BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

HUỲNH LÊ ANH NHI

HIỆU QUẢ CỦA BA (Benzyl Adenine) VÀ IBA (Indole-3Butyric Acid) TRÊN SỰ TÁI SINH CHỒI TỪ TỬ DIỆP CỦA
3 GIỐNG KHỔ QUA (Momordica charantia L.) IN VITRO

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP KỸ SƢ KHOA HỌC CÂY TRỒNG
CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ GIỐNG CÂY TRỒNG

Cần Thơ - 2014
i


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

HUỲNH LÊ ANH NHI

HIỆU QUẢ CỦA BA (Benzyl Adenine) VÀ IBA (Indole-3Butyric Acid) TRÊN SỰ TÁI SINH CHỒI TỪ TỬ DIỆP CỦA
3 GIỐNG KHỔ QUA (Momordica charantia L.) IN VITRO

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP KỸ SƢ KHOA HỌC CÂY TRỒNG
CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ GIỐNG CÂY TRỒNG

CÁN BỘ HƢỚNG DẪN
ThS. LÊ MINH LÝ

Cần Thơ – 2014
ii

TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG
BỘ MÔN DI TRUYỀN GIỐNG NÔNG NGHIỆP

Luận văn tốt nghiệp ngành Công nghệ giống cây trồng với đề tài:
“HIỆU QUẢ CỦA BA (Benzyl Adenine) VÀ IBA (Indole-3-Butyric Acid)
TRÊN SỰ TÁI SINH CHỒI TỪ TỬ DIỆP CỦA 3 GIỐNG
KHỔ QUA (Momordica charantia L.) IN VITRO”
do sinh viên HUỲNH LÊ ANH NHI thực hiện, kính trình lên hội đồng chấm luận văn
tốt nghiệp.

Cần Thơ, ngày … tháng … năm 2014
Cán bộ hƣớng dẫn

Ths. Lê Minh Lý

i


TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG
BỘ MÔN DI TRUYỀN GIỐNG NÔNG NGHIỆP

Hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp đã chấp thuận luận văn tốt nghiệp đính kèm với tên
đề tài: “HIỆU QUẢ CỦA BA (Benzyl Adenine) VÀ IBA (Indole-3-Butyric Acid)
TRÊN SỰ TÁI SINH CHỒI TỪ TỬ DIỆP CỦA 3 GIỐNG KHỔ QUA
(Momordica charantia L.) IN VITRO” do sinh viên HUỲNH LÊ ANH NHI thực
hiện và bảo vệ trƣớc hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp và đã đƣợc thông qua.

Luận văn đã đƣợc hội đồng đánh giá ở mức: ……… điểm.
Ý kiến hội đồng:
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………

Cần Thơ, ngày … tháng … năm 2014
Chữ ký của thành viên hội đồng

Thành viên 1

…………………..

Thành viên 2

…………………..

Thành viên 3

…………………..

Duyệt của khoa
Trƣởng khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng

ii


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân. Các số liệu, kết quả trình

bày trong luận văn là trung thực và chƣa từng đƣợc ai công bố trong bất kỳ công trình
luận văn nào trƣớc đây.

Tác giả luận văn

Huỳnh Lê Anh Nhi

i


TIỂU SỬ CÁ NHÂN

Họ và tên: Huỳnh Lê Anh Nhi

Giới tính: Nữ

Ngày/tháng/năm sinh: 24/10/1993

Dân tộc: Kinh

Họ tên cha: Huỳnh Chí Liêm
Họ tên mẹ: Lê Ngọc Oanh
Địa chỉ liên lạc: số 14/1, phƣờng Trà Nóc, Quận Bình Thủy, Tp. Cần Thơ.
Quá trình học tập:
Năm 1999 – 2004: Trƣờng tiểu học Trà Nóc 2, Quận Bình Thủy, Tp. Cần Thơ.
Năm 2004 – 2008: Trƣờng trung học cơ sở Trà Nóc, Quận Bình Thủy, Tp. Cần Thơ.
Năm 2008 – 2011: Trƣờng trung học phổ thông Trà Nóc, Quận Bình Thủy, Tp. Cần
Thơ.
Năm 2011 – 2014: Trƣờng Đại học Cần Thơ, Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng
dụng, ngành Công nghệ giống cây trồng, Khóa 37.

Cần Thơ, ngày … tháng … năm 2014
Ngƣời khai

Huỳnh Lê Anh Nhi

ii


LỜI CẢM TẠ
Kính dâng
Cha Mẹ đã sinh ra con và hết lòng nuôi con khôn lớn nên ngƣời và ăn học thành tài.
Xin tri ân sâu sắc
Cô Lê Minh Lý đã tận tình hƣớng dẫn, truyền đạt kinh nghiệm, giúp đỡ và đóng góp
những ý kiến quý báu cho em trong suốt thời gian thực hiện và hoàn thành đề tài.
Thầy cố vấn học tập Nguyễn Lộc Hiền đã quan tâm hƣớng dẫn em trong suốt khóa
học.
Quý Thầy Cô Trƣờng Đại Học Cần Thơ, đặc biệt là quý Thầy Cô Khoa Nông nghiệp
và Sinh học ứng dụng đã truyền đạt những kiến thức quý báu cho em hoàn thành khóa
học.
Xin chân thành cảm ơn
Quý Thầy Cô và các anh chị làm việc trong Bộ môn Sinh Lý – Sinh Hóa đã giúp đỡ,
tạo điều kiện cho em hoàn thành tốt luận văn này.
Chị Triệu Phƣơng Thảo, em Lâm Huyền Trâm đã nhiệt tình giúp đỡ tôi hoàn thành tốt
luận văn này.
Tập thể lớp Công nghệ giống cây trồng khóa 37 đã đồng hành và giúp đỡ tôi trong quá
trình học tập và rèn luyện suốt khóa học.
Xin gửi đến mọi ngƣời những lời chúc tốt đẹp nhất!

