TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

TRẦN QUỐC CƯỜNG

HIỆU QUẢ CỦA BA, NAA VÀ TDZ LÊN SỰ TÁI SINH
CHỒI DÃ YÊN THẢO (Petunia sp.)
IN VITRO

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Ngành: HOA VIÊN CÂY CẢNH

Cần Thơ, 2011

i


TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Ngành: HOA VIÊN CÂY CẢNH

Tên đề tài:

HIỆU QUẢ CỦA BA, NAA VÀ TDZ LÊN SỰ TÁI SINH
CHỒI DÃ YÊN THẢO (Petunia sp.)
IN VITRO

Cán bộ hướng dẫn:

Sinh viên thực hiện:

TS. Lâm Ngọc Phương

Trần Quốc Cường
MSSV: 3073223
Lớp: Hoa Viên Cây Cảnh k33

Cần Thơ, 2011

ii


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

Luận văn tốt nghiệp ngành Hoa Viên Cây Cảnh với đề tài: “HIỆU QUẢ CỦA BA,
NAA VÀ TDZ LÊN SỰ TÁI SINH CHỒI DÃ YÊN THẢO (Petunia sp.) IN
VITRO”. Do sinh viên Trần Quốc Cường thực hiện.
Kính trình lên hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp.

Cần Thơ, ngày….tháng….năm 2011

Cán bộ hướng dẫn

Lâm Ngọc Phương

iiii



TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG
BỘ MÔN SINH LÝ - SINH HÓA

Hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp đã chấp thuận luận văn đính kèm với
tên đề tài: “Hiệu quả của BA, NAA và TDZ lên sự tái sinh chồi dã yên
thảo (Petunia sp.) in vitro”. Do sinh viên Trần Quốc Cường thực hiện và
bảo vệ trước Hội đồng.

Luận văn tốt nghiệp đã được hội đồng đánh giá ở mức :………………………..
……..…………………………………………………………………………………
…………..…………………………………………………………………… ………
Ý kiến hội đồng :……………………………………………………………. ………
……..…………………………………………………………………………………
…………..……………………………………………………………………………
………………..………………………………………………………………………
……………………..………………………………….. …………………………….

Khoa Duyệt

Cần Thơ, ngày……tháng……năm 2011

Trưởng khoa Nông Nghiệp & SHƯD

Chủ tịch Hội đồng

iv
ii



LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân. Các số liệu, kết quả
trình bày trong luận văn tốt nghiệp là trung thực và chưa từng được ai công bố trong
bất kỳ công trình luận văn nào trước đây.

Tác giả luận văn

Trần Quốc Cường

v
iii


LỜI CẢM TẠ

Con xin kính dâng lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất đến Ba Mẹ cùng tất cả
những người thân trong gia đình đã nuôi con khôn lớn nên người và tận tâm lo lắng,
tạo mọi điều kiện cho con được học tập cho đến ngày hôm nay.
Em xin chân thành cám ơn cô Lâm Ngọc Phương đã tận tình hướng dẫn em
trong quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp. Cám ơn cô đã cho những lời khuyên bổ
ích và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho em nghiên cứu, hoàn thành tốt luận văn
này.
Em xin chân thành cảm ơn quý thầy cô trường Đại Học Cần Thơ đã dạy bảo,
truyền đạt cho em những kiến thức quý báu trong 4 năm qua.
Em xin chân thành cảm ơn quý Thầy Cô, chị Lý, cùng các anh chị trong Bộ môn
Sinh lý - sinh hoá, khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng, trường Đại Học Cần
Thơ đã tạo điều kiện, giúp đỡ và chỉ bảo em trong quá trình thực tập, giúp em có
thêm những kiến thức trong thực tế và học hỏi được nhiều kinh nghiệm quý báu.
Xin cảm ơn toàn thể các bạn lớp Hoa Viên Cây Cảnh K33 đã quan tâm giúp đỡ, động

viên tôi trong thời gian làm đề tài và tất cả những người bạn đã cùng học tập, trao đổi
kiến thức trong suốt thời gian học tập ở trường.
Xin chân thành cảm ơn!

Cần Thơ, ngày … tháng … năm 2011

Trần Quốc Cường

vi
iv


TIỂU SỬ CÁ NHÂN

Họ và tên:Trần Quốc Cường

Giới tính: Nam

Ngày sinh: 10/12/1989

Dân tộc: Kinh

Nơi sinh: Khu vực Bình Phước, phường Phước Thới, quận Ômôn, thành phố Cần Thơ
con ông Trần Vĩnh Hoàng và bà Phan Thị Nâu.
Đã tốt nghiệp tú tài năm 2007 tại trường trung học phổ thông Lưu Hữu Phước, quận
Ômôn, thành phố Cần Thơ.
Trúng tuyển vào Đại Học Cần Thơ năm 2007, học lớp Hoa Viên Cây Cảnh khóa 33
thuộc khoa Nông Nghiệp và SHƯD, trường Đại Học Cần Thơ.

