BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ HUYỀN

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH
ACID KOJIC CỦA NẤM MỐC
Aspergillus oryzae
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2018


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ HUYỀN
MÃ SINH VIÊN: 1301193

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH
ACID KOJIC CỦA NẤM MỐC
Aspergillus oryzae
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
1. PGS. TS. Đàm Thanh Xuân
2. ThS. Đào Anh Hoàng
Nơi thực hiện:
Bộ môn Công nghiệp Dược

HÀ NỘI - 2018

LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ sự kính trọng cùng lịng biết ơn chân thành nhất tới
PGS. TS. Đàm Thanh Xuân – người thầy đã truyền dạy cho tơi những bài học q báu
và lịng u khoa học từ những ngày đầu nghiên cứu tới nay, đã hết lòng hướng dẫn, tận
tâm chỉ bảo và giúp đỡ tơi hồn thành khóa luận tốt nghiệp này.
Tơi xin chân thành cảm ơn ThS. Đào Anh Hồng đã cho tơi những lời khun bổ
ích, nhiệt tình hướng dẫn, giải đáp thắc mắc và giúp đỡ tơi trong suốt q trình nghiên
cứu.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy, cô giáo và các anh, chị kỹ thuật viên Bộ môn
Công nghiệp Dược, đặc biệt là tổ Công nghệ Sinh học đã chỉ bảo, giúp đỡ tơi giải quyết
khó khăn và tạo điều kiện cho tơi hồn thành khóa luận.
Tơi cũng xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu, các phòng ban cùng tồn thể các
thầy cơ giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã dạy dỗ, tạo môi trường tốt nhất cho tôi học
tập và nghiên cứu tại trường trong suốt 5 năm.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân và bạn bè đã ln ở bên,
tiếp cho tôi động lực, giúp đỡ tôi trên quãng đường học tập và nghiên cứu.
Hà Nội, ngày 17 tháng 05 năm 2018
Sinh viên

Nguyễn Thị Huyền


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ .......................................................................................................... 1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ................................................................................... 2
1.1. Acid kojic .......................................................................................................... 2
1.1.1. Định nghĩa....................................................................................................... 2
1.1.2. Đặc điểm ......................................................................................................... 2
1.1.3. Công dụng ....................................................................................................... 3
1.2. Phương pháp sản xuất acid kojic ................................................................... 5
1.3. Vi sinh vật sinh acid kojic ............................................................................... 7
1.3.1. Giới thiệu chung.............................................................................................. 7
1.3.2. Chi Aspergillus ................................................................................................ 8
1.3.3. Loài Aspergillus oryzae ................................................................................ 10
1.4. Một số nghiên cứu về khả năng sinh acid kojic của Aspergillus oryzae .... 12
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................. 14
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị ................................................................................. 14
2.1.1. Nguyên vật liệu ............................................................................................. 14
2.1.2. Thiết bị sử dụng............................................................................................. 16
2.2. Nội dung nghiên cứu ...................................................................................... 17
2.2.1. Định tính và chiết tách acid kojic từ dịch nuôi cấy A. oryzae ...................... 17
2.2.2. Lựa chọn điều kiện lên men Aspergillus oryzae ........................................... 17
2.3. Phương pháp nghiên cứu .............................................................................. 17


2.3.1. Phương pháp giữ giống ................................................................................ 17
2.3.2. Phương pháp lên men thu acid kojic ............................................................ 17
2.3.3. Phương pháp tách chiết và tinh chế acid kojic từ dịch lên men ................... 18
2.3.4. Phương pháp định tính acid kojic ................................................................. 18
2.3.5. Phương pháp Schoorl- Regenbogen định lượng đường ............................... 19
CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .......................... 21
3.1. Định tính và chiết tách acid kojic từ dịch nuôi cấy A. oryzae .................... 21
3.1.1. Định tính acid kojic trong dịch lên men Aspergillus oryzae ........................ 21
3.1.2. Chiết tách acid kojic từ dịch ni cấy và xác định đặc tính sản phẩm thu

được……………………………………………………………………………... 23
3.2. Lựa chọn điều kiện lên men Aspergillus oryzae ........................................... 29
3.2.1. Lựa chọn nồng độ glucose ban đầu trong môi trường nuôi cấy ................... 29
3.2.2. Khảo sát khả năng tiêu thụ glucose của Aspergillus oryzae theo thời gian . 33
3.2.3. Lựa chọn thời điểm kết thúc quá trình lên men ............................................ 36
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .............................................................................. 40
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
A. oryzae
ESI – MS

FDA

Aspergillus oryzae
Phổ khối lượng ion hóa điện tử
(Electrospray Ionization - Mass Spectrometry)
Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ
(Food and Drug Administration)

IR

Hồng ngoại (Infrared)

m

Khối lượng


w/v

Khối lượng/ thể tích


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Một số dạng bào chế và các sản phẩm có chứa acid kojic .............................. 4
Bảng 1.2. Độc tố của một số chủng giống nấm mốc thuộc chi Aspergillus ....................9
Bảng 2.1. Các hóa chất sử dụng trong đề tài .................................................................14
Bảng 2.2. Các môi trường sử dụng trong đề tài ............................................................ 15
Bảng 2.3. Các thiết bị sử dụng.......................................................................................16
Bảng 3.1. Kết quả định tính acid kojic trong dịch lên men Aspergillus oryzae ............22
Bảng 3.2. Kết quả sắc ký lớp mỏng sản phẩm thu được và mẫu acid kojic nguyên liệu
.......................................................................................................................................25
Bảng 3.3. Kết quả sắc ký lớp mỏng sản phẩm thu được ở các hệ dung môi khác nhau
.......................................................................................................................................25
Bảng 3.4. Kết quả phân tích phổ hồng ngoại của sản phẩm thu được ..........................26
Bảng 3.5. Kết quả phân tích phổ khối lượng .................................................................28
Bảng 3.6. Khả năng tiêu thụ glucose của Aspergillus oryzae khi thay đổi

nồng

độ glucose trong môi trường..........................................................................................30
Bảng 3.7. Khả năng sinh acid kojic của Aspergillus oryzae khi thay đổi nồng độ
glucose trong môi trường............................................................................................... 31
Bảng 3.8. Khả năng tiêu thụ glucose của A. oryzae trong môi trường theo thời gian ..34
Bảng 3.9. Kết quả lượng sản phẩm acid kojic thu được tại các thời điểm
kết thúc quá trình lên men khác nhau ............................................................................37



DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình 1.1. Con đường sinh tổng hợp acid kojic của Aspergillus flavus. ..........................7
Hình 1.2. Aspergillus oryzae dưới kính hiển vi quang học (a), (b) (mơi trường Czapek)
và dưới kính hiển vi điện tử (c). ....................................................................................11
Hình 3.1. Hình ảnh sản phẩm thơ thu được ...................................................................23
Hình 3.2. Hình ảnh sắc ký lớp mỏng sản phẩm thu được ở hệ dung mơi 1, 2, 3 ..........24
Hình 3.3. Kết quả chồng phổ IR của acid kojic chiết từ mơi trường ni cấy

và

acid kojic ngun liệu ....................................................................................................26
Hình 3.4. Tinh thể acid kojic dưới kính hiển vi quang học vật kính 10 ........................27
Hình 3.5. Biểu đồ so sánh tỉ lệ tiêu thụ glucose của Aspergillus oryzae khi thay đổi
nồng độ glucose trong mơi trường ................................................................................30
Hình 3.6. Biểu đồ so sánh tỉ lệ sản phẩm thu được/ lượng glucose tiêu thụ của
Aspergillus oryzae khi thay đổi nồng độ glucose trong môi trường ............................. 31
Hình 3.7. Biểu đồ biến thiên lượng glucose tiêu thụ theo thời gian của A. oryzae .......34
Hình 3.8. Biểu đồ so sánh tỉ lệ sản phẩm thu được/ lượng glucose tiêu thụ khi kết thúc
quá trình lên men tại các thời điểm khác nhau .............................................................. 37


ĐẶT VẤN ĐỀ
Sự lên men được con người chú ý từ thời cổ đại, chủ yếu dưới dạng các kinh nghiệm
dân gian được lưu truyền và quá trình koji xuất hiện từ sớm là một ví dụ điển hình. Từ
q trình này, một hợp chất đã được phân lập vào năm 1907 bởi tiến sĩ Saito (Nhật Bản)
và hiện tại được gọi là acid kojic [12]. Thị trường của acid kojic phát triển từ năm 1955
với nỗ lực sản xuất đầu tiên thuộc về công ty Pfizer (Mỹ) [38]. Việc sản xuất acid hữu
cơ này ngày càng tăng bởi giá trị thương mại của nó trong nhiều lĩnh vực khác nhau:
trong y học, công nghiệp thực phẩm, nông nghiệp, công nghiệp hóa chất và đặc biệt là
trong ngành cơng nghiệp mỹ phẩm (Brtko và cộng sự, 2004; Bentley, 2006) [12], [14],

[16], [38]. Mặc dù đã được sản xuất trên quy mô công nghiệp, acid kojic vẫn được
nghiên cứu rộng rãi do nhu cầu sử dụng ngày càng cao với nội dung nghiên cứu thường
về sự cải thiện chủng giống và quá trình lên men [16], [38].
Acid kojic được tiết ra từ các chủng vi nấm thuộc chi Penicillium, Mucor,
Aspergillus,… hoặc vi khuẩn nhóm Gluconoacetobacter [15],[21]. Trong đó,
Aspergillus oryzae đã thu hút sự chú ý của các nhà khoa học trên thế giới về khả năng
sinh acid kojic với nhiều nghiên cứu đã được báo cáo (Kwak và Rhee, 1991; Wakisaka
và cộng sự, 1998) nhưng không sinh aflatoxin [32], [35], [50]. Tuy nhiên tại Việt Nam
những nghiên cứu về vấn đề trên vẫn cịn rất ít. Mặt khác, theo Hazaa (2013), khả năng
sinh acid kojic của các chủng phụ thuộc nhiều vào đặc tính của chủng và điều kiện ni
cấy [25]. Với những lý do đó đồng thời mong muốn được góp phần vào các nghiên cứu
về sản xuất acid kojic, đề tài “Khảo sát khả năng sinh acid kojic của nấm mốc Aspergillus
oryzae” được tiến hành với các mục tiêu sau:
- Định tính và chiết tách acid kojic từ dịch nuôi cấy Aspergillus oryzae.
- Lựa chọn điều kiện lên men Aspergillus oryzae.

1


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Acid kojic
1.1.1. Định nghĩa
Acid kojic là một acid hữu cơ, được tạo ra theo phương pháp sinh học, cụ thể từ
các loài nấm và vi khuẩn trong quá trình lên men với nhiều nguồn cơ chất chứa carbon
khác nhau [49].
1.1.2. Đặc điểm
Công thức tổng quát: C6H6O4
Tên khoa học: 5-hydroxy-2-(hydroxymethyl)pyran-4-one
Thành phần: C 50,70%; H 4,23%; O 45,07%
Khối lượng phân tử: 142,11 g/mol

Cơng thức cấu tạo:

OH
O
HO
O
Tính chất lý hóa của acid kojic:
Acid kojic kết tinh dưới dạng tinh thể hình que, lăng trụ khơng màu, khơng mùi, tan
trong nước (43,85 g/L), tan tốt trong ethanol, aceton, ethyl ether, hầu như không tan
trong benzen, cloroform [14], [16], [38].
Nhiệt độ nóng chảy: dao động từ 150 – 160℃ [8], [30].
Hằng số phân ly: pKa 7,90 và 8,03 [15], [51].
Acid kojic có cực đại hấp thụ tia cực tím tại bước sóng 270 nm.
Acid kojic được phân loại như một ℽ-pyron đa chức năng, dễ phản ứng với tính acid
yếu. Nó phản ứng ở mọi vị trí trên vịng và có thể tạo ra một số sản phẩm có giá trị trong
cơng nghiệp hóa học, ví dụ như chelat kim loại, pyridon, pyridin, ether, azodyes,
mannich base, các sản phẩm cyanoethyl hóa [27], [51].
Ở vị trí cacbon 5, nhóm hydroxyl hoạt động như một acid yếu, có khả năng tạo thành
muối với một số ít kim loại như natri, kẽm, đồng, canxi, niken và cadimi [16], [38].
2