HUỲNH LÊ ANH NHI


iii


HUỲNH LÊ ANH NHI, 2014. “Hiệu quả của BA (Benzyl Adenine) và IBA (Indole3-Butyric Acid) trên sự tái sinh chồi từ tử diệp của 3 giống khổ qua (Momordica
charantia L.) in vitro”. Luận văn tốt nghiệp kỹ sƣ Khoa học cây trồng, chuyên ngành
Công nghệ giống cây trồng, Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng, Trƣờng Đại
học Cần Thơ.
Cán bộ hƣớng dẫn: Ths. Lê Minh Lý

TÓM LƢỢC
Hiện nay, tái sinh chồi từ tử diệp là một trong những phƣơng pháp hiệu quả trong tạo
chồi in vitro. Đề tài “Hiệu quả của BA (Benzyl Adenine) và IBA (Indole-3-Butyric
Acid) trên sự tái sinh chồi từ tử diệp của 3 giống khổ qua (Momordica charantia
L.) in vitro” đƣợc thực hiện nhằm tìm ra nồng độ chất điều hòa sinh trƣởng phù hợp
cho sự tái sinh chồi từ tử diệp trên 3 giống khổ qua khác nhau làm tiền đề cho những
nghiên cứu về chọn tạo giống khổ qua sau này. Đề tài gồm 3 thí nghiệm đƣợc thực
hiện tại bộ môn Sinh lý – Sinh hóa, Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng, Trƣờng
Đại học Cần Thơ từ tháng 10/2013 đến tháng 12/2014. Kết quả thí nghiệm cho thấy:
(1) Môi trƣờng MS bổ sung BA 1,0 mg/l cho hiệu quả tái sinh chồi tốt; Giống khổ qua
Jupiter 25 cho hiệu quả tái sinh chồi cao hơn hai giống TN 166 và CN 0243; Giống
Jupiter 25 và CN 0243 trên môi trƣờng bổ sung BA 2 mg/l và giống TN 166 trên môi
trƣờng bổ sung BA 1 mg/l cho hiệu quả tái sinh chồi tốt. (2) Môi trƣờng bổ sung BA
0,2 mg/l cho hiệu quả nhân chồi tốt; Giống khổ qua Jupiter 25 ở môi trƣờng bổ sung
BA 0,2 – 0,5 mg/l, giống TN 166 ở môi trƣờng BA 0,2 mg/l và giống CN 0243 ở môi
trƣờng BA 1,0 mg/l cho số chồi gia tăng cao. (3) Môi trƣờng MS + than hoạt tính 2 g/l
+ IBA 1,0 mg/l thích hợp tạo rễ cho chồi khổ qua giống Jupiter 25 in vitro.
Từ khóa: BA, IBA, khổ qua, nhân chồi, tái sinh chồi, tạo rễ, tử diệp.

iv



MỤC LỤC
NỘI DUNG

Trang

LỜI CAM ĐOAN

i

TIỂU SỬ CÁ NHÂN

ii

LỜI CẢM TẠ

iii

TÓM LƢỢC

iv

MỤC LỤC

v

DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT

vii


DANH MỤC BẢNG

viii

DANH MỤC HÌNH

ix

MỞ ĐẦU

1

CHƢƠNG 1 LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU

2

1.1 SƠ LƢỢC VỀ CÂY KHỔ QUA

2

1.1.1 Nguồn gốc và sự phân bố

2

1.1.2 Đặc tính sinh học

2

1.1.3 Đặc tính ba giống khổ qua thí nghiệm


2

1.1.4 Giá trị dinh dƣỡng

2

1.1.5 Giá trị dƣợc liệu

3

1.2 SƠ LƢỢC VỀ NUÔI CẤY MÔ

3

1.2.1 Các giai đoạn nuôi cấy

3

1.2.2 Môi trƣờng nuôi cấy

4

1.3 SƠ LƢỢC VỀ TÁI SINH CHỒI

6

1.3.1 Cơ sở khoa học

6


1.3.2 Sự tái sinh mẫu cấy

7

1.3.3 Một số nghiên cứu về tái sinh chồi từ tử diệp

7

1.4 HIỆN TƢỢNG THƢỜNG GẶP TRÊN CÂY CẤY MÔ

8

1.4.1 Hiện tƣợng thủy tinh thể

8

1.4.2 Hiện tƣợng cấu trúc bất thƣờng

9

CHƢƠNG 2 PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

10

2.1 PHƢƠNG TIỆN

10
v



2.1.1 Thời gian và địa điểm

10

2.1.2 Vật liệu thí nghiệm

10

2.1.3 Các trang thiết bị, dụng cụ và hóa chất dùng trong thí nghiệm

10

2.2 PHƢƠNG PHÁP

10

2.2.1 Chuẩn bị môi trƣờng nuôi cấy

10

2.2.2 Vô trùng mẫu cấy

11

2.2.3 Bố trí thí nghiệm

11

2.2.4 Phân tích số liệu


13

CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

14

3.1 HIỆU QUẢ CỦA NỒNG ĐỘ BA TRÊN SỰ TÁI SINH CHỒI TỪ TỬ DIỆP
CỦA BA GIỐNG KHỔ QUA
14
3.1.1 Tỷ lệ mẫu tạo chồi
14
3.1.2 Số chồi
17
3.1.3 Chiều cao chồi
18
3.1.4 Số lá
19
3.2 HIỆU QUẢ CỦA NỒNG ĐỘ BA TRÊN SỰ NHÂN CHỒI CỦA BA GIỐNG
KHỔ QUA
20
3.2.1 Số chồi gia tăng
20
3.2.2 Chiều cao chồi gia tăng
22
3.2.3 Số lá gia tăng
24
3.3 HIỆU QUẢ CỦA NỒNG ĐỘ IBA TRÊN SỰ TẠO RỄ CỦA GIỐNG KHỔ
QUA JUPITER 25
26
3.3.1 Tỷ lệ (%) tạo rễ, số rễ và chiều dài rễ (cm)

3.3.2 Chiều cao gia tăng (cm) và số lá gia tăng

26
26

CHƢƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

28

4.1 KẾT LUẬN

28

4.2 ĐỀ NGHỊ

28

TÀI LIỆU THAM KHẢO

29

vi


DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT
ANOVA

Analysis of variance

BA


6- Benzyl adenine

ĐC

đối chứng

HgCl2

Clorua thủy ngân

IBA

Indole-3-butyric acid

in vitro

trong ống nghiệm

MS

môi trƣờng Murashige và Skoog (1962)

NT

nghiệm thức

TSKC

tuần sau khi cấy


vii


DANH SÁCH BẢNG
Bảng

Tên bảng

Trang

2.1

Bố trí các nghiệm thức thí nghiệm 1

11

2.2

Bố trí các nghiệm thức thí nghiệm 2

12

3.1

Tỷ lệ (%) mẫu tạo chồi của 3 giống khổ qua trên môi trƣờng có nồng độ
BA khác nhau ở 2 TSKC

14


3.2

Tỷ lệ (%) mẫu tạo chồi của 3 giống khổ qua trên môi trƣờng có nồng độ
BA khác nhau ở 3 TSKC

15

3.3

Số chồi tái sinh của 3 giống khổ qua trên môi trƣờng có nồng độ BA khác
nhau ở 2 TSKC

27

Số chồi của 3 giống khổ qua trên môi trƣờng có nồng độ BA khác nhau ở
3 TSKC

18

Chiều cao chồi (cm) của 3 giống khổ qua trên môi trƣờng có nồng độ BA
khác nhau ở 3 TSKC

