VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
------ -- --

------

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI:

“NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN CHUYỂN HÓA SUCROSE
THÀNH ISOMALTULOSE SỬ DỤNG VI SINH VẬT"

Giáo viên hướng dẫn: PGS. TS. Vũ Nguyên Thành
Sinh viên thực hiện: Trương Thị Tú Anh
Lớp: K20 - 1302

Hà Nội – 2017


Viện đại học Mở Hà Nội

Khoa Công Nghệ Sinh Học

LỜI CẢM ƠN
Với lòng biết ơn sâu sắc em xin gửi lời cảm ơn chân thành của mình tới
PGS. TS. Vũ Nguyên Thành đã tận tình hướng dẫn, truyền thụ cho em những
kiến thức chuyên môn vô cùng quý báu cũng như lòng nhiệt tình trong suốt quá
trình hoàn thành khóa luận tốt nghiệp của mình.
Em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới Ban Giám hiệu Viện Đại học Mở Hà
Nội, Ban Chủ nhiệm khoa Công nghệ sinh học và các thầy cô giáo Bộ môn đã
động viên chỉ dẫn, đóng góp ý kiến và tạo điều kiện thuận lợi để em hoàn thành

luận văn này.
Đồng thời em xin chân thành cảm ơn ThS.Nguyễn Thanh Thủy và ThS.Cao
Xuân Bách và các anh chị làm việc tại Trung tâm Vi sinh vât Công nghiệp –
Viện Công nghiệp Thực phẩm đã nhiệt tình hướng dẫn, giúp đỡ em trong suốt
quá trình học tập và hoàn thành đề tài nghiên cứu của mình..
Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè, những người
đã luôn bên cạnh động viên, khích lệ, giúp đỡ em trong suốt thời gian học tập
và nghiên cứu.
Do thời gian và khả năng của bản thân còn hạn chế, vì vậy bài khóa luận
của em không tránh khỏi những thiếu sót. Em rất mong nhận được sự chỉ bảo
của thầy cô và sự đóng góp ý kiến của các bạn để khóa luận của em được đầy
đủ và hoàn chỉnh hơn.
Một lần nữa, em xin chân thành cảm ơn !
Hà Nội, ngày tháng năm 2017
Sinh viên
Trương Thị Tú Anh
Trương Thị Tú Anh - 1302


Viện đại học Mở Hà Nội

Khoa Công Nghệ Sinh Học
MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN ............................................................................................... 1
PHẦN 1: TỔNG QUAN ............................................................................... 4
1.1 Đường Isomaltulose ............................................................................... 4
1.1.1 Cấu trúc của Isomaltulose..................................................................... 4
1.1.2 Tính chất của đường Isomaltulose ........................................................ 5
1.1.3 Enzyme chuyển hóa sucrose thành isomaltulose................................... 6

1.2 Đặc điểm sinh hóa .................................................................................. 8
1.2.1 Khả năng tiêu hóa ................................................................................. 8
1.2.2 Sự trao đổi chất .................................................................................... 9
1.2.3 Vai trò và chức năng của đường Isomaltulose .................................... 11
1.3 Tình hình sản xuất đường Isomaltulose trên thế giới ............................ 12
1.4 Tình hình sản xuất Isomaltulose ở Việt Nam ........................................ 13
PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................... 13
2.1 Nguyên vật liệu ...................................................................................... 13
2.1.1 Chủng giống ....................................................................................... 14
2.1.2 Hóa chất ............................................................................................. 15
2.1.3 Thành phần các môi trường dùng trong nghiên cứu ............................ 15
2.2 Máy móc, thiết bị ................................................................................. 16
2.3 Các phương pháp nghiên cứu ............................................................... 17
2.3.1 Nuôi cấy vi sinh vật ............................................................................ 17
Trương Thị Tú Anh - 1302


Viện đại học Mở Hà Nội

Khoa Công Nghệ Sinh Học

2.3.2 Nhuộm tế bào vi khuẩn Gram ............................................................. 17
2.3.3 Điều kiện chuyển hóa sucrose thành isomaltulose .............................. 18
2.3.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chuyển hóa sucrose thành
isomaltulose

............................................................................................. 19

2.4 Các phương pháp phân tích .................................................................. 22
2.4.1 Phương pháp xác định đường khử bằng DNS ..................................... 22