Acid kojic và các dẫn xuất của nó với phân tử saccharin tan trong nước. Cấu trúc
của acid kojic có thể điều chỉnh bằng phản ứng glycosyl hóa [39].
Một phản ứng đặc trưng của acid kojic là tạo thành phức màu đỏ sáng với ion Fe3+
[13].
1.1.3. Công dụng
 Trong y học
Acid kojic và các dẫn xuất của nó có tính chất kháng sinh, chống lại các vi khuẩn
Gram âm cũng như các vi khuẩn Gram dương. Tại nồng độ lớn hơn 0,5% w/v, acid kojic

có khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn, chống lại trực khuẩn lao (gây bệnh ở
người) trong kỹ thuật in vitro dưới nhiều điều kiện khác nhau và tại nồng độ 45 mg/100
ml, acid kojic ức chế hoàn toàn sự phát triển bề mặt của trực khuẩn [33]. Dẫn xuất 7iodo của acid kojic có hoạt tính mạnh chống lại tụ cầu khuẩn Gram dương
Staphylococcus aureus 209 [31].
Dưới dạng azidometalkojat, acid kojic cho thấy tác dụng kháng khuẩn và kháng nấm
trên một số loài Bacillus, Staphylococcus, Saccharomyces, Aspergillus, Rhizopus và
Fusarium. Azidometalkojat dạng dẫn xuất kẽm thể hiện tác động gây độc nhất định lên
tế bào u HeLa [26], [38].
Một nghiên cứu khác cho rằng acid kojic có thể sử dụng để điều chế các hợp chất
có hoạt tính chống ung thư dựa trên các cơ chế hoạt động khác nhau ở các mức độ khác
nhau của quá trình trao đổi chất và chức năng của tế bào, đóng vai trị như một tác nhân
gây độc tế bào [41].
Khi kết hợp với acid glycolic và hydroquinon, acid kojic có thể được sử dụng để
điều trị bệnh melisma và các bệnh liên quan [24], [36].
 Trong mỹ phẩm:
Hiện nay acid kojic được ứng dụng rất nhiều trong ngành công nghiệp mỹ phẩm và
đây cũng là lợi ích nổi bật nhất của nó.
Acid kojic chủ yếu được sử dụng làm nguyên liệu để sản xuất kem làm trắng da,
kem dưỡng da, xà phòng làm trắng và các sản phẩm chăm sóc răng miệng. Tác dụng
làm trắng da của nó được giải thích dựa trên cơ chế ức chế sự hình thành tyrosinase –
enzym xúc tác quá trình chuyển hóa tyrosine thành melanin, từ đó ức chế hình thành
melamin, dẫn đến ngăn cản sự gia tăng sắc tố trong da người. Tác dụng này đã được
chứng minh trên in vitro và in vivo [17], [38], [46].
3


Acid kojic thường được sử dụng kết hợp với hydroquinon trong cơng thức làm trắng
da để kiểm sốt tàn nhan và đồi mồi do tuổi già. Tuy nhiên hydroquinon đã bị cấm sử
dụng trong mỹ phẩm ở châu Á, được cơ quan Thực phẩm và Dược phẩm Mỹ (FDA) xác
nhận là một hợp chất có thể gây ung thư. Do đó, hiện nay việc sử dụng acid kojic trong

chế phẩm làm trắng da đã gia tăng đáng kể [38].
Nhiều nghiên cứu đã báo cáo về phương pháp tổng hợp dẫn xuất của acid kojic: acid
kojic dipalmitat, acid kojic laureat, acid kojic ester nhằm cải thiện độ tan và độ ổn định
của acid kojic trong các sản phẩm mỹ phẩm. Mặt khác, các dẫn xuất của acid kojic được
tổng hợp thông qua liên kết ethylen của nhóm phosphonat với aldehyd có hoạt tính ức
chế enzym tyrosinase mạnh gấp 8 lần acid kojic. Phản ứng liên hợp acid kojic với các
acid amin cũng tạo ra các liên hợp có hoạt tính ức chế tyrosinase cao hơn và ổn định
hơn so với acid kojic đơn thuần [34], [40].
Ngồi tác dụng ức chế hình thành tyrosinase, acid kojic cịn có khả năng bảo vệ da
khỏi ảnh hưởng của tia cực tím [38].
Nồng độ được khuyên dùng của acid kojic trong mỹ phẩm là từ 0,5% đến 1,0% [28].
Bảng 1.1. Một số dạng bào chế và các sản phẩm có chứa acid kojic
Dạng bào chế

Sản phẩm điển hình

Gel bơi da

Skin Ceuticals Phyto+

Kem bơi da

Skin Lightening Cream

Lotion

Pure Kojic Acid Skin Lightening Body Lotion

 Trong công nghiệp thực phẩm
Acid kojic có nguồn gốc tự nhiên trong các món ăn truyền thống của Nhật Bản như

miso, nước tương và sake [12], [38]. Trong sản xuất, acid kojic còn đóng vai trị là tiền
chất cho các chất điều hương vị điển hình như maltol và ethyl maltol (hợp chất có cơng
dụng cải thiện mùi vị thực phẩm, đồng thời cũng là một thành phần trong nước hoa)
[12], [27].
Một công dụng khác của acid kojic là ngăn ngừa sự hình thành các vết nâu (do các
phản ứng hóa học xảy ra bên trong thực phẩm) trong quá trình bảo quản và chế biến mì
thơ. Nó có tác dụng ức chế polyphenol oxidase trong nấm, táo, khoai tây, một số loại
4


