Nghiên cứu đa dạng di truyền nguồn gen liên quan đến tính
chịu mặn ở lúa Việt Nam
Lê Thị Thu Trang
Trường Đại học Khoa hoc Tự nhiên; Khoa Sinh học
Chuyên ngành: Di truyền học; Mã số: 60 42 70
Người hướng dẫn: TS. Lã Tuấn Nghĩa Năm bảo vệ: 2011
1. Đặt vấn đề

Năng suất lúa thấp do nguyên nhân mặn và những bất lợi của đất vẫn đang tồn tại ở các vùng
ven biển Việt Nam. Hơn nữa thiếu khoáng chất và độc tố của muối trong đất ảnh hưởng lớn đến
cây lúa, một cây trồng chủ đạo trong nên nông nghiệp nước ta (Hoàng Ngọc Giao, 2006; Nguyễn
Tuấn Hinh và cs, 2006). Bên cạnh đó, hiện tượng xâm thực của nước biển vào nước tưới và đất
trồng lúa đã làm cho diện tích ngập mặn lên tới 200.000 ha (Nguyễn Ngọc Anh, 2005). Mặt khác
do tập quán và nhu cầu mở rộng canh tác đổi mới ngành nghề nuôi trồng thuỷ sản vô tình làm
tăng thêm diện tích ngập mặn cũng tăng thêm diện tích ngập mặn cũng như độ mặn tăng lên từ
khoảng 0,3- 0,4% thậm chí có nơi cao hơn cả chục lần. Nông dân thường chờ mưa để trồng lúa.
Tuy nhiên do lượng mưa thất thường, cây lúa vẫn có thể bị mặn gây hại ở giai đoạn mạ, hoặc ở
giai đoạn trỗ đến chín. Từ trước đến nay, công tác chọn tạo giống 2 lúa ở nước ta tuy có nhiều
thành quả, song các phương pháp chọn tạo chủ yếu là truyền thống thông qua lai tạo và đột biến
thực nghiệm nên vẫn còn nhiều hạn chế và ảnh hưởng không nhỏ đến kết quả chọn tạo.
Với sự phát triển của công nghệ sinh học, rất nhiều vấn đề còn tồn tại trước đây của công tác
chọn giống truyền thống đã được giải quyết. Trong đó, ứng dụng chỉ thị phân tử như RAPD,
SSR, RFLP, AFLP được nghiên cứu và phát triển đã trở thành công cụ mạnh mẽ để phân tích đa
dạng di truyền và xác định được sự khác biệt về mặt di truyền của quần thể giống khởi đầu, từ đó
xác định các cặp lai có khoảng cách di truyền phù hợp có thể cho ưu thế lai cao nhất. Việc tiếp
cận ở mức độ phân tử cho phép đánh giá các giống bố mẹ một cách chính xác, không bị tác động
bởi điều kiện ngoại cảnh, rút ngắn thời gian và nâng cao hiệu quả công tác lai tạo Vì vậy, chúng
tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu đa dạng di truyền nguồn gen liên quan đến tính chịu


mặn ở lúa Việt Nam” với mục tiêu chính là xây dựng cơ sở dữ liệu ADN và tính chịu mặn của

các giống/dòng lúa nghiên cứu nhằm góp phần quan trọng cho việc khai thác nguồn gen chịu
mặn và định hướng cho chọn tạo giống lúa chịu mặn ở Việt Nam.
2.

Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

2.1. Vật liệu
- Bộ giống lúa gồm 40 mẫu giống/dòng lúa thu thập từ ven biển phía Bắc, miền Trung Việt
Nam đang được lưu giữ tại Ngân hàng gen cây trồng Quốc Gia và một số giống từ Viện nghiên
cứu lúa Quốc tế (IRRI)
Bảng 1 Danh sách 40 giống lúa trong nghiên cứu
stt Tên giống
Nguồn gốc
stt Tên giống
Nguồn gốc
1
Ỏn
Nam Định
21 Mành gié
Quảng Bình
2
Nếp cúc
Ninh Bình
22 IR28
IRRI
3
Hom râu 1
Thái Bình
23 Hom râu 2
Thái Bình

4
Bầu Hải Phòng
Hải Phòng
24 CM6
Viện di truyền NN
5
Nước mặn
Huế
25 Q5
Trung Quốc
6
Háu trắng
Huế
26 P4
Viện CLT-CTP
7
Lúa ven dạng 1
Quảng Bình
27 P6
Viện CLT-CTP
8
Tẻ chăm
Quảng Bình
28 AC5
Viện CLT-CTP
9
Quảng Trắng
Quảng Trị
29 Nghi hương
10 Ven đỏ

