ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­

Phan Lạc Dũng

NGHIÊN CỨU CÁC ĐẶC TÍNH SINH HỌC VÀ TIỀM NĂNG ỨNG 
DỤNG CỦA CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS  
AMYLOLIQUEFACIENS 
SUBSP. PLANTARUM SP 1901 PHÂN LẬP TẠI RỪNG QUỐC GIA 
HOÀNG LIÊN

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội ­ Năm 2013


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­

Phan Lạc Dũng

NGHIÊN CỨU CÁC ĐẶC TÍNH SINH HỌC VÀ TIỀM NĂNG ỨNG 
DỤNG CỦA CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS  
AMYLOLIQUEFACIENS 
SUBSP. PLANTARUM SP 1901 PHÂN LẬP TẠI RỪNG QUỐC GIA 
HOÀNG LIÊN

Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số: 60 42 40

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

                                                            NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
TS. TRỊNH THÀNH TRUNG


Hà Nội ­ Năm 2013
LỜI CẢM ƠN

Trước tiên, tôi xin bày tỏ  lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Trịnh Thành Trung,  
người đã dẫn dắt, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn  
cao học này.

Tôi xin chân thành cảm  ơn các cán bộ, anh chị đang làm việc tại Viện Vi  
sinh vật và Công nghệ Sinh học ­ Đại học Quốc gia Hà Nội đã giúp đỡ  tôi trong  
quá trình hoàn thành luận văn.

Tôi xin chân thành cảm  ơn các thầy cô giáo trong Bộ môn Vi sinh vật học  
nói riêng và Khoa Sinh học nói chung đã dạy dỗ tôi trong quá trình học tập.

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm  ơn gia đình, bạn bè đã luôn động viên,  
giúp đỡ, hỗ trợ để tôi có thể hoàn thành luận văn này.

Hà Nội, tháng 5 năm 2013
Học viên

Phan Lạc Dũng



MỤC LỤC
 
DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1. Khả năng sinh trưởng của chủng SP 1901 ở các nhiệt độ khác 
nhau.

33

Bảng 3.2. Khả năng đồng hoá các loại 
đường………………………………….

34

Bảng 3.3. Khả năng lên men các loại 
đường…………………………………...

35

Bảng 3.4. Khả năng sinh enzyme ngoại bào theo phương pháp sử dụng kit 
API ZYM………………………………….……………………………………

37

Bảng 3.5. Tỷ lệ giữa hoạt độ xylanase (U/ml) và nồng độ protein (mg/ml) 
của chủng SP 1901………………………………….
………………………………

40

Bảng 3.6. Hoạt độ của xylanase sau các bước tinh 

sạch………………………

46


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của xylan và các vị  trí tấn công của hệ  thống 
enzyme xylanolytic………………………………….…………………………

8

Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của amylose và amylopectin…………………….

11

Hình   1.3.  Phản   ứng   thủy   phân   liên   kết   peptide   của   chuỗi 
polypeptide………
Hình

 

2.1. 

13
Đồ

 

thị


 

đường

 

chuẩn

 

theo

 

thang 

BSA……………………………….

21

Hình 2.2. Đồ thị đường chuẩn theo thang xylose……………………………..

22

Hình 2.3. Đồ thị đường chuẩn theo thang glucose…………………………….

23

Hình   2.4. 


24

Đồ   thị   đường   chuẩn   theo   thang   L­


tyrosine…………………………
Hình 3.1.  Cây phát sinh chủng loại của 37 chủng vi khuẩn  Bacillus  phân 
lập tại rừng Quốc gia Hoàng Liên và 9 loài thuộc nhóm vi khuẩn  B. subtilis 
dựa   trên   phân   tích   trình   tự   16S   rDNA………………………………….
…………..

28

Hình 3.2.  Cây phát sinh chủng loại của các loài vi khuẩn thuộc nhóm  B. 
subtilis………………………………….……………………………………..

30

Hình   3.3.  Hình  thái  khuẩn  lạc   chủng   SP   1901  (a),   hình  thái  tế   bào  khi 
nhuộm   gram   (b)   và   soi   nổi   (c)   ………………………………….
…………………….

31

Hình 3.4.  pH sinh trưởng tối  ưu (a). Khả  năng chịu muối NaCl (b). Khả 
năng   chịu   dịch   dạ   dày   (c).   Khả   năng   chịu   muối   mật   (d)  
……………………………

31


Hình 3.5.  Khả  năng sinh chất kích thích sinh trưởng IAA của chủng SP  
1901   sau   24,   48   và   72   giờ………………………………….
………………………

32

Hình 3.6. Khả  năng sinh IAA làm cho dung dịch chuyển từ màu vàng sang  
đỏ  (a).  Ảnh hưởng của chủng SP 1901 lên khả  năng sinh trưởng của cây  
ngô   sau   10   ngày   trồng   (b)   ………………………………….
…………………………

32

Hình 3.7. Vòng phân giải cơ chất của các enzyme ngoại bào. Amylase (a). 
Cellulase (b). Phytase (c). Protease (d). Xylanase (e) ………………………

36

Hình 3.8. Phản  ứng thử  nghiệm khả năng sinh enzyme trên thanh thử  API  
ZYM………………………………….………………………………………

37

Hình 3.9. Khả  năng sinh kháng sinh của chủng SP 1901 theo phương pháp  
khuếch tán trên thạch. Đĩa thạch cấy sẵn vi khuẩn  E. coli  (a). Vi khuẩn 
Shigella sp. (b). Vi khuẩn S. aureus (c) ………………………………………

 38

Hình 3.10.  Khả  năng sinh trưởng trên các môi trường khác nhau (a, b) và 

hoạt độ  xylanase ngoại bào (c, d) của chủng SP 1901 khi nuôi cấy trên 10 
loại   môi   trường   ở   các   giờ   khác   nhau………………………………….
……………….

39

Hình 3.11.  Hoạt độ  xylanase (U/ml) và nồng độ  protein (mg/ml) khi nuôi  39


cấy trên môi trường có bổ sung CMC và glucose và môi trường NA dịch thể 
tại

 

các

giờ

 

 

khác

 

nhau………………………………….

