VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II

NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN TỐI ƯU NUÔI CẤY THU NHẬN BÀO TỬ
Bacillus S5 BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐÁP ỨNG BỀ MẶT (RSM)
Võ Hồng Phượng1*, Đặng Ngọc Thùy1, Nguyễn Thị Lan Chi1, Nguyễn Thanh Trúc1,
Chu Quang Trọng1, Phạm Thị Huyền Diệu2

TÓM TẮT
Chủng vi khuẩn Bacillus S5 là được phân lập từ bùn ao nuôi tôm quảng canh có khả năng ức chế vi khuẩn
V. parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (AHPND - acute hepatapancreatic necrosis disease)
trong điều kiện thí nghiệm. Nghiên cứu này nhằm lựa chọn các điều kiện và môi trường lên men phù hợp cho
sự sinh trưởng và tạo bào tử của chủng Bacillus S5 để ứng dụng trong sản xuất probiotic cho nuôi trồng thủy
sản. Mật độ tế bào OD550nm trong dịch nuôi cấy là thông số được sử dụng để đánh giá ảnh hưởng của các điều
kiện lên men. Tối ưu các điều kiện lên men được sử dụng bằng phương pháp đáp ứng bề mặt (RSM). Môi
trường tối ưu để sản xuất sinh khối Bacillus S5 sau 48 giờ lên men đạt giá trị OD550nm 11,36 tương ứng 4,3x109
CFU/mL là: bột đậu nành 34,9 g/L, cao nấm men 20 g/L, glucose 35 g/L và tốc độ lắc 170 vịng/phút. Ngồi
ra, 0,5 g/L ion Ca2+ được bổ sung sau 30 giờ lên men có thể kích thích trên 90% tế bào dinh dưỡng Bacillus
S5 chuyển thành bào tử.
Từ khóa: Sinh khối Bacillus S5, bào tử Bacillus S5, tối ưu các điều kiện nuôi cấy.

I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Khả năng kháng kháng sinh của các tác
nhân gây bệnh đã thúc đẩy phát triển nhiều cơng
trình nghiên cứu các giải pháp thay thế kháng
sinh trong trị bệnh do vi khuẩn gây ra (Gauri và
ctv., 2011). Các chủng Bacillus được xem là đối
tượng hàng đầu và được nhiều nhà nghiên cứu
khoa học quan tâm nhằm ứng dụng và sản xuất
probiotic với một số đặc tính như sản sinh một
số enzyme ngoại bào, tạo bào tử bền với nhiệt
thuận lợi trong quá trình sản xuất, bảo quản và

sử dụng (Duc và ctv., 2004). Lên men chìm được
xem là phương pháp hữu hiệu và được ứng dụng
rộng rãi trong công nghiệp sản xuất probiotic
nhờ khả năng kiểm sốt các thơng số được dễ
dàng (Nguyễn Văn Thanh và ctv., 2009).
Bacillus subtilis là vi khuẩn Gram dương,
khả năng tạo bào tử chúng được xem như là
những nghiên cứu quan trọng trong lĩnh vực
công nghiệp (Harwood, 1992). Thể bào tử
của B. subtilis được kích thích mạnh khi mật
độ tế bào vi khuẩn cao (Grossman và Losick,
1988), sự thiếu hụt về dinh dưỡng (Schaeffer

và ctv., 1965), thành phần muối khống cao,
pH mơi trường ni cấy trung tính và nhiệt độ
mơi trường ni phù hợp với từng lồi vi khuẩn
(Bernlohr và Leitzmann, 1969). Bào tử Bacillus
sp. được hình thành sau pha tăng trưởng (log
phage) của tế bào sinh dưỡng. Trong điều kiện
lý tưởng, hiệu quả chuyển thành bào tử của vi
khuẩn Bacillus sp. mật độ 108 tế bào ml-1 trong
khoảng 30-100% (Nicholson và Setlow, 1990).
Ngoài ra, muối được đưa vào môi trường lên
men cũng tăng khả năng tạo bào tử của nhóm
Bacillus, nhưng với nồng độ ion kim loại nặng
cao có thể ảnh hưởng đáng kể đến q trình tạo
bào tử (Cho và ctv., 2009). Sáu ion kim loại,
Mn2+, Fe3+, Fe2+, Ca2+, Mg2+ và Zn2+ được xem
là những yếu tố quan trọng kích thích bào tử
(Kolodziej và Slepecky, 1964, Granger và ctv.,

2011). Đến nay, có nhiều cơng trình nghiên cứu
được báo cáo giá trị tối đa tạo bào tử của B.
subtilis trong lên men chìm dao động 109 bào tử
ml-1 đến 7,4 x109 bào tử ml-1(Monteiro và ctv.,
2005). Sự điều chỉnh các chỉ số tạo bào tử trong
quá trình lên men thường được giám sát chặt

Trung tâm Quan trắc Môi trường và Bệnh Thủy sản Nam Bộ, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II.
Trường Đại học Sư phạm, Tp. HCM.
*Email:

1
2

TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ 13 - THÁNG 6/2019

45


VIỆN NGHIÊN CỨU NI TRỒNG THỦY SẢN II

chẽ nhằm kích thích tạo bào tử tốt nhất (Rao và
ctv., 2007).
Chủng Bacillus S5 được phân lập từ mẫu
bùn ao nuôi quảng canh tại Cà Mau, có khả
năng tạo vịng kháng Vibrio parahaemolyticus
gây bệnh gan tụy cấp tính trên tơm (AHPND)
với đường kính 15 mm ở điều kiện in vitro và
ổn định trong 24 giờ khảo sát. Bên cạnh đó,
mật độ ban đầu của Bacillus S5 ở giá trị 105

CFU/mL và 106 CFU/mL có khả năng ức chế
hồn tồn V. parahaemolyticus (mật độ ban đầu
tương ứng 104 và 105 CFU/mL) từ thời điểm 12
giờ khảo sát. Tỉ lệ bảo hộ (RPS) trên tôm sú và
tôm thẻ tương ứng đạt 61,8% và 50,1%. Kết quả
định danh sinh hóa bằng test kit API 50 CHB/E
cho thấy chủng Bacillus S5 thuộc loài Bacillus
subtilis (Võ Hồng Phượng và ctv., 2018).
Nhiều kỹ thuật đã được sử dụng trong việc
tối ưu các yếu tố trong quá trình lên men nhằm
tạo sinh khối tế bào cao nhất, như phân tích yếu
tố đơn, quy hoạch thực nghiệm (thống kê toán
học). Thiết kế đơn từng yếu tố là phương pháp
cổ điển dễ sử dụng đối với mơ hình thí nghiệm
ít yếu tố và không xét đến sự tương tác qua lại
giữa các yếu tố lên sinh khối của vi sinh vật
lên men. Để khắc phục vấn đề này, chúng tôi sử
dụng phương pháp đáp ứng bề mặt (RSM) để tối
ưu hóa giá trị các yếu tố đang được nghiên cứu.
Trong các thiết kế thí nghiệm như thiết kế thí
nghiệm theo Plackett- Burman (PBD) (Plackett
và Burman, 1946) và thiết kế cấu trúc tại tâm
Central Composite Design (CCD), được biết
đến là một trong những phương pháp đáp ứng
bề mặt (RSM), là thiết kế hữu ích nhằm tối ưu
các điều kiện dinh dưỡng và nuôi cấy trong quá
trình lên men (Xiao và ctv., 2007).
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng
phương pháp đáp ứng bề mặt (RSM) để khảo sát
ảnh hưởng của các nguồn carbon, nguồn nitơ,


