ỨNG DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ ADN
ỨNG DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ ADN
XÁC ĐỊNH GEN
XÁC ĐỊNH GEN
PHỤC VỤ CHỌN TẠO GIỐNG LÚA
PHỤC VỤ CHỌN TẠO GIỐNG LÚA
THƠM
THƠM
ĐẶT VẤN ĐỀ
ĐẶT VẤN ĐỀ

Cây lúa là cây lương thực chiếm vị trí quan trọng cho
Cây lúa là cây lương thực chiếm vị trí quan trọng cho
các nước đang phát triển, đặc biệt là Việt Nam. Nhìn
các nước đang phát triển, đặc biệt là Việt Nam. Nhìn
vào thị trường tiêu thụ lúa gạo hiện nay, chúng ta cần
vào thị trường tiêu thụ lúa gạo hiện nay, chúng ta cần
phải đầu tư hơn nữa trong việc nâng cao chất lượng
phải đầu tư hơn nữa trong việc nâng cao chất lượng
gạo, thông qua nhiều con đường để rút ngắn được thời
gạo, thông qua nhiều con đường để rút ngắn được thời
gian và cung cấp kịp thời các giống cho sản xuất
gian và cung cấp kịp thời các giống cho sản xuất

Trong những đặc tính lý hoá liên quan tới chất lượng
Trong những đặc tính lý hoá liên quan tới chất lượng
gạo thì mùi thơm là một trong những đặc tính quan
gạo thì mùi thơm là một trong những đặc tính quan
trọng. Sự biểu hiện tính trạng thơm trong lúa gạo
trọng. Sự biểu hiện tính trạng thơm trong lúa gạo
thường bị tác động bởi điều kiện môi trường nên việc

thường bị tác động bởi điều kiện môi trường nên việc
đánh giá để chọn lọc ra các dòng giống lúa thơm
đánh giá để chọn lọc ra các dòng giống lúa thơm
thường phải tiến hành trên nhiều vụ và chỉ tiến hành
thường phải tiến hành trên nhiều vụ và chỉ tiến hành
được khi đã thu hoạch lúa.
được khi đã thu hoạch lúa.


Việc làm này không những
Việc làm này không những
tốn kém về tiền bạc mà còn cả về thời gian.
tốn kém về tiền bạc mà còn cả về thời gian.



Việc sử dụng chỉ thị phân tử (marker) để xác định các
Việc sử dụng chỉ thị phân tử (marker) để xác định các
gen mong muốn ở các cá thể từ thế hệ sớm sẽ giúp cho
gen mong muốn ở các cá thể từ thế hệ sớm sẽ giúp cho
công tác chọn tạo giống cây trồng nói chung và giống
công tác chọn tạo giống cây trồng nói chung và giống
lúa nói riêng một cách hiệu quả hơn. Cho tới nay đã có
lúa nói riêng một cách hiệu quả hơn. Cho tới nay đã có
rất nhiều nghiên cứu về các chất tạo mùi thơm ở lúa
rất nhiều nghiên cứu về các chất tạo mùi thơm ở lúa
cũng như bản chất di truyền của gen tạo mùi thơm.
cũng như bản chất di truyền của gen tạo mùi thơm.

Người ta đã chứng minh rằng, chất thơm trong lúa

Người ta đã chứng minh rằng, chất thơm trong lúa
được hợp thành từ hơn một trăm hợp chất dễ bay hơi
được hợp thành từ hơn một trăm hợp chất dễ bay hơi
như hydrocarbons, alcohol, aldehydes, ketones, acid,
như hydrocarbons, alcohol, aldehydes, ketones, acid,
esters, phenols, pyridines, pyrazines và những hợp chất
esters, phenols, pyridines, pyrazines và những hợp chất
khác (Yajima và cộng sự, 1978). Trong đó, chất 2-
khác (Yajima và cộng sự, 1978). Trong đó, chất 2-
acetyl-1-pyrroline (2AP) được xem là hợp chất quan
acetyl-1-pyrroline (2AP) được xem là hợp chất quan
trọng nhất tạo mùi thơm ở tất cả các giống lúa
trọng nhất tạo mùi thơm ở tất cả các giống lúa

