Họ và tên: Nguyễn Thị Luyến
Lớp : K33c – Sinh – KTNN
Trường : Đại học sư phạm Hà Nội II
BÀI TIỂU LUẬN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Câu hỏi:
Nội dung
I. Khái niệm
Bản chất của kỹ thuật PCR( phản ứng chuỗi trùng hợp,phản ứng nhờ chuỗi
polymerase) là kỹ thuật tổng hợp nhân tạo nhân AND với tốc độ nhsnh chưa
từng thấy và độ chính xác cao được thực hiện trong máy chu kỳ nhiệt(máy PCR)
- Phương pháp căn bản chạy PCR được Kary Mullis phát minh, ông đã
đoạt giải Nobel về Hóa học vào tháng 10 năm 1993 cho thành tựu này, chỉ
sau 7 năm khi ông đưa ra ý tưởng. Ý kiến của Mullis là phát triển một quy
trình mà DNA có thể nhân lên nhiều lần một cách nhân tạo qua nhiều chu
kỳ sao chép bởi enzyme DNA polymerase.
II. Nguyên lý
Kỹ thuật tổng hợp AND ngoài cơ thể cũng tuân thủ những nguyên tắc cơ bản của sao
chép AND trong cơ thẻ như: Đoạn AND cần nhân mở xoắn thành 2 mạch đơn, cần có cặp
mồi, cần nguyên liệu và điều kiện môi trường thích hợp và enzim AND polymerase.
PCR được dùng để khuếch đại một đoạn DNA ngắn, đã xác định được một
phần. Đó có thể là một gen đơn, hay một phần của gen. Trái với sinh vật sống,
quy trình PCR có thể copy một mảnh DNA ngắn, có thể lên đến 10kb (kb = 1
kilobasepair = kilo cặp base = 1000 cặp base). DNA là một sợi đôi, và vì vậy nó
được đo với DNA bổ sung … gọi là cặp base. Một vài phương pháp có thể copy
một mảnh kích thuớc lên đến 40kb ít hơn nhiều so với nhiễm sắc thể DNA trong
tế bào eukaryote – ví dụ như tế bào người chứa hơn 3 tỉ cặp base.
Như đã thực hành hiện nay, PCR cần rất nhiều thành phần. Những thành phần
đó là: - DNA mẫu (template) chứa mảnh DNA cần khuếch đại - Cặp mồi(primer),
để xác định điểm bắt đầu và kết thúc vùng cần khuếch đại (xem phần tiếp theo
về mồi) - DNA-polymerase enzym xúc tác cho việc nhân lên của DNA. -
Nucleotides (ví dụ dNTP)là nguyên liệu cho DNA-polymerase để xây dựng DNA

mới. - Dung dịch đệm, cung cấp môi trường hóa học cho DNA-polymerase
Phản ứng PCR được thực hiện trong chu kỳ nhiệt. Đây là máy đun nóng và làm
nguội trong ống phản ứng ở nhiệt độ chính xác cho mỗi phản ứng. Để ngăn
ngừa sự bay hơi của hỗn hợp phản ứng, phần nắp đậy của máy PCR cũng
được đun nóng, trường hợp lượng dung dịch phản ứng quá ít, người ta cho một
lớp dầu (natural oil) lên trên bề mặt hỗn hợp phản ứng. Năm 2004, giá máy
khoảng 2500 USD.
Đoạn mồi
Đoạn DNA cần khuếch đại được xác định bằng mồi chọn lọc. Mồi là những đoạn
ngắn, sợi DNA nhân tạo – không quá 50 (thường 18-25) nucleotides (vì DNA
thường là sợi đôi, chiều dài của nó được xác định bằng số lượng cặp base (bp);
chiều dài của sợi đơn DNA được đo bằng base hay nucleotides) phù hợp một
cách chính xác ở điểm bắt đầu và kết thúc của DNA cần khuếch đại. Nó gắn
chặt với DNA mẫu ở những điểm khởi đầu và kết thúc, nơi mà DNA-polymerase
nối và bắt đầu quá trình tổng hợp của sợi DNA mới.
Sự lựa chọn về chiều dài của những đoạn mồi và nhiệt độ biến tính của nó (Tm-
melting) phụ thuộc vào số … Nhiệt độ biến tính của mồi – đừng nhầm lẫn với
nhiệt độ biến tính của DNA trong chu kỳ đầu tiên của quá trình PCR -- được định
nghĩa là nhiệt độ dưới lúc mồi bám vào DNA mẫu và nhiệt độ trên lúc mồi tách ra
khỏi DNA mẫu. Nhiệt độ biến tính tỉ lệ thuận với chiều dài đoạn mồi. Mồi quá
ngắn sẽ bám nhiều vị trí trên DNA mẫu dài và sẽ cho kết quả không rõ ràng. Mặt
khác chiều dài DNA bị giới hạn bởi nhiệt độ cần biến tính. Nhiệt độ biến tính quá
cao, ví dụ như trên 80°C sẽ gây ra nhiều vấn đề vì DNA-polymerase hoạt động
kém ở nhiệt độ đó. Chiều dài tốt nhất của đoạn mồi là từ 20-40 nucleotide với
nhiệt độ biến tính khoảng từ 60 – 75°C.
Thỉnh thoảng những đoạn mồi đã thoái hóa cũng được sử dụng. Những đoạn
mồi này là hỗn hợp tương tự nhưng không giống hoàn toàn. Nó có thể thuận tiện
nếu có cùng gen cần khuếch đại từ những sinh vật khác nhau, như bộ gen của
nó có thể là tương tự nhưng không giống nhau. Người ta còn dùng những đoạn
mồi đã thoái hóa khi mồi được thiết kế dựa trên chuỗi protein. Như nhiều codon