46

và ion khống khác nhau đến khả năng hình
thành và tạo bào tử của chủng Bacillus S5, được
xem là chủng probiotic tiềm năng để ứng dụng
trong công nghiệp nuôi trồng thủy sản nhằm
giảm thiểu thiệt hại do bệnh AHPND trên tôm.
II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. Vật liệu
Chủng vi khuẩn Bacillus S5 được phân lập
từ bùn ao nuôi tôm quảng canh tại Cà Mau có
khả năng ức chế vi khuẩn V. parahaemolyticus
gây bệnh AHPND thuộc phạm vi của đề tài
“Nghiên cứu tạo chế phẩm vi sinh đối kháng
Vibrio spp. gây bệnh hoại tử gan tụy cấp trên
tôm sú và tôm thẻ chân trắng”.
Chủng Bacillus S5 được làm giàu trong
erlen 250 mL chứa 150 mL môi trường dinh
dưỡng lỏng (Nutrient broth- NB) bổ sung 1,5%
NaCl và pH môi trường 7,2±0,2 trong thời gian
18-24 giờ, nhiệt độ ủ 300 C đến khi đạt mật độ
108 CFU/mL. Sau đó, 2% chủng giống được cấp
vào các erlen 100 ml chứa 50 mL nguồn dinh
dưỡng cần khảo sát.
2.2. Phương pháp sàng lọc đơn nguồn
dinh dưỡng ảnh hưởng đến sinh khối
Bacillus S5
Sàng lọc sáu nguồn nitơ và sáu nguồn
carbon, thành phần môi trường lên men bao

gồm 1,5% muối NaCl và pH môi trường
7,2±0,2. Bảng 1 thể hiện nồng độ và các nguồn
dinh dưỡng khảo sát. Mỗi công thức môi trường
được lặp lại 2 lần. Giống vi khuẩn Bacillus S5
được cung cấp với mật độ ban đầu 103 CFU/
mL. Các erlen được ủ lắc ở nhiệt độ 300C, 200
vòng/ phút, sau 48 giờ xác định giá trị mật độ
vi khuẩn thông qua chỉ số OD550nm (1 OD550nm
tương đương 3,8x108 CFU/mL giá trị xây dựng
đường chuẩn trong nghiên cứu này).

TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ 13 - THÁNG 6/2019


VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II

Bảng 1. Thành phần và nồng độ nguồn dinh dưỡng khảo sát đơn lên men Bacillus S5
Nguồn Nitơ
Cao nấm men
Pepton
Bột đậu nành
Casein
NaNO3
NH4Cl

Nồng độ
(g/L)

Ghi chú


5-15

Glucose 5 g/L

0,5 -2

Bổ sung Pepton
5 g/L, Glucose 5
g/L

2.3. Đánh giá các yếu tố ảnh hưởng chính
đến sự phát triển của Bacillus S5
2.3.1. Sàng lọc các yếu tố ảnh hưởng đến
việc tạo sinh khối Bacillus S5 trên ma trận
Plackett- Burman (PB)
Thiết kế Plackett- Burman (PBD) dựa trên
mơ hình tuyến tính bậc nhất Y = β0 +Σ βi Xi là
cách hiệu quả để sàng lọc các thơng số chính
trong một lượng lớn các yếu tố của quá trình
tối ưu (Plackett và Burman, 1946). Trong đó Y
là hàm đáp ứng (mật độ vi khuẩn), β0 là hệ số
chặn và βi là hệ số tuyến tính và Xi là biến độc
lập. Sàng lọc 11 yếu tố với tổng số thí nghiệm
được thiết lập theo thiết kế này là 15 thí nghiệm

Nguồn
Carbon
Glucose
Xylose
Dextrose

Lactose
Manitol

Nồng độ
(g/L)

Ghi chú

Pepton 5 g/L
5-15

Furtose
trong đó có 3 thí nghiệm lặp lại tại tâm. Mỗi yếu
tố được khảo sát ba mức giá trị là mức cao (+1),
mức thấp (-1) và giá trị trung bình (0). Nguồn
carbon và nguồn nitơ sẽ được lựa chọn trong thí
nghiệm khảo sát yếu tố đơn. Bên cạnh đó, một số
chất khống, điều kiện ni cấy như tốc độ lắc,
nhiệt độ cũng được xem như là các yếu tố cần
thiết đánh giá mức ảnh hưởng quá trình lên men
vi sinh vật (Bảng 2). Thí nghiệm được thiết kế
trong erlen 100mL và thể tích khảo sát 50 mL.
Sau thời gian 48 giờ thu mẫu và đo mật độ quang
(OD). Kết quả mật độ quang (OD550nm) được
phân tích bằng chương trình “Design Expert®
7.0” Stat-Ease, Inc., Minneapolis USA.

Bảng 2. Các yếu tố và mức ảnh hưởng trong thiết kế Plackett-Burman (PB) đối với Bacillus S5
Yếu tố
Pepton

Bột đậu nành
Cao nấm men
Glucose
Lactose
Dextrose
CaCl2
KH2PO4
MgSO4
Nhiệt độ ủ

Đơn vị

Ký hiệu

Mức khảo sát
Thấp
(-1)
10
10
5
15
5
15
0,5
0,5
0,5
30

Cao
(+1)

40
40
20
35
30
35
2
2
2
37

Trung tâm
(0)
25
25
12,5
25
17,5
25
1,25
1,25
1,25
33,5

Mức ảnh hưởng
Ảnh
hưởng
0,01b
0,35a
0,87a

0,28a
0,41a
0,09b
-0,18a
-0,06b
-0,27a
-0,10b

Prob>F

g/L
X1
0,762
g/L
X2
0,007
g/L
X3
0,001
g/L
X4
0,011
g/L
X5
0,005
g/L
X6
0,083
g/L
X7

0,026
g/L
X8
0,177
g/L
X9
0,012
0
C
X10
0,075
vòng/
Tốc độ lắc
X11
100
200
150
4,48a
< 0,0001
phút
Ghi chú: a khác biệt đáng kể α = 0,05; b không khác biệt đáng kể α = 0,05
-1, 0 và +1 là mã hóa giá trị khảo sát tương ứng mức thấp, trung bình và mức cao
TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 13 - THÁNG 6/2019

47


VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II

2.3.2. Kiểm định các yếu tố ảnh hưởng

chính sau khi loại bỏ các yếu tố khơng ảnh
hưởng
Sau q trình sàng lọc 11 yếu tố ảnh hưởng
đến khả năng tạo sinh khối Bacillus S5, kết quả
ghi nhận có 5 yếu tố ảnh hưởng chính và 6 yếu
tố không ảnh hưởng hoặc ảnh hưởng âm. Thí
nghiệm kiểm định nhằm đánh giá lại 5 yếu tố
trên có thật sự ảnh hưởng đến hàm mục tiêu
(sinh khối Bacillus S5) sau khi loại bỏ các yếu
tố không ảnh hưởng. Để tiết kiệm thời gian và
chi phí, kiểm định các yếu tố được thực hiện qua
thiết kế nhân tố từng phần (Fractional factorial
designs). Thiết kế dựa vào chương trình “Design
Expert® 7.0” Stat-Ease, Inc., Minneapolis USA
(Bảng 5). Mỗi cơng thức được thực hiện 2 lần
lặp lại.

