BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

VĂN THÙY LINH

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ
THÀNH PHẦN HÓA HỌC THEO ĐỊNH
HƢỚNG TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA
CỦA CÂY HỒNG RỪNG THU HÁI
TẠI SAPA, LÀO CAI

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC

HÀ NỘI – 2019


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

VĂN THÙY LINH

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ
THÀNH PHẦN HÓA HỌC THEO ĐỊNH
HƢỚNG TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA
CỦA CÂY HỒNG RỪNG THU HÁI

TẠI SAPA, LÀO CAI
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC
CHUYÊN NGÀNH: DƢỢC LIỆU - DƢỢC HỌC CỔ TRUYỀN
MÃ SỐ: 8720206
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS. TS. Nguyễn Mạnh Tuyển

HÀ NỘI - 2019


LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn này, em nhận đƣợc rất nhiều
sự quan tâm, động viên và giúp đỡ tận tình từ thầy cô, gia đình và bạn bè. Nhân dịp
này, em xin bày tỏ sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc đến:
PGS. TS. Nguyễn Mạnh Tuyển
Thầy đã trực tiếp hƣớng dẫn, chỉ bảo tận tình và tạo mọi điều kiện thuận lợi để
em có thể hoàn thành luận văn.
Đồng thời em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến: PGS. TS. Trần Thế Bách,
TS. Nguyễn Văn Tài đã hỗ trợ cho em rất nhiều trong quá trình thực hiện đề tài.
Em xin gửi lời cảm ơn đến thầy cô, các bạn và anh chị tại bộ môn Dƣợc học cổ
truyền, bộ môn Thực vật - Trƣờng đại học Dƣợc Hà Nội, bộ môn Hóa thực vật I, bộ
môn Dƣợc lý - Viện Dƣợc Liệu, Viện sinh thái và tài nguyên sinh vật - Viện Hàn lâm
khoa học và công nghệ Việt Nam, Trạm kiểm lâm Núi xẻ - Sapa, Vƣờn quốc gia
Hoàng Liên đã hỗ trợ em trong suốt quá trình nghiên cứu.
Xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu, phòng Đào tạo, cùng toàn thể các thầy
cô giáo, các cán bộ Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội đã tạo điều kiện để em có thể lĩnh
hội những kiến thức quý giá về ngành Dƣợc trong thời gian qua.
Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè, ngƣời thân đã
luôn sát cánh, động viên em hoàn thành luận văn này.
Hà Nội, ngày 30 tháng 3 năm 2019.
Học viên

Văn Thùy Linh


DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
Tên đầy đủ

Tên viết tắt
13

C-NMR

Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân carbon 13
(Carbon (13) Nuclear magnetic resonance)

1

H-NMR

Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton

ALAT

Alanin aminotransferase

ASAT

Aspartat aminotransferase

BuOH


Butanol

CAT

Catalase

CC

Sắc ký cột (Column chromatography)

D.

Diospyros

DPPH

1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl

ESI-MS

Phổ khối lƣợng ion hóa tia điện
(Electrospray ionization mass spectrometry)

EtOAc

Ethyl acetat

EtOH

Ethanol


GSH

Glutathion

GSH - Px

Glutathion peroxidase

IC50

Nồng độ ức chế 50%

IR

Phổ hồng ngoại (Infrared Spectroscopy)

LOP

Lipid Oxidation Product

MBC

Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu

MDA

Malondialdehyd

MIC


Nồng độ ức chế tối thiểu

MS

Phổ khối (Mass Spectrometry)

NMR

Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (Nuclear magnetic resonance)

ROS/RNS/RCN Reactive oxygen species/Reactive nitrogen species/Reactive
chlorine species.
UV-VIS

Phổ tử ngoại


DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

Tên viết tắt

Tên đầy đủ

CK

Creatin-kinase

EDTA


Ethylenediaminetetraacetic acid

HDL

High-density lipoprotein

LDL

Low-density lipoprotein

MCF-7

Michigan Cancer Foundation-7

NBT

Nitro blue tetrazolium

SKLM

Sắc ký lớp mỏng

SOD

Superoxide dismutase

TBA

Tert-butyl alcohol


TCA

Trichloroacetic acid

TG

Triglycerid


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ .......................................................................................................................... 1
Chƣơng 1. TỔNG QUAN ...................................................................................................... 3
1.1. TỔNG QUAN CHI DIOSPYROS .. .........................................................................3
1.1.1. Vị trí phân loại chi Diospyros .....................................................................3
1.1.2. Đặc điểm thực vật và phân bố .....................................................................3
1.1.3. Một số loài thuộc chi Diospyros. ...................................................................4
1.1.4. Tác dụng sinh học ......................................................................................10
1.1.5. Tổng quan về cây Hồng rừng .......................................................................11
1.2. GỐC TỰ DO VÀ CHẤT CHỐNG OXY HÓA .....................................................13
1.2.1. Gốc tự do ......................................................................................................13
1.2.2. Chất chống oxy hóa ......................................................................................13
Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................14
2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU ................................................................................14
2.1.1. Nguyên liệu nghiên cứu ...............................................................................14
2.1.2. Thiết bị và hóa chất nghiên cứu ...................................................................14
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..........................................................................15
2.2.1. Giám định tên khoa học và đặc điểm thực vật của cây nghiên cứu .............15
2.2.2. Nghiên cứu thành phần hóa học ...................................................................16
2.2.3. Phƣơng pháp xử lý số liệu - đánh giá kết quả ..............................................23
Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ..............................................................................24

3.1. VỀ THỰC VẬT .....................................................................................................24
3.1.1. Đặc điểm thực vật ........................................................................................24
3.1.2. Giám định tên khoa học ...............................................................................26
3.1.3. Đặc điểm vi phẫu thân và lá Hồng rừng ......................................................26
3.1.4. Đặc điểm phần bột thân và lá Hồng rừng ....................................................29
3.2. THÀNH PHẦN HÓA HỌC, CHIẾT XUẤT VÀ SÀNG LỌC TÁC DỤNG
CHỐNG OXY HÓA IN VITRO CỦA CAO CÁC PHÂN ĐOẠN .............................. 31
3.2.1. Định tính sơ bộ một số nhóm chất hữu cơ chính trong lá Hồng rừng .........31


