1
HỆ THỐNG TÁI SINH
HỆ THỐNG TÁI SINH

2
Hệ thống tái sinh
•
Đặc điểm của hệ thống tái sinh
•
Cơ sở khoa học của tái sinh cây
3. Các phương thức nuôi cấy tái sinh cây
Môi trường nuôi cấy
1. Các yêu cầu kỹ thuật chung
2. Các loại Môi trường

3
Hệ thống tái sinh
Hệ thống tái sinh
Đặc điểm chung
Tính toàn năng của tế bào thực vật

Khả năng tái sinh in vitro


Mô, tế bào thực vật


Có khả năng tái sinh và biến nạp

Có khả năng tái sinh hoặc biến nạp


Không có khả năng tái sinh và biến nạp


Khả năng tái sinh phụ thuộc:
•
Dạng vật liệu ban đầu dùng để biến nạp (phôi non,
m
mô
sẹo,
cuống lá, lá mầm, mẩu lá, thân mầm, hoặc chồi …)
cuống lá, lá mầm, mẩu lá, thân mầm, hoặc chồi …)
•
Các yếu tố: kiểu gen, tuổi mô, các chất điều hoà sinh
trưởng, nhiệt độ, ánh sáng.



4
•
Từ bất kỳ bộ phận nào của thực vật đều có thể tái sinh thành hàng ngàn
thậm chí hàng triệu cá thể giống hệt cây mẹ
Mô phân sinh
Mô khác
Thân, rễ, lá Hoa, quả, bẹ lá
Nuôi cấy mô
Cây con
Tính toàn năng của tế bào

Hệ thống tái sinh
Hệ thống tái sinh
Tính toàn năng của tế bào
Hệ thống tái sinh
Hệ thống tái sinh
Hiện tượng biệt hóa, phản biệt hóa và tái biệt hóa
Biệt hóa là sự biến đổi của tế bào từ trạng thái tế bào phôi cho đến
khi thể hiện một chức năng nào đó. Các tế bào dùng trong nuôi cấy
đều đã biệt hóa về cấu trúc và chức năng từ tế bào phôi.
Trong những điều kiện thích hợp, có thể làm cho những tế bào này
quay trở lại trạng thái của tế bào đầu tiên đã sinh ra chúng - tế bào
phôi và qúa trình đó gọi là qúa trình phản biệt hóa.
Thực vật: tế bào phôi non, tế bào mô phân sinh, tế bào của cơ quan
sinh sản (hạt phấn, noãn) rất dễ xảy ra qúa trình phản biệt hóa.


Khả năng hình thành cơ quan hay cơ thể của các tế bào thực vật
là giảm dần theo chiều hướng từ ngọn xuống gốc.

7
Các phương thức nuôi cấy – tái sinh
Nuôi cấy
tế bào đơn
Nuôi cấy
mô và
cơ quan
tách rời
Nuôi cấy
mô
phân sinh

Nuôi cấy
bao phấn
và
hạt phấn
Nuôi cấy
phôi
Nuôi cấy
protoplast

8
Hệ thống tái sinh
Hệ thống tái sinh
Nuôi cấy tế bào đơn
Tế bào đơn


môi trường lỏng


Dòng tế bào


- Dòng tế bào cho phép tách riêng từng tế bào rất dễ dàng.
- Các tế bào trong dòng tế bào có độ đồng nhất cao.
- Tế bào đơn được nuôi cấy trong môi trường lỏng thường có nhân to hơn,
nguyên sinh chất đậm đặc hơn so với tế bào nguyên thủy trong mô thực vật.
- Tế bào đơn được nuôi cấy trong môi trường lỏng thường chứa nhiều hạt
tinh bột (năng lượng dự trữ của thực vật).
- Tế bào có khả năng phân chia trong khoảng 24 – 72 giờ.
- Tế bào bị mất tính toàn năng.

- Tế bào bị tăng mức bội thể.


Nuôi cấy mô và cơ quan tách rời
- Nuôi cấy mô so với nuôi cấy cơ quan tách rời đòi hỏi bổ sung thêm
các chất hữu cơ chứa N (axit amin) và đặc biệt là chất điều hòa sinh
trưởng, vì mô tách rời không có khả năng tổng hợp những chất này.


Lựa chọn mẫu có tầm quan trọng đặc biệt: mẫu phải ở tình trạng
sinh lý tốt và đang phát triển, đó là những phần non của cây hoặc
phôi hợp tử trưởng thành như mầm, phần trên lá mầm, chồi bên
của lá thứ nhất hay thứ hai, nơi chứa nhiều tế bào mô phân sinh.
Nuôi cấy mô và cơ quan tách rời được ứng dụng trong nghiên cứu
điều kiện sinh trưởng đối với một bộ phận hoặc một mô của cây;
nhân nhiều và nhanh cây in vitro, tạo mô sẹo phục vụ cho các
nghiên cứu cơ bản như chọn dòng tế bào, đột biến soma



10
Nuôi cấy mô phân sinh
Mô phân sinh chứa các tế bào non trẻ, phân chia mạnh, lại không
bị virus xâm nhập


Nuôi cấy mô phân sinh được dùng trong các trường hợp:
- Tạo ra những giống cây sạch virut từ những giống bị bệnh
(phục tráng giống)
- Nhân giống in vitro