có thể mã hóa cho nhiều acid amin, thường rất khó để suy ra codon nào dùng
cho trường hợp đặc biệt. Vì vậy đoạn mồi tương ứng với axit amin isoleucine có
thể là “ATH”, A có nghĩa là adenine, T là thymine, và H ứng với adenine,
thymine, hay cytosine. (Xem mã di truyền để hiểu them về codons) Sử dụng
đoạn mồi đã thoái hóa có thể làm giảm đặc trưng của phản ứng khuếch đại
PCR. Vấn đề có thể được giải quyết bằng phương pháp touchdown PCR.
Vấn đề thiết kế mồi chính xác đã được đề cập ở trên cần phụ thuộc vào sản xuất
sản lượng: - hàm lượng GC nên trong khoảng 40-60% - Tính toán nhiệt biến tính
cho cả những đoạn mồi trong phản ứng không khác quá 50°C và nhiệt biến tính
của sản phẩm khuếch đại không khác mồi quá 10°C - Nhiệt độ bám vào thỉnh
thoảng thấp hơn nhiệt nóng chảy 50°C. Tuy nhiên, nên chọn lựa theo kinh
nghiệm cho từng trường hợp cụ thể. - Tránh … - Kết thúc đầu 3’ rất nhạy cảm –
nó có thể không bổ sung cho bất cứ vùng nào của đoạn mồi trong phản ứng và
phải cung cấp base chính xác phù hợp với mẫu. Có cả chương trình hỗ trợ việc
thiết kế mồi (xem External links)
Quy trình
Quy trình PCR gồm 20 đến 30 chu kỳ. Mỗi chu kỳ gồm 3 bước (Hình 2)
(1)Nhiệt độ tăng lên 94-96°C để tách hai sợi DNA ra. Bước này gọi là biến tính,
nó phá vỡ cầu nối hydrogen nối 2 sợi DNA. Trước chu kỳ 1, DNA thường được
biến tính đến thời gian mở chuỗi để đảm bảo mẫu DNA và mồi được phân tách
hoàn toàn và chỉ còn dạng sợi đơn. Thời gian: 1-2 phút
(2)Sau khi 2 sợi DNA tách ra, nhiệt độ được hạ thấp xuống để mồi có thể gắn
vào sợi DNA đơn. Bước này gọi là gắn mồi. Nhiệt độ giai đoạn này phụ thuộc
vào đoạn mồi và thường thấp hơn nhiệt độ biến tính 50°C (45-60°C). Sử dụng
sai nhiệt độ trong giai đoạn này dẫn đến việc đoạn mồi không gắn hoàn toàn vào
DNA mẫu, hay gắn một cách tùy tiện. Thời gian: 1-2 phút.
(3) Cuối cùng, DNA polymerase gắn tiếp vào sợi trống. Nó bắt đầu bám vào và
hoạt động dọc theo sợi DNA. Bước này gọi là kéo dài. Nhiệt độ kéo dài phụ
thuộc DNA-polymerase. Thời gian của bước này phụ thuộc vào cả DNA-
polymerase và chiều dài mảnh DNA cần khuếch đại. Như một quy tắc …,