Cần Thơ, ngày … tháng … năm 2011

Người khai ký tên

Trần Quốc Cường

vii
v


MỤC LỤC
Nội dung

Trang
Trang phụ bìa
Trang kính trình hội đồng

i

Trang duyệt luận văn

ii

Lời cam đoan

iii

Lời cảm tạ

iv

Tiểu sử cá nhân


v

Mục lục

vi

Danh sách chữ viết tắt

viii

Danh sách bảng

ix

Danh sách hình

xi

Tóm lược

xii

MỞ ĐẦU

1

Chương 1 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2


1.1 Đặc điểm thực vật của cây hoa dã yên thảo

2

1.1.1 Nguồn gốc và sự phân bố

2

1.1.2 Đặc điểm thực vật

2

1.1.3 Cách trồng hoa dã yến thảo

2

1.2 Sơ lược về nuôi cấy mô thực vật

3

1.2.1 Hiện trạng nuôi cấy mô ở Việt Nam

3

1.2.2 Thành phần môi trường nuôi cấy mô thực vật

3

1.3 Một số kết quả nuôi cấy mô cây hoa dã yên thảo đã

được công bố

6

Chương 2 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP

8

2.1 Phương tiện nghiên cứu

8

2.2.1 Vật liệu

8

2.2.2 Địa điểm và thời gian tiến hành thí nghiệm

8

viii
vi
v


2.2.3 Thiết bị và hóa chất

8

2.2.4 Điều kiện thí nghiệm


9

2.2 Phương pháp nghiên cứu

9

2.2.1 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy

9

2.2.2 Bố trí thí nghiệm

9

2.2.3 Cách lấy chỉ tiêu

11

2.3 Xử lý số liệu

11

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

12

3.1 Hiệu quả của BA và NAA trên sự tái sinh chồi từ lá dã
yên thảo


12

3.1.1 Tỷ lệ (%) mẫu lá tạo chồi

12

3.1.2 Số chồi tái sinh trên mẫu

14

3.1.3 Chiều cao chồi

16

3.1.4 Chiều dài mô sẹo

17

3.1.5 Chiều cao mô sẹo

19

3.2 Hiệu quả của BA và TDZ trên sự tái sinh chồi từ lá hoa dã
yên thảo

20

3.2.1 Tỷ lệ (%) mẫu lá tạo chồi

20


3.2.2 Số chồi tái sinh trên mẫu

23

3.2.3 Chiều cao chồi

25

3.2.4 Chiều dài mô sẹo

26

3.2.5 Chiều cao mô sẹo

28

Chương 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

31

4.1 Kết luận

31

4.2 Đề nghị

31

TÀI LIỆU THAM KHẢO


32

PHỤ LỤC

ix
vii


DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT
MS

Murashige và Skoog

BA

6-Benzyl adenin

NAA

1-naphthalene acetic acid

TDZ

Thidiazuron

HgCl2

Thủy ngân clorua


MS

Murashige và Skoog, 1962

EDTA

Ethylene diamine tetraacetic acid

ctv.

Cộng tác viên

viii
x


DANH SÁCH BẢNG
Bảng

Tựa bảng

Trang

2.1

Các nghiệm thức của thí nghiệm 1

9

2.2


Các nghiệm thức của thí nghiệm 2

10

3.1

Tỷ lệ (%) mẫu lá tạo chồi của dã yên thảo trên môi trường có
bổ sung BA và NAA với các nồng độ khác nhau ở thời điểm
sau 2 tuần nuôi cấy

12

3.2

Tỷ lệ (%) mẫu lá tạo chồi của dã yên thảo trên môi trường có
bổ sung BA và NAA với các nồng độ khác nhau ở thời điểm
sau 3 tuần nuôi cấy

13

3.3

Tỷ lệ (%) mẫu lá tạo chồi của dã yên thảo trên môi trường có
bổ sung BA và NAA với các nồng độ khác nhau ở thời điểm
sau 4 tuần nuôi cấy

14

3.4


Số chồi được tái sinh trên mẫu lá dã yên thảo trên môi trường có
bổ sung BA và NAA với các nồng độ khác nhau sau 2 tuần nuôi
cấy

15

3.5

Số chồi được tái sinh trên mẫu lá dã yên thảo trên môi trường có
bổ sung BA và NAA với các nồng độ khác nhau sau 3 tuần nuôi
cấy

15

3.6

Số chồi được tái sinh trên mẫu lá dã yên thảo trên môi trường có
bổ sung BA và NAA với các nồng độ khác nhau sau 4 tuần nuôi
cấy

16

3.7

Chiều cao chồi tái sinh (cm) trên mẫu lá của dã yên thảo trên môi
trường có bổ sung NAA và BA với các nồng độ khác nhau sau 2, 3
và 4 tuần nuôi cấy

17


3.8

Chiều dài mô sẹo (cm) trên mẫu lá của dã yên thảo trên môi trường
có bổ sung NAA và BA với các nồng độ khác nhau sau 2, 3 và 4
tuần nuôi cấy

18

3.9

Chiều cao mô sẹo (cm) trên mẫu lá của dã yên thảo trên môi
trường có bổ sung NAA và BA với các nồng độ khác nhau sau 2, 3
và 4 tuần nuôi cấy