18

3.4
3.5

3.6
3.7


Số lá của 3 giống khổ qua trên môi trƣờng có nồng độ BA khác nhau ở 2
TSKC
Số lá của 3 giống khổ qua trên môi trƣờng có nồng độ BA khác nhau ở 3
TSKC

19
20

3.8

Số chồi gia tăng trên 3 giống khổ qua trong môi trƣờng có nồng độ BA
khác nhau ở 1 TSKC

21

3.9

Số chồi gia tăng của 3 giống khổ qua trên môi trƣờng có nồng độ BA khác
nhau ở 3 TSKC

22

3.10

Chiều cao chồi gia tăng (cm) của 3 giống khổ qua trên môi trƣờng có nồng
độ BA khác nhau ở 1 TSKC

23

3.11


Chiều cao chồi gia tăng (cm) của 3 giống khổ qua trên môi trƣờng có nồng
độ BA khác nhau ở 3 TSKC

24

3.12

Số lá gia tăng của 3 giống khổ qua trên môi trƣờng có nồng độ BA khác
nhau ở 1 TSKC

24

3.13

Số lá gia tăng của 3 giống khổ qua trên môi trƣờng có nồng độ BA khác
nhau ở 3 TSKC

25

3.14

Tỷ lệ (%) tạo rễ, số rễ và chiều dài rễ (cm) của chồi khổ qua giống Jupiter
25 trên môi trƣờng có nồng độ IBA khác nhau ở 3 TSKC

26

3.15

Chiều cao gia tăng (cm) và số lá gia tăng của chồi khổ qua giống Jupiter

25 trên môi trƣờng có nồng độ IBA khác nhau ở 3 TSKC

27

viii


DANH SÁCH HÌNH
Hình

Tên hình

Trang

2.1

Hạt khổ qua đã nảy mầm 12 ngày (A), vị trí mẫu cấy trên hạt khổ qua (B)
và mẫu cấy sau khi cắt và loại bỏ chồi mầm (C)

11

3.1

Vị trí phát sinh chồi trên tử diệp khổ qua

15

3.2

Sự hình thành chồi khổ qua của (A) Giống TN 166 (B) Giống Jupiter 25

(C) Giống CN 0243 sau 3 tuần nuôi cấy

16

3.3

Chồi khổ qua giống Jupiter 25 trên môi trƣờng bổ sung BA 2 mg/l ở 2
TSKC bị vàng lá (A) và phát triển xanh tốt (B)

20

3.4

Chồi khổ qua (A) giống Jupiter 25 (B) giống TN 166 (C) giống CN 0243
phát triển thành cụm ở 3 TSKC

22

3.5

Chồi khổ qua phát sinh rễ trên môi trƣờng đối chứng ở 1 TSKC

23

3.6

Chồi khổ qua trong thí nghiệm nhân chồi ở 3 TSKC

25


3.7

Chồi khổ qua tạo mô sẹo trong thí nghiệm tạo rễ trên môi trƣờng không bổ
sung IBA ở 3 TSKC

27

3.8

Chồi khổ qua giống Jupiter 25 tạo rễ ở 3 TSKC

27

ix


MỞ ĐẦU
Khổ qua (Momordica charantia L.) là loại cây vừa mang nhiều giá trị dinh dƣỡng cần
thiết vừa là nguồn dƣợc liệu quý giá cho con ngƣời. Thêm vào đó, khổ qua còn là một
trong những loại rau màu có giá trị kinh tế cao đƣợc trồng phổ biến ở các nƣớc nhiệt
đới và cận nhiệt đới. Tuy nhiên, hầu hết hạt khổ qua đƣợc sử dụng gieo trồng hiện nay
là hạt giống lai F1 thƣờng có thời gian sinh trƣởng ngắn và đƣợc trồng quanh năm
nhƣng nếu chỉ trồng bằng hạt thì hệ số nhân giống không cao. Ngoài ra, việc nghiên
cứu chọn tạo giống khổ qua mới cũng sẽ tốn nhiều chi phí, công sức và thời gian. Hiện
nay, phƣơng pháp nhân giống vô tính bằng nuôi cấy in vitro đang dần trở nên phổ biến
và ngày càng có những bƣớc tiến mạnh mẽ, đáp ứng đƣợc yêu cầu nhân nhanh số
lƣợng cây giống (Nguyễn Bảo Toàn, 2010). Tái sinh chồi từ tử diệp là một trong
những phƣơng pháp hiệu quả trong tạo chồi in vitro và là một trong những ứng dụng
của công nghệ sinh học trong chọn giống cây trồng và tạo cây chuyển gen (Yan et al.,
2000).

Đề tài “Hiệu quả của BA (Benzyl Adenine) và IBA (Indole-3-Butyric Acid) trên sự
tái sinh chồi từ tử diệp của 3 giống khổ qua (Momordica charantia L.) in vitro”
đƣợc thực hiện nhằm xác định nồng độ chất điều hòa sinh trƣởng phù hợp cho sự tái
sinh chồi từ tử diệp trên ba giống khổ qua khác nhau phục vụ cho nhu cầu sản xuất và
làm tiền đề cho những nghiên cứu về chọn tạo giống khổ qua sau này.

1


CHƢƠNG 1 LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU
1.1 SƠ LƢỢC VỀ CÂY KHỔ QUA
1.1.1 Nguồn gốc và sự phân bố
Cây khổ qua có tên khoa học là Momordica charantia L. thuộc chi Momordica, họ bầu
bí (Cucurbitaceae). Tên gọi khác là mƣớp đắng, lƣơng qua, cẩm lệ chi,…Tên tiếng
Anh là Bittergrourd, Bitter cucumber,…
Khổ qua là một loài cây ăn quả nhiệt đới, có hơn 23 loài chủ yếu ở khu vực Đông Nam
Á, Châu Phi, và Nam Mỹ. Hiện nay khổ qua đƣợc trồng rộng rãi ở khắp nơi trong
vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới (Trần Thị Ba, 2012).
1.1.2 Đặc tính sinh học
Khổ qua là cây leo quấn hằng niên, thân mọc dài đến 5 m. Lá đơn, mọc cách, lá xẻ 3 9 thùy. Hoa đơn phái cùng cây, hoa mọc đơn độc ở nách lá, màu vàng, hoa đực có
cuống ngắn, hoa cái có cuống dài, bầu noãn hạ, phát triển rất nhanh trƣớc và sau khi
thụ phấn. Hoa thụ phấn nhờ côn trùng, chủ yếu là ong. Trái ăn tƣơi có thể thu hoạch 2
tuần sau khi thụ phấn, trái chứa từ 20 - 30 hạt.
Khổ qua thích nghi rộng với điều kiện thời tiết nên trồng đƣợc quanh năm trong vùng
nhiệt đới và á nhiệt đới. Cây phát triển tốt trong điều kiện nhiệt độ từ 20 - 35oC, vũ
lƣợng 1.500 – 2.500 mm và cao độ đến 1.000 m. Cây chịu đựng đƣợc nhiều điều kiện
đất khác nhau nhƣng phát triển tốt nhất trên đất thoát thủy tốt, giàu chất hữu cơ (Trần
Thị Ba, 2012).
1.1.3 Đặc tính ba giống khổ qua thí nghiệm
Giống TN 166: là giống khổ qua đƣợc quan tâm gần đây, giống này có khả năng thích