tôm dựa trên khả năng ngăn cản hấp thu oxy cần thiết cho quá trình nâu enzym (là quá
trình hình thành các sắc tố màu nâu ảnh hưởng đến mùi vị, màu sắc và giá trị của thực
phẩm) [17], [38], [47]. Do vậy, đây cũng là một ứng dụng phổ biến của acid kojic: dùng
trong bảo quản thực phẩm (thường sử dụng ở nồng độ 1,0% để bảo quản rau củ, 0,2%
để bảo quản các sản phẩm từ thịt – được coi là nồng độ an tồn) [28].
 Trong cơng nghiệp hóa học
Là thuốc thử để xác định sắt: Acid kojic là dẫn xuất pyron đầu tiên được sử dụng để
phân tích sắt trong quặng dựa trên phản ứng hóa học. Cơ sở của phương pháp này là khả
năng tạo phức hợp bền màu đỏ với lượng nhỏ ion sắt nồng độ 0,1 ppm của acid kojic.
Phức hợp chelat của acid kojic với kim loại được coi như cơ sở cho sự kiểm sốt giải
phóng của ion kim loại trong các chất có tác dụng làm thuốc hoặc các chất xúc tác [38],
[51].
Acid kojic có thể dễ dàng kết hợp với chitosan để sản xuất các hợp chất acid kojic
– chitosan (hoạt chất sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp khác nhau như
thực phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm, nông nghiệp và môi trường) [48].
 Trong nông nghiệp
Acid kojic có tác dụng nhất định chống lại cơn trùng Heliothis zea và Spodoptera
frugiperda (loài sâu bướm gây hại cho cây trồng). Đồng thời nó được sử dụng như một
chất tạo phức chelate để sản xuất thuốc trừ sâu [20]. Acid kojic có tác dụng ức chế sự
phát triển của ấu trùng Trogoderma (một loài bọ cánh cứng), làm mất khả năng sinh sản

của cả con đực và con cái thuộc chi này, ức chế sự phát triển của Musca domestica (ruồi
nhà) cũng như của Drosophila melanogaster (ruồi giấm). Các dẫn xuất của acid kojic
có tác dụng chống nấm Phythium graminicola, Fusarium oxysporum và Rhizoctonia
solani, gây bệnh thối hạt, héo lá cho cây trồng [11], [19], [29], [38].
1.2. Phương pháp sản xuất acid kojic
Acid kojic được sản xuất bằng phương pháp vi sinh vật với các chủng có khả năng
sinh acid kojic.
Rất nhiều loại cơ chất có thể được sử dụng, đó là các hợp chất có hai nguyên tử
carbon (ethanol, acid glycolic), ba (glycerol, dihydroxyaceton), bốn (acid tartric), năm
(ribitol), sáu (glucose, manitol, sorbitol) hoặc bảy (acid quinic, acid shikimic). Ngoài ra
cịn có thể sử dụng các di-, tri- và polysaccharid như gạo, khoai lang, lúa mì, lúa mạch
đen, yến mạch [7], [12].
5


Về cơ chế sinh tổng hợp: Các quá trình oxy hoá như CHOH → CO xảy ra thường
xuyên trong quá trình chuyển hóa của nấm và vi khuẩn, thể hiện bằng sự xuất hiện một
cách phổ biến của acid ketogluconic. Thơng thường chỉ tìm thấy các hợp chất 2- hoặc
5-keto, tuy nhiên nghiên cứu của Horecker và Smyrniotis (1950) đã khẳng định hợp chất
3-keto tồn tại: 3-ketogluconic acid 6-phosphate được cho là chất trung gian trong sự
hình thành ribose 5-phosphate từ 6-phosphogluconat bởi enzym. Ngoài ra, theo RiedlTfumova và Bernhauer (1950), một acid ketogluconic không phải là acid 2- hoặc 5- keto
và có thể là acid 3-ketogluconic đã được phân lập từ Acetobacter melanogenum - nhóm
vi khuẩn duy nhất được biết đến để sản xuất axit kojic. Gluconolactone (V) có thể là
bước đầu tiên trong sự hình thành acid kojic đặc biệt do acid gluconic được tạo ra bởi
một dòng Aspergillus oryzae và acid gluconic, gluconolactone có thể được sử dụng để
sản xuất axit kojic. Nếu q trình oxy hóa thành acid lactone 3-ketogluconic (VI) xảy
ra, hai con đường tiếp theo có thể là: (a) Giảm đến 3-ketoglucose (III), sau đó mất hai
phân tử nước hoặc (b) mất một phân tử nước để tạo (VII), sau đó giảm nhóm carbonyl
(để tạo (VIII)) và mất một phân tử nước thứ hai [7].


Trong q trình lên men, glucose trong mơi trường chuyển đổi thành acid kojic
thông qua hoạt động của hệ thống enzym liên kết với tế bào bao gồm glucose-6phosphate dehydrogenase, hexokinase và gluconate dehydrogenase [8], [10]. Glucose
hoạt động như một tiền chất trong tổng hợp acid kojic và quá trình tổng hợp chấm dứt
khi tất cả lượng đường trong môi trường cạn kiệt [43].
Con đường tổng hợp sinh học của acid kojic đã được báo cáo trong đó gluconic
acid-δ-lactone và ít nhất một trong ba hợp chất 3-ketogluconic acid lactone, 3ketoglucose và oxy-kojic acid đóng vai trị là chất trung gian trong con đường này [9].
6