19

xi
ix


3.10

Tỷ lệ (%) mẫu lá tạo chồi của dã yên thảo trên môi trường có bổ
sung BA và TDZ với các nồng độ khác nhau ở thời điểm sau 2
tuần nuôi cấy

20

3.11


Tỷ lệ (%) mẫu lá tạo chồi của dã yên thảo trên môi trường có bổ
sung BA và TDZ với các nồng độ khác nhau ở thời điểm sau 3
tuần nuôi cấy

21

3.12

Tỷ lệ (%) mẫu lá tạo chồi của dã yên thảo trên môi trường có bổ
sung BA và TDZ với các nồng độ khác nhau ở thời điểm sau 4
tuần nuôi cấy

22

3.13

Số chồi được tái sinh trên mẫu lá dã yên thảo trên môi trường có
bổ sung BA và TDZ với các nồng độ khác nhau sau 2 tuần nuôi
cấy

23

3.14

Số chồi được tái sinh trên mẫu lá dã yên thảo trên môi trường có
bổ sung BA và TDZ với các nồng độ khác nhau sau 3 tuần nuôi
cấy

24


3.15

Số chồi được tái sinh trên mẫu lá dã yên thảo trên môi trường có
bổ sung BA và TDZ với các nồng độ khác nhau sau 4 tuần nuôi
cấy

24

3.16

Chiều cao chồi tái sinh (cm) trên mẫu lá của dã yên thảo trên môi
trường có bổ sung BA và TDZ với các nồng độ khác nhau sau 2, 3
và 4 tuần nuôi cấy

26

3.17

Chiều dài mô sẹo (cm) trên mẫu lá của dã yên thảo trên môi
trường có bổ sung BA và TDZ với các nồng độ khác nhau sau 2,
3 và 4 tuần nuôi cấy
Chiều cao mô sẹo (cm) trên mẫu lá của dã yên thảo trên môi
trường có bổ sung BA và TDZ với các nồng độ khác nhau sau 2,
3 và 4 tuần nuôi cấy

27

3.18


x

29


DANH SÁCH HÌNH
Hình

Tựa hình

Trang

1.1

Hoa dã yên thảo

2

2.1

Bình chồi dã yên thảo 3 tuần tuổi được dùng để cắt lá thí nghiệm

8

3.1

Tỷ lệ (%) mẫu lá tạo chồi từ lá dã yên thảo trên môi trường có bổ
sung NAA và BA với các nồng độ khác nhau sau 4 tuần nuôi cấy

14


3.2

Chiều dài mô sẹo của lá dã yên thảo trên môi trường có bổ sung
BA và NAA với các nồng độ khác nhau sau 2 tuần nuôi cấy

18

3.3

Chiều cao mô sẹo của lá dã yên thảo trên môi trường có bổ sung
TDZ và BA với các nồng độ khác nhau sau 3 tuần nuôi cấy

22

3.4

Tỷ lệ (%) mẫu lá tạo chồi từ lá dã yên thảo trên môi trường có bổ
sung BA và TDZ với các nồng độ khác nhau sau 4 tuần nuôi cấy

28

3.5

Chiều dài mô sẹo của lá dã yên thảo trên môi trường có bổ sung
BA và TDZ với các nồng độ khác nhau sau 4 tuần nuôi cấy

30

xi



TRẦN QUỐC CƯỜNG, 2011. “Hiệu quả của BA, NAA và TDZ lên sự tái sinh chồi
dã yên thảo (Petunia sp.) in vitro”. Luận văn tốt nghiệp Đại Học kỹ sư ngành Hoa
Viên & Cây Cảnh, Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, Trường Đại Học Cần
Thơ. Cán bộ hướng dẫn: Ts. Lâm Ngọc Phương.

TÓM LƯỢC

Đề tài “Hiệu quả của BA, NAA và TDZ lên sự tái sinh chồi dã yên thảo (Petunia
sp.) in vitro” được thực hiện nhằm tìm ra nồng độ chất điều hòa sinh trưởng (BA, NAA
và TDZ) thích hợp cho sự tái sinh chồi từ lá, làm cơ sở cho công tác nhân giống.
Đề tài gồm 2 thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên 2 nhân tố,
6 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại là 1 keo, mỗi keo cấy 6 mẫu.
Kết quả thí nghiệm cho thấy: a) Môi trường MS có bổ sung thêm BA 2,0 mg/l +
NAA 0,5 mg/l cho tỷ lệ chồi tái sinh từ lá tốt là 88,9% và số chồi đạt mức cao (4
chồi); b) Môi trường MS có bổ sung TDZ 0,2 mg/l cho tỷ lệ chồi tái sinh từ lá đạt
100%, số chồi tái sinh cao nhất với 9,9 chồi, chiều cao chồi đạt mức cao nhất là 2,3 cm.

xii


MỞ ĐẦU
Hoa dã yên thảo có tên khoa học là Petunia sp., dã yên thảo có nguồn gốc từ
các nước miền Nam châu Mỹ, có nhiều loài lai tạo cho ra nhiều chủng loại, hoa có
màu sắc phong phú, khá bền và phù hợp với nhiều mục đích sử dụng. Hoa có đơn
hoặc đa lớp, dạng gợn sóng, có thể có sọc, đốm hoặc viền quanh cánh với các màu
đỏ tía, hoa cà, màu oải hương, hồng, đỏ, trắng hay vàng. Hiện nay dã yên thảo được
gây trồng rộng rãi ở các bãi cỏ, vườn hoa khắp nước ta. Ở miền Bắc, hoa nở vào dịp
hè thu, còn ở miền Nam, hoa nở vào dịp Tết (Trần Hợp, 2000).

