới hạn phát hiện trong mẫu nước tiểu là
0,3µg/ml, độ lệch chuẩn tương đối là 2,0%.
Toshihiro Kitahashi và Itaru Furuta đã phát triển phương pháp xác định meropenem
trong huyết thanh bằng cách tiêm trực tiếp huyết thanh vào mao quản mà không cần các
bước tiền xử lý[26].
Meropenem được phát hiện ở bước sóng 297nm. Dung dịch đệm được sử dụng là
natritetraborate 25mM, NaOH 0,1M chứa natridodecyl sulphate 90mM, pH=10. Thời gian
di chuyển của meropenem là 7,2 phút; LOD=2,0mg/l. Độ lệch chuẩn tương đối giữa các
23


ngày và độ chính xác lần lượt : 3,43-8,87 % và 4,28-8,54%. Hiệu suất thu hồi đạt 94-111%
và 92-105%.
Phương pháp cho phép phân tích nhanh chóng, kết quả đáng tin cậy và tính kinh tế cao,
giảm lượng máu cần thu gom và giảm đáng kể chất thải lỏng phát sinh từ q trình phân
tích. Hệ thống phân tích hoạt động dễ dàng vì nó được thực hiện hồn tồn tự động, và hơn
hết hầu như khơng có sự sai số giữa các phép đo vì khơng cần trải qua bước tiền xử lý mẫu.
Bảng 1.2.Một số phương pháp xác định meropenem
Tên phương

Điều kiện xử lý

pháp


mẫu

Sắc ký lỏng
hiệu năng cao
detector
UV(HPLC/UV)

Meropenem

được

tách

huyết

khỏi

tương bằng cách tủa
protein

sử

Khoảng tuyến tính

LOD

TLTK

50ng/ml – 2500ng/ml.


25ng/ml

[13]

50-2500 ng/ml

16,7 ng/ml

[24]

dụng

TCA 15%.
100µl

dịch

mẫu

được ly tâm với
Sắc ký lỏng

100µl

chuẩn

nội

ghép nối khối


(ceftazidime) 10000

phổ (LC-

vịng/phút trong 4

MS/MS)

phút. Dịch sau ly
tâm được bơm vào
hệ LC-MS/MS.
dịch mẫu được ly

Sắc ký lỏng

tâm với chuẩn nội

siêu hiệu năng

(ceftazidime)

detector DAD

đệm MES, ly tâm

(UHPLC/DAD) 13000

và

0,5-100 µg/ml.


vịng/phút

trong 5 phút. Dịch

24

0,15
µg/ml

[16]


sau ly tâm được bay
hơi đến khô bằng
nito , phần dư được
hồn ngun trong
đệm MES, ly tâm
10000

vịng/phút

trong 10 phút. Dịch
thu được bơm vào
cột.
Sắc ký lỏng
tương tác thân
nước (HILIC)

Thêm


dung

dịch

đệm, bổ sung chất
nội chuẩn, kết tủa

1 µg/ml- 50 µg/ml.

0,05
µg/ml

[27]

protein và ly tâm.
Meropenem

được

tách ra khỏi nền mẫu
bằng
Phương pháp
vonampe sóng
vng (SWV)

cách

protein


sử

tủa
dụng
8,0.10−7 -

2,9.10-9

9,0.10−5 mol/L.

mol/l

5-50 µg/ml

4µg/ml

ACN, sau đó ly tâm
15000

vịng/phút

[14]

trong 5 phút, dịch
sau ly tâm được hịa
trong

đệm

BR


(pH=11).
Phương pháp
điện di mao
quản vùng
(CZE)

Mẫu huyết tương
được

pha

lỗng

trong nước với tỉ lệ
1:4.
Mẫu nước tiểu được

25

[32]