nghi với nhiều vùng khí hậu. Trái màu xanh bóng, thuôn dài, thịt dày, nặng 180-200 g,
vận chuyển xa tốt, đặc biệt không bị nứt trái vào mùa mƣa.
Giống Jupiter 25: là giống khổ qua sinh trƣởng mạnh, chống chịu tốt, trái dài 18-20
cm, có gai lớn, da bóng, đƣờng gai liền, thịt dày, cứng, chịu đƣợc vận chuyển.
Giống CN 0243: là giống khổ qua đƣợc ƣa chuộng trên thị trƣờng gần đây, sinh trƣởng
mạnh, chống chịu sâu bệnh tốt, thời gian thu hoạch khoảng 35 – 40 ngày sau khi gieo
hạt và có thể thu kéo dài 1 – 2 tháng.
( />1.1.4 Giá trị dinh dƣỡng
Khổ qua có giá trị dinh dƣỡng cao nên thƣờng có mặt trong bữa ăn hàng ngày. Thành
phần dinh dƣỡng trong 100 g trái khổ qua bao gồm 30 mg glucid, 99 mg protein, 50
mg vitamin B1, 16 mg Magiê, 0,9 mg sắt,…Ngoài ra khổ qua còn chứa nhiều khoáng
vi lƣợng thiết yếu tốt cho sức khỏe. Bên cạnh đó, khổ qua còn đƣợc chế biến làm trà ở
dạng sấy khô, là một mặt hàng có giá trị xuất khẩu cao (Trần Thị Ba, 2012).
2


1.1.5 Giá trị dƣợc liệu
Ngoài giá trị dinh dƣỡng, khổ qua còn đƣợc xem là cây thuốc nam quý với nhiều dƣợc
tính tốt. Theo Đƣờng Hồng Dật (2003), khổ qua có vị đắng, tính mát, có tác dụng sáng
mắt, mát gan, bổ thận và giảm mệt mỏi. Khổ qua còn có tác dụng kháng khuẩn, tăng
tính chống chịu của tế bào, chống ung bƣớu và ức chế sinh sản của một số loài siêu vi
khuẩn nhƣ polio, herpes hay simplex I. Thành phần glycocide trong trái khổ qua bao
gồm momordicin và charantin là những hỗn hợp steroid có tác dụng thanh nhiệt và
giúp hạ đƣờng huyết.
Dây khổ qua đƣợc dùng làm thuốc chữa viêm xoang, chảy nƣớc mũi hoặc bệnh gan
làm vàng da (Phạm Thị Thọ và Đỗ Huy Bích, 2003). Theo Hải Ân (2002) lá khổ qua
có vị đắng, tính mát, ăn lá non trị bệnh nóng bức trong mình. Hoa đƣợc dùng để chữa
đau dạ dày, lỵ cấp tính, đau mắt.
Chitinase chiết xuất từ khổ qua có tác dụng kìm vi khuẩn mạnh. Phấn hoa từ khổ qua
ức chế sự nảy mầm của bào tử một số nấm gây bệnh. Cao lá khổ qua chiết với cồn 950

có tác dụng kháng khuẩn trên Shigella dysenteriae, Escherichia coli và Salmonella
paratyphi. Cao hạt khổ qua có tác dụng diệt giun tròn (Đỗ Huy Bích et al., 2004).
1.2 SƠ LƢỢC VỀ NUÔI CẤY MÔ
1.2.1 Các giai đoạn nuôi cấy
Theo Debergh và Zimmerman (1991) thì quá trình vi nhân giống thƣờng trải qua 4 giai
đoạn (không kể giai đoạn 0).
Giai đoạn 0: Chuẩn bị cây mẹ
Cây dùng để lấy mẫu phải sạch bệnh và đang trong giai đoạn tăng trƣởng mạnh. Vì
vậy cây mẹ cần đƣợc bón phân, phun thuốc trừ sâu bệnh chu đáo.
Giai đoạn 1: Khử trùng mẫu cấy
Mẫu cấy đƣợc vô trùng để đạt đƣợc độ sạch cần thiết và cho tỷ lệ sống cao trƣớc khi
thực hiện thao tác cấy. Thông thƣờng khó đạt 100% trong kỹ thuật vô trùng mẫu.
Giai đoạn 2: Nhân nhanh
Trong giai đoạn này môi trƣờng nuôi cấy thƣờng đƣợc thêm vào chất điều hòa sinh
trƣởng cytokinin, thƣờng là BA (đƣợc sử dụng phổ biến nhất) hay 2-iP hoặc TDZ và
có thể có hoặc không kết hợp thêm một lƣợng nhỏ auxin (NAA, IAA,…), (Wehner và
Locy, 1981; George, 1993; Lê Trần Bình et al.., 1997). Hiệu quả của kích thích tố BA
là rất đa dạng, vừa có khả năng tạo chồi, nhân chồi và kéo dài chồi đồng thời với nồng
độ thấp BA có thể hỗ trợ sự thành lập rễ (Lee et al.,2003; Hashemloian et al., 2008).
Nhƣng hàm lƣợng cytokinin cao có thể dẫn đến sự thừa nƣớc, tạo thành bụi rậm, biến
dị vô tính,… cho mẫu cấy (Nguyễn Bảo Toàn, 2010).
3