2.4. Tối ưu của các yếu tố ảnh hưởng
chính đến q trình lên men bằng phương
pháp đáp ứng bề mặt với kiểu tâm phức hợp
(RSM-CCD)
Thí nghiệm PB sàng lọc các yếu tố ảnh
hưởng lớn đến sinh khối của các chủng khảo
sát. Sau đó, tiến hành thí nghiệm với ma trận
thực nghiệm RSM-CCD tối ưu các yếu tố với
năm mức khảo sát (-α, -1, 0, +1, +α) trong
đó α =2, số thí nghiệm tại tâm (0) thực hiện
6 lần lặp và thiết kế 13 thí nghiệm dựa theo
Castillo E Del (2007). Tính tốn, lập phương
trình hồi quy, chọn điểm tối ưu của các yếu

tố cho hàm đáp ứng là mật độ OD550nm bằng
phần mềm Design expert 7.0® của Atat-Ease
Inc. USA, từ đó áp dụng vào thực nghiệm. Mỗi
thí nghiệm trong ma trận được bố trí 2 lần lặp
lại, thể tích mơi trường khảo sát 50 mL và thời
gian thu mẫu 48 giờ.

Bảng 3. Thiết kế thí nghiệm và kết quả mật độ quang tối ưu khi kết hợp các yếu tố khảo sát theo
phương pháp thiết kế cấu trúc tại tâm (CCD)
Các yếu tố tối ưu
Thí
nghiệm Bột đậu nành Cao nấm men
Glucose (g/L)
(g/L)
(g/L)
(X3)
(X1)
(X2)
1
28,5 [0]a
15 [0]
25 [0]
a
2
45,5 [+α]
15 [0]
25 [0]
3
11,5 [-α]
15 [0]

25 [0]
a
a
4
20 [-1]
20 [+1]
15 [-1]
5
20 [-1]
20 [+1]
15 [-1]
6
28,5 [0]
15 [0]
25 [0]
7
20 [-1]
20 [+1]
35 [+1]
8
20 [-1]
20 [+1]
35 [+1]
9
28,5 [0]
25 [+α]
25 [0]
10
28,5 [0]
5 [-α]

25 [0]
11
37 [+1]
10 [-1]
35 [+1]
12
37 [+1]
20 [+1]
35 [+1]
13
37 [+1]
20 [+1]
35 [+1]
14
37 [+1]
10 [-1]
15 [-1]
15
20 [-1]
10 [-1]
15 [-1]
16
20 [-1]
10 [-1]
35 [+1]
17
28,5 [0]
15 [0]
25 [0]


48

Tốc độ lắc
(vòng/phút)
(X4)
155 [-α]a
185 [0]
185 [0]
170 [-1]
200 [+1]
185 [0]
170 [-1]
200 [+1]
185 [0]
185 [0]
170 [-1]
200 [+1]
170 [-1]
170 [-1]
200 [+1]
200 [+1]
185 [0]

Mật độ quang
OD550nm
48 giờ
9,35
9,75
9,53
8,73

8,45
10,56
10,59
9,45
9,79
9,84
9,92
10,15
11,65
8,42
9,44
9,86
10,54

TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ 13 - THÁNG 6/2019


VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II

18
28,5 [0]
15 [0]
25 [0]
185 [0]
10,36
19
37 [+1]
20 [+1]
15 [-1]
170 [-1]

8,75
20
37 [+1]
10 [-1]
35 [+1]
200 [+1]
10,31
21
20 [-1]
10 [-1]
15 [-1]
170 [-1]
7,87
22
28,5 [0]
15 [0]
45 [+α]
185 [0]
9,93
23
37 [+1]
20 [+1]
15 [-1]
200 [+1]
8,52
24
28,5 [0]
15 [0]
25 [0]
185 [0]

10,65
25
28,5 [0]
15 [0]
25 [0]
215 [α]
9,66
26
28,5 [0]
15 [0]
5 [-α]
185 [0]
7,15
27
28,5 [0]
15 [0]
25 [0]
185 [0]
10,68
28
20 [-1]
10 [-1]
35 [+1]
170 [-1]
9,70
29
37 [+1]
10 [-1]
15 [-1]
200 [+1]

9,55
30
28,5 [0]
15 [0]
25 [0]
185 [0]
10,56
a
Ghi chú: số liệu được mã hóa [+1], [-1], [0], [+α], [-α] tương ứng với mức cao, thấp, trung bình
và mức mở rộng biên cao và thấp.
2.5. Đánh giá khả năng lên men giữa môi III. KẾT QUẢ
trường tối ưu và các môi trường dinh dưỡng
3.1. Sàng lọc đơn nguồn dinh dưỡng ảnh
Thí nghiệm được thực hiện nhằm đánh giá
sự phát triển của Bacillus S5 trong môi trường
tối ưu, môi trường Brain heart infusion broth
(BHIB) and Nutrient broth (NB), Luria broth
(LB). Một khuẩn lạc Bacillus S5 (sau 24 giờ
ủ trên đĩa thạch nutrient agar (NA) có bổ sung
1,5% NaCl) được huyền phù vào trong các erlen
250 ml có chứa 150 mL cơng thức mơi trường
cần khảo sát. Thí nghiệm được lặp lại 2 lần cho
mỗi công thức môi trường và thu dịch nuôi cấy
đo OD550nm mỗi sáu giờ và kéo dài trong 48 giờ
khảo sát.
2.6. Khảo sát thời điểm bổ sung khống
kích thích tạo bào tử
Dựa vào đường cong tăng trưởng của
Bacillus S5, bổ sung các ion kim loại tại các thời
điểm khác nhau: đầu pha log, giữa pha log, đầu

pha ổn định và giữa pha ổn định (Vũ Thanh Thảo
và ctv., 2018). Các ion được khảo sát bao gồm
Fe2+, Mn2+, Ca2+, Mg2+ được bổ sung với nồng độ
0,5 g/L. Số lượng bào tử S5 được xác định theo
phương pháp gia nhiệt mẫu đến 800C trong 15
phút trước khi làm mát và trãi đĩa trên môi trường
nutrient (NB) ủ 300C thời gian 48 giờ.

hưởng đến sinh khối Bacillus S5

Chủng Bacillus S5 có khả năng tạo sinh
khối cao đáng kể khi lên men bằng nguồn cao
nấm men (OD550nm tại thời điểm 48 giờ tăng từ
7,0 đến 7,8 khi nồng độ cao nấm men tăng từ 5
đến 15 g/L). Đối với pepton và bột đậu nành mật
độ S5 đạt giá trị OD550nm 7,0 khi pepton hoặc bột
đậu nành ở nồng độ 15 g/L. Trong khi đó, các
nguồn nitơ có nguồn gốc khác như axit amin
tổng hợp, nitơ vơ cơ thì sinh khối S5 đạt giá trị
thấp nhất OD550nm nhỏ hơn 2 (Hình 1).