…………………………
Hình   3.12.  Hoạt   tính   amylase   và   protease   của   chủng   SP   1901   trên   môi 

trường   có   bổ   sung   CMC   và   glucose   và   môi   trường   NA   dịch 
thể……………………

40

Hình 3.13. Hoạt độ xylanase và nồng độ protein ở các phân đoạn trong sắc 
ký   trao   đổi   ion   gel   CM   Sepharose………………………………….
……………

41

Hình 3.14. Hoạt độ amylase và nồng độ  protein ở các phân đoạn trong sắc 
ký   trao   đổi   ion   gel   DEAE   Sepharose………………………………….
…………

42

Hình 3.15. Hoạt độ protease và nồng độ  protein ở các phân đoạn trong sắc  
ký   trao   đổi   ion   gel   CM   Sepharose………………………………….
……………

42

Hình 3.16. Hoạt độ xylanase ở các phân đoạn trong sắc ký lọc gel…………

43

Hình 3.17. Hoạt độ amylase ở các phân đoạn trong sắc ký lọc gel…………

44


Hình 3.18. Hoạt độ protease ở các phân đoạn trong sắc ký lọc gel…………

44

Hình 3.19. Điện di SDS­PAGE 2 mẫu xyl 29 và xyl 36……………………

45

Hình   3.20.  Nhiệt   độ   hoạt   động   tối   ưu   của   xyl   29,   xyl   36,   amylase   và 
protease

từ

 

chủng

 

 

SP 

1901……………………………………………………………

46

Hình 3.21. Khả  năng bền nhiệt của xyl 29, xyl 36, amylase và protease từ 
chủng SP 1901………………………………………………………………


47

Hình 3.22. pH hoạt động tối  ưu của xyl 29, xyl 36, amylase và protease từ 
chủng SP 1901………………………………………………………………

48

Hình 3.23.  Khả  năng bền axít của xyl 29, xyl 36, amylase và protease từ 
chủng SP 1901………………………………………………………………

49

Hình 3.24.  Khả  năng bền ion kim loại và hóa chất của xyl 29, xyl 36,  
amylase

 

và

 

protease

 

từ

1901…………………………………………………


 

chủng

 

SP 
50


Hình 3.25. Bản chạy sắc ký lớp mỏng để phân tích sản phẩm thủy phân từ 
cơ

 

chất

 

xylan

 

bởi

 

xylanase

 


của

1901……………………………………

CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT

BSA

Bovine serum albumin

CMC

Carboxymethyl cellulose

DNA

Deoxyribonucleic axít

DNS 

Dinitrosalicylic

IAA

Indole­3­acetic axít

PAGE

Polyacrylamide gel electrophoresis


PCR

Polymerase chain reaction

RNA

Ribonucleic axít

SDS

Sodium dodecyl sulfate

 

chủng

 

SP 
52


ĐẶT VẤN ĐỀ
Ngày nay, việc ứng dụng vi sinh vật vào trong đời sống và sản xuất đã trở 
nên rất phổ  biến. Con người đã và đang khai thác triệt để  nguồn tài nguyên vi  
sinh vật trong nhiều lĩnh vực khác nhau. Trong y học, nhờ có vi sinh vật mà con 
người đã tổng hợp thành công nhiều loại chế  phẩm như  vacxin, kháng sinh, 
hormone, vitamin giúp phòng ngừa và điều trị  nhiều loại bệnh cho con người.  
Trong nông nghiệp, nhiều chế  phẩm sinh học có nguồn gốc từ  vi sinh vật đã  

được sản xuất để diệt trừ sâu bệnh hại cây và làm phân bón vi sinh. Trong công  
nghiệp thực phẩm, con người đã  ứng dụng vi sinh vật để  sản xuất ra các loại  
protein, enzyme, chế phẩm probiotic và các loại thực phẩm lên men truyền thống. 
Ngoài ra, vi sinh vật còn được ứng dụng vào trong xử lý rác thải hữu cơ và nước  
thải trong sản xuất công nghiệp. Với khả năng chuyển hóa mạnh mẽ và sinh sản 
nhanh chóng, vi sinh vật đóng một vai trò to lớn trong hệ  sinh thái tự  nhiên và 
trong các hoạt động cải thiện chất lượng cuộc sống của con người.
Bacillus là một trong những vi sinh vật đầu tiên được phát hiện và mô tả 
trong giai đoạn đầu của tiến trình phát triển ngành vi sinh vật học ở cuối thế kỷ 
19. Đây là một chi lớn với gần 200 loài vi khuẩn hiếu khí, hình que và có khả 
năng sinh nội bào tử. Chúng phân bố  rộng rãi trong các hệ  sinh thái tự  nhiên, từ 
trên cạn đến dưới nước, từ nước ngọt đến nước mặn và từ  ven bờ đến đáy các  
Đại Dương. Ngoài các loài vi khuẩn gây bệnh cho con người như  B. anthracis và 
B. cereus, nhiều loài vi khuẩn thuộc chi Bacillus đặc biệt là nhóm B. subtilis có 
tính  ứng dụng cao trong nhiều lĩnh vực  như  y dược  học, nông nghiệp, công 
nghiệp thực phẩm và xử  lý môi trường. Do đó, các loài thuộc chi  Bacillus đã và 
đang ngày càng trở  thành những vi sinh vật quan trọng hàng đầu về  mặt  ứng  
dụng. 
Nhằm góp phần tìm hiểu thêm kiến thức về chi Bacillus nói chung và ứng 
dụng của các loài thuộc nhóm B. subtilis nói riêng, chúng tôi tiến hành đề tài:
“Nghiên cứu các đặc tính sinh học và tiềm năng ứng dụng của chủng  
vi khuẩn  Bacillus amyloliquefaciens  subsp.  plantarum  SP 1901 phân lập tại 
rừng Quốc gia Hoàng Liên” với 4 mục tiêu chính sau:
(i)

Tuyển chọn các chủng vi khuẩn thuộc nhóm B. subtilis phân lập tại rừng 
Quốc gia Hoàng Liên.

9



(ii)

Sử  dụng kỹ  thuật phân tích trình tự  đa gen để  phân loại chính xác các 
chủng vi khuẩn nghiên cứu đến cấp độ loài và dưới loài.

