KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN,
ỨC CHẾ ENZYME XANTHINE OXIDASE, KHÁNG OXY HÓA CỦA CAO
CHIẾT ETHANOL TỪ HOA VÀ LÁ CÂY ĐU ĐỦ ĐỰC (CARICA PAPAYA L.)

CHUYÊN ĐỀ TỐT NGHIỆP

Đắk Lắk, năm 2018


KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN,
ỨC CHẾ ENZYME XANTHINE OXIDASE, KHÁNG OXY HÓA CỦA CAO
CHIẾT ETHANOL TỪ HOA VÀ LÁ CÂY ĐU ĐỦ ĐỰC (CARICA PAPAYA L.)

Đắk Lắk, năm 2018


MỤC LỤC

DANH MỤC VIẾT TẮT
- IC50:
- DPPH:
- XO:
- Us:
- DMSO:
- Ampi :
- XDH:
- SPSS:
- E. faecalis :
- E. aerogenes:
- P. aeruginosa:
- S.aureus

- E.coli

Haft maximal inhibitory cocentration
2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl
Enzyme xanthine oxidase
Acid usric
Dimethyl sulfoxide
Ampicillin
Xanthine dehydrogenase
Statistical Package for the Social Sciences
Enterococcus faecalis
Enterobacter aerogenes
Pseudomonas aeruginosa
Staphylococcus aureus
Enterobacteriaceae

3


DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1. 1: Cây đu đủ đực
Hình 1. 2: Vi khuẩn Enterococcus faecalis[9]
Hình 1. 3: Vi khuẩn Staphylococus aureus[10]
Hình 1. 4:Vi khuẩn Escherichia coli[11]
Hình 1. 5: Vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa [14]
Hình 1. 6: Vi khuẩn Enterobacter aerogenes [15]
Hình 3. 1: Tỉ lệ enzyme oxidase bị ức chế(%)

4



DANH MỤC BẢNG

5


MỞ ĐẦU
1.Đặt vấn đề

Đu đủ là cây có nguồn gốc từ miền nam Mexico qua miền đông Trung Mỹ và Nam
Mỹ. Loài cây này được người Tây Ban Nha đưa tới Philippines vào khoảng năm 1550.
Từ đây nó được đưa vào khu vực nhiệt đới châu Á, châu Phi. Ngày nay, đu đủ được trồng
ở phần lớn các nước nhiệt đới như Brasil, Ấn Độ, Nam Phi, Sri Lanka, Philippines,
Việt Nam.
Theo y học cổ truyền Ấn Độ các phần khác nhau của cây đu đủ gồm trái (chín và
chưa chín), hạt, vỏ cây, lá, rễ và nhựa được sử dụng để điều trị một số bệnh như bệnh
vàng da, bệnh dạ dày, sốt dengue, giun tròn, tiết niệu, cầm máu, giảm cân, huyết áp cao,
rắn cắn để loại bỏ chất độc. Tương tự, trà chiết xuất từ lá đu đủ có công dụng như một tác
nhân tiêu diệt khối u.
Cây đu đủ có ba dạng cơ bản là cái, đực và lưỡng tính được thể hiện trong hoa của
cây. Không thể xác định giới tính của cây đu đủ bằng cách nhìn vào hạt giống hoặc cây
con non.Thực tế thì những cây đu đủ đực thường bị loại bỏ vì không sản xuất ra trái, vì
vậy không mang lại hiệu quả kinh tế. Vì vậy những giá trị khác mà cây đu đủ đực đem lại
thường bị bỏ qua. Cho đến nay cây đu đủ đực chỉ được dùng trong các bài thuốc dân
gian để trị sốt rét, bệnh về tiêu hóa, sốt xuất huyết, ung thư. Một số nghiên cứu gần đây
cho thấy trong lá và hoa cây đu đủ đực chứa nhiều các hợp chất có hoạt tính như
flavonoid, glucosides cyanogenic, leucoacyanins, alkaloids.
Nhằm tìm hiểu và góp phần khai thác thêm nhiều lợi ích của cây đu đủ đực, chúng
tôi chọn đề tài: “Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn, ức chế enyme xanthine oxidase,
kháng oxy hóa của cao chiết ethanol từ hoa và lá cây đu đủ đực (Carica papaya L.) ”.

2. Mục tiêu đề tài
Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn, ức chế enzyme xanthine oxidase, kháng oxy hóa của
cao chiết của lá và hoa của cây đu đủ đực (Carica papaya L.).
6


3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
3.1. Ý nghĩa khoa học
Nghiên cứu và bước đầu đánh giá giá trị dược học của cây đu đủ đực làm cơ sở cho
những nghiên cứu tiếp theo về hoạt tính sinh học của đu đủ.
3.2. Ý nghĩa thực tiễn
Việc nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn, ức chế enzyme xanthine oxidase, kháng
oxy hóa của cao chiết lá và hoa của đu đủ đực có vai trò quan trọng trong việc sử dụng và
khai thác giá trị dược liệu loài cây này trong cộng đồng.
4. Giới hạn của đề tài
Do thời gian có hạn nên chúng tôi bước đầu nghiên cứu hoạt tính kháng vi khuẩn,
Staphylococcus

aureus,

Escherichia

coli,

Enterococcus

faecalis,

Pseudomonas


aeruginosa,
Enterobacter aerogenesức chế xanthine oxidase, kháng oxi hóa của cao chiết của lá và
cây đu đủ đực.