3.2.2. Chiết xuất .....................................................................................................36
3.2.3. Sàng lọc tác dụng chống oxy hóa in vitro của cao các phân đoạn dịch chiết
bằng phƣơng pháp dọn gốc tự do: ..................................................................38
3.3. PHÂN LẬP, XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC VÀ THỬ HOẠT TÍNH CHỐNG OXY
HÓA CỦA MỘT SỐ CHẤT TRONG PHÂN ĐOẠN ĐÃ LỰA CHỌN .....................43
3.3.1. Phân lập ........................................................................................................43
3.3.2. Xác định cấu trúc .........................................................................................49
3.3.3. Thử tác dụng chống oxy hóa của các chất phân lập đƣợc bằng phƣơng pháp
dọn gốc tự do ..................................................................................................56
Chƣơng 4. BÀN LUẬN ........................................................................................................61
4.1. VỀ ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT .................................................................................61
4.1.1. Đặc điểm về hình thái và giám định tên khoa học của loài nghiên cứu ......61
4.1.2. Đặc điểm vi học của loài nghiên cứu ........................................................... 62
4.2. THÀNH PHẦN HÓA HỌC, CHIẾT XUẤT VÀ SÀNG LỌC TÁC DỤNG
CHỐNG OXY HÓA IN VITRO CỦA CAO CÁC PHÂN ĐOẠN .............................. 62
4.2.1. Định tính sơ bộ một số nhóm chất hữu cơ chính .........................................62
4.2.2. Chiết xuất .....................................................................................................62
4.2.3. Sàng lọc tác dụng chống oxy hóa in vitro của cao các phân đoạn dịch chiết
bằng phƣơng pháp dọn gốc tự do ...................................................................63
4.3. PHÂN LẬP, XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC VÀ THỬ HOẠT TÍNH CHỐNG OXY

HÓA IN VITRO CỦA MỘT SỐ CHẤT TRONG PHÂN ĐOẠN ĐÃ LỰA CHỌN ...64
4.3.1. Phân lập, xác định cấu trúc ..........................................................................64
4.3.2. Thử tác dụng chống oxy hóa của các chất phân lập đƣợc bằng phƣơng pháp
dọn gốc tự do ..................................................................................................66
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................................................. 68
KIẾN NGHỊ ...........................................................................................................................69
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Thành phần hóa học của một số cây thuộc chi Diospyros . .................................. 6
Bảng 2.1. Hỗn hợp phản ứng..................................................................................................19
Bảng 3.1. Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ bằng phƣơng pháp hóa học ................34
Bảng 3.2. Độ ẩm của dƣợc liệu lá hồng và các mẫu cao ......................................................37
Bảng 3.3. % độ ẩm của các cao so với dƣợc liệu ban đầu ....................................................38
Bảng 3.4. Khả năng dọn gốc DPPH các cao chiết phân đoạn từ lá cây Hồng rừng ...........39
Bảng 3.5. Giá trị IC50 của các mẫu thử trên mô hình dọn gốc DPPH..................................40
Bảng 3.6. Khả năng dọn gốc Superoxide của cao chiết lá Hồng rừng ................................ 41
Bảng 3.7. Hoạt tính dọn gốc Superoxide của Quercetin.......................................................43
Bảng 3.8. Giá trị IC50 của các mẫu thử trên mô hình dọn gốc tự do Superoxide ................43
Bảng 3.9. Dữ kiện phổ NMR của hợp chất I2Đ4,5F5,6 ...........................................................50
Bảng 3.10. Dữ kiện phổ NMR của hợp chất A5Đ4F8............................................................ 52
Bảng 3.11. Dữ kiện phổ NMR của hợp chất Đ3F5,6 .............................................................. 54
Bảng 3.12. Dữ kiện phổ NMR của hợp chất C6N3I4Đ4,5F5,6 .................................................56
Bảng 3.13. Khả năng dọn gốc DPPH các chất chiết phân đoạn từ lá Hồng rừng ...............57
Bảng 3.14. Khả năng dọn gốc DPPH của Quercetin ............................................................ 58
Bảng 3.15. Khả năng dọn gốc Superoxide của các chất phân lập đƣợc .............................. 59
Bảng 3.16. Hoạt tính dọn gốc Superoxide của Quercetin ....................................................60

Bảng 3.17. Giá trị IC50 của các mẫu thử trên mô hình dọn gốc tự do Superoxide..............60


DANH MỤC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 3.1. Hoạt tính dọn gốc tự do DPPH Quercetin ........................................................39
Biểu đồ 3.2. Hoạt tính dọn gốc tự do DPPH cao n-hexan ...................................................39
Biểu đồ 3.3. Hoạt tính dọn gốc tự do DPPH cao DCM .......................................................40
Biểu đồ 3.4. Hoạt tính dọn gốc tự do DPPH cao n-butanol ................................................40
Biểu đồ 3.5. Hoạt tính dọn gốc tự do DPPH cao EtOH.......................................................40
Biểu đồ 3.6. Hoạt tính dọn gốc tự do DPPH cao EtOAc.....................................................40
Biểu đồ 3.7. Hoạt tính dọn gốc tự do SOD cao EtOAc .......................................................41
Biểu đồ 3.8. Hoạt tính dọn gốc tự do SOD cao nƣớc ..........................................................41
Biểu đồ 3.9. Hoạt tính dọn gốc tự do SOD cao n-hexan .....................................................42
Biểu đồ 3.10. Hoạt tính dọn gốc tự do SOD cao DCM .......................................................42
Biểu đồ 3.11. Hoạt tính dọn gốc tự do SOD cao EtOH .......................................................42
Biểu đồ 3.12. Hoạt tính dọn gốc tự do SOD cao n-butanol.................................................42
Biểu đồ 3.13. Hoạt tính dọn gốc tự do DPPH Quercetin......................................................58
Biểu đồ 3.14. Hoạt tính dọn gốc tự do DPPH Quercetrin ....................................................58
Biểu đồ 3.15. Hoạt tính dọn gốc tự do DPPH Mearnsetin ...................................................58
Biểu đồ 3.16. Hoạt tính dọn gốc tự do SOD Mearnsetin......................................................59
Biểu đồ 3.17. Hoạt tính dọn gốc tự do SOD Quercetrin.......................................................59
Biểu đồ 3.18. Hoạt tính dọn gốc tự do SOD Quercetin ........................................................60


DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Diospyros kaki Thunb .............................................................................................. 5
Hình 1.2. Diospyros lotus L...................................................................................................... 5
Hình 1.3. Diospyros oleifera Cheng......................................................................................... 5
Hình 1.4. Diospyros virginiana L. ............................................................................................ 5

Hình 2.1. Sơ đồ chiết xuất phân đoạn ....................................................................................17
Hình 3.1. Đặc điểm cơ quan sinh dƣỡng cây Hồng rừng .....................................................25
Hình 3.2. Đặc điểm hoa lƣỡng tính của cây Hồng rừng .......................................................25
Hình 3.3. Đặc điểm hoa đực cây Hồng rừng. ........................................................................26
Hình 3.4. Đặc điểm quả và hạt Hồng rừng. ...........................................................................26
Hình 3.5. Vi phẫu thân Hồng rừng.........................................................................................27
Hình 3.6. Vi phẫu lá Hồng rừng, phần gân lá........................................................................28
Hình 3.7. Vi phẫu lá Hồng rừng, phần phiến lá ....................................................................29
Hình 3.8. Ảnh bột thân Hồng rừng ........................................................................................30
Hình 3.9. Ảnh bột lá Hồng rừng............................................................................................. 31
Hình 3.10. Sắc ký đồ của cao toàn phần với hệ II ở các điều kiện quan sát.......................35
Hình 3.11. Sơ đồ chiết xuất các phân đoạn từ lá loài............................................................ 37
Hình 3.12. Sắc ký đồ của cao EtOAc với hệ V ở các điều kiện quan sát ............................ 45
Hình 3.13. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cao EtOAc ........................................................47
Hình 3.14. Sơ đồ phân lập chất từ cao phân đoạn EtOAc ....................................................48
Hình 3.15. Cấu trúc hóa học của Quercetin...........................................................................49
Hình 3.16. Cấu trúc hóa học của Quercetrin .........................................................................50
Hình 3.17. Cấu trúc hóa học của 4’-O-methyl myricetin .....................................................53
Hình 3.18. Cấu trúc hóa học của 3-O-β-arabinofuranoside-4’-methoxy myricetin............54


ĐẶT VẤN ĐỀ

Nƣớc ta nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, có điều kiện tự nhiên thuận
lợi cây cỏ phát triển rất đa dạng và phong phú. Ở Việt Nam, việc sử dụng thuốc có
nguồn gốc thảo dƣợc đã có từ rất lâu đời, thuốc có nguồn gốc tự nhiên thƣờng có
những ƣu điểm độc tính thấp vừa có giá trị điều trị bệnh, vừa có giá trị bồi dƣỡng,
phục hồi sức khỏe, tăng khả năng phòng trừ bệnh. Trên thế giới, các nhà khoa học hiện
đang chú trọng vào việc sàng lọc từ thiên nhiên để tìm ra các hoạt chất sinh học mới có
dƣợc tính mạnh hơn, ít độc hơn. Và hiện nay, xu thế chung của toàn cầu là dùng những

loại thuốc có nguồn gốc thảo dƣợc, thành phần từ tự nhiên để đảm bảo tính an toàn.
Năm 1954, bác sỹ Denham Harman là ngƣời đầu tiên nhận ra sự hiện hữu của
gốc tự do trong cơ thể với nguy cơ gây tổn thƣơng tế bào. Gốc tự do có vai trò phân
hủy, tổng hợp hóa học thông qua bẻ gãy liên kết để tạo liên kết mới, làm sai lệch cấu
trúc và làm rối loạn thông tin trên những phân tử sinh học, vật chất di truyền tế bào.
Đây là những nguyên nhân gây nhiều bệnh lý: viêm, xơ vữa động mạch, sự thoái hóa
của hệ thần kinh, sự lão hóa của các cơ quan phủ tạng…
Chi Diospyros thuộc họ Thị (Ebenaceae) là một chi lớn trên thế giới có hơn 500
loài, đƣợc phân bố chủ yếu ở khu vực nhiệt đới, đa dạng nhất là ở khu vực Đông Nam
Á, có một số loại thuộc Tây Á, Nhật Bản và Đông Nam nƣớc Mỹ [12]. Ở Việt Nam đã
thống kê đƣợc 70 loài [5], trong đó có một số loài thuộc chi Diospyros đã đƣợc nghiên
cứu trên thế giới với tác dụng chống oxy hóa, điều trị ung thƣ, tăng cholesterol máu,
hạ huyết áp, chống viêm, giảm đau….
Cây Hồng rừng là một trong những cây thuộc chi Diospyros tồn tại và phát triển
tự nhiên trên địa bàn Lào Cai. Lá cây Hồng rừng là một vị thuốc nam quý đƣợc ngƣời
dân địa phƣơng sử dụng theo kinh nghiệm với mục đích điều trị các bệnh về gan nhƣ:
thanh lọc gan, hạ men gan, giải độc gan do rƣợu bia,... Với lợi thế về khí hậu, thổ
nhƣỡng, tri thức bản địa của đồng bào dân tộc thiểu số về cây thuốc, ngoài việc sử
dụng rộng rãi các cây dƣợc liệu quý có giá trị kinh tế nhƣ tam thất, đƣơng quy,
atisô,… Hồng rừng cũng là một trong những cây đƣợc sử dụng làm thuốc trong thời
gian gần đây trên địa bàn tỉnh Lào Cai.

1


Do vậy, để góp phần nghiên cứu tạo cơ sở khoa học cho việc nâng cao giá trị sử
dụng của thuốc có nguồn gốc từ thảo dƣợc chúng tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu đặc
điểm vật và thành phần hóa học theo định hướng tác dụng chống oxy hóa của cây
Hồng rừng thu hái tại Sapa, Lào Cai” với mục tiêu sau:
1. Mô tả đặc điểm thực vật, đặc điểm vi học và giám định tên khoa học của cây

Hồng rừng thu hái tại Sapa, Lào Cai.
2. Nghiên cứu thành phần hóa học, chiết xuất, sàng lọc tác dụng chống oxy hóa
in vitro và lựa chọn phân đoạn có tác dụng chống oxy hóa mạnh nhất trong dịch chiết
lá cây Hồng rừng.
3. Phân lập, xác định cấu trúc và thử hoạt tính chống oxy hóa in vitro của một
số chất trong phân đoạn đã lựa chọn.