(iii)

Tìm hiểu các đặc tính sinh học quý của chủng vi khuẩn được lựa chọn.

(iv)

Tách chiết, tinh sạch và đánh giá sơ  bộ  đặc tính các enzyme ngoại của 
chủng vi khuẩn nghiên cứu.

10


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.

VI KHUẨN BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS

1.1.1. Tổng quan về Bacillus amyloliquefaciens
Bacillus   amyloliquefaciens  là   một   loài   vi   khuẩn   thuộc   nhóm  Bacillus  
subtilis [45]. B. subtilis được Christion Erenberg phát hiện lần đầu tiên vào năm  
1835, tên của loài vi khuẩn này lúc bấy giờ  là  “Vibrio subtilis”. Năm 1872, nhà 
sinh học người Đức Ferdinand Cohn đã đặt tên cho loài vi khuẩn này là Bacillus  
subtilis. Trong thế chiến thứ hai, tổ chức y học Nazi (Đức) đã dùng B. subtilis để 
phòng bệnh lị  cho các binh lính chiến đấu ở  Bắc Phi. Từ đó đến nay,  B. subtilis  

đã   được   nghiên  cứu  và   sử   dụng  rộng  rãi  trên   Thế   giới.   Thuật   ngữ   “Subtilis  
therapy” (điều trị  bằng subtilis) ra đời từ  đó và  B. subtilis  ngày càng được sử 
dụng rộng rãi để  phòng ngừa và điều trị  các loại bệnh về  rối loạn đường tiêu  
hóa, các chứng viêm ruột, viêm đại tràng và tiêu chảy. Hiện nay,  B. subtilis  đã 
được   chứng  minh  có   tiềm  năng  to  lớn   trong  nhiều   lĩnh  như   chăn  nuôi,   công  
nghiệp, xử lý môi trường [8].
Vi khuẩn B. subtilis có mặt ở hầu hết các loại môi trường tự nhiên. Phần  
lớn cư  trú trong đất, rơm rạ  và cỏ  khô nên được gọi là “trực khuẩn cỏ  khô”.  
Ngoài ra, chúng còn có mặt trong các nguyên liệu sản xuất như bột mì (trong bột 
mì  B. subtilis  chiếm 75­79% vi khuẩn tạo bào tử), bột gạo và trong các thực  
phẩm như mắm, tương và chao [12].
B. subtilis  có vai trò to lớn trong việc giữ   ổn định hệ  vi sinh vật đường 
ruột bằng cơ  chế cạnh tranh sinh tồn và khả  năng gây ức chế  các vi khuẩn gây  
bệnh khác do tác dụng của những sản phẩm ngoại bào của nó . Công trình nghiên 
cứu của Work và cộng sự  năm 1959 đã cho thấy B. subtilis có hệ thống enzyme 
tương đối hoàn chỉnh, có khả  năng thủy phân carbohydrate và protein. Ngoài ra, 
B. subtilis  còn có khả  năng tổng hợp một số  chất kháng sinh như  bacitracin,  

11


bacilysin, bacillomicin, bacillopectin, mycobacillin, subtilin và prolimicin. Những 
chất này có tác dụng ức chế sinh trưởng hoặc tiêu diệt một số vi sinh vật khác.  
Chúng tác dụng lên cả vi khuẩn gram âm, gram dương và nấm gây bệnh [9].
Nhóm  B. subtilis  gồm ít nhất 9 loài vi khuẩn là  B. amyloliquefaciens,  B. 
atrophaeus,  B.   axarquiensis,  B.   malacitensis,  B.   mojavensis,  B.   sonorensis,  B. 
tequilensis,  B. vallismortis và  B. velezensis. Kết quả  phân tích trình tự  đoạn gen 
16S rRNA cho thấy mức độ  tương đồng giữa chúng rất cao (> 99%). Bên cạnh  
đó, phương pháp phân loại truyền thống dựa trên hình dạng khuẩn lạc, hình thái 
tế  bào và bào tử  cũng như  các đặc điểm sinh hóa không có khả  năng phân tách 

các loài này. Vì vậy, 9 loài vi khuẩn trên thường được gọi theo một thuật ngữ 
chung là nhóm vi khuẩn B. subtilis [45].
Gần đây, bên cạnh việc phân tích trình tự gen 16S rRNA các nhà khoa học 
đã sử dụng phương pháp phân tích trình tự đa gen trong việc phân loại vi khuẩn  
đến cấp độ loài và dưới loài [25]. Đặc biệt trong nhóm B. subtilis, bằng phương 
pháp phân tích trình tự  đa gen và xây dựng cây phát sinh chủng loại, nhiều loài 
trong nhóm này đã được phân tách thành các loài phụ  như  B. subtilis được phân 
thành  B. subtilis  subsp.  subtilis,  B. subtilis  subsp.  spizizenii  và  B. subtilis  subsp. 
inaquosorum;  B. amyloliquefaciens  được phân thành  B. amyloliquefaciens  subsp. 
amyloliquefaciens và B. amyloliquefaciens subsp. plantarum [42].
Phân loại các loài trong nhóm B. subtilis nói chung và B. amyloliquefaciens 
nói riêng đòi hỏi phải có sự  tổ  hợp của nhiều phương pháp phân loại hiện đại.  
Hiện nay ở Việt Nam hầu như chưa có bất cứ một nghiên cứu nào công bố chính 
xác một loài vi khuẩn phân lập trong hệ sinh thái tự nhiên đến cấp độ dưới loài  
dựa trên việc phân tích trình tự đa gen.
1.1.2. Lịch sử phát hiện
B.   amyloliquefaciens  được   Fukomoto   phát   hiện   vào  năm  1943   nhờ   khả 
năng sinh  α­amylase và protease. Tại thời điểm đó, loài vi khuẩn này chưa được 
xếp loại trong bảng Danh pháp Vi khuẩn.  Cho đến năm 1975, theo điều 24a và  
28a   trong   Bộ   luật   Quốc   tế   về   Danh   pháp   Vi   khuẩn   thì   cái   tên   B. 
amyloliquefaciens mới được công bố [43].
Thời gian đầu, loài vi khuẩn này được xem là dòng khác của  B. subtilis hay 
loài phụ  B. subtilis subsp. amyoliquefaciens. B. amyloliquefaciens mang rất nhiều 