Hình 1.1. Con đường sinh tổng hợp acid kojic của Aspergillus flavus [9].
Chú thích: Dehydrogenation là q trình tách hydro, dehydration là quá trình tách
nước, reduction là quá trình khử.
1.3. Vi sinh vật sinh acid kojic
1.3.1. Giới thiệu chung
Năm 1907, tiến sĩ Saito lần đầu tiên phát hiện ra sự xuất hiện của acid kojic từ sợi
nấm Aspergillus oryzae được nuôi cấy trên nguồn cơ chất là cơm [44].
Tên gọi 'acid kojic' (ban đầu được gọi là acid koji) bắt nguồn từ "koji", tác nhân xúc
tác được sử dụng trong quá trình lên men thực phẩm ở các nước phương Đông trong
nhiều thế kỷ. Acid này được Yabuta (1912) gọi là acid kojic và được ông xác định là
một dẫn xuất ℽ - pyrone (nghiên cứu tại phịng thí nghiệm của G. Barger, Khoa Y Dược,
Đại học Edinburgh, công bố ngày 10 tháng 3 năm 1924) [16]. Tiếp sau đó, nhiều vi sinh
vật khác đã được chứng minh là có khả năng sản xuất acid kojic.
Acid kojic là một acid hữu cơ và là chất chuyển hóa thứ cấp, được tiết ra bởi một số
vi sinh vật của chi Aspergillus, đặc biệt các chủng như Aspergillus oryzae, Aspergillus
tamarii, Aspergillus parasiticus và Aspergillus flavus (có khả năng tiết ra lượng lớn)
[38]. Có 58 chủng khác nhau được sử dụng để sản xuất acid kojic là Penicilium, Mucor,
Aspergillus... [21]. Gluconoacetobacter là nhóm vi khuẩn duy nhất được báo cáo về khả
năng sinh acid kojic [7]. Ngồi ra, acid kojic cịn có thể được sản xuất bằng cách sử
dụng một số loài thực vật như Kigella africana [22]. Sự phong phú của nguồn sinh vật
7



có khả năng tạo acid kojic có thể liên quan đến tính chất tương đối đơn giản của cơ chế
sinh tổng hợp.
Việc sản xuất acid kojic từ nấm mốc, đặc biệt từ các loài Aspergillus và Penicillium
tạo ra nhiều loại aflatoxin, độc tố gây bệnh và gây ung thư cho người, động vật [16].
Dưới đây là một số chủng vi sinh vật điển hình trong các nghiên cứu về sinh tổng
hợp acid kojic:
Aspergillus flavus là chủng có khả năng sinh acid kojic cao nhất trong tất cả các vi
sinh vật sản xuất acid kojic. Tuy nhiên, nó cũng là một tác nhân gây bệnh và nguyên
nhân thường liên quan đến aflatoxin. Một số chủng đột biến do tia cực tím và gamma
cho thấy khả năng sản xuất acid kojic cao trong quá trình lên men và glucose được xem
là nguồn carbon tốt nhất [18], [21].
Aspergillus oryzae là chủng đầu tiên được sử dụng để sản xuất acid kojic. Ngồi ra,
nó còn được dùng trong sản xuất một số thực phẩm, bao gồm miso, shoyu và sake trên
toàn thế giới [12].
Aspergillus parasiticus là một trong số chủng nấm sinh ra nhiều acid kojic tuy nhiên
năng suất thấp hơn so với Aspergillus flavus và Aspergillus oryzae. Aspergillus tamari,
Trichoderma reesei và Trichoderma viride nói chung khơng thích hợp cho sản xuất acid
kojic quy mơ cơng nghiệp điển hình như chủng Aspergillus tamarii NRC 18 do khả năng
sinh acid kojic thấp hơn so với các loài Aspergillus khác như Aspergillus flavus,
Aspergillus oryzae, Aspergillus parasiticus [25], [45].
1.3.2. Chi Aspergillus
Năm 1729, Pier Antonio Micheli - nhà thực vật học người Ý đã khai sinh ra nấm
học qua tài liệu công bố “giống cây lạ”. Nhưng theo giáo sư Ekrikssion Gunnan (1978)
thì người có cơng nghiên cứu sâu về nấm mốc lại là Elias Fries (1794 – 1874). Elizabeth
Tootyll (1984) cho rằng nấm mốc có khoảng 5.100 giống và 50.000 lồi được mơ tả,
tuy nhiên ước tính có trên 100.000 đến 250.000 lồi nấm hiện diện trên trái đất [1].
Aspergillus là một trong những chi nổi tiếng nhất và được nghiên cứu nhiều nhất. Giống
nấm Aspergillus có thể lên đến 200 lồi, trong đó có khoảng 20 lồi gây hại cho con

người.
Aspergillus có dạng hình sợi, phân nhánh, khuẩn ty có vách ngăn, khơng màu, màu
nhạt hoặc trở nên nâu, nâu nhạt ở một số vùng nhất định trên khuẩn lạc. Sợi nấm đa bào,
8


đầu sợi nấm sinh sản phình to ra tạo thành các tế bào hình chai, phía trên mọc các cuống
sinh bào tử đính. Các bào tử đính xịe ra như những bông hoa cúc. Về màu sắc:
Aspergillus niger màu đen, Aspergillus oryzae màu vàng hoa cau, Aspergillus awamori
màu đen, Aspergillus flavus màu vàng xanh, Aspergillus usami màu đen nâu. Chúng
phân bố chủ yếu trên bề mặt các loại lương thực thực phẩm trong quá trình bảo quản,
trong đất, ở nhiều loại đồ dùng trong gia đình, một số đồ dùng cơng nghiệp và cịn kí
sinh trên cả cơ thể sống. Nhiều lồi đóng vai trị như những vi sinh vật phân hủy chất
hữu cơ, một số loài được dùng trong công nghiệp để tạo ra acid oxalic, acid citric, nhiều
loại men, chất kháng sinh… Ở Việt Nam, mốc Aspergillus đã được sử dụng từ lâu với
mục đích làm tương và được gọi là mốc vàng, mốc hoa cau [2].
Vào năm 1960, người Anh chịu thiệt hại lớn do một vụ dịch gà tây ăn phải khô lạc
mốc nhập từ Braxin với nguyên nhân được phát hiện là do độc tố của Aspergillus flavus.
Người ta đã xác định được độc tố này và đặt tên là aflatoxin, tên chắp từ ba chữ: “A”
của chữ “Aspergillus”, “fla” của chữ “flavus” và “toxin” nghĩa là độc tố. Cho đến cuối
năm 1973 thì các aflatoxin đã phát hiện tới 16 loại. Các aflatoxin được chú ý nhiều nhất
là các aflatoxin gây ung thư như aflatoxin B1, aflatoxin B2, aflatoxin B3 (có trong
Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus). Ngoài hai loại Aspergillus flavus,
Aspergillus parasiticus, nhiều loài Aspergillus khác cũng được xác định là sinh ra các
độc tố ít nhiều gây nhiễm độc cơ thể [2].
Bảng 1.2. Độc tố của một số chủng giống nấm mốc thuộc chi Aspergillus [16]
Độc tố