Giai đoạn 3a: Kéo dài chồi
Môi trƣờng dùng để kéo dài chồi thƣờng không sử dụng cytokinin hoặc sử dụng với
một lƣợng yếu hơn so với giai đoạn 2.
Giai đoạn 3b: Kích thích tạo rễ và tiền thuần dƣỡng
Auxin thƣờng đƣợc sử dụng trong giai đoạn này để kích thích tạo rễ. Tạo rễ tốt nhất
thƣờng đạt đƣợc trên môi trƣờng với hàm lƣợng khoáng thấp. Bên cạnh đó có thể làm

tăng khả năng tự dƣỡng cho cây con với việc cung cấp carbohydrate hoặc làm thấp ẩm
độ tƣơng đối trong bình chứa, sử dụng nấm rễ, sử dụng chất trơ,… (Nguyễn Bảo Toàn,
2010).
Giai đoạn 4: Sự thuần dƣỡng
Cây con hoàn chỉnh đƣợc lấy ra khỏi môi trƣờng nuôi cấy in vitro, rửa sạch bộ rễ và
trồng vào giá thể nơi vƣờn ƣơm (George, 1993). Trong giai đoạn này cần quan tâm
đến tình trạng cây con khi chuyển ra vƣờn ƣơm và các yếu tố về môi trƣờng nhƣ nhiệt
độ, ẩm độ, ánh sáng,… (Nguyễn Bảo Toàn, 2010).
1.2.2 Môi trƣờng nuôi cấy
Thành phần môi trƣờng nuôi cấy sẽ thay đổi tùy theo loài, bộ phận nuôi cấy, sự phát
triển và phân hóa của tế bào. Môi trƣờng còn thay đổi tùy theo mục đích nghiên cứu
muốn duy trì ở dạng mô sẹo, tạo rễ hay tạo chồi trực tiếp hoặc gián tiếp.
Tuy nhiên về nguyên tắc, môi trƣờng nuôi cấy thƣờng gồm 6 thành phần cơ bản: nƣớc,
các nguyên tố khoáng đa lƣợng và vi lƣợng, nguồn carbohydrate, vitamin, chất điều
hòa sinh trƣởng. Ngoài ra cũng có thể cho thêm một số chất hữu cơ có thành phần xác
định (Amino acid, EDTA, EDDHA,…) hoặc không xác định nhƣ nƣớc dừa, dịch chiết
nấm men, dịch trích khoai tây, khóm,… (Nguyễn Bảo Toàn, 2010).
1.2.2.1 Nước
Phẩm chất nƣớc là điều kiện quan trọng trong nuôi cấy, nƣớc sử dụng trong nuôi cấy
thƣờng là nƣớc cất một lần. Trong một số trƣờng hợp ngƣời ta cũng sử dụng nƣớc cất
hai lần hoặc nƣớc khử khoáng (Nguyễn Bảo Toàn, 2010).
1.2.2.2 Các nguyên tố khoáng đa lượng
Theo Lê Văn Hòa et al. (2005), khoáng đa lƣợng rất cần cho cây, có ảnh hƣởng rất tốt
cho sự hấp thu của mô cấy và chúng không gây độc. Các nguyên tố đa lƣợng cần phải
cung cấp là Nitrogen (N), Phosphorus (P), Potassium (K), Magnesium (Mg), Calcium
(Ca), Lƣu huỳnh (S),… Đối với cây trồng, các chất vô cơ đóng vai trò rất quan trọng.
Nhƣ Mg2+ là thành phần của phân tử diệp lục, Ca2+ là thành phần của màng tế bào, N
là thành phần quan trọng của amino acid, vitamin, protein và các acid nucleic.
4



1.2.2.3 Các nguyên tố khoáng vi lượng
Khoáng vi lƣợng đóng vai trò quan trọng trong hoạt động của các enzyme, tuy chiếm
tỷ lệ nhỏ nhƣng lại là thành phần không thể thiếu trong môi trƣờng nuôi cấy. Các
nguyên tố khoáng vi lƣợng là các nguyên tố thƣờng đƣợc sử dụng ở liều lƣợng thấp
hơn 30 mg/l. Bao gồm sắt (Fe), Bo (B), Mangan (Mn), Iodine (I), Molybden (M),
Đồng (Cu), Kẽm (Zn), Nickel (Ni), Cobalt (Co), Nhôm (Al), (Nguyễn Bảo Toàn,
2010).
1.2.2.4 Nguồn carbohydrate
Hầu hết các mẫu vật nuôi cấy là dị dƣỡng, không có khả năng tổng hợp chất hữu cơ.
Nguồn carbohydrate giúp mô tế bào thực vật tổng hợp nên các chất hữu cơ, sự phân
chia của tế bào, tăng sinh khối. Bên cạnh đó, carbohydrate còn có tác dụng điều hòa áp
suất thẩm thấu của môi trƣờng (Vũ Văn Vụ, 1999).
Nguồn cacbon đƣợc bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy thƣờng là đƣờng. Hai loại
đƣờng thƣờng đƣợc sử dụng là sucrose và glucose, nhƣng hiện nay sucrose đƣợc sử
dụng phổ biến hơn với nồng độ từ 1-8% (Nguyễn Đức Lƣợng và Lê Thị Thủy Tiên,
2002).
1.2.2.5 Vitamin
Các vitamin thƣờng đƣợc sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô là: thiamin (B1), acid
nicotinic (PP), pyridoxine (B6) và Myo-inositol. Trong đó thiamin là một vitamin căn
bản cần thiết cho sự tăng trƣởng của tất cả các tế bào (Nguyễn Đức Lƣợng và Lê Thị
Thủy Tiên, 2002). Ngoài ra, myo-inositol có tác dụng cải thiện sự sinh trƣởng của mô
cấy và đƣợc dùng ở hàm lƣợng khoảng 10-100 mg/l (Đặng Phƣơng Trâm, 1997).
1.2.2.6 Agar
Agar là một loại polysaccharide của tảo biển đƣợc sử dụng làm chất đệm cho môi
trƣờng dinh dƣỡng đông cứng lại (tạo môi trƣờng đặc hay môi trƣờng bán đặc) (Lê
Trần Bình et al., 1997), làm giá thể cho mô tế bào thực vật nuôi cấy (Nguyễn Xuân
Linh, 1998). Do không phản ứng với các chất có trong môi trƣờng nuôi cấy và không
bị thủy phân bởi enzyme thực vật nên đƣợc sử dụng rộng rãi (Nguyễn Đức Lƣợng và
Lê Thị Thủy Tiên, 2002). Agar trộn với nƣớc thì tạo thành dạng gel và tan ra ở nhiệt

độ từ 60 đến 100oC và đặc lại khi nhiệt độ giảm xuống 45oC. Nồng độ agar thƣờng sử
dụng trong môi trƣờng nuôi cấy mô thực vật từ 0,5 đến 10%.
Về độ tinh khiết của agar trong môi trƣờng nuôi cấy, ngƣời ta đã chứng minh rằng
trong agar có chứa Ca, Mg, Na, K và việc thay đổi hàm lƣợng agar sẽ làm ảnh hƣởng
đến hàm lƣợng khoáng trong môi trƣờng nuôi cấy (Nguyễn Đức Lƣợng và Lê Thị
Thủy Tiên, 2002).
5