12


đặc điểm tương đồng với các loài B. subtilis, B. licheniformis và B. pumilus. Bằng 
các phương pháp phân loại thông thường rất khó để  phân biệt giữa chúng. Đến 
năm 1987, B. amyloliquefaciens mới được tách ra thành một loài riêng dựa vào kết 

quả  lai DNA lần lượt là 23, 15 và 5% so với các loài B. subtilis, B. licheniformis 
và B. pumilus [43].
Từ đó đến nay, nhiều chủng B. amyloliquefaciens phân lập từ  các hệ  sinh 
thái khác nhau ở các vùng địa lý khác nhau đã được công bố. Năm 2010, Borriss và  
cộng sự  đã chứng minh sự  khác biệt về  chỉ  số  lai DNA, chỉ  số so sánh hệ  gen  
bằng kỹ  thuật microarray, tính tương đồng của toàn bộ  hệ  genome và phổ  các  
chất hoạt tính lipopeptide và polypeptide giữa một nhóm  B. amyloliquefaciens 
DSM7 không có khả năng và một nhóm B. amyloliquefaciens FZB42 có khả năng 
sống nội cộng sinh rễ  cây thực vật. Dựa vào kết quả  thu được, Borriss đã đề 
xuất  tách  B.   amyloliquefaciens  thành   2   nhóm   loài   phụ   là  B.   amyloliquefaciens 
subsp.  plantarum  (có   khả   năng   sống   nội   cộng   sinh   rễ   cây   thực   vật)   và   B. 
amyloliquefaciens  subsp.  amyloliquefaciens  (không có khả  năng sống nội cộng  
sinh rễ cây thực vật) [23].
1.1.3. Phân loại
Theo phân loại của Bergey (1974) [24], B. amyloliquefaciens thuộc:
Giới:

Bacteria

Ngành : 

Firmicutes

Lớp: 

Bacilli

Bộ: 

Bacillales


Họ: 

Bacillaceae

Chi: 

Bacillus

Nhóm: 

Bacillus subtilis

Loài:

Bacillus amyloliquefaciens

1.1.4. Đặc điểm sinh học và phân bố trong tự nhiên
B. amyloliquefaciens  thường có mặt trong các mẫu đất tự  nhiên. Đây là 
loài vi khuẩn hiếu khí, hình que, Gram dương, sinh nội bào tử, có khả  năng di  

13


động và kích thước tế  bào 3,0­4,0 × 0,7­1,5 µm. Đặc biệt, có một số  chủng vi  
khuẩn B. amyloliquefaciens có khả năng sống nội cộng sinh rễ cây thực vật [23].
1.2.

ỨNG DỤNG CỦA BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS


1.2.1. Sản xuất enzyme công nghiệp
Loài vi khuẩn này được biết đến từ  rất sớm nhờ  khả  năng sản sinh các 
loại enzyme ngoại bào đa dạng. Từ  những năm 1943,  B. amyloliquefaciens  đã 
được sử  dụng để  sản xuất 2 loại enzyme công nghiệp là  α­amylase và protease  
[43]. Enzyme từ B. amyloliquefaciens như amylase, xylanase, cellulase, protease và 
lipase có nhiều đặc tính quý như  khả  năng hoạt động tốt trong dải pH rộng và  
khả  năng bền nhiệt. Do đó, enzyme từ   B. amyloliquefaciens  đã được  ứng dụng 
nhiều trong công nghiệp chế biến thực phẩm, công nghiệp dệt may, công nghiệp  
giấy và công nghiệp sản xuất chất tẩy rửa [21].
Bên cạnh đó, nhóm  B. amyloliquefaciens  sống nội cộng sinh rễ  cây thực 
vật có khả  năng sinh phytase đã được công bố và gen mã hóa phytase của chúng  
đã   được   biểu   hiện   thành   công   trên   chủng   B.   subtilis  MU331   [31].   Phytase   là 
enzyme phân giải phytate khó tan trong các loại rau, củ và quả thành myo­inositol 
và các dạng phosphate hòa tan dễ  hấp thụ  trong hệ  tiêu hóa động vật. Vì vậy, 
phytase đã được bổ sung vào thức ăn chăn nuôi nhằm nâng cao hiệu quả sử dụng  
thức ăn cho nhóm động vật dạ  dầy  đơn và làm giảm nguy cơ   ô nhiễm môi  
trường do hàm lượng phosphate dư thừa thải ra môi trường nước [29].
1.2.2. Sản xuất chất kháng sinh
Các loài thuộc nhóm B. subtilis  đã được biết đến nhờ  khả  năng sinh các 
chất kháng sinh kháng vi khuẩn và nấm gây bệnh hoặc sản sinh các sản phẩm 
trao đổi bậc hai khác như  chất kháng virus, chất kháng ung thư  và chất  ức chế 
miễn dịch [47]. Chất kháng sinh từ  Bacillus có bản chất là các peptide được tổng 
hợp qua ribosome (còn gọi là bacteriocin hoặc lantibiotics). Lantibiotics có phổ 
kháng khuẩn hẹp và thường  ứng dụng trong bảo quản thực phẩm. Nhiều chất  
kháng sinh có bản chất peptide tổng hợp không qua ribosome cũng đã được công  
bố   từ   loài  B.   amyloliquefaciens  như   bacylicin,   lipopeptide   (surfactin,   fengycin, 
iturin và bacillomycin) và polyketide  (difficidin, bacillaene  và macrolactin) [18] 
[38]. Bacylicin là chất dipeptide được tạo nên từ  L­analine và một amino axít 
hiếm L­anticapsin. Bacylicin có khả năng ức chế vi khuẩn  Erwinia amylovora gây 