Nấm


Aflatoxins, Aflatrem, Aspergilic acid,
Aspergillus flavus

Cydoplazonic acid, β-nitropionic acid,
Serigmatocyctin
Aspergilic acid, Cycopiazonic acid,

Aspergillus oryzae

Maltoryzine β-nitropropionic acid,
Ochtratoxins

Aspergillus parasiticus
Aspergillus toxicarius

Aflatoxins, Aspergillic acid,
Sterigmatocyctin
Aflatoxins

9


1.3.3. Loài Aspergillus oryzae
Một số chủng nấm mốc thuộc giống Aspergillus được sử dụng trong công nghệ lên
men, sản xuất enzym (amylase, protease, pectinase…) và các acid hữu cơ (acid citric,
acid glucomic…) trong đó có Aspergillus oryzae.
Lồi Aspergillus oryzae được phân loại thuộc:
Giới:

Nấm (Fungi)


Ngành:

Ascomycota

Lớp:

Eurotiomycetes

Bộ:

Eurotiales

Họ:

Trichocomaceae

Chi:

Aspergillus

Loài:

Aspergillus oryzae [4]

Năm 1950, Aspergillus oryzae được phân lập lần đầu bởi Jokichi Takamine – một
nhà khoa học Nhật Bản và được gọi là RIB40 hoặc ATCC 42149 theo Wikipedia (2014).
Năm 2001, bộ gen di truyền của Aspergillus oryzae đã được phân tích và giải mã. Hệ
gen gồm 8 nhiễm sắc thể với 12.074 gen và 37 triệu cặp base (theo Machida và cộng sự,
2005) [37]. Đến nay, loài Aspergillus oryzae đang được ứng dụng trong rất nhiều lĩnh

vực ở các quốc gia khác nhau, đặc biệt là các nước châu Á.
Aspergillus oryzae có cấu tạo đa bào, sinh sản bằng bào tử, không sinh độc tố
aflatoxin và tạo hương tốt. Khi mới phát triển hệ sợi có màu trắng, sau đó chuyển sang màu
vàng, khi già thì chuyển hẳn sang màu xanh lục, phân nhánh có vách ngang chia sợi thành
nhiều tế bào sợi mảnh, chiều ngang sợi khoảng 5 – 7 µm. Từ những sợi nằm ngang hình
thành những sợi thẳng đứng gọi là cuống đính bào tử, ở đầu có cơ quan sinh sản vơ tính.
Cuống đính bào tử của Aspergillus oryzae thường dài 1,0 – 2,0 mm nên có thể nhìn thấy
bằng mắt thường. Phía đầu cuống đính bào tử phồng lên gọi là bọng. Từ bọng này phân chia
thành những tế bào nhỏ, thn, dài gọi là những tế bào hình chai. Đầu các tế bào hình chai

phân chia thành những bào tử dính vào nhau, gọi là đính bào tử, có màu vàng lục hay
màu vàng hoa cau (dưới kính hiển vi đính bào tử có dạng hình cầu có tia). Đây chính là
đặc trưng ở Aspergillus oryzae [4].

10


(a)

(b)

(c)

Hình 1.2. Aspergillus oryzae dưới kính hiển vi quang học (a), (b) (mơi trường
Czapek) và dưới kính hiển vi điện tử (c) [25].
Độ ẩm môi trường tối ưu cho sự hình thành bào tử của Aspergillus oryzae là 45%,
nhiệt độ thích hợp trong khoảng 28℃ – 32℃, độ ẩm khơng khí 85-95%, pH mơi trường
từ 5,5 đến 6,0, hồn tồn hiếu khí. Nấm mốc phải trực tiếp sử dụng các chất hữu cơ có
sẵn trong mơi trường để phát triển và đảm bảo hoạt động bình thường [4].
Aspergillus oryzae có các enzym thủy phân nội bào và ngoại bào như amylase,

glucoamylase, protease, pectinasa, xylanase, hemycenlulase... Trong đó hệ enzym
amylase tổng hợp từ Aspergillus oryzae có hoạt lực cao hơn so với một số chủng nấm
mốc và vi khuẩn khác. Ngoài ra Aspergillus oryzae có khả năng tổng hợp cả ba loại
enzym protease (acid, kiềm và trung tính).
Chủng Aspergillus oryzae là loại nấm sợi quan trọng trong công nghiệp, cách đây
hàng trăm năm nó được dùng để lên men rượu sake, pate đậu phộng, nước tương ở Nhật.
Người ta nhận ra rằng Aspergillus oryzae lên men tương ngon hơn so với một số chủng
khác vì chúng có khả năng biến đổi tinh bột của gạo nếp thành đường làm tương có vị
ngọt. Aspergillus oryzae đang được ứng dụng rộng rãi trong công nghệ lên men truyền
thống ở nhiều nước châu Á như Trung Quốc, Nhật Bản, Philippin, Indonesia và Việt
Nam. Cho đến thời điểm này thì chủng Aspergillus oryzae đã được đưa vào sử dụng phổ
biến trong công nghiệp sản xuất enzym (α-amylase, glucoamylase) và trong các ngành
chế biến thực phẩm.
Trong quá trình sinh trưởng và phát triển, nấm mốc phải trực tiếp sử dụng các chất
hữu cơ có sẵn trong môi trường để tổng hợp các chất cần thiết và chịu tác động từ các
yếu tố bên ngoài. Để nghiên cứu và ứng dụng Aspergillus oryzae vào sản xuất cần hiểu
11