Nguồn carbon khác nhau cũng ảnh hưởng
đến mật độ trong quá trình lên men của chủng
S5. Trong số các nguồn carbon được trình bày
Hình 1, lactose được xem như nguồn carbon
hiệu quả nhất cho quá trình lên men đối với
chủng Bacillus S5. Sinh khối S5 tăng một cách
đáng kể (p<0,05) khi tăng nồng độ lactose từ
5 đến 15 g/L, tương ứng giá trị OD550nm tăng
trong khoảng từ 6,0 đến 9,0. Ngoài ra, glucose,

dextrose cũng được xem như nguồn cung cấp
carbon tốt trong môi trường lên men của chủng
Bacillus S5. D- xylose, mannitol, furtose có
ảnh hưởng thấp hơn khi so sánh với các nguồn
carbon khác như lactose, dextrose, glucose.

TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 13 - THÁNG 6/2019

49


Nguồn Nitơ

Glucose D- xylose Dextrose lactose

15g/L

5g/L

5g/L

15g/L

5g/L

2g/L

Nh4Cl

i


15g/L

h

f
h

h

15g/L

NaNO3

h

0,5g/L

gf

e

g

5g/L

Casein

g


2g/L

15g/L

5g/L

15g/L

5g/L

15g/L

Cao nấm Bột đậu
men
nành

e

fg

c

c

d

15g/L

Pepton


5g/L

f

0,5g/L

d

b

5g/L

c

a

15g/L

b

10
9
8
7
6
5
4
3
2
1

0

5g/L

b

a

Mật độ quang OD 550 nm

b

5g/L

9
8
7
6
5
4
3
2
1
0

15g/L

Mật độ quang OD 550 nm

VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II


Manitol Frurtose

Nguồn Carbon

1. độ
Mậtquang
độ quang
ODchủng
các nguồn
và khác
carbon
khác nhau.
550nm chủng
HìnhHình
1. Mật
OD550nm
S5 cácS5
nguồn
nitơ và nitơ
carbon
nhau.
Ghi chú:
b, c,
i thể
sự khác
biệtbiệt
giữagiữa
cáccác
cộtcột

trong
biểu
đồđồ
vớivới
mức
ý nghĩa
Ghi a,
chú:
a, d,
b, e,
c, f,
d, g,
e, h,
f, g,
h, ihiện
thể hiện
sự khác
trong
biểu
mức
ý nghĩa
α=0,05
α=0,05

Đánh
các
yếu
ảnhhưởng
hưởngđến
đếnsinhTwo

level)của
sauBacillus
khi loại bỏ
3.2. 3.2.
Đánh
giágiá
các
yếu
tốtốảnh
trưởng
S5các yếu tố ảnh hưởng
sinh trưởng của Bacillus S5
âm hoặc không ảnh hưởng đến công thức môi
3.2.1. Sàng lọc các yếu tố ảnh hưởng đến sinh khối Bacillus S5 bằng ma trận PB
3.2.1. Sàng lọc các yếu tố ảnh hưởng đến trường. Mỗi yếu tố ảnh hưởng trên được khảo
Kết Bacillus
qua xử lýS5ANOVA
2) cho thấy, sát
năm
yếumức
tố có
trị độ
ảnhthấp
hưởng
vàcao
có ý
ở ba
độ:giá
mức
(-1),dương

mức độ
sinh khối
bằng ma(Bảng
trận PB
mức
độ trung
tâm
được thể
Bảng
nghĩaKết
thống
mật độ tế
bào 2)
chủng
Bacillus(+1)
S5 và
bao
gồm
tốc độ
lắc(0)(4,48),
caohiện
nấm
men
quakê
xửđến
lý ANOVA
(Bảng
cho thấy,
4. Như vậy, nhiệt độ khơng ảnh hưởng trong
năm

yếu
tố
có
giá
trị
ảnh
hưởng
dương
và
có
(0,87), lactose (0,41), bột đậu nành (0,35) và đường
glucose (0,28) (p < 0,05). Hơn nữa, theo
giá trị
ý nghĩa thống kê đến mật độ tế bào chủng sàng lọc PBD nên trong các thí nghiệm tiếp
0
C±20thức
C,
chúng
tơiđộ
duy
nhiệt
độ ủ đổi
ở mức
30cơng
OD
S5tốc
daođộđộng
từ 3,82cao
đến
9,84 khi

nồng
cáctrìyếu
tố thay
trong
550nm của
Bacillus
S5 chủng
bao gồm
lắc (4,48),
nấm
(0,87), lactose (0,41), bột đậu nành (0,35) pH môi trường dao động trong khoảng 7-7,5.
thímen
nghiệm.
Kết quả kiểm định mức ảnh hưởng của năm
và đường glucose (0,28) (p < 0,05). Hơn nữa,
Hàm
hồi
quy
mơ
tả
ảnh
hưởng
của
các
yếu
tốsàng
có dạng
phương
trình
lọc trong

cho thấy
cácđường
yếu tố thẳng:
bột đậu Y
giá trị OD550nm của chủng S5 dao động từ 3,82 yếu tố
nành, cao
nấm men, glucose, tốc độ lắc có giá trị
đến 9,84
khi+ nồng
yếu3tố
thay đổi
(OD)=
7,09
0,18Xđộ2+các
0,43X
+ 0,14X
0,2X5+ 2,24X
4+ trong
11. Trong đó, Y là hàm mục tiêu (mật độ
p
<
0,0001
và mức ảnh hưởng dương, chứng tỏ
công thức thí nghiệm.
quang OD550nm), X2, X3, X4, X5, X11 lần lượt là các
yếu
tố
bột
đậu nành, cao nấm men, glucose,
Hàm hồi quy mô tả ảnh hưởng của các sự có mặt của các yếu tố này là có ý nghĩa trong

phương
quy.
đó, tốccủa
độ lắc
lactose
độ phương
lắc. Ngồi
khi phân
tíchY phương
saitrình
cho hồi
thấy,
giáTrong
trị p-value
mơvẫn
hình
yếu tốvà
cótốc
dạng
trìnhra,đường
thẳng:
là
yếu
tố
ảnh
hưởng
nhất
(2,31),
tiếp
theo

là
cao
0,43X
+ 0,14X
+ 0,2Xchính
+ (main effects), do đó ảnh hưởng của các yếu tố
(OD)=
7,09 +
0,18X
bằng
0,0004
ứng
với2+các
yếu3tố
ảnh hưởng
4
5
2,24X11. Trong đó, Y là hàm mục tiêu (mật độ nấm men (0,85), glucose (0,72), bột đậu nành
làquang
có ý nghĩa
thống kê.
OD550nm), X2, X3, X4, X5, X11 lần lượt là (0,51). Khi phân tích ANOVA đối với mức ảnh
hưởng của lactose thì ở mức khảo sát 15 g/L
các yếuKiểm
tố bột
đậu các
nành,
cao
glucose,
3.2.2.