Quảng Trị
30 Tám dự
11 Nước mặn dạng 1 Quảng Trị
31 Khang dân 18
Trung Quốc
12 Chành trụi
Thanh Hóa
32 Lúa su dạng 1
Quảng Bình
13 Lúa đỏ
Huế
33 Cườm dạng 1
Nam Định
14 Lúa chăm
Nam Hà
34 Lúa chăm biển
Ninh Bình
15 Pokkali
IRRI
35 Ngoi tía
Nam Định
16 Cườm dạng 2
Nam Định
36 Ré trắng
Hải Phòng
17 Chiêm rong
Nam Định
37 IR325
IRRI
18 Tám thơm

NamĐịnh
38 Chiêm cũ
Quảng Bình
19 Lúa ngoi
Thanh Hóa
39 Tẻ tép
Nam Định
20 Nếp quắn
Hải Phòng
40 Nếp chẩn
Nghệ An
- Sử dụng 20 cặp mồi SSR để nhận dạng và phân tích đa dạng di truyền các mẫu lúa
Bảng 2: Danh sách các cặp mồi SSR sử dụng trong nghiên cứu
stt
1

Locus
RM5926

Trình tự
(f): ATATACTGTAGGTCCATCCA-5’
(r): AGATAGTATAGCGTAGCAGC-3’

Tm(⁰C)
55

KTSP(bp)
176



2

RM1233

3

RM527

4

RM5963

5

RM140

6

RM493

7

RM3412

8
9

RM1074
5
RM237


10

RM201

11

RM214

12

RM231

13

RM206

14

RM223

15

RM202

16

RM339

17


RM518

18

RM261

19

RM208

20

RM235

(f): GTGTAAATCATGGGCACGTG-5’
(r): AGATTGGCTCCTGAAGAAGG-3’
(f): GGCTCGATCTAGAAAATCCG-5’
(r): TTGCACAGGTTGCGATAGAG-3’
(f): CGAAAAGTGGGAAGCAAATG-5’
(r): GCGTACCCCTAGTGGCTGTA-3’
(f): TGCCTCTTCCCTGGCTCCCCTG-5’
(r):GGCATGCCGAATGAAATGCATG-3’
(f): TAGCTCCAACAGGATCGACC-5’
(r): GTACGTAAACGCGGAAGGTG-3’
(f): AAAGCAGGTTTTCCTCCTCC-5’
(r): CCCATGTGCAATGTGTCTTC-3’
(f):TGACGAATTGACACACCGAGTACG-5’
(r): ACTTCACCGTCGGCAACATGG-3’
(f): CAAATCCCGACTGCTCC-5’

(r): TGGGAAGAGAGCACTACAGC-3’
(f): CTCGTTTATTACCTACAGTACC-5’
(r): CTACCTCCTTTCTAGACCGATA-3’
(f): CTGATGATAGAAACCTCTTCTC-5’
(r): AAGAACAGCTGACTTCACAA-3’
(f): CCAGATTATTTCCTGAGGTC-5’
(r): CACTTGCATAGTTCTGCATTG-3’
(f): CCCATGCGTTTAACTATTCT-5’
(r): CGTTCCATCGATCCGTATGG-3’
(f): GAGTGAGCTTGGGCTGAAAC-5’
(r): GAAGGCAAGTCTTGGCACTG-3’
(f): CAGATTGGAGATGAAGTCCTCC-5’
(r): CCAGCAAGCATGTCAATGTA-3’
(f): GTAATCGATGCTGTGGGAAG-5’
(r): GAGTCATGTGATAGCCGATATG-3’
(f): CTCTTCACTCACTCACCATGG-5’
(r): ATCCATCTGGAGCAAGCAAC-3’
(f): CTACTTCTCCCCTTGTGTCG-5’
(r): TGTACCATCGCCAAATCTCC-3’
(f):TCTGCAAGCCTTGTCTGATG-5’
(r):TAAGTCGATCATTGTGTGGACC-3’
(f): AGAAGCTAGGGCTAACGAAC-5’
(r):TCACCTGGTCAGCCTCTTTC-3’

55

161

55


233

55

196

55

261

55

211

55

211

55

188

55

130

55

158


55

112

55

182

55

147

55

165

55

189

55

148

55

171

55


125

55

173

55

124

2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Đánh giá khả năng chịu mặn của các giống/dòng lúa trong điều kiện phòng thí nghiệm.
2.2.2. Đánh giá khả năng chịu mặn của các giống/dòng lúa trong điều kiện nhà lưới