Nuôi cấy mô là một công cụ nhân giống tích cực so với các phương pháp
nhân giống truyền thống là tạo được cây sạch bệnh, có hệ số nhân cao, thời gian
sản xuất được rút ngắn, nhân nhanh số lượng và tạo ra giống có chất lượng đáp
ứng yêu cầu của thị trường (Dương Công Kiên, 2007). Trên thế giới có nhiều
nghiên cứu về nhân giống cây dã yên thảo bằng phương pháp nuôi cấy mô nhằm
nhân giống cũng như lai tạo giống với các lọai mẫu cấy là chồi, thân hay lá
(Kedong, 2001; Hassan và ctv, 2010).
Đề tài: “Hiệu quả của BA, NAA và TDZ lên sự tái sinh chồi dã yên thảo
(Petunia sp.) in vitro” được thực hiện nhằm tìm ra môi trường thích hợp để tái sinh
chồi in vitro phục vụ công tác chuyển gen lai tạo và nhân giống cây hoa này.


CHƯƠNG 1 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
1.1 Đặc điểm thực vật của cây hoa dã yên thảo
1.1.1 Nguồn gốc và sự phân bố
Cây hoa dã yên thảo thuộc họ cà (Solanaceae), có nguồn gốc từ các nước miền
Nam châu Mỹ, hiện nay được gây trồng rộng rãi ở các bãi cỏ, các khu đất rộng,
vườn hoa khắp nước ta. Ở miền bắc, hoa nở vào dịp hè thu, còn ở miền nam, hoa nở
vào dịp Tết (Trần Hợp, 2000). Cây có nhiều tên gọi khác nhau, theo Phạm Hoàng
Hộ (2000) cây có tên là dã yên, theo Trần Hợp (2000) có tên là cây hoa cà. Đây là
một loại cây lai mà tổ tiên có từ nhiều loài khác của chi Petunia, ví như P. axillaris
BSP (Large White Petunia) hoa dạng ống hẹp, màu trắng, hoặc P. violacea Lindl
(Violet-flowered Petunia) hoa dạng ống dài, thùy rộng, màu tím. Ngày nay, các nhà
vườn từ loài lai này còn cho ra các dạng hoa kép hay cánh hoa xèo ngón rất đẹp
(Trần Hợp, 2000).
1.1.2 Đặc điểm thực vật
Cây hoa dạ yên thảo (Hình 1.1) thuộc loại cây
sống sống hàng năm, thân thảo, mềm, phân ít
cành nhánh. Hình dạng lá có hình trái xoan, đều
và thuôn, có màu xanh, mềm, hoa dã yên thảo

đơn độc ở nách lá, thể có nhiều hoa nở cùng lúc
từ một thân và hoa có rất nhiều màu sắc như: từ
trắng, hồng đến tím, đỏ hay có sự phối trộn các
màu đó trên cùng một hoa, quả thuộc loại quả
nang 2 mảnh, nhiều hạt (Trần Hợp, 2000), và
cánh đài hợp ở gốc thường còn lại ở quả, cánh
tràng hợp thành ống, leo rộng ra ở đỉnh, dạng loa
kèn, mềm, nổi rõ các gân thùy (Trần Hợp, 2000).

Hình 1.1 Hoa dã yên thảo

Đây là một loại cây lai mà tổ tiên có từ nhiều loài khác của chi petunia, ví như P.
axillaris BSP (Large White Petunia) hoa dạng ống hẹp, màu trắng, hoặc P. violacea
Lindl. (Violet-flowered Petunia) hoa dạng ống dài, thùy rộng, màu tím. Ngày nay,
các nhà vườn từ loài lai này còn cho ra các dạng hoa kép hay cánh hoa xòe ngón rất
đẹp (Trần Hợp, 2000).
1.1.3 Cách trồng hoa dã yến thảo
Có thể trồng bằng hai cách đó là giâm cành và trông từ hạt, với cách trồng hoa
dã yên thảo bằng hạt thì cần làm đất kỹ và đủ ánh nắng trước khi gieo hạt, hạt gieo
4-6 ngày sẽ cho cây con và có thể đem trồng ở vườn ươm sau 20 ngày. Sau 20-25
2


ngày nữa thì đem trồng ở vườn hoa, đất trồng cần đủ phân. Đối với cành giâm, sau
20 ngày đã có rễ và sau 1 tháng bứng trồng ở nơi cố định. Cây chóng cho hoa,
nhưng nở rộ và chóng tàn, quả cần thu hoạch kịp thời (1g hạt có 10.000-12.000 hạt).
1.2 Sơ lược về nuôi cấy mô thực vật
1.2.1 Hiện trạng nuôi cấy mô ở Việt Nam
Ở Việt Nam, công việc nuôi cấy mô tế bào bắt đầu thực hiện trong khoảng năm
1977 ở Phân Viện Khoa học Thành phố Hồ Chí Minh. Hiện nay có rất nhiều phòng