- Tạo cây đa bội thông qua xử lý colchicine.
- Nghiên cứu qúa trình hình thành cơ quan
Nuôi cấy bao phấn và hạt phấn
Nuôi cấy bao phấn là kỹ thuật nuôi cấy in vitro các bao phấn chứa tiểu bào
tử hay hạt phấn chưa thành thục trên môi trường dinh dưỡng để tạo ra
cây đơn bội. Số nhiễm sắc thể của cây đơn bội được nhân đôi để tạo ra cây
lưỡng bội đồng hợp tử hoàn toàn, gọi là thể đơn bội kép.
Việc nuôi cấy bao phấn rất có ích đối với nhà chọn giống vì thế đơn bội
kép có thể được sử dụng để làm các dòng thuần ở cả cây tự thụ phấn và
cây giao phấn


Nuôi cấy noãn chưa thụ tinh

13
Nuôi cấy phôi
Loài dại x loài trồng con lai có độ bất hợp
cao
cao
nuôi cấy phôi
cứu phôi


Nuôi cấy phôi non


Nuôi cấy phôi trưởng thành


Nuôi cấy tế bào trần (protoplast)

- Chọn lọc các dòng tế bào vô tính có các tính trạng đặc biệt do sự di truyền của tế bào
hoặc được tạo ra do xử lý đột biến.
- Chuyển những đoạn ADN ngoại lai quy định những tính trạng mong muốn vào tế
bào trần rồi tái sinh thành cây.
- Dung hợp tế bào trần từ những loài cách xa nhau về mặt di truyền, không thể áp
dụng lai hữu tính bình thường.


Tế bào thực vật bị phá bỏ toàn bộ lớp vỏ bao bọc chỉ còn lại khối nguyên sinh chất được
bao bởi màng nguyên sinh được gọi là tế bào trần (protoplast). Các tế bào trần sau khi
được nuôi cấy trên môi trường thích hợp thì tái tạo thành tế bào, phát triển thành khối
mô sẹo và tái sinh thành cây hoàn chỉnh



15
Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy
Ánh sáng
Chất
dinh dưỡng
Nhiệt độ
Độ ẩm
Phát sinh cơ quan,
hình thành cây
pH
Khác....
Phải chọn được các điều kiện trên
thích hợp để thực hiện được tính
toàn năng của tế bào


16
Ánh sáng
Đòi hỏi đối với nguồn sáng
Phát sinh cơ quan,
hình thành cây
Cường độ
1500-2000 LUX
Chu kỳ
chiếu sáng 16/24;
hoặc 8/24
Chất lượng
quang phổ: dải tần
230-780 nm
Bóng tối đối với
một số trường hợp
như tạo củ, tạo
callus

17
Vai trò của ánh sáng
Kích thích
tạo diệp lục
Cung cấp chất
dinh dưỡng cho cây
Ảnh hưởng đến
phát sinh hình thái
Khi tạo callus, tạo củ,
lưu giữ quỹ gen- cần cường độ
ánh sáng thấp


18
-
Có cường độ chiếu sáng tương đối đồng đều cho
một mục đích sử dụng.
-
Dùng ánh sáng lạnh để chống tăng nhiệt độ – thông
dụng là đèn huỳnh quang.
- Sử dụng thiết bị tắt mở tự động để tắt bật ánh sáng
theo chu kỳ định trước, thường là 16 giờ chiếu sáng/
8 giờ tối.
Phương pháp bố trí ánh sáng trong
phòng thí nghiệm

19

20
Vai trò của nhiệt độ: duy trì sự phát triển bình thường của thực vật. Tuỳ
theo mục đích người ta sử dụng các chế độ nhiệt độ khác nhau để sự sinh
trưởng và phát triển của thực vật được tối ưu
Nhiệt độ
Nhiệt độ tối ưu thường dùng
25-27 độ C
Lưu giữ quỹ gen dùng
nhiệt độ thấp từ 4-20 độ
Khi chuẩn bị cho
cây ra ngoài có thể tăng
dần nhiệt độ

21
Phương pháp duy trì nhiệt độ phòng nuôi

Ở Xứ lạnh – chủ yếu phải
tăng nhiệt độ bằng sưởi,
Ở Việt Nam – phải giảm
nhiệt độ bằng điều hoà
•
Ưu điểm: diện tích sử dụng lớn, giá
thành rẻ. Thường dùng cho các mục
đích chung, sản xuất đại trà.

22
Ưu điểm:
gọn nhẹ, có
thể điều chỉnh
các chế độ
đặc biệt bổ
sung cho
buồng nuôi.
Nhược điểm:
giá thành cao
Phương pháp duy trì nhiệt độ sử dụng tủ nuôi

23
Được duy trì nhờ bình nuôi. Thường là độ ẩm bão hoà
Độ ẩm
Trước khi đưa ra ngoài, giảm dần độ ẩm bằng cách:
Thay nút bằng nút giấy. Nút giấy cho phép độ ẩm thoát ra
ngoài nhưng vẫn chống được nhiễm trong thời gian ngắn.
Mở hẳn nút 2-3 ngày trước khi đưa cây ra ngoài để độ ẩm
gần với độ ẩm tự nhiên.


24
Đảm bảo vô trùng
Chịu nhiệt;
Cho ánh sáng đi qua
Lưu giữ độ ẩm
đảm bảo tiểu
khí hậu
Đảm bảo thông khí với
môi trường bên ngoài
Bình nuôi

25
Bình tam giác
Hộp vuông
Bình trụ
Túi nuôi cấy,
ống nghiệm
Khác
Các loại bình nuôi