Theo số liệu thống kê, hàm lượng 2AP ở những giống
Theo số liệu thống kê, hàm lượng 2AP ở những giống
lúa thơm đạt tới 0,09 mg/kg, cao gấp 10 lần so với các
lúa thơm đạt tới 0,09 mg/kg, cao gấp 10 lần so với các
các giống lúa không thơm (0,006-0,008 mg/kg)
các giống lúa không thơm (0,006-0,008 mg/kg)
(Buttery và cộng sự, 1983). Chất tạo mùi 2AP được tìm
(Buttery và cộng sự, 1983). Chất tạo mùi 2AP được tìm
thấy ở hầu hết các bộ phận của cây, trừ phần rễ
thấy ở hầu hết các bộ phận của cây, trừ phần rễ
(Lorieux và cộng sự, 1996).
(Lorieux và cộng sự, 1996).

Di truyền tính trạng thơm ở lúa đã được nhiều nhà khoa
Di truyền tính trạng thơm ở lúa đã được nhiều nhà khoa
học quan tâm nghiên cứu. Khi nghiên cứu tỷ lệ phân ly

học quan tâm nghiên cứu. Khi nghiên cứu tỷ lệ phân ly
giữa cá thể thơm và không thơm trong quần thể F2 của
giữa cá thể thơm và không thơm trong quần thể F2 của
nhiều tổ hợp lai, một số nhà nghiên cứu cho rằng, có
nhiều tổ hợp lai, một số nhà nghiên cứu cho rằng, có
một số gen khác nhau (trội hoặc lặn) liên quan tới tính
một số gen khác nhau (trội hoặc lặn) liên quan tới tính
trạng thơm. Tuy nhiên, người ta đã khẳng định rằng,
trạng thơm. Tuy nhiên, người ta đã khẳng định rằng,
trong hầu hết các giống lúa thơm, gen đơn lặn (
trong hầu hết các giống lúa thơm, gen đơn lặn (
fgr
fgr
) nằm
) nằm
trên nhiễm sắc thể số 8 chịu trách nhiệm sinh tổng hợp
trên nhiễm sắc thể số 8 chịu trách nhiệm sinh tổng hợp
hợp chất 2AP là hợp chất chính của mùi thơm (Ahn và
hợp chất 2AP là hợp chất chính của mùi thơm (Ahn và
cộng sự, 1992).
cộng sự, 1992).


Gen này có khoảng cách di truyền với
Gen này có khoảng cách di truyền với
RFLP marker RG28 là 4,5 cm.
RFLP marker RG28 là 4,5 cm.

Bằng việc sử dụng một số SSR markers khác như L02,
Bằng việc sử dụng một số SSR markers khác như L02,

L06, độ dài và vị trí của gen
L06, độ dài và vị trí của gen
fgr
fgr
cũng được xác định
cũng được xác định
chính xác hơn. Gen
chính xác hơn. Gen
fgr
fgr
được xác định trên nhiễm sắc
được xác định trên nhiễm sắc
thể số 8, có độ dài khoảng 69 kb (Chen và cộng sự,
thể số 8, có độ dài khoảng 69 kb (Chen và cộng sự,
2006). Vanavichit và cộng sự (2004) đã xác định gen
2006). Vanavichit và cộng sự (2004) đã xác định gen
quy định mùi thơm bằng việc sử dụng nhiều SSR
quy định mùi thơm bằng việc sử dụng nhiều SSR
markers như RM223, RM339, RM342… và kỹ thuật
markers như RM223, RM339, RM342… và kỹ thuật
fine mapping để xác định ra một đoạn nhiễm sắc thể
fine mapping để xác định ra một đoạn nhiễm sắc thể
khoảng 27,6 kb được đặt tên là Os2AP chứa 15 exon
khoảng 27,6 kb được đặt tên là Os2AP chứa 15 exon
nằm trên nhiễm sắc thể số 8 điều khiển tính trạng
nằm trên nhiễm sắc thể số 8 điều khiển tính trạng
không thơm ở lúa.
không thơm ở lúa.