7


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.

Giới thiệu về cây đu đủ đực

Hình 1. 1: Cây đu đủ đực
Đu đủ có nguồn gốc từ vùng đồng bằng của Trung Đông, từ Mexico đến Panama
(Nakasone & Paull 1998). Đu đủ được phân bố ở vùng Caribê và Đông Nam Á
(Philippines), trong chuyến thám hiểm Tây Ban Nha vào thế kỷ 16 nó đã được đưa đến
Ấn Độ, Thái Bình Dương và Châu Phi (Villegas 1997). Papaya đã được người Tây Ban
Nha đưa đến Hawaii vào đầu những năm 1800 trong chuyến thám hiểm của Don
Francisco Marin và trở thành một cây trồng xuất khẩu của Hawaii vào năm 1948 (Fitch
2005). Ngày nay, đu đủ được phân phối rộng rãi khắp vùng nhiệt đới và ấm hơn các vùng
cận nhiệt đới của thế giới (Villegas 1997) và đã trở nên phổ biến trong nhiều khu vực
(Morton 1987) [5].
Đu đủ thuộc họ Caricaceae là một loài thực vật đơn tính. Là cây tơ ngắn, phát triển
nhanh, không hoặc ít khi có nhánh cao từ 3–10 m. Lá to hình chân vịt, cuống dài, đường
kính 50–70 cm, có khoảng 7 khía. Chúng chỉ phát triển nhánh khi bị thương. Hoa có màu
8


trắng hay xanh, đài nhỏ và có năm cánh. Đu đủ đực, cây chỉ mang toàn hoa đực trên phát
hoa. Phát hoa có cuống dài và phân nhánh. Những cây đu đủ đực có đặc điểm là các hoa

đốm dài, lõm, hoa nhiều, có hoa màu đậm, không có nhụy hoa.
Đu đủ sống được trên các loại đất có độ thấm nước tốt với độ sâu lớp đất mặt tối
thiểu là 0,5 m, độ pH 5,5-6,5 và tránh gió mạnh (O'Hare 1993, Elder và cộng sự, 2000a).
Đu đủ phát triển tốt nhất trên đất có hàm lượng hữu cơ cao ở vùng nhiệt đới nhưng thích
nghi với nhiều loại đất (Benson & Poffley 1998) ngoại trừ đất sét nặng (O'Hare 1993).
Nhiều nghiên cứu đã được tiến hành để đánh giá các hoạt động sinh học của các bộ
phận khác nhau của đu đủ Carica bao gồm trái cây, chồi, vỏ, hạt, rễ. Quả đu đủ, cũng như
tất cả các bộ phận khác của cây, chứa nước ép sữa gọi là papain đã được sử dụng để chế
biến thịt. Trong lá đã tìm thấy các hợp chất tự nhiên (annonaceous acetogenins) có hoạt
tính chống khối u và bọ cánh cứng. Bên cạnh đó, các nghiên cứu cũng được tiến hành
trên hoa. Cây đu đủ có ba dạng cơ bản là cái, đực và lưỡng tính được thể hiện trên hoa
của cây. Không thể xác định giới tính của cây đu đủ bằng cách nhìn vào hạt giống hoặc
cây con non. Cây đu đủ phải cao tới 2-5 mét trước khi hoa phát triển thì giới tính của cây
mới có thể được xác định.
Lá đu đủ có nhiều công dụng. Ở một số vùng của châu Á, lá non của đu đủ được
hấp và ăn như rau bina. Bác sĩ Sanath Hettige, người đã tiến hành nghiên cứu trên 70
bệnh nhân sốt xuất huyết, cho biết nước ép papaya giúp tăng bạch cầu và tiểu cầu, bình
thường hóa đông máu, và sửa chữa gan. Các nghiên cứu gần đây về chiết xuất trà đu đủ
đã chứng minh sự ức chế tăng trưởng tế bào ung thư. Lá đu đủ được làm thành trà như
một phương pháp điều trị bệnh sốt rét và chống thoái hóa. Lá của cây đu đủ tạo điều kiện
thuận lợi cho việc tiêu hóa, chúng có chứa các hợp chất hoá học của carpaine, chất làm
chết các vi sinh vật thường gây trở ngại cho chức năng tiêu hóa. Ngoài ra, lá đu đủ còn có
một số công dụng khác như: là một loại thuốc trị mụn trứng cá, tăng sự thèm ăn, giảm
đau kinh nguyệt, làm mềm thịt, giảm buồn nôn [4].
9