14


bệnh cháy lá trên táo và lê. Surfactin hoạt động như  chất tẩy rửa trên màng tế 
bào. Chất này có tính kháng khuẩn, kháng virus và kháng viêm. Iturin, fengycin và 
bacillomycin là các lipopeptide vòng có tính kháng nấm gây bệnh cây. Nghiên cứu  
gần đây cho thấy, một số chất peptide giống iturin từ B. amyloliquefaciens có khả 
năng diệt Paenibacillus larvae gây bệnh trên ong mật [22]. Difficin là chất kháng 
sinh phổ rộng, chất này ức chế quá trình tổng hợp protein và có khả năng ức chế 
Erwinia amylovora. Bacillaene cũng là một chất ức chế tổng hợp protein ở tế bào  
prokaryotes. Macrolactin là một chất kháng khuẩn Gram dương.
1.2.3. Sản xuất phân bón vi sinh
Một số chủng B. amyloliquefaciens sống nội cộng sinh trên rễ cây thực vật 
có khả năng sinh chất kích thích sinh trưởng Indole­3­acetic axít (IAA). Chất này 
sẽ tác động tích cực đến những quá trình sinh lý của thực vật như quang hướng  
động, địa hướng động, ưu thế chồi ngọn và sự tượng rễ. Yao và cộng sự (2012)  
đã thử nghiệm bổ sung chế phẩm chứa vi khuẩn  B. amyloliquefaciens FZB24 lên 
cây bông. Kết quả cho thấy, sản lượng bông thu hoạch được tăng 30% so với đối  
chứng bổ sung đạm NPK [56]. Trong nghiên cứu Idris và cộng sự (2007), tác giả 
đã thử  khả  năng sinh chất kích thích sinh trưởng indole­3­acetic axít  của chủng  
vi khuẩn B. amyloliquefaciens FZB42 lên bèo tấm. Kết quả cho thấy, trọng lượng 
tươi của bèo tấm khi thu hoạch có sự gia tăng đáng kể so với đối chứng. Loài vi 
khuẩn  B. amyloliquefaciens  đã được chứng minh có tiềm năng  ứng dụng trong 
sản xuất phân bón vi sinh nhờ  khả  năng sinh các chất kháng nấm và chất kích  
thích sinh trưởng thực vật [31].
1.2.4. Sản xuất chế phẩm probiotics
B. amyloliquefaciens là những vi sinh vật an toàn (Generally recognized as 
safe; GRAS) và có thể  dùng như  probiotics để  bổ  sung vào thức ăn hoăc n
̣ ươć  
uông nh

́
ằm cân băng hê vi sinh đ
̀
̣
ường ruôt, qua đo ngăn ng
̣
́
ừa va phong chông cac
̀ ̀
́
́ 
bênh tiêu chay th
̣
̉
ương găp. Ngoai ra, vi sinh v
̀
̣
̀
ật trong probiotics con tăng c
̀
ường  
kha năng chuy
̉
ển hóa lactose, điêu hoa hê thông miên dich va tăng c
̀ ̀ ̣
́
̃ ̣
̀
ường sức khoẻ  
con ngươi [48] [49]. Nhi

̀
ều bằng chứng cho thấy  B. amyloliquefaciens đã được sử 
dụng trong chế phẩm probiotics [53].
1.3.

15

MỘT SỐ ENZYME CÔNG NGHIỆP QUAN TRỌNG


1.3.1. Xylanase
1.3.1.1. Cấu trúc xylan
Xylan là thành phần chính của hemicellulose và là polysaccharide phổ biến  
thứ  hai trong tự  nhiên chỉ  sau cellulose. Chúng được tìm thấy trong thành tế  bào  
thực vật [50].
Xylan là một polysaccharide không đồng nhất, bao gồm các gốc D­xylose 
liên kết với nhau bằng liên kết β­1,4­xylanosidic giữa đường xylopyranose với 
acetyl, arabinosyl và glucuronisyl [39].

Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của xylan và các vị trí tấn công của hệ thống enzyme 
xylanolytic [34].
Thực vật trên cạn có xylan là chuỗi D­xylosyl được nối với nhau bằng liên 
kết β­1,4, trong khi tảo biển tổng hợp xylan với một cấu trúc hóa học khác gồm 
các monomer D­xylose nối với nhau bằng liên kết  β­1,3.  Thông thường, xylan 
chiếm khoảng 15­30% trọng lượng khô của cây hạt kín và khoảng 7­15% của 
cây hạt trần. Đặc biệt trong cây lá rộng, xylan chiếm tới 35% tổng trọng lượng 
khô của chúng [35].
Do xylan có cấu trúc không đồng nhất, để thủy phân cấu trúc này cần phải  
có hệ thống enzyme xylanolytic. Tất cả các enzyme trong hệ thống này tác động  
tương hỗ với nhau để phân giải xylan thành các phân tử đường [34].

1.3.1.2. Nguồn sản sinh xylanase

16


Xylanase được sinh tổng hợp bởi nấm, vi khuẩn, xạ  khuẩn và động vật 
nguyên sinh. Trong các loài vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp xylanase, nấm,  
vi khuẩn và xạ khuẩn là các nhóm quan trọng nhất [57].
Các loại xylanase được sinh ra bởi vi khuẩn và nấm sợi  ưa kiềm có khả 
năng chịu nhiệt tốt hơn và do đó chúng được ứng dụng rộng rãi và cho hiệu quả 
cao hơn trong công nghiệp [39].
1.3.1.3. Đặc tính hoạt động của xylanase
Axít glutamic là axít amin quyết định sự  hoạt động của xylanase [10]. Sự 
thủy phân xylan đòi hỏi sự hỗ trợ hoạt động của các thành phần trong hệ thống 
enzyme xylanolytic (hình 1.1.).

Vai trò của các enzyme chính trong hệ  thống enzyme xylanolytic cụ  thể 
như sau:
 β ­1,4­endo­xylanase và 
 
 ferulic axít esterase
 
 
Enzyme β­1,4­endo­xylanase và ferulic axít esterase là hai enzyme có vai trò 
chủ đạo trong quá trình thủy phân mạch chính của xylan. Trong đó,  β ­1,4­endo­
xylanase tấn công vào liên kết xylosidic của mạch chính còn ferulic axít esterase 
tấn công các liên kết xylosyl còn lại và giải phóng ra các xylooligosaccharide. Hai 
enzyme này là thành phần chính của hệ enzyme xylanolytic do các vi sinh vật sinh  
ra,   chẳng   hạn   như   các   loài   thuộc  Trichoderma,  Aspergillus,  Schizophyllum, 
Bacillus, Clostridium và Streptomyces [55].