thí nghiệm nuôi cấy mô ở các Trường Đại học, các Viện nghiên cứu, các Sở khoa
học và Công nghệ ở các Tỉnh, Thành phố. Đà Lạt là nơi có nhiều phòng thí nghiệm
nuôi cấy mô của tư nhân phục vụ cho công tác nhân giống hoa cảnh và rau củ
(Nguyễn Bảo Toàn, 2004).
1.2.2 Thành phần môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật
Các thành phần cơ bản của môi trường nuôi cấy bao gồm: muối khoáng (đa
lượng và vi lượng), nguồn cacbon, vitamin, các chất điều hòa sinh trưởng, agar (đối
với môi trường rắn) (Nguyễn Đức Thành, 2000). Thành phần của môi trường nuôi
cấy mô tế bào thay đổi tùy theo loài thực vật, loại tế bào, mô và cơ quan được nuôi
cấy. Đối với cùng một loại mô, cơ quan nhưng mục đích nuôi cấy không giống
nhau, môi trường sử dụng cũng khác nhau khá cơ bản. Môi trường nuôi cấy còn
thay đổi theo giai đoạn sinh trưởng và phát triển của mẫu cấy (Vũ văn Vụ và ctv.,
2006).
* Nước
Phẩm chất nước là điều kiện quan trọng trong nuôi cấy. Nước sử dụng trong
nuôi cấy thường là nước cất một lần. Trong một số trường hợp người ta cũng sử
dụng nước cất hai lần hoặc nước khử khoáng (Nguyễn Bảo Toàn, 2004).
* Các nguyên tố khoáng đa lượng
Theo Lê Văn Hòa và ctv. (1999), khoáng đa lượng rất cần cho cây, có ảnh
hưởng rất tốt cho sự hấp thu của mô cấy và chúng không gây độc. Nhu cầu khoáng
đa lượng của mô, tế bào thực vật không khác nhiều so với cây trồng tự nhiên. Các
nguyên tố đa lượng cần phải cung cấp là Nitrogen (N), Phosphorus (P), Potassium
(K), Magnesium (Mg), Calcium (Ca), Lưu huỳnh (S), Sodium (Na+), Chloride (Cl-).
Đối với cây trồng, các chất vô cơ đóng vai trò rất quan trọng như Mg2+ là thành
phần của phân tử diệp lục, Ca2+ là thành phần của màng tế bào, N là thành phần
quan trọng của amino acid, vitamin, protein và các acid nucleic.

3



* Các nguyên tố vi lượng
Các nguyên tố vi lượng thường được sử dụng với lượng nhỏ, nhưng đây là thành
phần không thể thiếu trong môi trường nuôi cấy. Các vi lượng thường thêm vào môi
trường là Iode (I), Bo (B), Mangan (Mn), Kẽm (Zn), Đồng (Cu), Molybden (Mo),
Cobalt (Co), Sắt (Fe). Nồng độ khoáng vi lượng sử dụng thường thấp hơn 30 mg/l.
Các nguyên tố này đóng vai trò quan trọng trong hoạt động của các enzym (Nguyễn
Xuân Linh, 1998).
* Nguồn cacbonhydrat
Các mẫu nuôi cấy mô thực vật nói chung không thể quang hợp hoặc quang hợp
rất thấp do thiếu chlorophyll, nồng độ CO2. Ngoài ra, nguồn carbon còn có tác dụng
điều hòa áp suất thẩm thấu của môi trường (Vũ Văn Vụ, 1999). Vì vậy phải đưa
thêm hợp chất cacbonhydrat vào thành phần môi trường nuôi cấy. Hai loại đường
mono và disaccharide đã được thí nghiệm. Đường sucrose thường được sử dụng
trong khoảng 2-5% (Nguyễn Bảo Toàn, 2004).
* Chất điều hòa sinh trưởng
Chất điều hòa sinh trưởng thực vật là những chất có hoạt tính sinh học rất lớn,
được tạo ra một lượng rất nhỏ để điều hòa các quá trình sinh trưởng và phát triển
của thực vật (Lê Văn Hòa và Nguyễn Bảo Toàn, 2004).
 Auxin
Trên cơ sở các hoạt tính sinh học của auxin, công nghiệp hóa chất đã tổng hợp
được các hóa chất hóa học có tác dụng giống IAA. Chúng được sử dụng trong nông
nghiệp có tác dụng như chất điều hòa sinh trưởng thực vật. Mặc dù cấu trúc hóa học
khác nhau, nhưng chúng được cấu tạo bởi các nhân: Napthalene, Phenoxy, Indole.
Các chất thường được sử dụng là Alpha- napthatelene acetic acid (NAA), 2,4Dichlorophenoxy acetic acid (2,4-D), Indole bytyric acid (IBA) (Lê Văn Hòa và
Nguyễn Bảo Toàn, 2004).
Auxin liên quan đến nhiều quá trình sinh lý trong cây. Vài ảnh hưởng quan
trọng của auxin điều hoà các quá trình sinh lý của thực vật có thể kể đến như sự
vươn dài tế bào, quang hướng động, địa hướng động, ưu thế chồi ngọn, sự tượng rễ,
sự sản sinh ethylen, sự phát triển trái... (Nguyễn Minh Chơn, 2004).
Đặc biệt là NAA có tác dụng tạo rễ, làm tăng khả năng hô hấp của tế bào và mô