1.2. Hoạt tính sinh học của cây đu đủ đực
1.2.1. Hoạt tính kháng khuẩn
Các thử nghiệm về mặt hoá học cho thấy có sự hiện diện của flavonoid, sterole,

triterpenoid, tannin, polyphenol và glycosid có trong chiết xuất hoa đu đủ đực. Mặt khác,
alkaloids, saponin, và anthraquinone không được phát hiện bằng cách sử dụng quy trình
khảo nghiệm cụ thể. Sự hiện diện của các polyphenol, flavonoid và glycosid với các phát
hiện trước đây về bột giấy và lá của cây đu đủ[3]. Trong số các chất phytochemicals hiện
nay gồm có tannin, polyphenols, flavonoid và terpenoid là những hợp chất hoạt tính sinh
học quan trọng nhất trong. Các chất polyphenol như flavonoid có tính chống oxy hóa,
chống dị ứng, chống viêm, chống vi khuẩn, chống ung thư hoạt tính [9]. Sự hiện diện của
một số hợp chất hoạt tính sinh học này đã khẳng định rằng cây đu đủ có thể có ý nghĩa về
mặt dược học.
Harrison Abia đã nghiên cứu hiệu quả của các phương pháp điều trị bằng đu đủ
Carica phụ thuộc vào số lượng các chất hoá học khác nhau có trong chế phẩm. Số lượng
các chất hoá học khác nhau trong trái cây, mủ, lá và rễ và thay đổi theo phương pháp
chiết, tuổi thực vật, giống cây trồng và giới tính của cây. Khả năng kháng khuẩn và kháng
nấm của cả lá tươi và lá khô Carica đu đủ chống lại vi khuẩn và nấm có tầm quan trọng y
học đã được thực hiện. Dịch chiết nước, ethanol và axeton của cả lá khô và tươi được thử
nghiệm ở nồng độ 25,50 và 100mg/ml trên cả hai chủng vi khuẩn và nấm sử dụng phương
pháp khuếch tán đĩa. Kết quả cho thấy hoạt tính chống vi khuẩn phổ rộng rất đáng kể đối
với vi khuẩn và nấm Gram dương và Gram dương. Các chiết xuất hữu cơ có hiệu quả hơn
chất chiết xuất từ nước. Kết quả cho thấy mẫu khô có hiệu quả chống lại vi khuẩn Gram
dương và Gram âm trong khi mẫu tươi có hiệu quả hơn đối với vi khuẩn Gram âm. Chiết
xuất lá khô có khả năng chống lại một số vi khuẩn mà kháng sinh tiêu chuẩn không thể ức
chế. Lá đu đủ Carica cho thấy hoạt tính kháng khuẩn tốt hơn hoạt tính kháng nấm. Chứng
10


minh hoạt tính kháng khuẩn đối với các mẫu xét nghiệm là dấu hiệu cho thấy có khả năng
tìm nguồn kháng sinh thay thế trong cây đu đủ để phát triển các chất kháng khuẩn mới
Ravi kumar Pigli giải thích trong nghiên cứu của mình rằng sốt xuất huyết hoặc sốt xuất
huyết dengue là bệnh do virus phổ biến nhất gây ra bởi virus dengue một gia đình
flavivirus truyền qua aedes aegypti muỗi. Khoảng 2,5 tỷ người bị ảnh hưởng bởi virus

này. Dengue là virut RNA có sợi đơn, có bốn serotype, tức là loại 1, 2, 3 và 4. Hiện không
có thuốc kháng virut được chấp thuận hoặc vaccin nào có thể sử dụng để điều trị siêu vi
khuẩn này làm tăng tỷ lệ tử vong trên toàn thế giới. Do không có thuốc tổng hợp nên hiện
nay cần tập trung vào cây thuốc được coi là có hiệu quả, an toàn hơn và không độc hại.
Có một số chiết xuất thực vật có chứa hoạt chất chống sốt xuất huyết, nhưng chúng không
được chấp thuận cho điều trị virus dengue. Bài báo này đánh giá các cây thuốc có sẵn cho
hoạt động chống sốt xuất huyết của chúng và cũng cung cấp thành phần phytochemical có
trong những cây thuốc [6].
1.2.2. Hoạt tính ức chế enzyme Xanthine oxidase
Gout là một căn bệnh phổ biến trên thế giới, do các tinh thể natri urate đóng trong các
khớp xương và những mô khác khi bão hòa urate trong máu. Chế độ dinh dưỡng giàu
nucleic acid trong các thức ăn như thịt, đậu, đồ biển và các thức ăn lên men gây nên
chứng cao uric acid trong máu và nếu không kịp bài tiết uric acid sẽ dẫn đến bệnh gout.
Trong giai đoạn cuối của quá trình trao đổi chất, XO xúc tác cho quá trình oxy hóa
hypoxanthine thành xanthine và xanthine thành uric acid Trong hầu hết các loài động vật
có vú đều chứa enzyme uricase, enzyme này xúc tác cho quá trình chuyển hóa uric acid
thành allantoin, là hợp chất có tính phân cực cao, tan trong nước, do đó được đào thải ra
ngoài một cách dễ dàng. Ở người bệnh gout do thiếu uricase nên quá trình trao đổi chất
chỉ tạo thành uric acid. Mà uric acid này lại ít tan trong huyết tương máu và khi nồng độ
trên 7 mg/dL sẽ dẫn đến bệnh gout.