được ảnh hưởng của thành phần dinh dưỡng cũng như các điều kiện nuôi cấy khác lên
sự sinh trưởng, phát triển và khả năng sinh sản phẩm của chúng.
1.4. Một số nghiên cứu về khả năng sinh acid kojic của Aspergillus oryzae
 Nghiên cứu ở nước ngoài
Khả năng sinh acid kojic của Aspergillus oryzae lần đầu tiên được ghi nhận bởi tiến
sĩ Saito vào năm 1907. Ông đã chiết xuất hợp chất từ bột nấm với nước nóng và sau đó
tiến hành chiết với ether cho ra một sản phẩm thô, được tinh chế bằng cách kết tinh lại
từ nước nóng [44].
Năm 1912, Teijiro Yabuta, một nhà khoa học nơng nghiệp, trường Đại học Hoàng
gia, Tokyo đã tiến hành tạo các dẫn xuất của acid kojic. Trong nghiên cứu, Aspergillus
oryzae được cấy vào môi trường gạo và giữ ở nhiệt độ 30℃ - 35℃ trong 2 - 3 tuần, lắc

gián đoạn, cho đến khi thu được sợi nấm và bào tử. Sau khi sấy khô ở nhiệt độ thấp, gạo
đã được chế thành bột và chiết xuất bằng ether. Yabuta đã đặt tên “koji” - tên gọi thông
thường của Aspergillus oryzae cho sản phẩm, và thu được khoảng 50 g acid kojic từ 15
kg gạo [12].
Tiếp sau đó, một loạt các nghiên cứu về việc sản xuất acid kojic bằng cách lên men
Aspergillus oryzae đã được báo cáo. Kitada và cộng sự (1967) công bố đạt được mức
sản xuất 24 g/l acid kojic khi sử dụng môi trường nuôi cấy truyền thống có chứa glucose
với nồng độ 100 g/l và một vài gram trên mỗi lít peptone cùng một lượng khoáng chất
nhất định. Kwak và Rhee (1991) đã tiến hành thực nghiệm thành công trong việc tăng
nồng độ của acid kojic lên 83 g/l bằng cách sử dụng các tế bào cố định của Aspergillus
oryzae. Takafumi Futamura và cộng sự (2000) nhận định sự cải thiện khả năng sinh acid
kojic của chủng đột biến Aspergillus oryzae, MK107-39. Lượng acid kojic do chủng
MK107-39 sinh ra là 28 g/1 từ 100 g/l glucose, gấp 7,7 lần so với khả năng sản xuất của
chủng gốc. Dựa trên việc sử dụng các carbohydrat và acid hữu cơ khác nhau, tác giả
nhận định chủng MK107-39 có một số đột biến về sự chuyển hóa carbohydrat [23], [30],
[32].
 Nghiên cứu ở Việt Nam
Các nghiên cứu về khả năng sinh acid kojic của Aspergillus oryzae còn khá ít hoặc
chưa được cơng bố nhiều. Nhóm tác giả Trương Phương (tại Đại học Y Dược Thành
12


phố Hồ Chí Minh) cơng bố đề tài điều chế kojic dipalmitat gồm hai phần: “Sàng lọc
chủng Aspergillus oryzae và nghiên cứu điều kiện lên men thu nhận acid kojic” và “Tổng
hợp ester – kojic dipalmitat” đăng tải trên Tạp chí Dược học (2013). Trong báo cáo
“Sàng lọc chủng Aspergillus oryzae và nghiên cứu điều kiện lên men thu nhận acid
kojic”, với phương pháp lên men trong môi trường lỏng được lắc với tốc độ 200 vịng/
phút, nhóm tác giả này đã ghi nhận chủng A. oryzae 4F được phân lập từ mẫu cơm, bánh
mì tại quận Bình Thạnh, Thành phố Hồ Chí Minh cho nồng độ acid kojic cao nhất (36,25
g/l) và lựa chọn điều kiện lên men thích hợp với chủng 4F: nuôi cấy tại nhiệt độ 30℃,

sử dụng glucose làm nguồn carbon với nồng độ 100 g/l, sử dụng pepton casein làm
nguồn nitơ với nồng độ 2,5 g/l trong thời gian 15 ngày [6].

13


CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị
2.1.1. Nguyên vật liệu
 Chủng giống Aspergillus oryzae do Bộ môn Công Nghiệp Dược trường Đại học
Dược Hà Nội cung cấp.
 Nguyên liệu sử dụng trong đề tài:
Bảng 2.1. Các hóa chất sử dụng trong đề tài
Tên hóa chất

Nguồn gốc

Tên hóa chất

Nguồn gốc

Glucose

Trung Quốc

KNa(C4H4O6)

Trung Quốc

Cao nấm men


Merck – Đức

NaOH

Trung Quốc

KH2PO4

Trung Quốc

CuSO4

Trung Quốc

MgSO4.7H2O

Trung Quốc

KI

Trung Quốc

Pepton

Merck – Đức

H2SO4 98%

Trung Quốc


Thạch bột

Việt Nam

Na2S2O3

Trung Quốc

Nước RO

Việt Nam

FeCl3 3%

Việt Nam

Ethanol 96o

Việt Nam

Na2CO3

Trung Quốc

Acid kojic nguyên liệu Brillian – Trung Quốc Ethylacetat

Trung Quốc

Tinh bột


Việt Nam

Aceton

Trung Quốc

Methanol

Trung Quốc

Cloroform

Trung Quốc

14


 Môi trường sử dụng trong đề tài:
Bảng 2.2. Các môi trường sử dụng trong đề tài
Môi trường giữ giống
Thành phần

Môi trường lên men

Khối lượng

Thành phần

(g/100ml)


Khối lượng
(g/100ml)

Glucose

10,0

Glucose

10,0

Pepton

0,3

Cao nấm men

0,25

KH2PO4

0,1

KH2PO4

0,1

MgSO4.7H2O


0,05

MgSO4.7H2O

0,05

Thạch bột

2,0

Nước RO

Nước RO

Vừa đủ

pH

pH

Vừa đủ
6,5

6,5

 Các dung dịch sử dụng được pha theo hướng dẫn của DĐVN IV:
1. Dung dịch Fehling A: Hòa tan 34,66 g đồng sulfat trong nước đã acid hóa bằng
2 giọt đến 3 giọt acid sulfuric lỗng vừa đủ 500 ml.
2. Dung dịch Fehling B: Hòa tan 173 g natri kali tartrat và 50 g natri hydroxyd trong
400 ml nước, làm nguội, thêm nước vừa đủ 500 ml.