nuôi cấy, tăng hoạt tính enzym và ảnh hưởng mạnh đến trao đổi chất của nitơ, tăng
khả năng tiếp nhận và sử dụng đường trong môi trường (Nguyễn Đức Thành, 2000).
Auxin thường được sử dụng kết hợp với cytokinin (Pierick, 1987). Theo Nguyễn
Văn Uyển (1993), nhóm auxin thường được sử dụng với nồng độ trong khoảng 0,15,0 mg/l, tùy theo nhu cầu và mục đích thí nghiệm.
4


 Cytokinin
Vị trí sinh tổng hợp cytokinin thường ở trong các mô có hoạt động phân sinh
mạnh, như tượng tầng mô gỗ, đỉnh sinh trưởng dinh dưỡng và lá non. Người ta cũng
phát hiện nồng cytokinin cao xuất hiện vào mùa xuân trong nhựa cây. Đỉnh rễ là vị
trí chính yếu của sự tạo hormone ở những cây con (Lê Văn Hòa và Nguyễn Bảo
Toàn, 2004).
Chức năng chính của cytokinin là kích thích sự phân bào. Ngoài ra, cytokinin
còn kích thích pha dãn dài lẫn pha chuyên hóa. Khi có tác dụng của auxin ở các
mức khác nhau, đối với các tế bào tách rời (nuôi cấy mô) sự cân đối giữa auxin và
cytokinin sẽ kích thích sự thành lập mô sẹo, rễ và chồi. Cytokinin còn có tác dụng
làm lá trẻ hóa (trì hoãn sự già cỗi) (Lê Văn Hòa và Nguyễn Bảo Toàn, 2004).
Các cytokinin thường được dùng trong nuôi cấy mô là kinetin (6furfurylaminopurin), BA (Benzyl adenine). Ngoài ra, một số cytokinin tổng hợp
như DPU (Diphenylurea), CPPU (N-(2-chloro-4-pyridyl)-N-phenylurea), TDZ
(Thidiazuron) cũng được dùng rộng rãi trong nuôi cấy mô (Nguyễn Bảo Toàn,
2004). TDZ là chất điều hòa sinh trưởng có hiệu quả trong nhân giống các loài cây
thân gỗ (Malik và Saxena, 1992).
TDZ ít bị phân hủy bởi enzym nội sinh so với các loại cytokinin khác, vì vậy nó
có hoạt tính cao ở nồng độ thấp (Mok và ctv., 1987). Nồng độ sử dụng TDZ thường
thấp hơn so với các chất điều hòa sinh trưởng thực vật khác. Ở nồng độ thấp, nó có
thể cho hệ số nhân chồi cao hơn các loại cytoknin khác và ở nồng độ cao TDZ có
thể kích thích mẫu cấy hình thành mô sẹo, chồi bất định hoặc phôi soma. Tuy nhiên,
TDZ lại ức chế sự vươn dài của chồi (Huetteman và Preece, 1993). Theo Eeckhaut
và ctv. (2010), TDZ là cytokinin kích thích nhân chồi đỗ quyên, tuy nhiên các chồi

tạo ra thường cứng và không hình thành rễ trong điều kiện in vivo vì vậy TDZ ít
được sử dụng trong giai đoạn nhân chồi nhưng TDZ lại thường được sử dụng trong
tái sinh chồi. Theo Huetteman và Preece (1993) cho rằng TDZ không ảnh hưởng
đến khả năng hình thành rễ bất định trên các loài đã được khảo sát.
* Vitamin
Thực vật cần vitamin để xúc tác các quá trình biến dưỡng khác nhau. Khi tế bào
và mô được nuôi cấy thì một vài vitamin trở thành yếu tố giới hạn của chúng
(Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002). Vitamin thường được sử dụng
nhất là Nicotinic acid, Pyridoxin (B6), Thiamin (B1), Myo- inositol (Nguyễn Bảo
Toàn, 2004).
* Nước dừa