11


Xanthine dehydrogenase (XDH) hay xanthine oxidase (XO) là một phức hợp metalloflavoprotein tạo ra các gốc tự do. Enzyme XO xúc tác quá trình oxy hoá hypoxanthine
thành xanthine và oxy hoá xanthine thành acid uric. Enzyme XO có vai trò quan trọng
trong quá trình dị hoá vòng purin, là nguyên nhân gây ra bệnh gout (Rasaratnam and
Christophidis, 1995). Bệnh gout (Thống phong) thường gắn liền với mức độ acid uric
trong huyết thanh cao, dẫn đến lắng đọng các tinh thể urat. Kết quả là gây ra các cơn đau
dữ dội ở các khớp về đêm, đặc biệt là ở ngón chân và ngón tay cái (Kramer and Curhan,

2002). Bệnh gout ngày càng phổ biến trong xã hội hiện đại và trở thành một vấn đề đáng
quan tâm, chỉ tính riêng ở Mỹ đã có hơn hai triệu người mắc bệnh, căn bệnh này cũng
tăng lên nhanh chóng ở Trung Quốc (Ying et al., 2004)Ở người bình thường, nồng độ acid
uric trong máu ở nam là 3,4-7,0 mg/dL (200-420 µmol/L) và ở nữ là 2,4-5,7 mg/dL (140340 µmol/L). Để mức acid uric được cân bằng hằng ngày, acid uric được thải ra ngoài chủ
yếu theo đường thận qua nước tiểu, một phần qua phân và các đường khác. Vì nhiều
nguyên nhân nguyên phát (bệnh gắn liền với các yếu tố di truyền, cơ địa) và thứ phát như
thường xuyên ăn nhiều thức ăn chứa nhiều purin (gan, thịt, cá,…), uống nhiều rượu, bia
làm cho quá trình chuyển hóa purin thành acid uric tăng. Theo báo cáo lâm sàng, acid uric
không chỉ liên quan đến bệnh gout, mà còn làm tăng nguy cơ rối loạn tim mạch, sỏi thận,
đái tháo đường (Nakanishi et al., 1999). Do đó, đề tài được thực hiện với mục đích là
đánh giá khả năng ức chế enzyme XO mức độ in vitro để ngăn sự hình acid uric, nguyên
nhân gây bệnh gout[1]. Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu khoa học nào được công bố về
công dụng trên cũng như khả năng ức chế enzyme XO của cao chiết lá và hoa của cây đu
đủ đực. Do đó, đề tài được thực hiện với mục đích là đánh giá khả năng ức chế enzyme
XO mức độ in vitro để ngăn sự hình acid uric, nguyên nhân gây bệnh gout.
1.2.3. Hoạt tính kháng oxi hóa
Khoảng vài thập niên gần đây, các nghiên cứu khoa học đã chứng tỏ rằng oxy khi
vào cơ thể tham gia nhiều quá trình sinh hóa và trong các quá trình đó oxy tạo ra gốc tự
12


do, các gốc tự do có nguồn gốc oxy này có hoạt tính cao, kém bền vững và được gọi
chung là các gốc dạng oxy hoạt động (ROS), các dạng oxy hoạt động này dễ dàng phản
ứng với những đại phân tử như protein, lipid, DNA,…Gây rối loạn các quá trình sinh hóa
trong cơ thể. Đồng thời khi một phân tử bị các gốc tự do tấn công, nó sẽ mất điện tử và
trở thành một gốc tự do mới tiếp tục phản ứng với những phân tử khác tạo thành một
chuỗi phản ứng thường gọi là phản ứng dây chuyền, gây ra các biến đổi có tác hại đối với
cơ thể.
Gốc tự do có khuynh hướng đạt tới sự ổn định và có thời gian tồn tại rất ngắn, hoạt
tính rất mạnh. Hoạt tính của gốc tự do tương quan nghịch với thời gian tồn tại của gốc tự

do. Gốc tự do có thời gian < 10-6 giây là gốc tự do không bền và có độc tính cao, gốc tự
do tồn tại > 10-6 giây là gốc tự do bền, ít độc tính hơn và đây chính là tác nhân trung hòa
gốc tự do không bền. Gốc tự do khi đạt tới trạng thái ổn định nó có thể thể hiện là
gốc oxy hóa khử.
Do tác hại của các gốc tự do thúc đẩy việc tìm ra các chất chống oxi hóa từ các
thành phần tự nhiên ngaỳ càng nhiều hơn.
1.3. Tổng quan về vi khuẩn
1.3.1 Vi khuẩn Enterococcus faecalis