định
yếu
tốnấm
ảnhmen,
hưởng
chính sau khi loại bỏ các yếu tố không ảnh hưởng
lactose và tốc độ lắc. Ngồi ra, khi phân tích đến 30 g/L, lactose không ảnh hưởng đến sinh
Năm yếu tố được chọn lọc và kiểm định lại bằng thiết kế từng phần (Fractional factorial
phương sai cho thấy, giá trị p-value của mô khối của chủng Bacillus S5 (p = 0,136 > 0,05).
ra, khi
phânảnh
tíchhưởng
mức độ
phùcơng
hợp thức
của mơ
Two
sau khiứng
loạivới
bỏcác
cácyếu
yếutốtố
hưởng Ngồi
âm hoặc
khơng
đến
mơi
hìnhlevel)
bằng 0,0004
ảnhảnh

hưởng
hình
thử
nghiệm
đạt
p
<
0,0001
và
giá
trị
sự
chính (main
effects),
do hưởng
đó ảnhtrên
hưởng
củakhảo
các sát ở ba mức độ: mức độ thấp (-1), mức độ cao
trường.
Mỗi yếu
tố ảnh
được
khơng tương thích (lack of fit) có p = 0,0509
yếu tố là có ý nghĩa thống kê.
0,05,
nàynhiệt
cho độ
thấykhơng
mơ hình

quy phù
(+1) và mức độ trung tâm (0) được thể hiện Bảng> 4.
Nhưđiều
vậy,
ảnhhồi
hưởng
trong
3.2.2. Kiểm định các yếu tố ảnh hưởng chính
hợp nhưng giá trị vùng cực trị cịn xa so với
giá
sàng
lọc loại
PBDbỏnên
thí ảnh
nghiệm
tiếp theo chúng tơi duy trì nhiệt độ ủ ở mức 300C±20C,
sau khi
các trong
yếu tố các
không
hưởng
trị đang khảo sát.
Năm
yếu dao
tố được
và kiểm
định
pH môi
trường
độngchọn

tronglọc
khoảng
7-7,5.
lại bằng thiết kế từng phần (Fractional factorial
50

7
TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ 13 - THÁNG 6/2019


VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II

Bảng 4. Kiểm định mức ảnh hưởng đến sinh khối Bacillus S5 của các yếu tố bằng thiết kế
từng phần (Fractional factorial Two level)
Yếu tố

Đơn vị

Ký
hiệu

Mức khảo sát
Thấp
(-1)

Ảnh
hưởng

Prob>F
(p-value)


Bột đậu nành
g/L
X2
10
40
25
0,51a
Cao nấm men
g/L
X3
5
10
12,5
0,85a
Glucose
g/L
X4
15
35
25
0,72a
Lactose
g/L
X5
15
30
22,5
0,16b
Tốc độ lắc

vịng/phút
X11
100
200
150
2,31a
Mơ hình mẫu (significant)
Sự khơng tương thích (not significant)
R2
Ghi chú: a Có ý nghĩa ở độ tin cậy α=0,05; b Khơng có ý nghĩa ở độ tin cậy α=0,05

0,0003
< 0,0001
< 0,0001
0,1360
< 0,0001
< 0,0001
0,0509
0,982

3.3. Tối ưu các yếu tố ảnh hưởng chính
đến q trình lên men bằng phương pháp
đáp ứng bề mặt với thiết kế cấu trúc tại tâm
(RSM-CCD)
Mật độ Bacillus S5 trong thiết kế thí
nghiệm tối ưu dao động ở mức OD550nm từ 7,15
đến 11,65 sau khi loại bỏ các yếu tố khơng ảnh
hưởng. Ngồi ra, qua đánh giá sự phù hợp và sự
có ý nghĩa của mơ hình qua phân tích ANOVA
(Bảng 5) cho thấy sự có ý nghĩa của các hệ số

hồi quy được kiểm định bởi phân phối Fisher
(F), với giá trị p < 0,05 cho biết các hệ số hồi
quy có ý nghĩa. Như vậy, kết quả Bảng 5 thể
hiện mơ hình bậc 2 hồn tồn có ý nghĩa thống

Cao
(+1)

Mức ảnh hưởng

Trung
tâm (0)

kê với độ tin cậy 99,99% (p<0,0001). Các yếu
tố bột đậu nành và glucose đều có khả năng ảnh
hưởng đáng kể đến sinh khối Bacillus S5. Bên
cạnh đó, các cặp yếu tố như bột đậu nành và cao
nấm men và cao nấm men với glucose có sự
tương tác thuận từng cặp có ý nghĩa (p<0,05).
Trong khi đó, cặp yếu tố cao nấm men và tốc độ
lắc và cặp yếu tố glucose và tốc độ lắc lại có sự
tương tác nghịch có ý nghĩa (p<0,05). Thêm vào
đó, giá trị p cho sự khơng tương thích của mơ
hình là 0,075>0,05, thơng số R2 (R-Squared) là
0,97 và R2 hiệu chuẩn (Adj-R squared) là 0,95,
điều đó chứng tỏ mơ hình hồn tồn tương thích
với thực nghiệm.

Bảng 5. Kết quả phân tích ANOVA tối ưu q trình tổng hợp các yếu tố
Yếu tố

Mơ hình
Bột đậu nành (X1)
Cao Nấm men (X2)
Glucose (X3)
Tốc độ lắc (X4)
X1X2
X1X3
X1X4

Hệ số
tuyến tính
10,56
0,15
0,046
0,73
0,029
0,033
0,10

Giá trị p
Prob>F
< 0,0001a
0,0015a
0,2515b
< 0,0001a
0,4614b
0,5057b
0,0441a

Yếu tố

X2X3

Hệ số
tuyến tính
0,18
-0,40
-0,27
-0,21
-0,17
-0,49
-0,25

X2X4
X3X4
X12
X22
X32
X42
Sự khơng tương
-0,033
0,5025b
thích mơ hình
a
b
Ghi chú: Có ý nghĩa ở độ tin cậy α=0,05; Khơng có ý nghĩa ở độ tin cậy α=0,05
TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ 13 - THÁNG 6/2019

Giá trị p
Prob>F
0,0018a

< 0,0001a
< 0,0001a
< 0,0001a
0,0003a
< 0,0001a
< 0,0001a
0,0755b

51


Từ các giá trị phân tích có ý nghĩa trên,
giá trị hàm mong đợi được phần mềm Expert
Design 7.0 biểu diễn theo phương trình:
Y
(mật
độ
quang
OD550nm)
=10,56+0,15X 1+0,73X 3+0,1X 1X 3+0,18X 2X 30,40X2X4-0,27X3X4-0,21X12-0,17X22-0,49X320,25X42.

Trong đó X1, X2, X3, X4 là giá trị mã hóa hàm
lượng bột đậu nành, cao nấm men, glucose, tốc
độ lắc.