Sự mất đoạn 8 bp trong exon thứ 7 đã kìm hãm hoạt

Sự mất đoạn 8 bp trong exon thứ 7 đã kìm hãm hoạt
động đồng hoá chất proline thành các hợp chất không
động đồng hoá chất proline thành các hợp chất không
thơm của đoạn gen trên và cung cấp nguồn proline
thơm của đoạn gen trên và cung cấp nguồn proline
cùng các chất trung gian khác để tạo ra chất thơm 2
cùng các chất trung gian khác để tạo ra chất thơm 2
acetyl-1 pyroline. Dựa trên những kết quả này thì
acetyl-1 pyroline. Dựa trên những kết quả này thì
Bralbury và cộng sự (2005) cũng đã sử dụng phương
Bralbury và cộng sự (2005) cũng đã sử dụng phương
pháp ASA (Allele Specific Amplication) với 4 cặp
pháp ASA (Allele Specific Amplication) với 4 cặp
mồi: ESP, EAP, IFAP và INSP giúp phân biệt kiểu
mồi: ESP, EAP, IFAP và INSP giúp phân biệt kiểu
gen của các giống lúa đồng hợp tử thơm (cho băng 257
gen của các giống lúa đồng hợp tử thơm (cho băng 257
bp), dị hợp tử thơm (cho 2 băng dài 355 bp và 257 bp)
bp), dị hợp tử thơm (cho 2 băng dài 355 bp và 257 bp)
và giống không thơm (cho băng dài 355 bp). Nguyên
và giống không thơm (cho băng dài 355 bp). Nguyên
lý hoạt động của 4 mồi ESP, EAP, INSP, IFAP như
lý hoạt động của 4 mồi ESP, EAP, INSP, IFAP như
sau:
sau:



Trong bài báo này, chúng tôi trình bày kết quả ứng
Trong bài báo này, chúng tôi trình bày kết quả ứng

dụng một số chỉ thị phân tử ADN quy định gen mùi
dụng một số chỉ thị phân tử ADN quy định gen mùi
thơm
thơm
fgr
fgr
và đã chọn tạo được một số dòng lúa thơm.
và đã chọn tạo được một số dòng lúa thơm.
NỘI DUNG
NỘI DUNG
1.VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
1.VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

-
-
Trên 40 dòng, giống lúa thơm và không thơm đang
Trên 40 dòng, giống lúa thơm và không thơm đang
được gieo trồng rộng rãi trong sản xuất
được gieo trồng rộng rãi trong sản xuất

Các chỉ thị phân tử là RG 28 (F và R), RM342 (F và R),
Các chỉ thị phân tử là RG 28 (F và R), RM342 (F và R),
L05 (F và R) và chỉ thị BADH2 gồm 4 mồi EAP, ESP,
L05 (F và R) và chỉ thị BADH2 gồm 4 mồi EAP, ESP,
IFAP và INSP, cùng các hóa chất sử dụng trong tách
IFAP và INSP, cùng các hóa chất sử dụng trong tách
chiết ADN và chạy điện di được sử dụng cho nghiên cứu.
chiết ADN và chạy điện di được sử dụng cho nghiên cứu.



Các giống lúa được trồng trong điều kiện đồng ruộng tại
Các giống lúa được trồng trong điều kiện đồng ruộng tại
Viện Cây lương thực và Cây thực phẩm vụ xuân và vụ
Viện Cây lương thực và Cây thực phẩm vụ xuân và vụ
mùa năm 2007-2008
mùa năm 2007-2008

Mẫu lá được thu khi cây được 30-35 ngày tuổi và
Mẫu lá được thu khi cây được 30-35 ngày tuổi và
được bảo quản trong điều kiện - 80oC đến tận khi
được bảo quản trong điều kiện - 80oC đến tận khi
phân tích.
phân tích.
Phương pháp
Phương pháp



Tách chiết ADN
Tách chiết ADN


100 mg mẫu lá được nghiền nhỏ trong 800 µl dung dịch
100 mg mẫu lá được nghiền nhỏ trong 800 µl dung dịch
đệm chiết (NaCl 0,05 M, SDS 1%, EDTA 0,05 M, Tris
đệm chiết (NaCl 0,05 M, SDS 1%, EDTA 0,05 M, Tris
HCl 0,01 M) bằng cối chày sứ. Hỗn hợp được ủ ở
HCl 0,01 M) bằng cối chày sứ. Hỗn hợp được ủ ở
nhiệt độ 65 độ C trong 30 phút, rồi thêm 100 µl
nhiệt độ 65 độ C trong 30 phút, rồi thêm 100 µl

CH3COOK 5 M, trộn đều và để trên đá -20 độ C trong
CH3COOK 5 M, trộn đều và để trên đá -20 độ C trong
20 phút, sau đó ly tâm ở tốc độ 12.000 vòng/phút trong
20 phút, sau đó ly tâm ở tốc độ 12.000 vòng/phút trong
15 phút. Thu và chuyển phần dung dịch phía trên sang
15 phút. Thu và chuyển phần dung dịch phía trên sang
ống 1,5 ml mới.
ống 1,5 ml mới.