Hình 1. 2: Vi khuẩn Enterococcus faecalis[10]
13


Enterococcus faecalis là vi khuẩn gram dương sống tại đường tiêu hóa của người
và động vật có vú khác. Enterococcus faecalis là nguyên nhân hàng đầu gây nhiễm trùng
mắc phải tại các bệnh viện và là tác nhân gây nhiễm trùng huyết đứng hàng thứ hai tại
Hoa Kỳ. Nhiễm khuẩn do Enterococcus faecalis đề kháng với vancomycin (VRE) gia
tăng nhanh chóng và trở thành mối quan tâm chủ yếu, nhất là ở các bệnh nhân dễ bị tổn
hại. VRE được nhắc đến lần đầu tiên tại Hoa Kỳ vào năm 1989, chiếm dưới 1% các
chủng Enterococcus faecalis được phân lập nhưng là mối đe dọa nghiêm trọng trong
những năm gần đây, chiếm gần 30% trong số 66,000 trường hợp nhiễm Enterococcus
faecalis có liên quan đến chăm sóc y tế và 1,300 trường hợp tử vong hàng năm [10].
Enterococcus faecalis có trong hệ vi khuẩn bình thường ở dạ dày ruột. Sự đề kháng kháng
sinh gia tăng khi các chủng Enterococcus faecalis xâm nhập đường tiêu hóa và gây nhiễm
trùng, cũng như nguy cơ lan truyền giữa bệnh nhân và người mang mầm bệnh. Khó kiểm
soát được sự lan truyền của vi khuẩn này, một khi vi khuẩn này xuất hiện ở cơ sở y tế;
sống nhiều chủng có thể sót trên 1 tuần ở hầu hết môi trường bệnh viện [10].
1.3.2 Vi khuẩn Staphylococcus aureus

Hình 1. 3: Vi khuẩn Staphylococus aureus[11]

14


Staphylococcus aureus hay Tụ cầu vàng là một loài tụ cầu khuẩn Gram-dương kỵ khí
tùy nghi, và là một trong nhiều nguyên nhân gây ra nhiễm khuẩn. Nó là một phần của hệ
vi sinh vật sống thường trú ở da được tìm thấy ở cả mũi và da. Khoảng 20% dân số loài
người là vật mang lâu dài của S. aureus. Sắc tố carotenoid staphyloxanthin làm nên
tính chất màu vàng của 'S. aureus', vốn có thể thấy được từ các khúm cấy trên thạch
của vi khuẩn này. Sắc tố đóng vai trò là một tác nhân độc hại có tính chất chống ôxy
hóa giúp cho vi sinh vật này không bị chết. Các tụ cầu thiếu sắc tố sẽ dễ dàng bị tiêu diệt
bởi hệ thống miễn dịch của cơ thể ký chủ.
Vi khuẩn này phát triển dễ dàng ở môi trường thông thường, không thể sinh trưởng ở
nhiệt độ thấp. Theo Mc Landsborough L. (2005), nhiệt độ sinh trưởng tối ưu của S.
aureus là 18 – 40℃, pH = 7,2. Tuy nhiên mọc tốt nhất ở 25℃, hiếu khí hay kỵ khí tuỳ ý.
Ở môi trường đặc, khuẩn lạc tròn lồi, bóng láng, óng ánh co thể có màu vàng đậm, màu
vàng cam hoặc màu trắng, tương đối lớn sau 24 giờ nuôi cấy. Ngoài ra S. aureus có thể
sinh trưởng được trên môi trường có hoạt độ thấp hơn các loài vi khuẩn khác hoặc môi
trường có nồng độ muối cao. Chúng thường tạo sắc tố vàng sau 1 - 2 ngày nuôi cấy ở
nhiệt độ phòng và đều tổng hợp enterotoxin ở nhiệt độ trên 15℃, nhiều nhất là khi tăng
trưởng ở 35 - 37℃. Những chủng khác nhau làm tan máu ở những mức độ khác nhau, ở
thạch máu, typ tan máu β thường được quan sát xung quanh khuẩn lạc.
Tụ cầu vàng chịu nhiệt và thuốc sát khuẩn tương đối tốt hơn những vi khuẩn khác.
Ngoài ra chúng còn chịu được khô và có thể sống ở môi trường nồng độ NaCl cao (9%),
nhiều chủng tụ cầu vàng đề kháng với penicillin và các kháng sinh khác.
S. aureus có phản ứng DNase, Catalase (+) (chuyển hoá hydrogen peroxit thành nước và
oxygen, phosphase (+), có khả năng lên men và sinh acid từ mannitol, trehalose, sucrose,
desoxyribonuclease là enzyme phân giải DNA. Tất cả các dòng S. aureus đều mẫn cảm
với novobiocine.