1.2.2.7 Than hoạt tính
Than hoạt tính cho vào môi trƣờng nhằm làm tối môi trƣờng nuôi cấy (tạo rễ), hấp thu
các phân tử kim loại và các phân tử có cấu trúc vòng (chất điều hòa sinh trƣởng) hoặc
các chất có phenol. Than hoạt tính có thể chứa các thành phần kích thích nhƣ
polyamine. Vì mỗi loại than có khả năng ngoại hấp khác nhau tùy vào công ty sản xuất
(Nguyễn Bảo Toàn, 2010).
1.2.2.8 Nước dừa
Nƣớc dừa là nội nhũ lỏng cung cấp các chất dinh dƣỡng nuôi phôi dừa. Thành phần
của nƣớc dừa khá phong phú nhƣ các loại khoáng, acid amin, myo-inositol, đƣờng,
chất béo và các chất thuộc nhóm cytokinin nhƣ zeatin,…(Vũ Văn Vụ et al., 2006).
1.2.2.9 pH
pH của môi trƣờng nuôi cấy mô có thể từ 5,0 đến 6,5 và thƣờng đƣợc điều chỉnh vào
khoảng 6,0. Môi trƣờng có pH thấp hơn 4,5 hoặc cao hơn 7,0 sẽ gây ức chế sự phát
triển của mô (Bùi Bá Bổng, 1995).
1.2.2.10 Chất điều hòa sinh trưởng
Các chất điều hòa sinh trƣởng có vai trò quan trọng trong quá trình phát sinh hình thái
của thực vật. Các chất kích thích sinh trƣởng gồm hai nhóm chính là auxin và
cytokinin, ngoài ra gibberellin và ethylen cũng có vai trò quan trọng đối với sinh
trƣởng, phát triển và trao đổi chất ở thực vật (Nguyễn Đức Thành, 2000). Tỷ lệ
cytokinin và auxin trong môi trƣờng nuôi cấy sẽ ảnh hƣởng đến sự thành lập chồi và
rễ. Một tỷ lệ cao cytokinin và auxin thấp thích hợp cho sự tạo chồi, ngƣợc lại tỷ lệ cao

auxin và cytokinin thấp thích hợp cho việc tạo rễ, còn với mức độ trung gian thích hợp
cho tạo mô sẹo. Cytokinin kích thích sự phân chia tế bào thực vật, tham gia vào quá
trình tạo chồi phụ, ức chế tạo rễ, phân chia tế bào, thành lập mô sẹo và tăng trƣởng,
kích thích mọc chồi nách, ức chế sự lão hóa lá. Các cytokinin tổng hợp thƣờng dùng
gồm Benzyl adenin (BA), Kinetin, 6- benzylaminopurin (BAP), Thidiazuron (TDZ)
(Nguyễn Bảo Toàn, 2010).
1.3 SƠ LƢỢC VỀ TÁI SINH CHỒI
1.3.1 Cơ sở khoa học
Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật dựa trên cơ sở tính toàn năng và khả năng phân
hóa, phản phân hóa của tế bào thực vật. Về bản chất, hai quá trình phân hóa và phản
phân hóa là kết quả của sự hoạt hóa, phân hóa các gen có trong tế bào. Ngày nay,
ngƣời ta đã chủ động điều khiển đƣợc sự phân hóa và phản phân hóa tế bào để tái sinh
một cây hoàn chỉnh từ tế bào mô thực vật tách rời nhờ vào việc chọn tạo đƣợc môi
trƣờng nuôi cấy thích hợp cho từng đối tƣợng thực vật (Phạm Văn Duệ, 2005).
6


Qua quá trình tái sinh chồi từ mảnh tử diệp thƣờng đi kèm với sự tạo mô sẹo. Sự xuất
hiện của khối mô sẹo này là do quá trình phản phân hóa xảy ra mạnh trong môi trƣờng
có cytokinin. Tuy nhiên, khả năng tạo chồi hoặc phôi soma từ các mô sẹo này rất thấp
và phải chuyển khối mô sẹo này sang một môi trƣờng tái sinh mới. Chính vì vậy, sự
hình thành khối mô sẹo này là không cần thiết trong quá trình tái sinh chồi trực tiếp
(Mendi et al., 2009).
1.3.2 Sự tái sinh mẫu cấy
Nguyễn Văn Uyển (1984) định nghĩa quá trình tái sinh là quá trình biểu hiện tính toàn
thể của tế bào, làm cho một tế bào (hay một mô) trở thành một cơ thể hoàn chỉnh. Cây
tái sinh là một yếu tố cực kỳ quan trọng trong cấy mô và chuyển gen. Không có cây tái
sinh thì việc chuyển gen không có ý nghĩa (Nguyễn Thị Lang, 2002).
Theo Nguyễn Đức Lƣợng và Lê Thị Thủy Tiên (2002) sự tái sinh cơ quan (tạo mới
hoặc tạo cơ quan bất định) không xảy ra ngay khi vừa cô lập mẫu cấy mà phải trải qua

quá trình phức tạp do có những mối tƣơng quan cần phải phá vỡ để lặp lại những mối
tƣơng quan khác có thể đƣa đến việc tái sinh cơ quan. Quá trình này gồm các bƣớc
sau:
- Sự phân hóa của những tế bào đã phân hóa (có thể dẫn đến sự tái sinh và trẻ hóa tế
bào).
- Sự phân chia tế bào, đôi khi thành mô sẹo khi tế bào phân chia thì xảy ra sự hình
thành cơ quan và tiến đến sự phát triển của cơ quan.
Sự phát sinh cơ quan từ mô sẹo tƣơng tự nhƣ phát sinh cơ quan trực tiếp từ mẫu cấy.
Tế bào mẫu cấy sẽ phản phân hóa dƣới tác động của chất điều hòa sinh trƣởng thực vật
để phân chia hỗn độn tạo thành mô sẹo. Khi thay đổi thành phần và nồng độ các chất
điều hòa sinh trƣởng thì tế bào mô sẹo lại đƣợc cảm ứng để phân hóa tạo thành cơ
quan.
Sự hình thành cơ quan đƣợc xác định là những cơ quan có cấu trúc, hình dạng, kích
thƣớc rõ ràng ví dụ nhƣ lá, hoa, trái,… Các cơ quan khác chƣa xác định là những cơ
quan chƣa hình thành cấu trúc, hình dạng rõ ràng nhƣ phân sinh mô rễ, phân sinh mô
chồi.
1.3.2 Một số nghiên cứu về tái sinh chồi từ tử diệp
1.3.2.1 Tái sinh chồi gián tiếp thông qua mô sẹo
Bên cạnh phƣơng pháp tái sinh chồi trực tiếp từ tử diệp thì tái sinh gián tiếp thông qua
mô sẹo vẫn có thể thực hiện đƣợc (Selvaraj et al., 2007), với phƣơng pháp này ngoài
sử dụng tử diệp còn có thể sử dụng trục hạ diệp mà vẫn cho kết quả hình thành mô sẹo
tốt (Pal et al., 2007).
7