Ferulic   axít  esterase  là   enzyme   ngoại  bào  exoglycosidase   thủy  phân  các 
oligosaccharide ngắn và xylobiose thành đường xylose [57]. Trong số các cơ chất, 
xylobiose thường là cơ chất tốt nhất [ 39]. Hầu hết các ferulic axít esterase được 
nghiên cứu cho đến nay đều bị   ức chế  ngược bởi xylose, một sản phẩm thủy  
phân của chúng.
 α ­L­Arabinofuranosidase
 
 
α­L­Arabinofuranosidase có khả năng thủy phân cả hai liên kết 1,3 và 1,5­
α­L­arabinofuranosyl   trong   arabinoxylan   giải   phóng   arabinose.   Khi   giải   phóng 

17


arabinose,   mạch   chính   xylan   không   bị   thủy   phân   và   không   tạo   ra 
xylooligosaccharide [55].
 α ­D­Glucuronidase
 
 
α­D­Glucuronidase phân giải liên kết  α­1,2 giữa axít glucuronic và gốc 
xylose trong phân tử  glucuronoxylan. Tính đặc hiệu của α­glucuronidase là khác 
nhau phụ thuộc vào nguồn gốc của enzyme [39].
 Acetyl xylan esterase 
Acetyl xylan esterase là enzyme có thể  cắt  đứt liên kết giữa các nhóm 
acetyl với 2 hoặc 3 vị trí của gốc xylose và góp phần đóng vai trò thủy phân xylan  
trong tự nhiên [34]. Enzyme này thường được sinh ra từ một số loài vi khuẩn và 
nấm.
1.3.1.4. Ứng dụng của enzyme xylanase
Xylanase được ứng dụng trong sản xuất nước hoa quả và làm trong rượu.  
Hơn nữa, xylanase còn có thể  hoạt động trong điều kiện nhiệt độ  cao (khoảng 

60­70oC) nên có thể ngăn chặn được sự nhiễm vi sinh vật khi chế biến nước hoa  
quả ở nhiệt độ cao [27].
Xylanase  còn được   ứng  dụng  trong công nghiệp thực  phẩm như   trong  
công nghệ sản xuất bánh nướng, hỗ trợ quá trình đường hóa lignocellulose (một 
polysaccharide khó phân hủy trong thành tế bào thực vật). Xylanase còn được sử 
dụng để loại lignin khỏi bột giấy.
Trong công nghiệp sản xuất giấy và  vải sợi, xylanase tham gia vào quá 
trình tách xylan và lignin để  thu cellulose một cách nhanh chóng và dễ  dàng.  
Xylanase giúp tẩy màu và làm mềm sợi lanh và sợi gai [11].
Xylan là chất xơ  khó phân hủy trong thực vật và là chất khó tiêu trong 
thức ăn chăn nuôi. Vì thế việc bổ sung xylanase  vào khẩu phần ăn của gia súc và 
gia cầm sẽ  giúp chúng dễ  tiêu hóa và dễ  hấp thụ thức ăn, đồng thời góp phần 
làm giảm ô nhiễm môi trường.
1.3.2. α ­amylase
1.3.2.1. Cấu tạo tinh bột và glycogen

18


Cơ  chất tác dụng của amylase và tinh bột và glycogen. Tinh bột là nhóm 
carbohydrate ở thực vật. Chúng có chủ yếu ở trong các loại củ và hạt như khoai  
lang, khoai tây, sắn, củ mì và các loại hạt ngũ cốc. Tinh bột từ  mọi nguồn khác  
nhau đều có cấu tạo từ 20­30% amylose và 70­80% amylopectin.
Amylose được cấu tạo từ  200­1.000 phân tử  D­glucose nối với nhau bởi  
liên kết  α­1,4­glucoside tạo thành một mạch dài không phân nhánh. Amylopectin 
được cấu tạo từ  600­6.000 phân tử  D­glucose nối với nhau bởi liên kết  α­1,4­
glucoside và α­1,6­glucoside tạo thành mạch có nhiều nhánh.

Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của amylose và amylopectin [14].


19


Glycogen được ví như  tinh bột của động vật. Glycogen có cấu tạo giống 
với tinh bột nhưng mức độ  phân nhánh mạnh hơn. Cấu tạo của chúng gồm các  
phân tử  glucose nối với nhau bằng liên kết  α­1,4­glucoside.  Ở  các vị  trí phân  
nhánh glucose nối với nhau băng liên kết  α­1,4­glucoside. Glycogen có  ở  động 
vật và người, chúng tập trung chủ yếu ở gan.
1.3.2.2. Nguồn sản sinh α­amylase
Amylase là hệ  enzyme rất phổ  biến  ở  nhiều sinh vật. Vi khuẩn và nấm 
sợi là những nhóm sinh amylase chính. Amylase của vi khuẩn có  ưu điểm chịu  
nhiệt tốt hơn của nấm sợi, chúng có thể hoạt động ở nhiệt độ 85­95oC [34].
Các enzyme này thuộc nhóm enzyme thủy phân. Có 6 loại amylase được 
xếp vào 2 nhóm: endoamylase và exoamylase. Endoamylase gồm  α­amylase và 
nhóm enzyme khử nhánh. Exoamylasse gồm có β­amylase và glucoamylase.
1.3.2.3. Đặc tính hoạt động của α­amylase
Đây là một enzyme kim loại, nếu không có sự  hiện diện của ion canxi  
trong phân tử enzyme thì chúng sẽ không hoạt động được. α­amylase có khả năng 
phân cắt các liên kết  α­1,4­glucoside nằm  ở phía bên trong phân tử  cơ chất một 
cách ngẫu nhiên không theo một trật tự  nào cả.  α­amylase không chỉ  thủy phân  
hồ tinh bột mà chúng còn có khả năng thủy phân cả hạt tinh bột nguyên thủy.
Quá trình thủy phân tinh bột bở   α­amylase là quá trình xảy ra qua nhiều 
giai đoạn: dextrin hóa    đường hóa    phân cắt polyglucose tạo polyglucose 
collagen  sản phẩm thủy phân gồm maltotetrose, maltotriose và maltose.
Ở  giai đoạn đầu (giai đoạn dextrin hóa): chỉ  một số  phân tử  cơ  chất bị 
thủy phân tạo thành một lượng lớn dextrin phân tử thấp (α­dextrin), độ nhớt của  
hồ tinh bột giảm nhanh (các amylose và amylopectin đều bị dịch hóa nhanh).
Sang giai đoạn 2 (giai đoạn đường hóa): các dextrin phân tử thấp tạo thành 
bị  thủy phân tiếp tục tạo ra các tetra­trimaltose không cho màu với iodine. Các 
chất   này   bị   thủy   phân   rất   chậm   bởi   α­amylase   cho   tới   disaccharide   và  