Mật độ quang OD 550nm

VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II
12
10

8
6
4

2
0

6h

9h

12h 15h 18h 21h 24h 30h 36h 42h 48h

Thời gian khảo sát
Môi trường tối ưu

LB

BHI

NB

Từ kết quả kiểm tra thực nghiệm các giá trị
Hình
Đường
cong tăng
trưởng
của
Bacillus
tối ưu cho 4 biến khảo sát được xácHình

định2. như
Đường cong
tăng 2.
trưởng
của Bacillus
S5 trong
các mơi
trường
ni cấy khác nhau
S5 trong các môi trường nuôi cấy khác nhau
sau: bột đậu nành 34,9 g/L, cao nấm men 20
3.4.2. Khảo sát khả năng ảnh hưởng của khống đến sự hình thành bào tử của Bacillus S5
g/L, glucose 35 g/L và tốc độ lắc 170 vòng/phút,
3.4.2. Khảo sát khả năng ảnh hưởng
Theo9số liệu
đường
cong tăng
của Bacillus
S5 bào
trong tử
môi của
trường tối ưu, các m
giá trị OD550nm là 11,36 tương ướng 4,2x10
của khống
đếntrưởng
sự hình
thành
CFU/mL.
S5chọn là 12 giờ, 21 giờ, 30 giờ, 36 giờ tương ứng với đầu pha tă
thời điểm bổ sungBacillus

khoáng được
3.4. Khảo sát các loại khoáng và thời
Theo số liệu đường cong tăng trưởng của
giữa pha tăng trưởng, đầu pha ổn định và giữa pha ổn định.
điểm bổ sung khống kích thích tạotrưởng,
bào tử
Bacillus S5 trong môi trường tối ưu, các mốc
Khả năng thời
chuyển
từ tếbổ
bàosung
dinh khoáng
dưỡng sang
bào chọn
tử của làchủng
Bacillus S5 ảnh hưở
điểm
được
12 giờ,
3.4.1. Đường cong tăng trưởng chủng
21
giờ,
30
giờ,
36
giờ
tương
ứng
với
đầu

pha
Bacillus S5 trong môi trường tối ưu.đáng kể đến loại khoáng sử dụng và thời điểm bổ sung loại khống đó. Trong nghiệm thức
Từ một khuẩn lạc S5 ban đầu khi cho tăng trưởng, giữa pha tăng trưởng, đầu pha ổn
chứng (Bảng 6) cho thấy tỷ lệ tạo bào tử sau 48 giờ nuôi cấy đạt giá trị thấp (33%). Trong khi
vào các môi trường khảo sát khác nhau, cho định và giữa pha ổn định.

2+
từ Fe
tế2+,bào
dưỡng
khả năng
kích thích tạoKhả
bào tửnăng
của cácchuyển
ion kim loại
Mn2+,dinh
Ca2+, Mg
có xu hướng tăng d
thấy tại thời điểm 15 giờ đầu ni cấy
khơng
có sự khác biệt giữa mơi trường tối ưu và các sang bào tử của chủng Bacillus S5 ảnh hưởng
khi kích thích S5 ở các giai đoạn từ pha tăng trưởng đến pha ổn định. Tỷ lệ chuyển bào tử S5
môi trường thương mại như LB, BHI, NB. đáng kể đến loại khống sử dụng và thời điểm
nhấtđến
(93,09%)
có ýsung
nghĩa loại
khác khống
biệt so vớiđó.
các Trong

ion kim nghiệm
loại khác và
nghiệm
thức
đối thức đối chứng
Tuy nhiên, sau thời điểm từ 15 giờ
48 và bổ
chứng
(Bảng
giờ khảo sát thì mật độ S5 tăng dần
sử và
dụngkhác
ion Ca2+ bổ
sung sau
30 giờ6)lêncho
men.thấy tỷ lệ tạo bào tử sau
biệt có ý nghĩa với ba mơi trường cịn lại 48 giờ nuôi cấy đạt giá trị thấp (33%). Trong
6. các
Tỷ lệ chuyển
bào tửkhả
củanăng
chủng kích
Bacillus
S5 tạitạocácbào
thời tử
điểm
khác
khi đó,
thích
của

cácnhau và bổ sung
trong
(p<0,05). Mật độ quang OD550nm S5Bảng
2+
2+
2+
2+
ion kim loại Fe , Mn , Ca , Mg có xu hướng
mơi trường tối ưu, NB, BHI, LB sau
48 giờkhác nhau.
loại khoáng
lên men lần lần lượt là 11,61; 4,81; 3,87 và tăng dần khi kích thích S5 ở các giai đoạn từ pha
Khảo sát
saupha
48 giờ
Khảo sát
Thờitrường
điểm
tăng trưởng
đến
ổn định. Tỷ
lệ chuyển
bàosau 48 giờ
3,14. Điều này có thể cho thấy mơi
Danh
Danh
bổ sung
Tỷ và lệcó ý nghĩa khác biệt
Tỷ l
(93,09%)

tối ưu được xem là môi trường tiềm năng cho mụctử S5 cao
mục
TổngnhấtBào
Tổng Bào
khoáng
bào
tử
bào t
* tử
* loại khác vàkhoáng
so với tế
các
kim
nghiệmtếthức
bàoion
bào* đối
tử*
việc ứng dụng trong sản xuất Bacillus S5 ở khoáng
(giờ)
(%)
(%)
sau 30 giờ
chứng khi sử dụng ion Ca2+ bổ sung
quy mô lớn.
Fe2+
3,65
0,94
25,72
Ca2+
3,00

1,00
33,27
lên
12
2+ men.
2+
Mn
2,69
0,50
18,58
Mg
0.94
0,20
21,39
Fe2+
3,24
0.90
27,77
Ca2+
2,67
1,20
44,85
21
2+
2+
Mn
3,34
0.70
20,92
Mg

1,67
0.67
40,00
2+
2+
Fe
3,83
2,05
53,45
Ca
3,11
2,90
93,09
30
Mn2+
3,66
1,09
29,78
Mg2+ 2,54
1,22
47,83
2+
2+
Fe
3,43
2,55
74,23
Ca
3,45
3,10

89,85
36
Mn2+
3,65
2,40
65,75
Mg2+ 3,24
2,05
63,27
3,85
1,30
33,80
Đối chứng
Ghi chú: *: x109 CFU/mL; Đối chứng: môi trường tối ưu không bổ sung khống kích thích bào tử

52

10
TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ 13 - THÁNG 6/2019


VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II

Bảng 6. Tỷ lệ chuyển bào tử của chủng Bacillus S5 tại các thời điểm khác nhau và bổ sung các
loại khoáng khác nhau.
Thời điểm
bổ sung
khoáng
(giờ)


Danh
mục
khoáng

Khảo sát sau 48 giờ
Tổng tế
bào*

Bào
tử*

Khảo sát sau 48 giờ
Danh
mục
Tổng tế Bào
Tỷ lệ bào
Tỷ lệ bào
khoáng
bào*
tử (%)
tử*
tử (%)

3,65
0,94
25,72
3,00
1,00
33,27
Ca2+

2+
2,69
0,50
18,58
0.94
0,20
21,39
Mg
2+
3,24
0.90
27,77
2,67
1,20
44,85
Ca
21
2+
3,34
0.70
20,92
1,67
0.67
40,00
Mg
2+
3,11
2,90
93,09
Ca

3,83
2,05
53,45
30
2+
3,66
1,09
29,78
2,54
1,22
47,83
Mg
2+
3,43
2,55
74,23
3,45
3,10
89,85
Ca
36
2+
3,65
2,40
65,75
3,24
2,05
63,27
Mg
Đối chứng

3,85
1,30
33,80
*:
9
Ghi chú: x10 CFU/mL; Đối chứng: môi trường tối ưu khơng bổ sung khống kích thích bào tử
12