Tuy nhiên việc tạo chồi trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua mô sẹo bằng trục hạ diệp sẽ
không hiệu quả so với tái sinh từ vật liệu ban đầu là tử diệp (Wehner và Locy, 1981);
(Oridate và Oosawa, 1986).
Moreno et al., (1985) đã tiến hành nuôi cấy mô sẹo từ tử diệp và trục hạ diệp của dƣa
lê (Cucumis melo L. Amarillo Oro) và kết quả cho thấy mẫu cấy từ tử diệp với nồng

độ IAA 1,5 mg/l và kinetin 6,0 mg/l sẽ cho tỷ lệ chồi cao nhất là 90% so với trục hạ
diệp.
Souzu et al., (2005) đã tiến hành thí nghiệm về hình thái phản ứng của lá và tử diệp
dƣa lê (Cucumis melo L. Amarillo Oro) trên môi trƣờng MS có bổ sung IAA 1,5 mg/l,
BA 1,0 mg/l và kinetin 6,0 mg/l và kết quả cho thấy tử diệp vẫn là nơi cho số chồi cao
nhất. Tiếp theo về sự cảm ứng của tuổi mẫu cấy (1, 3, 5 và 7 ngày tuổi) và cách cắt của
tử diệp thì mẫu cấy từ tử diệp 7 ngày tuổi trên môi trƣờng MS có bổ sung đồng thời
IAA 1,5 mg/l và BA 1,0 mg/l cho hiệu quả số chồi cao nhất và mẫu cấy cắt theo chiều
ngang cho kết quả cao nhất.
1.3.2.2 Tái sinh chồi trực tiếp từ tử diệp
Tái sinh chồi từ tử diệp là một kỹ thuật vi nhân giống tƣơng đối thông dụng và đƣợc
sử dụng phổ biến trên nhóm cây hai lá mầm thuộc họ đậu và bầu bí dƣa. Trên cây bí
ngô, Lee và Chung (2006) đã tiến hành tái sinh từ tử diệp hạt bí ngô 4 ngày sau khi
nảy mầm bằng phƣơng pháp in vitro.
Trên dƣa lê, hiệu quả của kiểu mẫu cấy kết hợp với nồng độ IAA, BAP lên sự vi nhân
giống cho thấy mẫu tử diệp ở vị trí gần phôi sẽ cho số chồi cao nhất sau 3 tháng nuôi
cấy trên môi trƣờng chỉ bổ sung BAP 0,5 mg/l. Ngoài ra Nabi et al.,(2002) qua nghiên
cứu trên cây thuộc họ bầu bí dƣa cũng cho rằng số chồi bất định đƣợc tạo ra từ tử diệp
là nhiều hơn so với nốt, đỉnh chồi và lá.
Đối với một số cây thuộc họ bầu bí dƣa khi sử dụng môi trƣờng MS có bổ sung thêm
BA với nồng độ 1mg/l sẽ cho hiệu quả tái sinh chồi cao, còn ở giai đoạn tạo rễ thì sử
dụng IBA 0,1 mg/l kết hợp với 2g/l than hoạt tính sẽ cho hiệu quả tạo rễ cao sau 2 tuần
nuôi cấy (Lee và Chung, 2006).
1.4 HIỆN TƢỢNG THƢỜNG GẶP TRÊN CÂY CẤY MÔ
1.4.1 Hiện tƣợng thủy tinh thể
Nguyễn Quang Thạch et al. (2005) nhận thấy rằng trong quá trình nhân nhanh in vitro
thƣờng xuất hiện hiện tƣợng cây bị “thủy tinh hóa” – thân, lá cây mọng nƣớc, trong
suốt, cấy rất khó sống khi đƣa ra ngoài môi trƣờng do bị mất nƣớc rất mạnh. Hiện
tƣợng này thƣờng xảy ra trong môi trƣờng lỏng hay môi trƣờng ít agar, sự trao đổi khí
thấp. Cây bị thủy tinh hóa thƣờng có hàm lƣợng lớp sáp bảo vệ thấp, cấu tạo có nhiều

phân tử phân cực nên dễ hấp thu nƣớc.
8


Để tránh hiện tƣợng thủy tinh hóa có thể tiến hành các giải pháp: giảm sự hút nƣớc của
cây bằng cách tăng nồng độ đƣờng hoặc các chất có áp suất thẩm thấu cao, giảm nồng
độ các chất chứa nitơ trong môi trƣờng, tăng cƣờng ánh sáng và giảm nhiệt độ phòng
nuôi cấy.
1.4.2 Hiện tƣợng cấu trúc bất thƣờng
Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật hầu hết các cơ quan hình thành từ mẫu cấy hoặc từ
các callus (mô sẹo) có các cấu trúc dễ nhận biết, ví dụ nhƣ chồi, rễ hoặc phôi vô tính.
Tuy nhiên trong quá trình biến đổi thành các cơ quan này, có một số quá trình đƣợc
điều tiết bên trong cơ thể không đƣợc hoàn tất hoặc ngừng hẳn. Điều này có thể dẫn
đến kết quả hình thành nên các cơ quan mới có các cấu trúc bất thƣờng (Nguyễn Bảo
Toàn, 2010).

9


CHƢƠNG 2 PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP
2.1 PHƢƠNG TIỆN
2.1.1 Thời gian và địa điểm
Các thí nghiệm đƣợc thực hiện tại phòng nuôi cấy mô của Bộ môn Sinh lý - Sinh hóa,
Khoa Nông Nghiệp & Sinh Học Ứng Dụng, Trƣờng Đại Học Cần Thơ. Điều kiện
phòng thí nghiệm: nhiệt độ 26oC± 2, cƣờng độ chiếu sáng 1000– 2000 lux, thời gian
chiếu sáng 16 giờ/ngày.
Thời gian thực hiện từ tháng 10/2013 đến tháng 12/2014.
2.1.2 Vật liệu thí nghiệm
Thí nghiệm đƣợc tiến hành trên 3 loại hạt giống khổ qua gồm TN 166, Jupiter 25và
CN 0243.