2.4.2 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ................................ 25
PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................... 27
3.1 Tuyển chọn chủng có khả năng sinh enzyme chuyển hóa hiệu suất cao ....
........................................................................................................... 27
3.2 Đặc điểm hình thái và phân loại vi khuẩn ............................................. 32
3.3 Điều kiện chuyển hóa sucrose thành isomaltulose ................................ 34
3.3.1 Thời gian chuyển hóa ......................................................................... 35
3.3.2 Ảnh hưởng của pH trong quá trình chuyển hóa................................... 36
3.3.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ quá trình chuyển hóa .................................... 38
3.3.4 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất ......................................................... 39
3.4 Quy trình sản xuất isomaltulose trong phòng thí nghiệm ...................... 41
PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................... 43
4.1 Kết luận ................................................................................................ 43
4.2 Kiến nghị ............................................................................................... 44
TÀI LIỆU THAM KHẢO.......................................................................... 45

Trương Thị Tú Anh - 1302


Viện đại học Mở Hà Nội

Khoa Công Nghệ Sinh Học

NHỮNG TỪ VIẾT TẮT
PCA

Plate count agar

SPY


Sucrose peptone yeast extract

rpm

Revolutions Per Minute

DNS

Dinitrosalicylic acid

WHO

World Health Organization

HPLC

High Performance Liquid Chromatography

GI

Glycemic Index

Trương Thị Tú Anh - 1302


Viện đại học Mở Hà Nội

Khoa Công Nghệ Sinh Học
DANH MỤC BẢNG


Bảng 1 Danh sách mẫu và các chủng vi khuẩn sinh isomaltulose ................. 14
Bảng 2 Tỉ lệ pha đệm axit axetic .................................................................. 20
Bảng 3 Tỉ lệ pha đệm sodium phosphate ...................................................... 21
Bảng 4 Pha nồng độ đường của đường chuẩn ............................................... 23
Bảng 5 Hình thái tế bào của các chủng được lựa chọn khảo sát ................... 33

Trương Thị Tú Anh - 1302


Viện đại học Mở Hà Nội

Khoa Công Nghệ Sinh Học
DANH MỤC HÌNH

Hình 1 Sơ đồ chuyển hóa của sucrose dưới tác dụng của sucrose. .................. 5
Hình 2 Công thức cấu tạo của Isomaltulose .................................................... 6
Hình 3. Đồ thị đường chuẩn Isomaltulose. ................................................... 24
Hình 4. Đồ thị đường chuẩn. ........................................................................ 26
Hình 5 So sánh nồng độ đường khử tổng sản phẩm theo DNS của 23 chủng
ISB và CBS .................................................................................................. 28
Hình 6 Kết quả phân tích nồng độ glucose, isomaltulose, sucrose của 23
chủng ISB và chủng CBS theo HPLC .......................................................... 29
Hình 7. Sơ đồ cây phân loại các chủng chuyển hóa sucrose thành
isomaltulose. ................................................................................................ 31
Hình 8 Hình thái khuẩn lạc và tế bào của các chủng chủng vi khuẩn ............ 33
Hình 9 Thí nghiệm khảo sát theo thời gian lấy mẫu tại các thời điểm: 0h, 1h,
2h,3h,4h,5h,6h,12h,24h. ............................................................................... 35
Hình 10 Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của pH tại pH 3, pH 4, pH 5, pH 6,
pH 7, pH 8. ................................................................................................... 37
Hình 11 Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ bao gồm 20°C, 30°C,

40°C, 50°C, 60°C, 70°C ............................................................................... 38
Hình 12 Thí nghiệm khảo sát với các nồng độ cơ chất bao gồm 10%, 20%,
30%, 40%, 50%, 60%. .................................................................................. 39
Hình 13 Hiệu suất chuyển hóa sucrose thành isomaltulose.........................40
Hình 14 Quy trình công nghệ sản xuất isomaltulose từ sucrose................. 41