2


Chƣơng 1. TỔNG QUAN
1.1. TỔNG QUAN CHI DIOSPYROS
1.1.1. Vị trí phân loại chi Diospyros
Theo hệ thống phân loại thực vật của Armen L. Takhtajan (2009) chi Diospyros
có vị trí phân loại nhƣ sau: [1], [14].
Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta)
Lớp Ngọc lan (Magnoliopsida)
Phân lớp Số (Dillenianae)
Liên bộ Đỗ quyên (Ericanae)
Bộ Thị (Ebenales)
Họ Thị (Ebenaceae)
Chi Diospyros
1.1.2. Đặc điểm thực vật và phân bố
 Đặc điểm thực vật
Cây gỗ hoặc cây bụi, rụng lá hoặc thƣờng xanh lá. Lá mọc so le, nguyên [4].
Thỉnh thoảng có các vết mờ rải rác hoặc có các vết rỗ lớn [42].
Hoa thƣờng đơn tính, khác gốc hoặc cùng gốc; hiếm khi lƣỡng tính. Hoa đực
mọc thành xim ở nách lá; nhị từ 4 đến rất nhiều, thƣờng kết hợp thành hai vòng xoắn.
Hoa cái thƣờng đơn độc, mọc ở nách lá; nhị lớp 1-16 hoặc không có; bầu thƣờng có 26. Đài hoa thƣờng có 3-7 thùy. Tràng hoa hình chum, hình chuông, hoặc hình ống, 3-7
thùy rụng sớm. Quả thịt, mang đài to không rụng. Hạt 1-10 (hoặc hơn), thƣờng hẹp

theo bề ngang [42].
 Phân bố
Chi Diospyros là chi lớn nhất trong họ Ebenaceae, có khoảng 500 loài, phân bố
chủ yếu ở khu vực nhiệt đới (Ở Chấu Á có tới 200 loài) và một số nơi thuộc khu vực
ôn đới, trong đó đa dạng nhất là khu vực Đông Nam Á, chỉ có một số loài ở Tây Á,
Nhật Bản và Đông Nam nƣớc Mỹ [13]. Trung Quốc có 60 loài nhiều nhất ở Đông
Nam và Tây Nam Trung Quốc [42]. Ở Việt Nam, chi Diospyros có khoảng 70 loài [4],
trong đó có 9 loài cho gỗ có giá trị sử dụng, hai loài có quả ăn đƣợc là Hồng (D. kaki
L.f.) và Cậy (D. lotus L.) [6].

3


1.1.3. Một số loài thuộc chi Diospyros
1.1.3.1. Đặc điểm thực vật một số loài
Chi Diospyros là chi lớn nhất trong họ Ebenaceae, có khoảng 500 loài, phân bố
chủ yếu ở khu vực nhiệt đới (Ở Chấu Á có tới 200 loài) đa dạng nhất là khu vực Đông
Nam Á [13]. Trung Quốc có 60 loài nhiều nhất ở Đông Nam và Tây Nam Trung Quốc
[42]. Ở Việt Nam, chi Diospyros có khoảng 70 loài [4], trong đó có Hồng (D. kaki
L.f.) và Cậy (D. lotus L.) là hai loài có quả ăn đƣợc [6] và có nhiều đặc điểm tƣơng
đối giống nhau về hình thái thực vật: lá mọc so le, mặt dƣới lá có lông tơ nhạt; hoa đực
và hoa cái mọc riêng rẽ, quả mọng khi chín có màu vàng. Ngoài ra hai loài D. oleifera
Cheng và D. virginiana L. cũng có nhiều đặc điểm tƣơng đồng về hình thái với mẫu
nghiên cứu, do vậy chúng tôi mô tả chi tiết về hình thái thực vật của 4 loài dƣới đây để
có căn cứ khoa học phân biệt với mẫu nghiên cứu.
Diospyros kaki Thunb.: Cây gỗ lớn cao tới 15m. Lá mọc so le, hình trứng hay
trái xoan, dài 6-18cm, rộng 3-9cm, đầu có mũi lồi ngắn, gốc lá nhọn dần, mặt trên lá
màu lục sẫm, mặt dƣới có lông tơ nhạt. Hoa đực mọc chụm lại thành xim ở nách lá, có
2 lá bắc, 14-24 nhị, thƣờng là 16. Hoa cái mọc đơn độc, dài xẻ 5 thùy, bầu có 4 vòi
nhụy và 4 ô, thƣờng có vách giả chia làm 8 ngăn. Quả mọng từ 3,5-8cm, nhẵn, khi

chín màu vàng hay đỏ, mang đài tồn tại và không gập xuống. Hạt dẹt màu nâu vàng.
Hoa tháng 4-6 và quả tháng 8-10 [3].
Diospyros lotus L.: Cây gỗ nhỏ, vỏ đen đen, nhánh non có lông. Lá mọc so le,
phiến lá hình bầu dục, gốc hơi không cân, dài 6-15cm, rộng 4,5-6cm, mỏng, mặt dƣới
nhạt và có lông. Hoa màu vàng, 1-5 ở nách lá, mẫu 4, hoa đực và hoa cái riêng rẽ. Hoa
đực có 16 nhị; hoa cái có 8 nhị lép và bầu nhẵn với 6-8 ô. Quả mọng tròn nhỏ, 1-2cm,
vàng nâu rồi tím đậm đen khi chín. Hoa tháng 5-6, quả tháng 9-11[3].
Diospyros oleifera Cheng: Cây gỗ cao 14m, vỏ cây màu xám đen đến nâu xám.
Cành cây mọc nhiều lông tơ màu sáng. Cuống lá dài 6-10mm; phiến lá thuôn dài, đầu
lá nhọn, hiếm khi hình trứng, gốc lá tròn, gân lá từ 7-9 gân mỗi bên. Hoa lƣỡng tính,
đơn tính đực, cái. Hoa đực mọc thành xim gồm 3-5 cụm hoa (hoặc nhiều hơn), đài 4
thùy, tràng 4 thùy có lông mịn. Hoa cái, đài phân chia ở giữa, tràng hoa khoảng 1,5cm
nhiều lông mịn, nhị 12-14 nhiều lông, nhụy nhiều lông dày đặc. Quả mọng màu vàng
sẫm hình cầu hoặc hình trứng, 8-10 ngăn, nhiều lông mịn [18].