15



Hầu hết các chủng tụ cầu đều sản xuất được men penicillinase (beta – lactamase).
Men này phá huỷ vòng beta – lactam, cấu trúc cơ bản của các kháng sinh như penicilline
G, Ampicilline và Ureidopenicilline, làm cho các kháng sinh này mất tác dụng. S. aureus
không có khả năng tạo bào tử.
S.aureus được xác định trên cơ sở các đặc điểm tăng trưởng và phản ứng đông
huyết tương của các dòng thuần từ các khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường phân lập. Sự
hiện diện với mật độ cao của S. aureus trong thực phẩm chỉ thị điều kiện vệ sinh và kiểm
soát nhiệt độ kém của quá trình chế biến nên thhường có mặt trong nhóm thực phẩm đã
được qua chế biến và nấu chín [11].
1.3.3. Vi khuẩn Escherichia coli

Hình 1. 4:Vi khuẩn Escherichia coli[12]
Escherichia coli (thường được viết tắt là E. coli) hay còn được gọi là vi khuẩn đại
tràng là một trong những loài vi khuẩn chính ký sinh trong đường ruột của động vật máu
nóng (bao gồm chim và động vật có vú). Vi khuẩn này cần thiết trong quá trình tiêu hóa
thức ăn và là thành phần của khuẩn lạc ruột. Sự có mặt của E. coli trong nước ngầm là
một chỉ thị thường gặp cho ô nhiễm phân.
E. coli thuộc họ vi khuẩn Enterobacteriaceae và thường được sử dụng làm sinh vật
mô hình cho các nghiên cứu về vi khuẩn.
16


Năm 1885, tại München, một bác sĩ nhi khoa tên là Theodor Escherich rất quan tâm
đến những phát hiện quan trọng của Louis Pasteur và Robert Koch về vi khuẩn. Cùng với
việc nghiên cứu bệnh tiêu chảy, Escherich tỏ rõ mối lưu ý tới một vi sinh vật đường ruột
trẻ em qua nhiều thí nghiệm lâm sàng. Vi khuẩn do Escherich phát hiện từ trong tã lót của
trẻ em được công bố với tên gọi đầu tiên là Bacterium coli commune. Chỉ 4 năm sau vi
khuẩn này được giới chuyên môn đổi tên thành Escherich nhằm tri ân người có công

khám phá. Tuy nhiên, nó được gọi bằng tên Bacillus coli vào năm 1895 và Bacterium
colivào một năm sau đó, Sau nhiều kiểu gọi, đến năm 1919, vi khuẩn kia được định danh
thống nhất toàn cầu là Escherichia coli[12].
1.3.4. Vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa

Hình 1. 5: Vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa [15]
Đây là vi khuẩn Gram âm, hiếu khí, hình que với khả năng di chuyển một cực.
Ngoài việc một là mầm bệnh cơ hội cho con người, Pseudomonas aeruginosa còn được
biết đến như là mầm bệnh cơ hội cho thực vật.
P. aeruginosa (hay còn gọi là Trực khuẩn mủ xanh) là một vi khuẩn phổ biến
gây bệnh ở động vật và con người. Nó được tìm thấy trong đất, nước, hệ vi sinh vật trên
da và các môi trường nhân tạo trên khắp thế giới. Vi khuẩn không chỉ phát triển trong môi
trường không khí bình thường, mà còn có thể sống trong môi trường có ít khí ôxy, và do
17


đó có thể cư trú trong nhiều môi trường tự nhiên và nhân tạo. Vi khuẩn này dinh dưỡng
bằng rất nhiều các hợp chất hữu cơ; ở động vật, nhờ khả năng thích ứng vi khuẩn cho
phép nó lây nhiễm và phá hủy các mô của người bị suy giảm hệ miễn dịch. Triệu chứng
chung của việc lây nhiễm thông thường là gây ra viêm nhiễm và nhiễm trùng huyết. Nếu
vi khuẩn xâm nhập vào các cơ quan thiết yếu của cơ thể như phổi, đường tiết niệu,
và thận, sẽ gây ra những hậu quả chết người, vì vi khuẩn này phát triển tốt trên các bề mặt
bên trong cơ thể. Vi khuẩn cũng được phát hiện trên các dụng cụ y khoa bao
gồm catheter, gây ra nhiễm khuẩn bệnh viện và phòng mạch. Đây cũng là nguyên nhân
gây ra viêm chân lông [15].
1.3.5. Vi khuẩn Enterobacter aerogene