5


Nước dừa là thành phần bổ sung vào môi trường nuôi cấy nhằm làm tăng sinh
trưởng và phát triển của mô. Các loại khoáng, acid amin, myo-inositol, chất béo và
các chất điều hòa sinh trưởng như cytokinin đã được chứng minh có trong nước dừa
(Vũ Văn Vụ, 1999). Các thành phần này có hàm lượng thay đổi khác nhau giữa quả
non, quả già, thậm chí khác nhau giữa những quả cùng độ tuổi (Vũ Văn Vụ và ctv.,
2006).
* Agar
Agar là một loại polysaccharide của tảo biển được sử dụng làm chất đệm cho
môi trường dinh dưỡng đông cứng lại (tạo môi trường đặc hay môi trường bán đặc)
(Lê Trần Bình và ctv., 1997), làm giá thể cho mô tế bào thực vật nuôi cấy (Nguyễn
Xuân Linh, 1998). Nồng độ agar được sử dụng sẽ ảnh hưỡng đến thế năng nước
trong môi trường nuôi cấy, độ cứng của môi trường, sự sinh trưởng của mẫu cấy,
các vấn đề sinh lý của mẫu cấy như sự thừa nước, sự hoạt động của cytokinin trong
môi trường có agar (Nguyễn Bảo Toàn, 2004).
* pH

pH của môi trường là một trong những yếu tố rất quan trọng ảnh hưởng đến khả
năng hòa tan của các ion khoáng, khả năng đông tụ agar và sự tăng trưởng của tế
bào. Ngoài ra sự bền vững và hấp thụ một số chất phụ thuộc vào pH môi trường,
đặc biệt mẫn cảm với pH là NAA, gibbrellin và các vitamin. Sự hấp thụ chất sắt
cũng phụ thuộc vào pH (Nguyễn Đức Thành, 2002). Theo Murashige và Skoog
(1962) nhận thấy rằng độ pH = 5,7-5,8 thích hợp duy trì sự hòa tan các chất khoáng
trong môi trường MS.
1.3 Một số kết quả nuôi cấy mô cây hoa dã yên thảo đã được công bố
Kết quả nghiên cứu của Trần Nguyên Vũ và ctv. (1999) cho thấy các đoạn thân
và lá của chồi non đang tăng trưởng trong điều kiện in vitro được nuôi cấy trên môi
trường MS có BA hoặc BA và NAA. Kết quả được ghi nhận trên giống hoa kép và
hoa đơn sau 10 ngày nuôi cấy. Tỷ lệ (%) thành lập chồi cao nhất từ mẫu cấy lá được
ghi nhận trên môi trường MS có 0,5 µM BA đối với giống hoa kép và 2 µM BA đối
với hoa đơn. Chồi được tái tạo từ lóng thân của cả hai giống trên môi trường MS bổ
sung 0,5 µM BA và 0,05 µM NAA.
Việc bổ sung nước dừa 5% kích thích cho sự kéo dài chồi non. Cây con có bộ rễ
khỏe mạnh được trồng thủy canh trong ½ MS trong 7-10 ngày trước khi ra vườn
ươm.
Theo kết quả nghiên cứu của Hassan và ctv. (2010) trong thí nghiệm nhân chồi
thì số chồi dã yên thảo trung bình cao nhất với môi trường bổ sung BA 0,8 mg/l và
NAA 0,1 mg/l. Đối với thí nghiệm tái sinh chồi từ mẫu cấy lá của hoa dã yến thảo
6


thì tỷ lệ chồi được tái sinh là 45% đã được quan sát trong môi trường MS có bổ
sung BA 2 mg/l.
Kết quả nghiên cứu của Huỳnh Ngọc Minh Tâm (2005) đã cho thấy môi trường
tốt nhất để nhân giống dã yên thảo gồm có: nước cá, nồng độ đường 50 g/l và auxin
được chọn là NAA. Điều kiện thuần dưỡng có tỉ lệ sống cao nhất là trùm bọc nilon
kín trong vòng 1 tuần.

Theo Kedong (2001) môi trường MS có bổ sung BA 1 mg/l cũng rất thích hợp
cho sự tái sinh chồi từ lá của cây hoa dã yên thảo.

7


CHƯƠNG 2 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1 Phương tiện nghiên cứu
2.1.2 Vật liệu
Thí nghiệm tiến hành trên mẫu lá của cây hoa dã yên thảo, Mẫu cấy là những
mẫu được cấy trong môi trường MS không có chất điều hòa sinh trưởng, mẫu cấy
được 3 tuần tuổi, cắt lấy lá bố trí thí nghiệm (Hình 2.1).

Hình 2.1 Bình chồi dã yên thảo 3 tuần tuổi được dùng để cắt lá thí nghi m

2.1.2 Địa điểm và thời gian tiến hành thí nghiệm
Các thí nghiệm được thực hiện tại phòng nuôi cấy mô của Bộ môn Sinh lý-Sinh
hóa, khoa Nông nghiệp & Sinh học ứng dụng, trường Đại học Cần Thơ.
Thời gian thí nghiệm: Đề tài được thực hiện từ tháng 12/2010 đến 5/2011
2.1.3 Thiết bị và hóa chất
Trang thiết bị thí nghiệm: tủ cấy vô trùng, cân điện tử, nồi thanh trùng
(Autoclave), máy đo pH, bếp khử trùng dụng cụ cấy, tủ sấy giấy, các dụng cụ thủy
tinh dùng trong thí nghiệm : ống đong, keo,...
Hóa chất gồm có: Môi trường khoáng đa lượng - vi lượng MS (Murashige và
Skoog, 1962). Vitamin như thiamin, pyridoxin, nicotinic acid, myo-inositol. Các chất
điều hòa sinh trưởng thực vật: Benzyl adenin (BA), naphthaleneacetic acid
(NAA), TDZ. Các chất khác như: đường sucrose, agar, nước dừa tươi.

