Các Enzyme và Vector sử dụng trong công nghệ gen
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (3.71 MB, 42 trang )
Kỹ thuật
chuyển gen
vào thực vật
CONCEPTS ON
BIOTECHNOLOGY
Ph¬ng ph¸p t¹o gièng
Khái niệm
Kỹ thuật chuyển gen vào thực vật là kỹ thuật đưa một
hay nhiều gen lạ đã được thiết kế ở dạng ADN tái tổ hợp
vào tế bào làm cho gen lạ gắn vào bộ gen tế bào chủ.
Trong tế bào chủ, các gen này hoạt động tổng hợp nên
các protein/enzyme đặc trưng dẫn tới việc xuất hiện các
đặc tính mới của cơ thể chuyển gen.
1. Các phương pháp chuyển gen vào thực
vật
•
Trực tiếp: súng bắn gen, vi tiêm, xung
điện, siêu âm, hóa chất.
•
Gián tiếp: chuyển gen thông qua sinh vật trung gian
(Virus hoặc vi khuẩn).
1.1. Giới thiệu về vi khuẩn A. tumefaciens
-
Là một loài vi khuẩn đất thuộc nhóm vk Gram âm
-
Có chứa 1 loại plasmid đặc biệt gọi là Ti-plasmid khi
chuyển vào thực vật sẽ gây bệnh khối u (crown gall)
hay hình thành lông rễ (hairy roots)
-
Chủng Agrobacterium tumefaciens và A. rhizogenes
được sử dụng trong chuyển gen vào thực vật.
Agrobacterium
tumefaciens
Crown Gall
Disease
Ti-plasmid (tumor-inducing plasmid). Ti-Plasmid
có kích thước khoảng 200kb đã được xác định trình tự,
gồm có 3 vùng cơ bản trong vận chuyển ADN và cảm ứng
hình thành khối u là T-DNA, các bờ T-DNA và vùng Vir.
Ti Plasmid
Tumor-
producing
genes
Virulence region
Opine catabolism
ORI
T-DNA
region
DNA between
L and R borders is
transferred to plant
as ssDNA;
T-DNA encoded
genes can be
substituted by
target genes
1.2.Cơ chế chuyển gen gây u
thực vật của vi khuẩn A.
tumefaciens
Overview of the Infection Process
- Cơ chế chuyển gen gây u: Khi cây bị thường sẽ tiết ra 1 chất độc
vết thương có cấu trúc dạng hợp chất phenol. Acetosyringone hấp
dẫn vi khuẩn đất tới các mô đó, là chất hoạt hoá nhóm gen vir (gồm
6-9 đơn vị sao mã) điều khiển sinh tổng hợp các sản phẩm
(protein/enzyme). Các protein/enyme có các chức năng sau:
+ Cắt vùng bờ trái, bờ phải (T-DNA) giải phóng sợi đơn T-DNA
+ Bảo vệ sợi đơn T-DNA vừa cắt.
+ Vận chuyển sợi đơn T-DNA xâm nhập TBTV và gắn vào NST (hệ
gen).
Do trên đoạn T-DNA chứa một số gen mã hoá sinh tổng hợp
phytohormone (auxin và cytokinin) kích thích phân chia tế bào
mạnh mẽ, không được kiểm soát dẫn đến hình thành khối u.
Đây là cơ chế chuyển gen tự nhiên vào thực vật của vi khuẩn A.
tumefaciens.
1.3. Thiết kết vector chuyển gen nhờ vi
khuẩn A. tumefaciens
Vector Ti-plasmid tự nhiên của vi khuẩn A. tumefaciens có một
số hạn chế trong khi chuyển gen vào thực vật vì:
- Ti-plasmid có kích thước lớn (200-800 kb).
- Ti-plasmid không tự tái bản trong E. coli.
- Đoạn T-DNA của Ti-plasmid mang các gen điều khiển sinh
tổng hợp auxin và cytokinin cản trở sự tái sinh của cây trong qúa
trình nuôi cấy. Nó còn chứa các gen điều khiển tổng hợp opine
sử dụng các nguyên liệu của cây ảnh hưởng đến năng suất.
- Ti-plasmid không mang gen chỉ thị (reporter, seletion genes)
nên khó chọn lọc cây chuyển gen.
- Các điểm cắt của RE nằm rải rác nên khó thao tác.