Hình 1. 6: Vi khuẩn Enterobacter aerogenes [16]
18



Enterobacter aerogenes là một vi khuẩn gram âm, oxidase âm tính, catalase dương
tính, citrate dương tính, indole, hình que. Vi khuẩn này có chiều dài khoảng 1-3 micron,
và có khả năng di chuyển qua cờ lê peritrichous.
E. aerogenes là một vi khuẩn gây bệnh và gây ra bệnh nhiễm trùng cơ hội bao gồm hầu
hết các loại bệnh nhiễm trùng. Phần lớn chúng kháng lại hầu hết các loại kháng sinh được điều
chế cho vi khuẩn này, nên phải liên lục đổi kháng sinh [16].
E. aerogenes thường thấy trong đường tiêu hóa của con người và thường không gây
ra bệnh ở người khỏe mạnh. Nó đã được tìm thấy để sống trong chất thải khác nhau, hóa
chất vệ sinh, và đất. Các vi khuẩn cũng có một số ý nghĩa thương mại - khí hydro được
sản xuất trong quá trình lên men đã được thử nghiệm với việc sử dụng mật đường làm
chất nền [16].
1.4. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
Vào năm 2014, GS Nguyễn Xuân Hiền, nguyên Chủ nhiệm Khoa Da Liễu, Bệnh
viện TƯ Quân đội 108 đã từng gửi lá thư tới tòa soạn báo Khoa học & Đời sống công bố
hướng dẫn 250 người chữa ung thư bằng lá đu đủ. Kết quả nhiều bệnh nhân khỏi bệnh
hoặc đỡ, kéo dài sự sống tốt. Nhưng bằng sự thận trọng của một người từng làm trong
lĩnh vực y khoa, ông vẫn mong muốn các bộ ngành liên quan nghiên cứu bài thuốc dân
gian này[13].
GS Nguyễn Xuân Hiền nhấn mạnh, nhiều người, đặc biệt với những người chưa qua phẫu
thuật khối u, chưa chạy xạ, truyền hóa chất chống ung thư thì kết quả tốt và nhanh
hơn[13].
Gần đây nhất là công trình nghiên cứu của BS.TS Nam.H.Dang giáo sư Đại học
Florida Mỹ đã công bố trên tạp chí dược học cho thấy, chất chiết xuất từ lá đu đủ có tác
dụng tăng cường quá trình sản sinh các phân tử truyền dẫn tín hiệu chủ chốt có tên Th1type cytokines.

19


Hiệp hội các nhà vi sinh vật học của Ấn Độ năm 2011 đã công bố rằng ethanol có

thể được sử dụng để chiết các hợp chất có hoạt tính sinh học từ carica papaya L. Phân
tích chiết xuất lá với các thử nghiệm hoá học cho thấy có sự hiện diện của alkaloids,
flavonoid và terpenes. Hiệu quả kháng nấm được xác định bằng cách thử nghiệm các
chiết xuất (LE, SRE, SUE) từ phương pháp chiết xuất tốt nhất chống lại ba loại nấm gây
bệnh nấm: Rhizopus stolonifer, Fusarium spp. và Colletotrichum gloeosporioides. Chiết
xuất lá trưng bày phổ rộng hành động. MIC50 cho chiết xuất lá là 0,625 mg ml-1 đối với
Fusarium spp. và[10 mg ml-1 đối với C. gloeosporioides, đều bằng khoảng 20% sự ức
chế sự phát triển của sợi nấm. Ethanolic chiết xuất từ carica papaya L. cv. Lá Maradol là
một nguồn tiềm năng của các chất chuyển hóa thứ cấp có tính kháng nấm[9].
Năm 2013 Soobitha S, Tan CC, Kee CC, Thayan R và Mok BT đã nghiên cứu ra
nước ép lá đu đủ làm tăng số lượng tiểu cầu trong số bệnh nhân sốt xuất huyết và sốt xuất
huyết sốt xuất huyết hỗ trợ cho việc điều trị bệnh[8].

20


21


CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nôi dung nghiên cứu
- Nghiên cứu hoạt tính kháng Escherichia coli, Staphylococcus aureus,
Enterococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter aerogenes của cao chiết
lá và hoa của cây đu đủ đực.
- Nghiên cứu hoạt tính ức chế enzyme xanthine oxidase của cao chiết lá và hoa của
cây đu đủ đực.
- Nghiên cứu hoạt tính kháng oxi hóa của cao chiết lá và hoa của cây đu đủ đực.
2.2. Vật liệu và đối tượng nghiên cứu
- Vật liệu nghiên cứu: mẫu lá và hoa đu đủ đực có 46% hoa nở, 44% cành và 10%
nụ được thu hái ở thành phố Buôn Ma Thuột vào tháng 10.

- Đối tượng nghiên cứu:
+ Cao chiết ethanol của lá và hoa của cây đu đủ đực
+ Vi khuẩn Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus aureus ATCC:25922,
Enterococcus faecalis ATTC® 19433, Pseudomonas aeruginosa ATTC® 25922,
Enterobacter aerogenes ATTC® 13048 được mua từ công ty Microbiologics, Mỹ.
2.3. Đia điểm nghiên cứu
- Phòng thí nghiệm bô môn Sinh học thực nghiêm, khoa Khoa học tự nhiên và
công nghệ trường Đại học Tây Nguyên.
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.1. Phương pháp ly trích thu cao chiết (extract) thô
Mẫu lá và hoa của cây đu đủ đực khô được xay nhỏ sau đó ly trích 3 lần với dung môi
ethanol với tỉ lệ nguyên liệu/dung môi (1:10) trong vòng 24h trên máy lắc với tốc độ 165
vòng/phút. Tiếp theo dịch trích ly được cô đặc bằng bằng phương pháp chưng cách thủy

22


đến khi đuổi hoàn toàn dung môi. Cao chiết được sử dụng ngay hoặc bảo quản ở
nhiệt độ -30 o C.