8



2.1.4 Điều kiện thí nghiệm
Điều kiện phòng thí nghiệm: phòng nuôi cấy mô được trang bị máy điều hoà
nhiệt độ, đèn neon, có nhiệt độ 26oC ± 2, cường độ chiếu sáng 1.500 lux, thời gian
chiếu sáng 16 giờ/ngày.
2.2 Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy
Chuẩn bị môi trường: môi trường nuôi cấy cơ bản gồm môi trường dinh dưỡng
MS (phụ lục) và các chất bổ sung nước dừa (80 ml/l), đường (30 g/l), agar (7 g/l),
myo-inositol (100 mg/l), nicotinic acid (1 mg/l), pyridoxin (1 mg/l), thiamin (1 mg/l).
Tùy theo từng thí nghiệm mà thêm các chất điều hòa sinh trưởng: BA, NAA, TDZ.
Điều chỉnh pH môi trường về khoảng 5,7-5,8 trước khi nấu môi trường. Thể tích
môi trường trong keo là 40 ml. Môi trường được khử trùng ở 121 oC, áp suất 1 atm.
trong 20 phút.
2.2.2 Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm 1: Hiệu quả của BA và NAA trên sự tái sinh chồi từ lá dã yên thảo
Mục tiêu: Tìm nồng độ BA và NAA thích hợp cho sự tái sinh chồi từ lá của cây
dã yên thảo in vitro.
Vật liệu thí nghiệm: Chọn mẫu lá ở cặp lá thứ 3 hoặc thứ 4 từ trên xuống, có
kích thước tương đương nhau. Sau đó, dùng dao gạch 1 đường ở mặt dưới lá tạo vết
thương, khi cấy để mặt trên của lá tiếp xúc với môi trường.
Môi trường nuôi cấy: Bổ sung đường sucrose 30 g/l, chất điều hòa sinh trưởng
NAA và BA.
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên 2
nhân tố gồm 3 nồng độ BA và 2 nồng độ NAA với 6 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức
có 6 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại là 1 keo, 1 keo cấy 6 mẫu (Bảng 2.2).

Bảng 2.1 Các nghiệm thức của thí nghiệm 1

Nồng độ

NAA (mg/l)
0,5
1,0

Nồng độ BA (mg/l)
0,5

1,0

2,0

NT1

NT2

NT3

NT4

NT5

NT6

9


Các chỉ tiêu theo dõi:
- Tỷ lệ (%) tạo chồi
- Số chồi được tái sinh trên mẫu
- Chiều cao chồi

- Chiều dài mô sẹo
- Chiều cao mô sẹo
-Thời gian lấy chỉ tiêu: 1, 2, 3, 4 tuần sau khi cấy
2.2.3 Cách lấy chỉ tiêu
Chiều cao chồi (cm) được đo từ mặt môi trường tới lá cao nhất.
Số chồi được đếm là những chồi có kích thước > 0,3 cm
Chiều cao, (cm) được tính từ mặt agar có kích thước > 0,4 cm
Chiều dài mô sẹo, được đo có kích thước > 0,4 cm

Thí nghiệm 2: Hiệu quả của BA và TDZ trên sự tái sinh chồi từ lá dã yên thảo
Mục tiêu: Tìm nồng độ BA và NAA thích hợp cho sự tái sinh chồi từ lá của cây
dã yên thảo in vitro.
Vật liệu thí nghiệm: Chọn mẫu lá ở cặp lá thứ 3 hoặc thứ 4 từ trên xuống, có
kích thước tương đương nhau. Sau đó, dùng dao gạch 1 đường ở mặt dưới lá tạo vết
thương, khi cấy để mặt trên của lá tiếp xúc với môi trường.
Môi trường nuôi cấy: Bổ sung đường sucrose 30 g/l, chất điều hòa sinh trưởng
TDZ và BA.
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên 2
nhân tố gồm 3 nồng độ TDZ và 2 nồng độ BA với 6 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức
có 6 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại là 1 keo, 1 keo cấy 6 mẫu (Bảng 2.1).
Bảng 2.2 Các nghiệm thức của thí nghiệm 2

Nồng độ
BA (mg/l)
0,0
2,0

Nồng độ TDZ (mg/l)
0,0


0,2

0,4

NT1

NT3

NT5

NT2

NT4

NT6

10


Các chỉ tiêu theo dõi:
- Tỷ lệ (%) tạo chồi
- Số chồi được tái sinh trên mẫu
- Chiều cao chồi
- Chiều dài mô sẹo
- Chiều cao mô sẹo
- Thời gian lấy chỉ tiêu:1, 2, 3, 4 tuần sau khi cấy
2.3 Xử lý số liệu
Các số liệu thí nghiệm được xử lý bằng phần mềm thống kê MSTATC. Phân
tích phương sai (ANOVA), so sánh các giá trị trung bình bằng phương pháp kiểm
định LSD hoặc Duncan ở mức ý nghĩa 5% hoặc 1%.


11