2.2.3. Tách chiết ADN tổng số từ mẫu lá lúa
Tách chiết ADN lúa bằng dung dịch đệm chứa CTAB dựa trên quy trình chuẩn của
Saghai và Maroof (1994)
2.2.4. Nhận dạng di truyền các giống/dòng lúa bằng chỉ thị SSR
40 giống/dòng lúa được nhận dạng di truyền bằng 20 chỉ thị SSR. Phản ứng PCR được
chuẩn bị bao gồm các thành phần: 2µl Buffer 10X; 1,2µl MgCl2 (25mM); 1µl dNTP(2,5mM);
0,1µl Taq DNA polymerase (5U); 1µl primer forward (20pmol/µl), 1 µl primer reverse
(20pmol/µl)), 2µl ADN khuôn (20ng/µl) trong tổng thể tích phản ứng là 20µl. Chu kỳ nhân gen
được thiết kế như sau: 94ºC trong 5 phút; (94ºC trong 1 phút, 56ºC trong 45 giây, 72ºC trong 1
phút) lặp lại 35 lần; 72ºC trong 7 phút; 4ºC trong 30 phút. Sản phẩm PCR được điện di trên gel
polyacrylamid 12%, trong môi 6 trường đệm TAE 1X, ở 70V trong 3 giờ 20 phút. Sau khi điện
di, bản gel được nhuộm trong dung dịch Ethidium bromide và soi chụp ảnh bằng máy soi UV
Transiluminator.
1.2.5. Phân tích số liệu
Phân tích thống kê một số chỉ tiêu sinh trưởng khi tiến hành đánh giá mặn các mẫu

giống/dòng lúa bằng phần mềm IRRISTAR 5.0 Dữ liệu kiểu gen được xử lý, phân tích bằng phần
mềm NTSYS pc 2.11X (Applied Biosatistics); các chỉ số đánh giá đa dạng di truyền, tần số alen
quần thể được xử lý bằng phần mềm POPGENEv1.32.
3.

Kết quả và thảo luận
3.1 Kết quả tách chiết DNA tổng số
Kết quả tách chiết ADN bằng phương pháp CTAB cải tiến thu được AND nguyên vẹn, độ

tinh sạch cao và có nồng độ khá lớn, từ 150- 300ng/µl, đảm bảo đủ điều kiện để tiến hành các thí
nghiệm tiếp theo( hình 1)


Hình 1. Kết quả tách chiết DNA tổng số lúa
Số TT: 1đến 40: các giống/dòng lúa theo danh sách mẫu (phụ lục 1)
3.2 Kết quả phản ứng PCR và phân tích đa hình trên gel polyacrylamide

Sản phẩm PCR-SSR được điện di trên gel polyacrylamide 8% để phân tích mối tương
quan di truyền liên quan đến tính chịu mặn của bộ giống/dòng lúa nghiên cứu Tổng số thu được
800 mẫu phản ứng PCR (tổ hợp PCR).

Hình 2 Kết quả nhận dạng di truyền 40 giống/dòng lúa bằng chỉ thị SSR- RM339
M: ADN 50bp ladder
Số 1-40: thứ tự các mẫu giống/dòng lúa (phụ lục 1)

Hình 3: Kết quả nhận dạng di truyền 40 giống/dòng lúa bằng chỉ thị SSR- RM261
M: ADN 50bp ladder

Số 1-40: thứ tự các mẫu giống/dòng lúa (phụ lục 1)


Thống kê trên 20 locut SSR, sản phẩm PCR là các băng có kích thước nằm trong khoảng
từ 110-300bp, kích thước phổ biến của các alen thu được trong bộ giống lúa nghiên cứu biến
thiên trong khoảng 120- 250bp.