3. Dung dịch acid sulfuric 25%: Cho từ từ 143 ml acid sulfuric 98% vào 500 ml
nước, khuấy liên tục, làm nguội, thêm nước vừa đủ 1000 ml.
4. Dung dịch natri thiosulfate 0,1 N: Hòa tan 25,0 g natri thiosulfate và 0,2 g natri
carbonat trong nước khơng có carbon dioxyd vừa đủ 1000 ml.
5. Dung dịch hồ tinh bột: Nghiền 1 g tinh bột với 5 ml nước, rồi vừa đổ vừa khuấy
vào 100 ml nước sôi. Đun sôi cho đến khi thu được chất lỏng chỉ hơi đục, pha trước khi
dùng.
6. Các hệ dung môi sắc ký lớp mỏng: tiến hành pha trong tủ hốt theo tỉ lệ như sau:
Ethylacetat – Methanol (15:1)
Aceton – Cloroform

(7:3)

Methanol- Cloroform

(1:1)
15


2.1.2. Thiết bị sử dụng
Bảng 2.3. Các thiết bị sử dụng
Thiết bị sử dụng

Nguồn gốc, xuất xứ

Cân kỹ thuật

Satorious, Đức

Cân phân tích


Satorious, Đức

Nồi hấp

ALP, Nhật

Tủ cấy vơ trùng

Clean Bench, Nhật

Máy lắc ổn nhiệt

Bio- Shaker BR- 300LF, Nhật

Thiết bị hút chân không

VRL Model 200- 7.0, Mỹ

Bể điều nhiệt cách thủy

WiseBath, Hàn Quốc

Tủ lạnh

LG, Hàn Quốc

Tủ sấy

Memmert, Đức


Tủ ấm thường

Memmert, Đức

Lò vi sóng

Sharp, Nhật Bản

Thiết bị đo nhiệt độ nóng chảy

Buchi, Thụy Sĩ

Thiết bị đo phổ hồng ngoại

Jasco, Nhật

Thiết bị đo phổ khối (ESI – MS)

Bruker, Mỹ

Kính hiển vi gắn camera

Nikon, Nhật

Bản mỏng sắc ký

Merck KGaA, Đức

Ống nghiệm, bình nón, đĩa petri, que

cấy, giấy chỉ thị vạn năng,…

16


2.2. Nội dung nghiên cứu
2.2.1. Định tính và chiết tách acid kojic từ dịch ni cấy Aspergillus oryzae
 Định tính acid kojic trong dịch lên men Aspergillus oryzae.
 Chiết tách acid kojic từ dịch nuôi cấy và xác định đặc tính sản phẩm thu được.
2.2.2. Lựa chọn điều kiện lên men Aspergillus oryzae
 Lựa chọn nồng độ glucose ban đầu trong môi trường nuôi cấy.
 Khảo sát khả năng tiêu thụ glucose của Aspergillus oryzae theo thời gian.
 Lựa chọn thời điểm kết thúc quá trình lên men.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp giữ giống
Cân đong nguyên liệu, pha môi trường giữ giống (theo công thức ở bảng 2.2) rồi
chia vào các ống nghiệm, 10 ml/ ống, vặn kín nắp (chú ý không vặn quá chặt). Hấp tiệt
trùng ở điều kiện 0,6 atm trong 20 phút, để nguội xuống 65℃ – 70℃. Tiến hành đặt
thạch nghiêng (chiều cao môi trường thạch không vượt quá 2/3 ống nghiệm), để yên
trong 1 giờ cho mơi trường thạch rắn lại. Sau đó, dựng ống nghiệm thẳng đứng trong
khoảng 2 giờ để nước đọng lại trên thành ống chảy xuống đáy ống nghiệm.
Tiến hành cấy giống: Lấy một vòng que cấy từ khuẩn lạc nấm mốc trong ống giống,
cấy thành một đường thẳng lên bề mặt thạch, sao cho đường cấy đều, không bị đứt
quãng. Thao tác thực hiện trong tủ cấy vô trùng. Nuôi trong tủ ấm thường ở 30℃. Sau
một khoảng thời gian nhất định có được ống giống cần thiết. Bảo quản ống giống trong
tủ lạnh 2℃ – 4℃.
2.3.2. Phương pháp lên men thu acid kojic
Chuẩn bị 100 ml môi trường lên men (theo công thức ở bảng 2.2) vào bình nón thể
tích 250 ml. Nút bình nón bằng bơng không thấm nước. Tiệt trùng môi trường ở điều
kiện 0,6 atm trong 20 phút, để nguội đến nhiệt độ khoảng 30 – 35℃.

Tiến hành cấy giống: Lấy một vòng que cấy từ khuẩn lạc nấm mốc trong ống giống,
cấy vào môi trường đã chuẩn bị ở trên. Thao tác thực hiện trong tủ cấy vô trùng. Nuôi
trong máy lắc ổn nhiệt ở 30℃, tốc độ lắc 150 vòng/ phút. Kết thúc thời gian lên men,
lọc lấy dịch để kết tinh acid kojic và xác định lượng glucose đã được tiêu thụ.
17