4


Diospyros virginiana L.: Cây gỗ cao từ 10-24m, cành cây xù xì, vỏ cây nâu
đậm hoặc xám đen. Cành mảnh, nhiều lông. Lá đơn, mọc so le, hình tròn hoặc hình
tim, hẹp ở gốc, đầu lá nhọn, lá lon màu nhạt, mép lá có lông, lá già phía trên màu xanh
đậm, phía dƣới màu nhạt, mặt dƣới lá phủ nhiều lông. Hoa thƣờng ra vào tháng 5,
tháng 6, hoa đơn tính khác gốc, hiếm khi lƣỡng tính; đài hoa có 4 thùy; tràng hoa màu
vàng lục hoặc trắng kem, hình ống, 4 thùy; nhị hoa 16, xếp thành hai hàng, sợi ngắn,
mảnh, có lông mịn; bầu hình nón, có 8 ô. Quả mọng, hình cầu màu cam nhạt, chứa 1-8
hạt [18].
Bằng phƣơng pháp đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn (RELP) trong DNA lục
lạp (cpADN) đã đƣợc sử dụng để nghiên cứu sự phát triển và tiến hóa giữa các loài
của chi Diospyros. Trong tổng số 24 loài thu thập từ các vùng khác nhau của chi
Diospyros có 3 loài phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới Châu Á: D. kaki Thunb, D. lotus

L., D oleifera Cheng và một loài ở Châu Mỹ: D. virginiana L., qua nghiên cứu dựa
trên phân tích cpADN kết quả cho thấy cả 4 loài D. kaki Thunb, D. lotus L., D oleifera
Cheng, D. virginiana L. có liên hệ chặt chẽ với nhau về kiểu gen [36], [37]

Hình 1.1. Diospyros kaki Thunb

Hình 1.2. Diospyros lotus L.

Hình 1.3. Diospyros oleifera Cheng

Hình 1.4. Diospyros virginiana L.

5


1.1.3.2. Thành phần hóa học một số loài thuộc chi
Nhiều loài trong chi Diospyros đã phân lập đƣợc một số thành phần hóa học có
hiệu quả cao trong điều trị bệnh. Theo nghiên cứu của U. V. Mallavadhani, Antani K.
Panda và Y. R. Rao và cộng sự đã có khoảng 300 chất hữu cơ đã đƣợc phân lập từ chi
Diospyros trong đó có số lƣợng lớn các thành phần sau: [49]. (Bảng 1.1)
Bảng 1.1. Thành phần hóa học của một số cây thuộc chi Diospyros
Tên loài

Bộ phận
nghiên cứu

D. kaki

Lá


D. lotus

Rễ

D. virginiana

Quả

D. melanoxylon

Lá

D. mespiliformis

Hạt

D. peregrina

Quả

Thành phần hóa học
Tài liệu
phân lập đƣợc
tham khảo
- Triterpene: Lupeol, Betulin,…
- Steroid: β-Sitosterol, Campesterol,..
- Naphthoquinones: Plumbagin, 3[49]
methoxy-7-methyljuglon,..
Flavonoid: Kampfero, Kampferol-3O-α-L-rhamnopyranoside…
- Triterpen: Lupeol, Ursolic acid,…

- Steroid: β-Sitosterol
- Naphthoquinones: 7-Methyljuglon..
[49]
- Flavonod: Myricetin-3-O-α-Lrhamnopyranoside..
- Triterpen: Ursolic acid
- Naphthoquinones: 7-Methyljuglon
[49]
- Diospyrin, Isodiospyrin
- Steroid: β-Sitosterol
-Triterpen: Lupeol, Ursolic acid,
Oleanolic acid…
- Steroid: β-Sitosterol..
[49]
- Naphthoquinones: 7-Methyljuglon,
2-methyl-5-methoxy-6-hydroxy-1,4naphthoquinone..
Triterpen: Betulin, Betulinic acid …
[49]
- Triterpen: Peregrinol, Oleanolic
acid glycosides
- Steroid: β -Sitosterol glucoside..
[49]
-Flavonoid: Leucopelargonidin-3-Oα-L-rhamnopyranosid

6


Nhóm triterpen là nhóm phổ biến nhất đƣợc tìm thấy trong chi Diospyros bao
gồm các chất đã đƣợc phân lập nhƣ: Peregrinol, ursolic acid, taraxerol…[49].

R1


R2

Taraxerol

α –H

β-OH

Taraxeryl acetat:

α-H

β-OCOCH3

Taraceron

O

O

Peregrinol

R1

R2

R1

R2


Lupeol

β-OH

CH3

α-amyrin

β-OH

CH3

Betulin

β-OH

CH2OH

Ursolic acid

β-OH

COOH

Betuliniacid

β-OH

COOH


Ursolic acid

β-OCOCH3

COOH

β-OCOCH2

COOH

β-OCO(CH2 )16CH3

COOH

α-amyrenon

O

CH3

Epi-uvaol

α-OH

CH2OH

Uvaol

β-OH


CH2OH

acetat
Epi-lupeol

α-OH

CH3

Ursolic acid
palmitat

Lupenon

O

CH3

Ursolic acid
stearat

Betulinaldehyd

β-OH

CHO

Sự đa dạng về cấu trúc của các hợp chất steroid là hạn chế và cho đến nay chỉ


7


có sáu chất đƣợc phát hiện và phân lập từ các cây thuộc chi Diospyros [49].

R1

R2

β-sitosterol

H

CH3

β-sitosterol glucosid

gluc

CH3

Stigmasta -5,6 - dihydro - 22 - en - 3β – ol

Stigmasterol

Chi Diospyros có một lƣợng lớn 1,4 – naphthoquinones đã đƣợc nghiên cứu và
chúng có thể đƣợc sử dụng làm dấu hiệu hóa học cho các nghiên cứu phân loại.
Plumbagin và 7 - methyljuglone là các naphthoquinon phân bố rộng rãi nhất và đƣợc
tìm thấy tích lũy với số lƣợng đáng kể trong một số loài thuộc chi Diospyros [49].


2-methoxy -7-methyjuglone

3-methoxy -7-methyjuglone

Cyclodiospyrin

Neodiospyrin

8


Các flavonoid đƣợc phân lập cho đến nay tất cả đều thuộc về phân lớp 3,5,7trihydroxyflavone. Lá D. kaki L. là nguồn tiềm năng cho các chất chuyển hóa này và
cho đến nay đã có flavonol glycoside và một số đã đƣợc báo cáo ức chế angiotensin
chuyển đổi hoạt động enzyme [49].