monosaccharide. Dưới tác dụng của  α­amylase, amylose bị  phân giải khá nhanh 
thành oligosaccharide gồm 6­7 gốc glucose.

20


Sau   đó   các   polyglucose   này   bị   phân   cắt   tiếp   tục   tạo   nên   các   mạch 
polyglucose   collagen   cứ   ngắn   dần   và   bị   phân   giải   chậm   đến   maltotetrose, 
maltotriose và maltose.
Sau phản ứng, sản phẩm thủy phân của amylose chứa 13% glucose và 87% 
maltose. Tác dụng của α­amylase lên amylopectin cũng xảy ra tương tự nhưng vì 
không phân cắt được liên kết  α­1,6­glycoside  ở  chỗ  mạch nhánh trong phân tử 
amylopectin nên dù có chịu tác dụng lâu thì sản phẩm cuối cùng ngoài các đường 
nói trên còn có dextrin phân tử thấp và isomaltose [1].
1.3.2.4. Ứng dụng của α­amylase
Với khả  năng thủy phân tinh bột nên  α­amylase đã được con người sử 
dụng từ  rất sớm. Trong công nghiệp thực phẩm, người ta thường bổ  sung  α­
amylase vào bột chế  biến trong quá trình sản xuất bánh kẹo. Hoạt động của  α­
amylase sẽ làm tăng lượng đường khử, lượng đường khử này sẽ tham gia vào các 
phản ứng oxy hóa khử. Kết quả của quá trình đó sẽ tạo cho bánh kẹo có mùi vị 
và màu hấp dẫn [2].
Cả   α­amylase và  β­amylase đều được sử  dụng trong sản xuất bánh mì. 
Các loại enzyme này tham gia thủy phân tinh bột thành đường, nhờ đó nấm men 
Saccharomyces cerevisiae  sẽ  dễ  dàng chuyển hóa chúng thành cồn và CO2, làm 
tăng thể tích, tạo ra màu sắc và mùi vị tốt cho bánh [2].
Trong sản xuất bia, các nhà sản xuất thường sử dụng  α­amylase có trong  
mầm đại mạch để  thủy phân tinh bột có sẵn trong đó. Cồn công nghiệp được  
sản xuất bằng phương pháp lên men. Cồn được lên men từ  nguyên liệu chứa  
đường hoặc từ nguyên liệu chứa carbohydrate. Trong đó, α­amylase đóng vai trò  
chuyển hóa tinh bột để tạo thành dextrin [15].

1.3.3. Protease
Protease là nhóm các enzyme có khả  năng phân giải các liên kết peptide  
trong phân tử protein tạo thành các đơn vị nhỏ như các đoạn peptide hay các phân  
tử amino axít [5].

21


Hình 1.3. Phản ứng thủy phân liên kết peptide của chuỗi polypeptide [34].
1.3.3.1. Nguồn sản sinh protease
Protease được sản xuất chủ yếu từ 3 nguồn chính là động vật, thực vật và 
vi sinh vật. Trong đó, nguồn enzyme từ vi sinh vật là phong phú nhất và là nguồn  
nguyên liệu thích hợp nhất để sản xuất enzyme ở quy mô công nghiệp [16]. Ngày  
nay, hướng sản xuất enzyme từ  vi sinh vật đang dần thay thế  enzyme từ  động  
vật và thực vật bởi: tốc độ  sinh sản của vi sinh vật nhanh, enzyme được tách  
chiết từ  vi sinh vật có hoạt tính cao và vi sinh vật là giới sinh vật phù hợp cho  
sản xuất theo quy mô công nghiệp. Các đối tượng vi sinh vật thường được dùng 
để tách chiết protease là nấm mốc, vi khuẩn và xạ khuẩn.
1.3.3.2. Phân loại protease
Protease được xếp vào nhóm enzyme thủy phân. Tuy nhiên, do sự đa dạng 
về  đặc tính hoạt động và cấu trúc nên protease còn được phân loại theo nhiều  
cách khác nhau dựa vào pH hoạt động tối  ưu hay vị  trí hoạt động trong tế  bào  
[51].
 Dựa vào pH hoạt động tối  ưu : protease được phân thành protease axít, 
protease trung tính và protease kiềm tương ứng với pH tối ưu < 7, = 7 và >7.
 Dựa vào vị trí phân bố trong tế bào : protease bao gồm protease nội bào và 
ngoại bào (enzyme được tiết ra bên ngoài tế  bào). Trong giới hạn luận văn này 
chúng tôi tập trung nghiên cứu các protease ngoại bào.
 Theo vị  trí xúc tác : protease được chia thành hai nhóm: exopeptidase và 
endopeptidase. Exopeptidase là những enzyme có khả  năng phân cắt từ  hai đầu  

tận cùng của chuỗi polypeptide. Endopeptidase là những enzyme có khả  năng 
phân cắt liên kết peptid nằm phía trong phân tử protein [44].
1.3.3.3.  Ứng dụng của protease