2.1.3 Các trang thiết bị, dụng cụ và hóa chất dùng trong thí nghiệm
- Trang thiết bị cơ bản trong phòng thí nghiệm nuôi cấy mô.
- Hóa chất:
+ Khoáng đa, vi lƣợng.
+ Vitamin: thiamine HCl (B1), pyridoxine HCl (B6), nicotinic acid (niacine).
+ Chất điều hòa sinh trƣởng thực vật: benzyl adenine (BA), indole-3-butyric acid
(IBA) nhập từ hãng Merck của Đức.
+ Đƣờng sucrose, agar, nƣớc dừa tƣơi, sắt EDTA.
+ Chất khử trùng: HgCl2 0,05%, javel 10%, cồn 700.
2.2 PHƢƠNG PHÁP
2.2.1 Chuẩn bị môi trƣờng nuôi cấy
Môi trƣờng nền đƣợc sử dụng là môi trƣờng đa vi lƣợng MS (Murashige và Skoog,
1962) có bổ sung đƣờng sucrose (30 g/l), agar (6,8 g/l), nƣớc dừa tƣơi (100 ml/l),
vitamin (Thiamin, Pyrydoxin và nicotinic acid). Tùy theo từng thí nghiệm mà bổ sung
chất điều hòa sinh trƣởng BA hay IBA ở nồng độ khác nhau và đƣợc điều chỉnh về pH
5,7- 5,8 trƣớc khi nấu.
Thí nghiệm 1, môi trƣờng đƣợc chuẩn bị trong các bình tam giác 250 ml (khoảng 125
ml/bình) và đƣợc rót vào đĩa petri sau khi thanh trùng (mỗi đĩa 20 ml). Thí nghiệm 2
và thí nghiệm 3, môi trƣờng đƣợc rót vào keo đậy nắp có lỗ đƣợc lót giấy bên trong và
bao ngoài nắp (mỗi keo 50 ml) trƣớc khi thanh trùng.
Môi trƣờng đƣợc hấp khử trùng với nhiệt độ là 121oC, áp suất 1 atm, trong 20 phút.
10


2.2.2 Vô trùng mẫu cấy
Hạt khổ qua đƣợc đƣa vào tủ vô trùng ngâm 20 phút trong nƣớc ấm nhiệt độ khoảng
50oC (2 sôi 3 lạnh), sau đó rửa bằng cồn 700 trong 30 giây rồi tiến hành ngâm trong
dung dịch javel 10% trong thời gian 3 phút, sau đó rửa lại 3 lần bằng nƣớc cất đã khử
trùng. Sau khi khử trùng hạt, tiến hành tách vỏ hạt rồi khử lại bằng dung dịch clorua
thủy ngân (HgCl2) 0,05% trong thời gian 10 phút và rửa sạch lại bằng nƣớc cất vô

trùng 3- 4 lần.
Cấy hạt vào keo môi trƣờng nền có bổ sung BA 0,2 mg/l và đặt trong tối 12 ngày.
2.2.3 Bố trí thí nghiệm
2.2.3.1 Thí nghiệm 1: Hiệu quả của nồng độ BA trên sự tái sinh chồi trực tiếp từ tử
diệp của ba giống khổ qua.
Mục tiêu: Tìm đƣợc nồng độ BA thích hợp cho sự tái sinh chồi từ tử diệp ở ba giống
khổ qua.
Vật liệu: Hạt khổ qua sau khi nảy mầm đƣợc 12 ngày thì đƣa vào tủ cấy để tiến hành
cắt mẫu. Dùng dao tách hai tử diệp ra sau đó cắt bỏ một nửa tử diệp (phần xa trục
phôi) và phần trục hạ diệp (để lại 1 mm phía gần trục phôi) (Hình 2.1).

A

B

C

Mẫu cấy

Hình 2.1 Hạt khổ qua đã nảy mầm 12 ngày (A), vị trí mẫu cấy trên hạt khổ qua (B) và
mẫu cấy sau khi cắt và loại bỏ chồi mầm (C)

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm đƣợc bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên hai nhân
tố gồm ba giống khổ qua và bốn nồng độ BA, mỗi nghiệm thức gồm 4 lần lặp lại, mỗi
lặp lại 2 đĩa petri, mỗi đĩa petri 4 mẫu cấy (Bảng 2.1).
Bảng 2.1 Bố trí các nghiệm thức thí nghiệm 1
TN 166

Giống
Jupiter 25


CN 0243

0

NT 1

NT 5

NT 9

1,0

NT 2

NT 6

NT 10

2,0

NT 3

NT 7

NT 11

3,0

NT 4


NT 8

NT 12

Nồng độ BA (mg/l)

11


Các chỉ tiêu theo dõi:
-

Tỷ lệ (%) mẫu cấy tạo chồi
Tỷ lệ (%) mẫu cấy tạo mô sẹo
Số chồi tái sinh trên mỗi mẫu cấy
Chiều cao chồi (cm)
Số lá trên mỗi chồi

2.2.3.2 Thí nghiệm 2: Hiệu quả của nồng độ BA trên sự nhân chồi của ba giống khổ
qua
Mục tiêu: Tìm đƣợc nồng độ BA thích hợp cho sự nhân chồi của ba giống khổ qua.
Vật liệu thí nghiệm: chồi đƣợc chọn ra từ thí nghiệm 1, các chồi tách từ cụm chồi in
vitro sẽ đƣợc cấy chuyền trên môi trƣờng MS. Sau khoảng 2 tuần nuôi cấy, từ những
chồi này chọn ra những chồi đủ tiêu chuẩn làm vật liệu thí nghiệm, mẫu chọn là những
chồi ngọn đã phát triển hoàn toàn, khỏe mạnh, các mẫu tƣơng đối đồng đều, chiều cao
trung bình từ 1,5 – 2,0 cm, mẫu phát triển bình thƣờng không dị dạng, không thủy tinh
thể, chƣa có tua cuốn.
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm đƣợc bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên hai nhân
tố, 4 lần lặp lại, mỗi lặp lại 2 keo, mỗi keo 4 mẫu (Bảng 2.2).

Bảng 2.2 Bố trí các nghiệm thức thí nghiệm 2
Nồng độ BA (mg/l)

Giống
TN 166

Jupiter 25

CN 0243

0

NT 1

NT 5

NT 9

0,2

NT 2

NT 6

NT 10

0,5

NT 3


NT 7

NT 11

1,0

NT 4

NT 8

NT 12

Các chỉ tiêu theo dõi:
-

Số chồi gia tăng (ghi nhận chồi phát triển từ 0,2 cm trở lên)
Số lá gia tăng (đếm lá vừa bung ra)
Chiều cao chồi gia tăng (cm)

2.2.3.3 Thí nghiệm 3: Hiệu quả của nồng độ IBA trên sự tạo rễ của giống khổ qua
Jupiter 25
Mục tiêu: Tìm nồng độ IBA thích hợp cho sự tạo rễ trên giống khổ qua Jupiter 25.
Vật liệu thí nghiệm: chọn các chồi ngọn khỏe mạnh, phát triển tƣơng đối đồng đều,
chiều cao trung bình từ 1,5 – 2,0 cm, không dị dạng, không thủy tinh thể, chƣa có tua
cuốn.
12