3,7,3,5’-tetrahydroxy-3’-methoxy-flavanone-4’o-α-L- rhamnopyranoside
R1

R2

R3

H

H

H

α-L-rhamnopyranoside


H

H

β-D-xylopyranoside

H

H

1.1.3.3. Kinh nghiệm sử dụng các loài Diospyros ở Việt Nam và trên thế giới
Ở Việt Nam, một số loài trong chi đã đƣợc nhân dân sử dụng làm thuốc theo
kinh nghiệm dân gian nhƣ:
Diospyros decandra Lour (Thị trái, Thị mƣời nhị): Thịt quả dùng an thần và
tẩy giun cho trẻ em, vỏ thân làm giảm đau vết thƣơng, lá làm thuốc chữa phù thũng,
mụn nhọt…
Diospyros kaki Thunb (Hồng): Quả chữa suy dinh dƣỡng, háo khát, ho có
đờm, trĩ, táo bón; tai hồng chữa nấc, đầy bụng không tiêu, đau bụng lạnh, nôn mửa;
(thị tất) chữa cao huyết áp, cầm máu chống sung huyết ở bệnh trĩ; vỏ thân, vỏ rễ chữa
băng huyết, đại tiện ra máu.
Diospyros candolleana Wight (Thị candolle): Rễ chữa thấp khớp, phù thũng
Diospyros ebenum Koenig ex Retz (Thị huyền): Gỗ làm thuốc giải độc, gây
nôn, tiêu sỏi.
Diospyros mollis Griff (Mắc nƣa): Hạt chữa giun sán.
Diospyros lotus L (Cậy, Thị sen, Thị bị): Lá, vỏ thân chữa lở loét, chảy máu,
quả chữa táo bón, lỵ, làm thuốc giải nhiệt, tiêu khát, chống phiền nhiệt bất an, thúc đẩy

9



sự bài tiết [7].
Trên thế giới một số loài đã đƣợc nghiên cứu về tác dụng dƣợc lý, theo nghiên
cứu của U. V. Mallavadhani, Antani K. Panda và Y. R. Rao và cộng sự các loài có
những tác dụng sau:
D. melanoxylon: Hạt có tính kháng khuẩn
D. mespiliformis: Hạt có tính kháng khuẩn
D. montana: Lá có tác dụng kháng khuẩn và hiệu quả chống lại hầu hết các sinh
vật đƣợc thử nghiệm. Vỏ cây có tác dụng hạ sốt, giảm đau, chống viêm.
D. peregrina: Quả có hoạt tính chống vi rút và hạ đƣờng huyết, kháng khuẩn.
Toàn cây bỏ gốc giảm stress, viêm loét dạ dày và nhiễm độc gan.
D. exsculpta: Toàn cây bỏ rễ tác dụng trên hệ tim mạch.
D. zombensis: Vỏ rễ thể hiện độc tính tế bào chống lại tế bào ung thƣ đại tràng
ở ngƣời [49].
1.1.4. Tác dụng sinh học
Trong lá hồng (Diospyros kaki L.f) có hai thành phần chính là flavonoid và
triterpenoid [20], [21]. Trên thế giới đã có một số nghiên cứu về tác dụng sinh học
dựa trên hai thành phần hóa học từ lá của cây, trong đó có một số tác dụng sinh học
nổi bật nhƣ:
1.1.4.1. Tác dụng trên hệ tim mạch
Một số báo cáo đã chứng minh rằng lá hồng đã làm tăng lƣu lƣợng máu động
mạch vành của thỏ, ếch và chó [30], [44]. Dịch chiết lá hồng có tác dụng chống thiếu
máu cơ tim. Nhóm sử dụng liều lƣợng lớn và nhỏ của dịch chiết lá hồng làm giảm rõ
rệt tỷ lệ rối loạn nhịp tim, nhồi máu cơ tim, và hạ thấp hàm lƣợng CK và LDH trong
huyết thanh [75].
Hơn nữa, flavonoid của lá hồng (PLF) ở liều 4mg/ml có thể làm giảm sự giải
phóng AST, CK, LDH và sản xuất MDA, cũng nhƣ tăng hoạt động của enzym SOD.
Điều đó cho thấy rằng PLF có tác dụng bảo vệ cơ tim [65].
1.1.4.2. Tác dụng chống đái tháo đường
Dịch chiết phân đoạn ethanol, ethyl acetat, n-butanol và nƣớc từ lá hồng đã làm
giảm đáng kể lƣợng đƣờng trong máu ở chuột bị tiểu đƣờng với chỉ số kháng Insulin giảm

và tăng chỉ số nhạy cảm với Insulin. Chiết xuất nƣớc của lá hồng (polysacaharide của lá

10


hồng - Diospyros kaki L.) làm giảm đáng kể mức đƣờng trong máu và cải thiện dung nạp
glucose [71].
1.1.4.3. Hoạt tính kháng khuẩn
Cao chiết ethanol và ethyl acetat từ lá hồng (Diospyros kaki L.) đã có hiệu quả
đáng kể chống lại 6 loại vi khuẩn: Escherichia coli, Staphylococus aureus,
Fluorescence pseudomonas, Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Proteus vulgaris. Cao
chiết nƣớc có hiệu quả với nấm hơn vi khuẩn. Chiết xuất n-butanol có hiệu quả khác
nhau chống lại vi khuẩn, nhƣng không có tác dụng với nấm. Arakawa và cộng sự đã
chứng minh hoạt tính kháng khuẩn của lá hồng (Diospyros kaki L.) là do tanin trong
cây [71].
1.1.4.4. Tác dụng chống oxy hóa
Lá hồng (TFPL) có hoạt tính dọn gốc tự do 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, mặc
dù kém hiệu quả hơn rutin, do trong nghiên cứu đã chứng minh TFPL sở hữu một
lƣợng flavonoid đáng kể. Nghiên cứu này cho thấy việc xử lý các tế bào MC3T3-E1
bằng TFPL đã làm giảm đáng kể sản xuất ROS (Reactive oxygen species )và MDA
(malondialdehyd) và tăng mức độ hoạt động của GSH (glutathione) , SOD và CAT
(catalase), cho thấy tác dụng bảo vệ của TFPL có thể liên quan đến khả năng chống
oxy hóa của nó [64].
1.1.4.5. Tác dụng giảm đau, chống viêm
Theo nghiên cứu của Ghias Uddin (2014) và cộng sự đã kết luận và xác nhận rằng
rễ của D. lotus L. là thuốc thảo dƣợc dùng trong triệu chứng giảm đau và viêm.
Phân đoạn chloroform của D. lotus L. đã phân lập đƣợc Diospyrin và 8hydroxyisodiospyrin thể hiện tác dụng chống viêm và an thần rõ rệt [68].
1.1.5. Tổng quan về cây Hồng rừng (Diospyros kaki Thunb. var. silvestris Makino)
1.1.5.1. Đặc điểm thực vật
- Tên khoa học: Diospyros kaki Thunb. var. silvestris Makino [18].