22


Trong công nghiệp chế  biến thủy sản, đồ  hộp và đồ  đông lạnh, protease 
được dùng làm mềm thịt nhờ khả năng thủy phân một phần protein có trong thịt.  
Hoàn toàn có thể sử dụng enzyme này trong sản xuất bột đạm thủy phân [3].
Trong công nghệ chế biến sữa, protease tham gia vào quá trình thủy phân  
protein trong sữa tạo thành các sản phẩm như pepton, axít amin. Protease có mặt 
tự nhiên trong sữa và chúng không bị phân hủy hoàn toàn khi thanh trùng ở nhiệt 
độ 76­78oC. Trương Thị Hòa và cộng sự (1994) đã thử  nghiệm sử  dụng protease 
được tách chiết từ Aspergillus oryzae để thủy phân protein trong hạt ngũ cốc, tạo 
điều kiện xử lý bia tốt hơn [7].
Trong công nghiệp thuộc da, trước khi bị  xử  lý da thường bị  cứng do có 
nhiều collagen. Protease được sử  dụng làm mềm da nhờ  khả  năng  thủy phân 
collagen. Quá trình đó đã loại bỏ khỏi da các chất nhớt và làm cho da có độ mềm  
dẻo nhất định.
Ngoài   ra,   protease  còn  được  phối   hợp   với   amylase   tạo  thành  hỗn   hợp 
enzyme  được bổ  sung vào thức ăn gia súc làm tăng  kha năng tiêu hóa cao, có ý
̉
 
nghĩa lớn trong chăn nuôi gia súc và gia cầm.

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. THIẾT BỊ VÀ MÁY MÓC ĐàSỬ DỤNG

23



Các thiết bị và máy móc của bảo tàng giống chuẩn vi sinh vật, Viện Vi  
Sinh Vật và Công Nghệ Sinh Học, Đại Học Quốc Gia Hà Nội.
Máy  đọc  trình  tự   ADN   3100  Avant  Genetic   Analyzer  (Applied 
Biosystem, Mỹ).
Máy khuếch đại gen Gene Amp PCR System 9700 (Eppendorf,  
Mỹ). 
Máy ly tâm lạnh Centrifuge C30P (Satorius Group, Đức).
Máy đo quang phổ UV 1600(Thermo, Mỹ).
Máy lắc ổn nhiệt (B.Braun, Mỹ).
Kính hiển vi (Olympus, Nhật).
Máy ly tâm 6K15 (Sigma, Đức).
Máy ly tâm Centrifuge 5417R (Eppendorf, Đức).
Bộ chạy điện di đứng cho protein (Biorad, Mỹ).
Máy lọc tiếp tuyến 17525­001 (Sartorius Stedim, Mỹ).
2.2.

NGUYÊN LIỆU

2.2.1. Chủng vi sinh vật
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng bộ vi sinh vật được phân lập tại  
rừng Quốc gia Hoàng Liên và các ruộng canh tác nông nghiệp lân cận [13].
2.2.2. Môi trường
 Môi trường hoạt hóa : Môi trường NA (g/l): pepton­5; cao thịt­3; thạch­16.
 Môi  trường  nuôi  giống  khởi   động : Môi  trường  NA   dịch thể   (như   môi 
trường NA nhưng không có thạch).
 Môi trường nuôi cấy : Môi trường khoáng (g/l): CaCl2­0,5; NH4NO3­5; KCl­
0,5; MgSO4.7H2O­0,25; FeSO4.7H2O­0,01; MnSO4.H2O­0,01; KH2PO4­1 [33] 
có bổ sung một trong số các nguồn carbon: D­glucose, tinh bột tan, casein,  

CMC, xylan, chitin, tributyrin và pectin.

24


2.3.

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1. Nuôi cấy giống khởi động
Để  nuôi cấy khởi động chủng giống, các chủng vi khuẩn được nuôi cấy  
qua đêm trên môi trường NA dịch thể ở nhiệt độ 37oC trong 24 giờ.
2.3.2. Phân tích trình tự đa gen
2.3.2.1. Tách chiết DNA của vi khuẩn
Phương pháp tách chiết DNA của vi khuẩn được thực hiện theo Sakiyama 
và cộng sự  (2009) [46].  Vi khuẩn đuợc nuôi trên môi trường dịch thể  với thời  
gian thích hợp. Sau đó hút 1,5 ml dịch vào  ống eppendorf và ly tâm  ở  15.000 v/p 
trong 15 phút để  lấy sinh khối tế  bào. Hòa sinh khối tế  bào trong 100   µl  TAE. 
Thêm 0,4 mg lysozyme rồi trộn đều, ủ ở 37oC trong 1 giờ. 
Thêm 100  µl  SDS 10% (w/v), trộn đều 2­3 phút,  ủ   ở  37oC trong 30 phút. 
Thêm một thể tích tương đương phenol : chloroform : isoamyl alcohol, trộn đều. 
Ly tâm 15.000 v/p trong 15 phút. Chuyển lớp dịch phía trên sang  ống eppendorf 
khác.
Bổ sung 8 µl RNAse 3 mg/ml, trộn đều, ủ ở 37oC trong 30 phút. Thêm  12 
µl proteinase K (5 mg/ml), trộn đều,  ủ   ở  56oC trong 15 phút. Tiếp tục thêm 1/10 
thể tích natri acetate 3M và 1 ml ethanol 100% rồi trộn đều. Đặt hỗn hợp trong đá 
30 phút.
Ly tâm hỗn hợp 15.000 v/p trong 15 phút. Hút bỏ  lớp dịch trên, rửa phần  
tủa bằng ethanol 70%. Làm khô phần tủa bằng máy cô quay chân không. Hoà tan 
tủa trong 50­100  l nước MQ hoặc đệm TAE.

2.3.2.2. Phản ứng khuếch đại DNA
Thành phần phản  ứng khuếch đại DNA bao gồm 10 µl đệm PCR 10x, 10 
µl dNTP 2 mM, 2 µl mồi xuôi, 2 µl mồi ngược, 2 µl tag polymerase, 1­2 µl DNA 
khuôn và bổ sung H2O đến thể tích tổng là 25 µl. 
Trình tự cặp mồi đã sử dụng (xem phụ lục B).
Chu trình nhiệt của của phản  ứng này bao gồm 30 chu kỳ, mỗi chu kỳ 
gồm 3 bước: (i) gây biến tính DNA bằng cách đun hỗn hợp ở 95oC trong 30 giây, 
(ii) sau đó gắn mồi bằng cách hạ  nhiệt độ  xuống 56oC trong 15 giây, (iii) tiếp 

25