1000bp/ 1 phút.
III. Các thành phần tham gia phản ứng
1. Enzyme
- Các đặc tính enzyme DNA polymerase và định nghĩa đơn vị (unit) của
mỗi loại (hãng) sản xuất là khác nhau. Cần kiểm tra thông tin trên các tờ
hướng dẫn đi kèm hóa chất.
- Lượng enzyme cần thiết là phụ thuộc vào lượng DNA template và kích
thước phản ứng PCR. Tuy nhiên, thành phần này chỉ nên hiệu chỉnh khi
1) sản phẩm PCR lớn hơn 5kb; 2) có khả năng hoạt tính của enzyme bị
giảm sút do thiếu sót ở khâu bảo quản; 3) đã tiến hành hiệu chỉnh bằng
nhiều cách nhưng sản phẩm PCR vẫn thấp hoặc không có gì.
- Không nên tăng enzyme quá 2U (5µl) trên 50 µl tổng thể tích phản ứng
Việc thay đổi loại DNA polymerase có thể làm thay đổi hiệu suất của phản
ứng PCR.
- Khi tính toán chiến lược cloning bằng hệ thống TA vector, cần lưu ý DNA
polymerase có đặc tính tạo đầu treo A ở đầu 3' hay không. Nếu không thì
cần phản ứng bổ sung sử dụng Klenow và ATP.
- Tính chính xác của enzyme DNA polymerase phụ thuộc vào hoạt tính 3
´→5´ exonuclease. Tùy thuộc mục đích thí nghiệm mà cần lựa chọn loại
DNA polymerase có hay không có hoạt tính này.
2. Buffers
_Hiệu suất, tính chính xác của enzyme DNA polymerase phụ thuộc nhiều
vào hệ buffer sử dụng. Thông thường nên sử dụng đúng loại buffer tương
ứng với enzyme do nhà sản xuất khuyến cáo.
_Một số buffer chứa chất hoạt động bề mặt có thể ảnh hưởng đến các
phản ứng microarray hoặc DHPLC.
_Nhiều loại buffer đã có sẵn một lượng nhất định ion Mg2+ nên cần lưu ý
khi tối ưu hóa nồng độ Mg2+ .
3. Nồng độ Mg2+ và dNTP
_ Việc tăng nồng độ ion Mg2+ có thể làm xuất hiện thêm các sản phẩm

không đặc hiệu. Tuy nhiên nếu thiếu ion Mg2+ thì dẫn đến lượng sản
phẩm PCR thấp.
_ Nồng độ ion Mg2+ tối ưu phụ thuộc vào loại DNA polymerase, loại DNA
template và thành phần buffer (một số buffer thương mại đã có sẵn 1
lượng nhất định ion Mg2+).
_ Dò tìm nồng độ Mg2+ tối ưu thông thường bằng gradien nồng độ từ 0.5
đến 2 mM với các khoảng cách mỗi bước là 0.2 mM.
_ dNTPs là loại hóa chất kém bền cần lưu ý khi sử dụng và bảo quản.
Nên chia nhỏ lượng dNTPs để giảm số lần làm tan, sử dụng lại.
Lượng dNTP tối ưu là 200 µM of mỗi loại dNTP. Việc tăng dNTP không
làm tăng đáng kể lượng sản phẩm PCR so với việc hiệu chỉnh các yếu tố
khác.
3. Template và Primers
_ Nồng độ tối ưu DNA template là từ 1) đối với các mẫu DNA tương đối
đồng nhất (plasmid, lambda hoặc BAC DNA): 1 pg - 10 ng / 50 µl tổng thể
tích phản ứng; 2) đối với mẫu DNA genome thì từ 50 - 500 ng/50 µl tổng
thể tích.
_ Nồng độ primer thường tối ưu ở 10 mM mỗi loại.
4. Chất khác
_ Đối với các DNA template lớn, giàu GC thì có thể sử dụng các chất biến
tính như DMSO, formamide, glycerol, and betaine trong thành phần PCR.
Tuy nhiên, phải kiểm tra độ tương thích đối với enzyme DNA polymerase.
_ Tăng lượng DMSO trong PCR sẽ cần giảm nhiệt bắt mồi xuống.
Một số buffer đã có chứa sẵn loading buffer để có thể điện di ngay sau
PCR. Tuy nhiên, độ nhạy của PCR với những buffer này không cao.
Khuôn ADN được biến đổi
thành 2 sợi đơn (94
0
C, 5 phút)
Gắn primer vào đầu đoạn ADN

(55
0
C, 30 giây)
Tổng hợp chuỗi ADN mới
(65-75
0
C, 2-5 phút)
Biến đổi để tách s
ợi ADN mới
thành 2 đơn (94
0
C, 30 giây)
Chu trình PCR
IV: Chu kỳ phản ứng của PCR
Biến tính
- Việc tăng nhiệt độ hoặc kéo dài thời gian biến tính có thể làm tăng tính đặc hiệu
của PCR nhưng làm giảm tuổi thọ của enzyme DNA polymerase.
- Đối với những enzyme DNA polymerase bền nhiệt thường nên sử dụng nhiệt
độ biến tính 95°C-98°C. Bao gồm bước biến tính dài lúc khởi đầu và một bước
biến tính ngắn trước từng chu kỳ nhiệt.
- Đối với các genome lớn như thực vật thường sử dụng bước biến tính dài đến 5
min. Để làm giảm ảnh hướng đối với enzyme thì có thể bổ sung enzyme DNA
polymerase sau khi biến tính ban đầu.
- Khi đã tối ưu PCR thì cần giảm tối thiểu thời gian biến tính mỗi chu kỳ để tăng
lượng sản phẩm. Thông thường từ 10s đến 30s.
- Tốc độ gia nhiệt và chế độ điều khiển nhiệt độ ở mỗi hệ thống luân nhiệt (PCR
machine, thermocylcer) là khác nhau phụ thuộc hãng sản xuất. Một số hệ thống
cho phép thay đổi thông số này khi tối ưu PCR.
2. Bắt mồi