- Tên đồng nghĩa:

+ Diospyros argyi H. Lév. [18].
+ Diospyros trichocarpa R.H. Miao [18].

- Chi Diospyros Họ Thị Ebenaceae.
Theo từ điển thực vật Trung Quốc loài Diospyros kaki Thunb. var. silvestris
Makino vỏ cây già có màu nâu đỏ, thân non màu xanh, phủ lông dày mịn màu trắng.
Đài hoa hình trứng. Tràng hoa đực 6-9 mm. Quả mọng 2-5 cm.

11


1.1.5.2. Phân bố
Diospyros kaki Thunb. var. silvestris Makino đƣợc phân bố nhiều ở một số
vùng của Trung Quốc nhƣ: An Huy, Bắc Kinh, Trùng Khánh, Quảng Đông, Hồ
Nam,…[66]. Trong cuốn “Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam” (2004) của Đỗ Tất
Lợi, Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam (2006) của Viện Dƣợc Liệu chƣa
tìm thấy thông tin của loài Diospyros kaki Thunb. var. silvestris Makino.
1.1.5.3. Thành phần hóa học
Phân lập từ dịch chiết MeOH của rễ loài Diospyros kaki Thunb. var. silvestris
Makino thu đƣợc dẫn xuất dicoumarol là: gerberinol; 11-methylgerberinol và dẫn xuất
4-hydroxy-5-methylcoumarin [61].
Phân lập chất từ dịch chiết CHCl3 của rễ loài Diospyros kaki Thunb. var.
silvestris Makino thu đƣợc một số hợp chất: 4,4;-dimethoxy-6,6’-dimethyl-8,8’dihydroxy-2,2’-binaphthyl-1,1’-quinone; 7-methyljuglone; Lupeol; β-sitosterol;
Isodiospyrin; Butulinic acid. Tiến hành phân lập bằng phƣơng pháp sắc ký cột pha
thuận từ dịch chiết MeOH của rễ loài Diospyros kaki Thunb. var. silvestris Makino
cũng thu đƣợc một số hợp chất sau: lupeol, 7-methyljuglone. Từ vỏ thân của loài
Diospyros kaki Thunb. var. silvestris Makino tiến hành phân lập chất từ dịch chiết vỏ
thân bằng dung môi CHCl3 thu đƣợc một số hợp chất sau: 7-methyljuglone; Lupeol;

Isodiospyrin [52].
1.1.5.4. Tác dụng sinh học
Mẫu nghiên cứu là quả của 6 loài khác nhau trong chi Diospyros bao gồm: Các
kiểu gen của Trung Quốc (1) D. kaki. cv. Xingyangshuishi, (2) D. kaki. cv.
Xiuningbianshi, (3) D. kaki. cv. Zhouqumomoshi; kiểu gen của Nhật Bản là (4) D.
kaki.cv. Jiro, (5) D. kaki. cv. Zenjimaru; kiểu gen hoang dã (6) D. kaki. var. silvestris
Makino. Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa dựa vào 4 phƣơng pháp: ABTS ((2,2'-azinobis (axit 3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic)) DPPH (2,2-diphenyl-1-picryl-hydrazyl),
FRAP (ferric reducing antioxidant power), HRSA (hydroxyl radical scavenging activity)
nhƣ đƣợc mô tả bởi Peng-Min Li et al. [43]. Kết quả chỉ ra các kiểu gen của D. kaki đều
có hoạt tính chống oxy hóa. Phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) dấu vết hợp chất
polyphenolic bao gồm các thành phần: Galilic acid, (+)-Catechin, chlorogenic acid, phydoxybenzoic acid, 0-phtalic acid, vanillic acid, caffeic acid, syringic acid, p- coumarin
acid, ruttin, ferulic acid, phloridzin, quercetin; cho thấy acid galilic và quercetin là thành
phần phenolic có hoạt tính chống oxy hóa mạnh nhất [58].

12


1.2. GỐC TỰ DO VÀ CHẤT CHỐNG OXY HÓA
1.2.1. Gốc tự do
Là những tiểu phân hóa học (nguyên tử, phân tử, ion..) có điện tử không cặp đôi
ở orbital hóa trị. Chúng có tác dụng chống oxy hóa cao, có vai trò phân hủy, tổng hợp
hóa học thông qua bẻ gãy liên kết để tạo ra liên kết mới, làm sai lệch cấu trúc và làm
rối loạn thông tin trên những phân tử sinh học, vật chất di truyền tế bào. Đây là nguyên
nhân của nhiều bệnh lý: viêm, thiếu máu cục bộ, xơ vữa động mạch, sự thoái hóa của
hệ thần kinh, sự lão hóa của các cơ quan phủ tạng… trong cơ thể gốc tự do đƣợc hình
thành qua hai con đƣờng:
+ Nội sinh trong cơ thể: Chuỗi hô hấp tế bào trong ty thể, quá trình peroxyd hóa
lipid (LOP) và từ các phản ứng tạo gốc oxy hóa trong cơ thể.
+ Ngoại sinh do tác động của môi trƣờng: các tia phóng xạ, bức xạ: ô nhiễm
môi trƣờng gây ô nhiễm cơ thể nhƣ chất dị sinh là các hóa chất, trừ sâu, diệt cỏ gây