Thêm vào ống 300 µl dung dịch Isopropanol, để ở
Thêm vào ống 300 µl dung dịch Isopropanol, để ở
nhiệt độ phòng 30 phút, ly tâm 12.000 vòng/phút rồi
nhiệt độ phòng 30 phút, ly tâm 12.000 vòng/phút rồi
thu chất kết tủa và rửa bằng Ethanol 80%, để khô trong
thu chất kết tủa và rửa bằng Ethanol 80%, để khô trong
10 phút. Hoà tan ADN trong 200 µl TE, thêm vào 1 µl
10 phút. Hoà tan ADN trong 200 µl TE, thêm vào 1 µl
Rnase, ủ trong khoảng thời gian 30 phút, ly tâm 12.000
Rnase, ủ trong khoảng thời gian 30 phút, ly tâm 12.000
vòng/phút rồi thu kết tủa ADN ở đáy ống nghiệm. Rửa
vòng/phút rồi thu kết tủa ADN ở đáy ống nghiệm. Rửa
phần kết tủa bằng Ethanol 70%, để khô và cho TE vào
phần kết tủa bằng Ethanol 70%, để khô và cho TE vào
hòa tan ADN để sử dụng.phút ở 37 độ C, thêm vào 10
hòa tan ADN để sử dụng.phút ở 37 độ C, thêm vào 10
µl CH3COONa và 200 µl Ethanol 100%, trộn đều và
µl CH3COONa và 200 µl Ethanol 100%, trộn đều và
để ở nhiệt độ phòng 30 phút, ly tâm 12.000 vòng/phút
để ở nhiệt độ phòng 30 phút, ly tâm 12.000 vòng/phút
rồi thu kết tủa ADN ở đáy ống nghiệm. Rửa phần kết

rồi thu kết tủa ADN ở đáy ống nghiệm. Rửa phần kết
tủa bằng Ethanol 70%, để khô và cho TE vào hòa tan
tủa bằng Ethanol 70%, để khô và cho TE vào hòa tan
ADN để sử dụng.
ADN để sử dụng.

Phản ứng PCR
Phản ứng PCR


Đối với primer RG28, RM342, L05 mỗi một 10 µl phản
Đối với primer RG28, RM342, L05 mỗi một 10 µl phản
ứng nhân gen chứa 20 ng ADN của mẫu, 0,5 đơn vị Taq
ứng nhân gen chứa 20 ng ADN của mẫu, 0,5 đơn vị Taq
polymerase, 10 X PCR buffer, 20 mM MgCl2, 1 mM
polymerase, 10 X PCR buffer, 20 mM MgCl2, 1 mM
dNTPs và 5 uM primer. Phản ứng nhân gen được tiến
dNTPs và 5 uM primer. Phản ứng nhân gen được tiến
hành trên máy Bio-rad 9800 với các chu trình nhiệt như
hành trên máy Bio-rad 9800 với các chu trình nhiệt như
sau:
sau:


Bước 1: Giữ ở 94 độ C trong 5 phút; bước 2: 94
Bước 1: Giữ ở 94 độ C trong 5 phút; bước 2: 94
độ
độ
C
C

trong 30 giây; bước 3: 550C trong 30 giây; bước 4: 72
trong 30 giây; bước 3: 550C trong 30 giây; bước 4: 72
độ C trong 1 phút 30 giây; bước 5: 72 độ C trong 5 phút;
độ C trong 1 phút 30 giây; bước 5: 72 độ C trong 5 phút;
và bước 6: Giữ ở 4 độ C. Chu
và bước 6: Giữ ở 4 độ C. Chu


kỳ nhiệt từ bước 2 đến
kỳ nhiệt từ bước 2 đến
bước 4 lặp lại 35 chu kỳ.
bước 4 lặp lại 35 chu kỳ.