Hình 4: Biến động kích thước của các alen tại locut SSR khảo sát.
Thống kê kết quả nhân gen 40 giống/dòng lúa bằng 20 chỉ thị SSR được thể hiện ở hình
9. Tổng số alen được phát hiện tại 20 locut là 144. Số alen đa hình tại mỗi locut biến động từ 3
đến 11, đạt trung bình là 7,2 alen/locut. Số lượng alen nhiều nhất là 11 (RM235), đạt 10 alen
(RM140, RM201, RM493, RM1233) và 9 alen 9(RM202). Locut cho ít đa hình nhất (3alen) tại
RM5963.
Bằng phần mềm POPGENE 3.1, tần số alen của mỗi locut được tính toán dựa trên số liệu nhận
dạng di truyền của 40 giống/dòng lúa và là cơ sở để xác định các chỉ số đa dạng di truyền. Trong
số 20 chỉ thị SSR, có 12 chỉ thị cho nhận dạng đặc biệt (unique allele). Các băng kích thước nằm
trong khoảng 100-250bp. Tần số allen phổ biến nhất dao động từ 15.79 % đến 85%, trung bình là
40.07% (bảng 2). Hệ số đa dạng di truyền PIC (Polymorphism Information Content) được coi là
thước đo tính đa hình của các alen trong từng locut SSR. Số liệu ở bảng 2 cho thấy các
giống/dòng lúa nghiên cứu rất đa dạng về thành phần các alen ở các locut được nghiên cứu. Hệ
số PIC thu được tại các locut SSR biến động từ 0,265 (locut RM5926) đến 0.889 (locut RM235)
với giá trị trung bình là 0.713, cho thấy mức độ đa dạng gen tồn tại trong 40 mẫu lúa nghiên cứu
ở mức khá cao.


Hình 5: Kết quả phản ứng PCR của 40 giống/dòng lúa với 20 cặp mồi SSR
(ô đen- có alen được ghi nhận; ô trắng – không có alen được ghi nhận)


Bảng 3: Đa hình các locut SSR ở các giống lúa nghiên cứu



3.3 Quan hệ di truyền liên quan đến tính chịu mặn của các giống/dòng lúa
Quan hệ di truyền của 40giống/dòng lúa với 20 locut tương ứng với các mồi SSR được
phân tích UPGMA bằng phần mềm NTSYS pc 2.11X. Sơ đồ hình cây giữa các giống nghiên cứu
cho thấy hệ số tương đồng di truyền của cả nhóm biến động từ 0,68 đến 0,91 (theo phương pháp
SM, NTSYS). Tại giá trị tương đồng 0,825; 40 giống/dòng lúa được chia thành 10 nhóm lớn với
khả năng chịu mặn khác nhau:
Nhóm I: Mức độ tương đồng di truyền thấp nhất là 0,836; gồm 3 giống/dòng lúa là Ỏn,
Nếp cúc, Hom râu 1có khả năng chịu mặn tốt trong dung dịch Yoshida có NaCl với nồng độ
0.8% (EC= 16dS/m) và trong đất có NaCl với nồng độ 0.6% (EC=12dS/m).
Nhóm II: Mức độ tương đồng di truyền thấp nhất là 0,826; gồm 5 giống/dòng lúa Bầu
Hải Phòng, Háu trắng, Lúa đỏ, Nước mặn, Lúa chăm. Nhóm này đều là các giống/dòng lúa địa
phương, trong đó có 3 giống/dòng lúa Lúa đỏ, Nước mặn, Lúa chăm có cùng nguồn gốc Thừa
Thiên Huế. Đặc biệt có giống Bầu Hải Phòng có khả năng chịu mặn khá , 2 giống Háu trắng và
Nước mặn có khả năng chịu mặn trung bình trên thực nghiệm.
Nhóm III: Gồm 5 giống/dòng lúa là Lúa Ven dạng 1, Quảng trắng, Nước mặn dạng 1, Tẻ
chăm, Ven đỏ đều có nguồn gốc từ ven biển miền Trung Việt Nam. Nhóm này có mức độ tương
đồng thấp nhất là 0,852. Phần lớn các giống/dòng lúa trong nhóm này có khả năng chịu mặn khá
cao.
Nhóm IV: Có mức độ tương đồng di truyền thấp nhất là 0,842, chỉ gồm 2 giống/dòng
lúa, trong đó, 1 giống có nguồn gốc từ Nam Định là Chiêm rong và 1 giống có nguồn gốc từ
Thanh Hoá là Chành trụi có khả năng chịu mặn tốt trong điều kiện môi trường có muối với nồng
độ 0,8%.
Nhóm V: Có mức độ tương đồng thấp nhất là 0,825; gồm 6 giống/dòng lúa của Việt Nam
(Cườm dạng 2, Tám thơm, CM6, Mành gié) và IRRI (Pokkali và IR28). Trong nhóm này, cùng
với giống chuẩn kháng mặn Pokkali, giống/dòng lúa Cườm dạng 2 và CM6 có khả năng chịu
mặn khá trong môi trường có muối với EC=16dS/m.
Nhóm VI: Mức độ tương đồng thấp nhất là 0,835; gồm 3 giống/dòng lúa Q5, Tám dự ,
Nghi hương. Nhóm này có 1 giống nhập nội có nguồn gốc từ Trung Quốc là Q5 có khả năng chịu