nhiều phản ứng Fenton nguy hiểm, stress oxy hóa là sự quá tải gốc tự do, làm mất cân
bằng nghiêm trọng giữa gia tăng đột biến các ROS/RNS/RCS và sự cạn kiệt các tác
nhân chống oxy hóa trong cơ thể [29].
1.2.2. Chất chống oxy hóa
Chất chống oxy hóa là chất có khả năng cho hoặc nhận electron của gốc tự do
để trung hòa gốc tự do đó, do đó làm giảm khả năng gây nguy hại của nó. Chất chống
oxy hóa làm chậm hoặc ngăn chặn sự phá hủy tế bào chủ yếu thông qua khả năng dọn
gốc tự do của chúng. Những chất oxy hóa có trọng lƣợng phân tử thấp có thể tƣơng tác
một cách an toàn với các gốc tự do và chấm dứt chuỗi phản ứng trƣớc khi các phân tử
quan trọng bị phá hủy. Các chất chống oxy hóa đƣợc chia thành hai loại:
Các enzym chống oxy hóa: superoxide dismutase, catalase và glutathione.
Các chất phi enzym: là các antioxidant không phải enzym đƣợc tổng hợp trong
cơ thể nhƣng rất ít, chủ yếu là từ nguồn gốc thức ăn bổ sung. Các antioxidant sử dụng
chủ yếu: vitamin C, lipoic acid, coenzyme Q, vitamin E… mỗi antioxidant có tác dụng
riêng tới từng gốc tự do ở mỗi loại tế bào.
Trong tự nhiên có rất nhiều thực vật có thành phần có tác dụng chống oxy hóa:
vitamin E có trong đậu nành, cà rốt, xà lách… flavonoid và phenolic nhƣ: rutin,
catechin… chính vì vậy cần có thêm nhiều nghiên cứu phát hiện những thành phần hóa
học có trong thực vật có tác dụng chống oxy hóa [29].

13


Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU
2.1.1. Nguyên liệu nghiên cứu
- Mẫu có hoa, quả làm tiêu bản và giám định tên khoa học của cây.
- Lá của cây Hồng rừng tại Sapa, Lào Cai vào tháng 5 năm 2018 đƣợc sử dụng
để nghiên cứu thành phần hóa học. Sau khi thu hái, lá Hồng rừng đƣợc rửa sạch, sấy ở

60˚C đến khô, làm nhỏ, bảo quản trong túi nilon kín, để nơi khô ráo, thoáng mát làm
nguyên liệu nghiên cứu.
2.1.2. Thiết bị và hóa chất nghiên cứu
Thiết bị và dụng cụ
- Máy siêu âm có gia nhiệt của 23 ang Power sonic 405
- Các máy đo các loại phổ: Cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR), phổ tử ngoại (UVVIS), phổ hồng ngoại (IR), phổ khối (MS).
- Các máy đo nhiệt độ nóng chảy, năng suất quay cực. đo độ pH.
- Bình chạy sắc ký lớp mỏng, cột sắc ký, bếp điện, đèn tử ngoại.
- Tủ sấy Memmert
- Máy ly tâm
- Cân phân tích Precisa, cân kỹ thuật Sartorius
- Các dụng cụ thủy tinh thông thƣờng tại phòng thí nghiệm
- Đĩa 96 giếng, micropipet và đầu típ các cỡ
- Máy đọc Microplate, Human reader
- Máy cất quay lớn Buchi, máy cất quay nhỏ Buchi (Thuỵ sỹ)
- Máy xác định hàm ẩm Precisa
- Đèn tử ngoại hai bƣớc sóng 254nm và 366nm
Hóa chất nghiên cứu
- 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, Sigma
- Đệm Na2HPO4/NaH2PO4, Sigma
- Xanthine oxidase, Sigma
- Xanthine, Sigma

14


- Nitrotetrazolium Blue chloride (NBT), Sigma
- Nƣớc cất 2 lần
- DMSO, Merk
- Methanol, Merk

- Ethanol 900
- Hóa chất dùng trong nghiên cứu đặc điểm thực vật: Javen, cloramin, acid
acetic, xanh methylen, đỏ son phèn, glycerin.
- Các dung môi dùng trong chiết xuất, phân lập nhƣ methanol, n-hexan, ethyl
acetat, chloroform, aceton đều đạt tiêu chuẩn công nghiệp.
- Các hóa chất thuốc thử đều đạt tiêu chuẩn phân tích theo quy định của Dƣợc
điển Việt Nam V.
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Giám định tên khoa học và đặc điểm thực vật của cây nghiên cứu
- Quan sát, mô tả và chụp ảnh đặc điểm hình thái thực vật, điều kiện sinh trƣởng
và phát triển của cây Hồng rừng.
- Thu hái, làm tiêu bản mẫu cành mang hoa, quả và lƣu giữ tiêu bản.
- Giám định tên khoa học của mẫu nghiên cứu trên cơ sở phân tích đặc điểm
hình thái thực vật, đặc điểm bộ phận sinh sản, so sánh với các tài liệu phân loại thực
vật của chi Diospyros dƣới sự hƣớng dẫn của các chuyên gia phân loại thực vật.
Nghiên cứu đặc điểm vi học: Soi bột và làm vi phẫu, thân, lá của mẫu nghiên
cứu. Quan sát các đặc điểm, mô tả và chụp ảnh tiêu bản dƣới kính hiển vi.
Dƣợc liệu đƣợc ngâm mềm với nƣớc hoặc ethanol, cắt lát mỏng. Sau đó ngâm
nƣớc Javen 30 phút để tẩy các chất trong các tế bào. Tiếp tục rửa với nƣớc nhiều lần
rồi ngâm với acid acetic 15 phút, cuối cùng đƣợc rửa lại bằng nƣớc. Nhuộm vi phẫu
thu đƣợc bằng xanh methylen trong thời gian 30s - 60s và nhanh chóng rửa lại bằng
nƣớc. Đỏ son phèn đƣợc nhuộm tiếp theo trong khoảng 30 phút. Tiêu bản sau nhuộm
đƣợc rửa lại bằng nƣớc. Đặt vi phẫu vào 1 giọt glycerin trên phiến kính, đậy lá kính.
Sau đó tiến hành soi tiêu bản dƣới kính hiển vi quang học, chụp ảnh và mô tả vi phẫu.
Soi bột:
Dƣợc liệu sau khi thu hái đƣợc sấy khô, nghiền bột, rây qua lƣới đƣợc bột mịn.

15