Nguyên liệu tươi
- Phơi khô hoặc sấy ở 60oC
- Nghiền
Ngâm trong dung môi ethanol
- Lắc qua đêm
- Ngâm lắc 3 lần
Đun cách thủy ở 55oC

Mẫu cao ethanol
2.4.2. Phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn của cao chiêt của lá và hoa của

cây đu đủ đực
Thực hiện nuôi cấy các chủng vi khuẩn khuẩn khảo sát trên môi trường
MuellerHinton agar. Thành phần môi trường (g/l): Beef Extract: 2 g; Acid Hydrolysate of
Casein: 17.5; Starch:1.5 g; Agar: 17 g
Hoạt tính kháng khuẩn khuẩn E.coli, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis,
Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter aerogenes của cao chiết lá và hoa của cây đu đủ
đực được khảo sát bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch (disk-diffusion method)
Đĩa thạch chuẩn bị chứa 10ml môi trường Mueller-Hinton agar được hấp khử trùng
ở nhiệt độ 121oC, 1atm, trong 15 phút. Dùng micropipet hút 1ml huyền phù vi khuẩn cấy
có mật độ 1 x 108 CFU/ml trên đĩa thạch sau đó giữ 10 phút cho khô.
Dùng một ống thủy tinh có đường kính 6 mm đã được khử trùng để đục lỗ trên bề mặt
thạch đã nuôi cấy vi khuẩn, sau đó bổ sung 50μl dịch trích ly địa y vào lỗ thạch với nồng độ
10 mg/ml, 30 mg/ml, 60 mg/ml, 90mg/ml 3 lần lặp lại. Đĩa cấy được giữ ở nhiệt độ phòng
23


trong 30 phút để dịch trích ly phân tán trên bề mặt đĩa. Đĩa petri sau khi cấy được ủ ấm trong
tủ ấm ở nhiệt độ 37oC trong 24, 48, 72 h.
Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết được xác định qua đường kính vòng kháng khuẩn.
r = (D-d)
r: Đường kính vòng kháng khuẩn
D: Đường kính vòng ngoài kháng khuẩn
d: Đường kính lỗ thạch
Đường kính vòng vô khuẩn (D-d) được xác định bằng đường kính vòng kháng ngoài
trừ đi đường kính lỗ thạch.
Thí nghiệm sử dụng tetracillin làm đối chứng dương.
2.4.3. Kháng xanthine oxidase của lá và hoa của cây đu đủ đực
Nguyên tắc
Dựa trên phản ứng:
Xanthine


+

H2O

+O2

XO

Acid uric

+

H2O2

XO xúc tác quá trình oxy hóa hypoxanthine thành xanthine và oxy hóa xanthine
thành acid uric, đồng thời hình thành gốc tự do O 2-. Acid uric có bước sóng hấp thụ cực
đại tại 290 nm. Nếu mẫu thử có khả năng kháng XO càng cao sẽ hạn chế sự hình thành
acid uric, do đó sẽ giảm giá trị mật độ quang. Mẫu có chất thử được so sánh với mẫu
không có chất thử để đánh giá tác dụng ức chế enzyme của chất thử.
Mục đích: thí nghiệm là khảo sát khả năng ức chế của cao ethanol của lá và hoa
của cây đu đủ đực hoạt động của enzyme XO in vitro, dựa vào thử nghiệm xanthine
oxidase. Kết quả khảo sát được đánh giá dựa vào phần trăm enzyme XO bị ức chế. Thí
nghiệm được bố trí với 3 lần lặp lại. Hỗn hợp phản ứng gồm có ethanol của lá và hoa của
cây đu đủ đực với các nồng độ trong phản ứng là 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 và 1mg/mL. Nghiệm
thức đối chứng không sử dụng cao ethanol của lá và hoa của cây đu đủ đực. Tiến hành thí
nghiệm: Cao 10 mg/mL được pha trong dung môi dimethyl sulfoside (DMSO) 0,1 M. Sau
24



đó, cao ethanol của lá và hoa của cây đu đủ đực 10 mg/mL được pha loãng thành các
nồng độ khác nhau. Phản ứng được tiến theo bảng 2.1
Bảng 2.1 : Bố trí thí nghiệm ức chế xanthine oxidase in vitro
Lô
Nồng độ mẫu
(μg/ml)
Thể tích mẫu (μl)
Thể tích dung môi
DMSO 5% (μl)
Thể tích đệm
phosphate (μl)
Thể tích XO 0,05U
(μl)

1

2

3

4

5

6

0

200


400

600

800

1000

0

30

60

90

120

150

150

120

90

60

30


0

45
15
Trộn đều và ủ 15 phút ở nhiệt độ phòng

Thể tích xanthine
150 Μm (μl)

240
Trộn đều và ủ 30 phút ở nhiệt độ phòng
25

Thể tích HCl 1M
(μl)

Đo OD ở bước sóng 290 nm
I(%) ức chế tính theo công thức:
I (%) =

∆ODch − ∆ΟDt
.100%
∆ODch

Trong đó:
ODch : là giá trị mật độ quang của dung dịch không có mẫu thử.
ODt : là giá trị mật độ quang của dung dịch có chứa mẫu thử

25