Fe2+
Mn2+
Fe2+
Mn2+
Fe2+
Mn2+
Fe2+
Mn2+

IV. THẢO LUẬN
Các nghiên cứu về điều kiện môi trường lên
men lên sinh khối của nhóm Bacillus đã được
thực hiện bởi nhiều nhóm tác giả, trong đó Trần
Vũ Đình Ngun (2014) đã cơng bố mật độ tế
bào của chủng Bacillus B3.10.2 bị ảnh hưởng
bởi nguồn nitơ thử nghiệm như bột đậu nành,
amoni sulfat, pepton. Trong đó, pepton được
xem là nguồn nitơ thích hợp nhất cho sinh trưởng
của Bacillus B3.10.2. Ngồi ra Bacillus B3.10.2
cịn phát triển tốt khi môi trường được cung cấp
thêm nguồn glucose hoặc mật rỉ đường. Hơn nữa,
Dong và ctv., (2010) đã tìm ra mơi trường phù

hợp đạt sinh khối cao của B. licheniformis khi
sử dụng nguồn nitơ là pepton hoặc cao thịt bị và
nguồn carbon là sucrose, glucose hoặc lactose.
Có nhiều cơng trình nghiên cứu được thực
hiện để tìm ra mơi trường thích hợp tăng cường
khả năng tạo bào tử của các chủng Bacillus.
Trong đó đáng chú ý với hai công thức môi
trường như sau: công thức 1 bao gồm 16,18
g/L bột bắp, 17,53 g/L bột đậu nành và 8,14 g/L
cao nấm men có khả năng tạo mật độ bào tử B.
subtilis là 1,52x1010 CFU/mL sau 40 giờ (Chen
và ctv., 2010); công thức 2 bao gồm bột vỏ quýt
40g, pepton 8,0g, KH2PO4 1,0g, MgSO4.7H2O
0,5 g, polypropylene glycol 5 mL hòa tan trong
1L nước bột phô mai và lên men sau 97 giờ đạt

mật độ bào tử 6,5 x1010 CFU/mL (Khardziani
và ctv., 2017). Ngồi ra, nồng độ glucose giữ
vai trị quan trọng trong quá trình tạo bào tử của
Bacillus. Nồng độ glucose trong môi trường
lên men gia tăng là nguyên nhân dẫn đến giảm
lượng bào tử Bacillus. Nồng độ glucose đạt 5
g/L có thể tăng tế bào dinh dưỡng và bào tử
B. subtilis MB 24. Mặt khác, nồng độ glucose
tăng trên 5 g/L sẽ ức chế hiệu quả tạo bào tử
của chúng (Monteiro và ctv., 2005, Khardziani
và ctv., 2017). Tuy nhiên, trong thí nghiệm của
chúng tơi, nồng độ glucose có mối tương quan
thuận đến sinh khối của Bacillus S5 và lượng
sinh khối này ảnh hưởng đến số lượng bào tử

thu được sau thời gian lên men 48 giờ.
Các ion kim loại giữ vai trị quan trọng
trong việc hoạt hóa hệ thống enzyme cần thiết
cho quá trình hình thành bào tử (Kolodziej và
Slepecky, 1964). Ren và ctv., (2018) thử nghiệm
trong sáu ion kim loại thì có ba ion Mn2+, Fe2+
và Ca2+ với nồng độ theo thứ tự 1,0 mM, 3,0
mM, 2,1 mM tạo bào tử B. amyloliquefaciens
với mật độ 8,05x109, cao gấp 8,8 lần so với môi
trường không bổ sung các ion kim loại này.
Ngoài ra, nghiên cứu của Phương Thị Hương
và Vũ Văn Hạnh (2018) cho thấy với tỷ lệ cấp
giống 7%, pH 7, nhiệt độ lên men 370C, tốc độ
lắc 200 vịng/phút và thành phần mơi trường

TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 13 - THÁNG 6/2019

53


VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II

chứa 1,5% glucose, 1% pepton và Ca2+ 50 mM,
sinh khối của chủng B. subtilis BSVN 15 đạt
6,3 x 1011 CFU/mL. Tương tự trong nghiên
cứu của Vũ Thanh Thảo và ctv., (2018), mơi
trường thích hợp để sản xuất sinh khối của B.
subtilis KP3 (4,46x109 CFU/mL) bao gồm 10
g/L glucose, 19,75 g/L đậu không dầu, amoni
citrate 1,7 g/L, mật rỉ 7,2 g/L, pepton từ thịt

11,13 g/L, MnCl2 16,58 mM, KH2PO4 4,58 g/L,
CaCl2 0,01 g/L, NaCl 4,04 g/L, FeSO4.7H2O 1
µM, MgSO4.7H2O 0,38 g/L, sau 8 giờ bổ sung
CaCl2 0,5 g/L và FeSO4.7H2O 35 µM có khả
năng kích thích mật độ bào tử tăng lên gấp 3
lần. Ngoài ra, Yu và ctv., (1998) cho rằng mỗi
loại vi khuẩn khác nhau sẽ thích hợp với tỷ lệ
C/N trong môi trường sống nhất định
Ion Ca2+ là thành phần chủ yếu của lõi bào
tử và có khả năng gắn kết với thành phần đặc
biệt bào tử gọi là DPA (dipicolinic acid) giúp
bào tử có khả năng chịu đựng được nhiệt độ cao
(Levinson và ctv., 1961). Ngoài ra, Ca2+ tương
tác với các enzyme chịu trách nhiệm cho việc
tạo ra các kết nối giữa các protein bề mặt với
thành tế bào vi khuẩn, do đó ảnh hưởng đến khả
năng bám dính của vi khuẩn (Thomas và Rice,
2014).
V. KẾT LUẬN
Trong điều kiện lên men quy mơ phịng thí
nghiệm thể tích 50mL, thành phần môi trường
được lựa chọn nhằm tối ưu sinh khối của chủng
Bacillus S5 đã được xây dựng theo mơ hình
Placket- Burman và phương pháp đáp ứng bề
mặt RSM bao gồm bột đậu nành 34,9 g/L, cao
nấm men 20 g/L, glucose 35 g/L, tốc độ lắc 170
vịng/phút, pH mơi trường 7,0 và nhiệt độ lên
men 300C, sau 48 giờ nuôi cấy giá trị OD550nm
đạt 11,36 tương ứng với mật độ 4,3x109 CFU/
mL. Ngoài ra, bổ sung Ca2+ 0,5g/L sau 30 giờ

lên men, tế bào dinh dưỡng Bacillus S5 có khả
năng chuyển 93% sang dạng bào tử.

TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt
Nguyễn Văn Thanh, Trần Cát Đông và Trần Thu
Hoa, 2009. Công nghệ Sinh học Dược, NXB
Giáo Dục.
Phương Thị Hương và Vũ Văn Hạnh, 2018. Lựa
chọn điều kiện lên men cho sự sinh trưởng chủng
Bacillus subtilis BSVN 15 ứng dụng chế phẩm
probiotic trong chăn ni, Tạp chí Cơng Nghệ
Sinh học 16(1): 167-172V.
Võ Hồng Phượng, Lê Hồng Phước, Nguyễn Thị
Ngọc Tĩnh và Đặng Ngọc Thùy, 2018. Nghiên
cứu tạo chế phẩm vi sinh đối kháng Vibrio spp.
gây bệnh hoại tử gan tụy cấp trên tôm sú và tôm
thẻ chân trắng, Báo cáo tổng kết năm 2018.
Vũ Thanh Thảo, Phan Cảnh Trình, Nguyễn Thị Linh
Giang, Lê Văn Thanh và Trần Cát Đông, 2018.
Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy thu nhận bào tử
Bacillus subtilis KP3, Y học TpHCM, Phụ bản
Tập 22(1): 453-459.
Tài liệu tiếng Anh
Bernlohr, R. W. và Leitzmann, C., 1969. Control of
sporulation London: Academic Press.
Castillo E Del (2007), Process Optimization A
Statistical Approach., Springer Science. New
York, USA, 118-122.
Chen, Z. M., Li, Q., Liu, H. M., Yu, N., Xie, T. J.,

Yang, M. Y., Shen, P. và Chen, X. D., 2010. Greater
enhancement of Bacillus subtilis spore yields in
submerged cultures by optimization of medium
composition through statistical experimental
designs, Appl Microbiol Biotechnol, 85(5):
1353-60.
Duc, L. H., Hong, H. A., Barbosa, T. M., Henriques,
A. O. và Cutting, S. M., 2004. Characterization
of Bacillus probiotics available for human use,
Applied and environmental microbiology, 70(4):
2161-2171.
Granger, A. C., Gaidamakova, E. K., Matrosova, V.
Y., Daly, M. J. và Setlow, P., 2011. Effects of Mn
and Fe levels on Bacillus subtilis spore resistance
and effects of Mn2+, other divalent cations,
orthophosphate, and dipicolinic acid on protein
resistance to ionizing radiation, Appl Environ
Microbiol, 77(1): 32-40.
Cho, J.-H., Kim, Y.-B. và Kim, E.-K., 2009.
Optimization of culture media for Bacillus species
by statistical experimental design methods.

54

TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 13 - THÁNG 6/2019


VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II
Dong, W., Zhang, D., Zhang, J., Li, H. và Jin, Y.
Optimization of the Growth Culture Medium

with Traditional Chinese Herbs and Conditions
of Bacillus Licheniformis SH003. 2010 4th
International Conference on Bioinformatics and
Biomedical Engineering, 18-20 June 2010 2010.
1-5.
Gauri, S. S., Mandal, S. M., Pati, B. R. và Dey, S.,
2011. Purification and structural characterization
of a novel antibacterial peptide from Bellamya
bengalensis: activity against ampicillin and
chloramphenicol
resistant
Staphylococcus
epidermidis, Peptides, 32(4): 691-6.
Grossman, A. D. và Losick, R., 1988. Extracellular
control of spore formation in Bacillus subtilis,
Proceedings of the National Academy of
Sciences of the United States of America, 85(12):
4369-4373.
Harwood, C. R., 1992. Bacillus subtilis and its
relatives: molecular biological and industrial
workhorses, Trends Biotechnol, 10(7): 247-56.
Khardziani, T., Kachlishvili, E., Sokhadze, K.,
Elisashvili, V., Weeks, R., Chikindas, M. L. và
Chistyakov, V., 2017. Elucidation of Bacillus
subtilis KATMIRA 1933 Potential for Spore
Production in Submerged Fermentation of Plant
Raw Materials, Probiotics Antimicrob Proteins,
9(4): 435-443.
Kolodziej, B. J. và Slepecky, R. A., 1964. Trace
Metal Requirements for Sporulation of Bacillus

Megaterium, J Bacteriol, 88(821-30.
Levinson, H. S., Hyatt, M. T. và Moore, F. E.,
1961. Dependence of the heat resistance of
bacterial spores on the calcium: Dipicolinic acid
ratio, Biochemical and Biophysical Research
Communications, 5(6): 417-421.
Monteiro, S. M., Clemente, J. J., Henriques, A.
O., Gomes, R. J., Carrondo, M. J. và Cunha,

A. E., 2005. A procedure for high-yield spore
production by Bacillus subtilis, Biotechnol Prog,
21(4): 1026-31.
Nicholson, W. L. và Setlow, P., 1990. Sporulation,
germination, and outgrowth, Chichester,
England: John Wiley & Sons Ltd. .
Plackett, R. L. và Burman, J. P., 1946. The Design
of Optimum Multifactorial Experiments,
Biometrika.
Rao, Y., Tsay, K.-J., Wu, W.-S. và Tzeng, Y.-M.,
2007. Medium optimization of carbon and
nitrogen sources for the production of spores
from Bacillus amyloliquefaciens B128 using
response surface methodology.
Ren, H., Su, Y. T. và Guo, X. H., 2018. Rapid
optimization of spore production from Bacillus
amyloliquefaciens in submerged cultures based
on dipicolinic acid fluorimetry assay, AMB
Express, 8(1): 21.
Schaeffer, P., Millet, J. và Aubert, J. P., 1965.
Catabolic repression of bacterial sporulation,

Proceedings of the National Academy of Sciences
of the United States of America, 54(3): 704-711.
Thomas, K. J., 3rd và Rice, C. V., 2014. Revised
model of calcium and magnesium binding to the
bacterial cell wall, Biometals, 27(6): 1361-70.
Xiao, Z. J., Liu, P. H., Qin, J. Y. và Xu, P., 2007.
Statistical optimization of medium components
for enhanced acetoin production from molasses
and soybean meal hydrolysate, Appl Microbiol
Biotechnol, 74(1): 61-8.
Yu, X., G Hallett, S., Sheppard, J. và Watson, A.,
1998. Effects of carbon concentration and
carbon-to-nitrogen ratio on growth, conidiation,
spore germination and efficacy of the potential
bioherbicide Colletotrichum coccodes.

TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ 13 - THÁNG 6/2019

55


VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II

FERMENTATION CONDITIONS FOR OPTIMIZATION OF SPORE
PRODUCTION IN BACILLUS S5 USING RESPONSE SURFACE
METHOD (RSM)
Vo Hong Phuong1*, Dang Ngoc Thuy1, Nguyen Thi Lan Chi1, Nguyen Thanh Truc1,
Chu Quang Trong1, Pham Thi Huyen Dieu2
ABSTRACT
Bacillus S5 strain was isolated from the soil of an extensive shrimp pond which can inhibit V.

parahaemolyticus causing AHPND in experimental conditions. This research aimed to determine
the medium composition and fermentation parameters for the optimal growth and spore formation
in Bacillus S5 strain which was proved to be a potential probiotic for aquaculture. The optical
density (OD550nm) of culture suspension was the parameter that can be used to assess the effectiveness
of fermentation conditions. Response surface method (RSM) was used to optimize the fermentation
parameters. The results showed that the optimal fermentation medium for producing highest
Bacillus S5 biomass after 48h (with OD550nm value 11,36 which corresponded a density of 4.3 x 109
CFU/mL) should have the following composition: soybean flour 34.9 g/L, yeast 20g/L, glucose 35
g/L and shaking speed 170 rpm. In addition, 0.5 g/L of calcium ion added after 30h of fermentation
can stimulate a spore-forming ratio of over 90%.
Keywords: Bacillus S5 biomass, Bacillus S5 spores, fermentation condition optimization.

Người phản biện: TS. Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh
Ngày nhận bài: 20/5/2019
Ngày thông qua phản biện: 22/6/2019
Ngày duyệt đăng: 26/6/2019

Southern Monitoring Center for Aquaculture Environment and Epidemics, Research Institute for Aquaculture No.2.
HCMC University of Education.
*Email:
1

2

56

TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ 13 - THÁNG 6/2019