mặn kém, 2 giống/dòng Tám dự và Nghi hương chịu mặn tốt trong môi trường có muối với nồng
độ 12dS/m.
Nhóm VII: Gồm 3 giống chịu mặn kém là P4, P6, AC5. Nhóm này có mức độ tương
đồng di truyền thấp nhất là 0,862 và có nguồn gốc từ Việt Nam.
Nhóm VIII: có mức tương đồng thấp nhất là 0,847; gồm 7 giống/dòng lúa của Việt Nam
và IRRI là Lúa chăm biển, Ngoi tía, Ré trắng, IR352, Chiêm cũ, Tẻ tép, Nếp chẩn , trong đó có 2
giống/dòng lúa có khả năng chịu mặn ở mức trung bình có cùng nguồn gốc từ Nam Định là Ngoi
tía và Tẻ tép
Nhóm IX: có mức tương đồng di truyền thấp nhất là 0,829; gồm 3 giống/dòng lúa Lúa
ngoi, Nếp quắn , Hom râu 2 đều là các giống địa phương của Việt Nam, trong đó có Hom râu 2
nguồn gốc từ Thái Bình có khả năng chịu mặn khá.
Nhóm X: Gồm 3 giống/dòng lúa, trong đó có 1 giống nhập nội có nguồn gốc từ Trung
Quốc là Khang dân; 2 giống địa phương của Việt Nam là Cườm dạng 1 và Lúa su dạng 1 có khả
năng chịu mặn tốt theo thực nghiệm.

Hình 6 : Sơ đồ cây phân loại 40 giống/dòng lúa bằng phương pháp UPGMA


Trong công tác tạo giống lúa lai, người ta nhận thấy rằng các cặp bố mẹ càng xa nhau về phương
diện di truyền thì càng cho ưu thế lai cao. Nếu khoảng cách di truyền giữa cặp giống bố mẹ quá
lớn (tương đồng di truyền nhỏ hơn 0,4), con lai thường khó sống sót hoặc bất thụ. Nếu khoảng
cách di truyền giữa cặp giống bố mẹ quá nhỏ (tương đồng di truyền lớn hơn 0,7) con lai thường
có ưu thế lai rất thấp hoặc không cho ưu thế lai. Như vậy mức độ tương đồng di truyền từ 0,4 đến
0,7 làm chuẩn để chọn bố mẹ tạo các dòng lúa lai có khả năng cho ưu thế lai. Trên cơ sở phân
tích di truyền dựa vào chỉ thị phân tử SSR, kết quả phân nhóm di truyền và hệ số tương đồng di
truyền giữa các giống/dòng lúa nghiên cứu, chúng tôi đề xuất một số tổ hợp lai dự kiến có triển
vọng như sau: Hom râu 1 và Pokkali, Chành trụi và P6, Pokkali và Q5, Cườm dạng 2 và Khang
dân.
4. Kết luận
- Đã nhận dạng di truyền 40 giống/dòng lúa liên quan đến tính chịu mặn bằng 20 chỉ


thị SSR. Ghi nhận được tính đa alen rất cao của 20 locut SSR nghiên cứu (từ 3-11
alen/locut). Tần số alen phổ biến dao động từ 15,79% đến 85%, trung bình đạt
40,07%. Hệ số đa dạng di truyền PIC của các locut nghiên cứu khá cao với giá trị
-

trung bình là 0,713.
Đánh giá đa dạng di truyền các giống/dòng lúa liên quan đến tính chịu mặn bằng chỉ
thị SSR cho thấy mức độ đa dạng di truyền cao giữa các giống/dòng lúa; hệ số tương
đồng di truyền ghi nhận được từ 0,68 đến 0,91. Tại giá trị tương đồng 0,825 đã phân

-

40 giống/dòng lúa thành 10 nhóm.
Trên cơ sở khoảng cách di truyền và khả năng chịu mặn của các giống/dòng lúa
nghiên cứu, chúng tôi đề suất một số tổ hợp lai trong công tác chọn tạo giống lúa chịu
mặn có triển vọng cho ưu thế lai cao như sau: Hom râu 1 và Pokkali, Chành trụi và
P6, Pokkali và Q5, Cườm dạng 2 và Khang dân18