Trương Thị Tú Anh - 1302


MỞ ĐẦU
Theo cảnh báo của Tổ chức Y tế thế giới (WHO), cho đến nay, có khoảng
1 tỷ trong số gần 7 tỷ người trên thế giới bị thừa cân, trong đó có 400 triệu
người mắc bệnh béo phì. Bên cạnh béo phì do yếu tố di truyền thì lối sống,
những tiện ích của xã hội hiện đại như dành nhiều thời gian xem truyền hình,
chơi video game, sử dụng máy tính liên tục, dành ít thời gian tập thể dục
khiến người ta ít vận động thể lực. Bên cạnh đó còn cả những nguyên nhân
như chế độ dinh dưỡng không hợp lý, ngày nay mọi người có xu hướng thích
đồ ăn nhanh hay các loại bánh kẹo chứa nhiều chất béo sẽ làm các chất béo
tích tụ trong cơ thể đó là những nguyên nhân chính. Tỉ lệ béo phì và thừa cân
đang tăng lên đột ngột tại các quốc gia nghèo hơn, chứ không chỉ tại các nước
giàu và dự báo trước một gánh nặng các bệnh mãn tính như tiểu đường, tim,
huyết áp, ung thư, loãng xương... Mỗi năm, chi phí chữa béo phì chiếm từ 2%
đến 8% ngân sách dành cho y tế của mỗi quốc gia này.
Đối với bệnh tiểu đường, Tổ chức Y tế thế giới (WHO) cho là “Cơn sóng
thần tàn phá sức khỏe toàn cầu”. Tuy Việt Nam không phải là nước có tỉ lệ
mắc bệnh tiểu đường lớn nhất thế giới nhưng là nước có bệnh tiểu đường phát
triển nhanh nhất thế giới. Hiện có khoảng 4,8 triệu người mắc bệnh tiểu
đường và con số này sẽ tăng lên 7 đến 8 triệu người vào năm 2025, đó là
khuyến cáo từ Viện nghiên cứu Chiến lược phòng chống bệnh tiểu đường ở
Việt Nam.

Chính từ mối lo ngại đó, trong gần 20 năm qua, các nhà khoa học đã
nghiên cứu, lựa chọn và tìm ra phương pháp sản xuất các loại đường chức
năng có nhiều đặc tính có lợi cho sức khỏe như: chống bệnh tiểu đường,
chống béo phì, không gây sâu răng, có khả năng kích thích hoạt động của hệ
tiêu hóa... Điển hình là các loại đường chức năng: mannitol, sorbitol, xylitol,
Trương Thị Tú Anh - 1302

1


galactose, isomalulose, xylo-oligosacarit, v.v... Trong đó isomaltulose là một
loại đường chức năng đang được nhiều nhà nghiên cứu chú ý bởi ưu điểm
chính của loại đường này là không gây ra những tác dụng phụ như các loại
đường hóa học và có nhiều lợi ích cụ thể cho cơ thể con người cùng với một
số đặc tính ưu việt hơn. Đặc biệt gần đây người ta đã chứng minh rằng
isomaltulose còn tốt cho chức năng của não, tăng bộ nhớ.
Hiện nay, isomaltulose đã được ứng dụng rộng rãi trong sản xuất thực
phẩm và dược phẩm. Đi đầu trong sản xuất những sản phẩm này là tập đoàn
Südzucker của Đức cũng là nhà sản xuất đường lớn nhất của châu Âu. Ngoài
ra, Cerestar (thuộc tập đoàn Cargill) và Shin Mitsui (Nhật) cũng là các công
ty lớn sản xuất isomaltulose. Isomaltulose công nghiệp được sản xuất từ
sucrose qua phản ứng đồng phân hoá bởi enzyme sucrose isomerase. Công
nghệ sản xuất isomaltulose phổ biến nhất hiện nay trên thế giới là sử dụng tế
bào cố định của Protaminobacter rubrum.

Nhận thấy tính thực tiễn đó, với mong muốn nâng cao hiệu suất chuyển
hóa và giảm chi phí sản xuất isomaltulose từ đường mía (sucrose) vì Việt
Nam là một trong những quốc gia có nguồn nguyên liệu đường sucrose dồi
dào. Vậy nên trong đề tài này chúng tôi tập trung "Nghiên cứu điều kiện
chuyển hóa sucrose thành isomaltulose nhờ vi sinh vật"


Trương Thị Tú Anh - 1302

2


Nội dung nghiên cứu:
- Chọn được chủng có hiệu suất chuyển hóa sucrose thành isomaltulose
với hiệu suất 85-90%.
- Điều kiện chuyển hóa sucrose thành isomaltulose
- Xây dựng qui trình sản xuất isomaltulose trong phòng thí nghiệm
Mục tiêu:
Sản xuất được đường thế hệ mới - Isomaltulose từ đường sucrose (đường
mía) bằng cách sử dụng chế phẩm enzyme sucrose isomerase được sinh từ
chủng vi khuẩn phân lập tại Việt Nam.

Trương Thị Tú Anh - 1302

3


1
1.1

TỔNG QUAN

Đường Isomaltulose
Isomaltulose còn được biết đến với tên thương mại Palatinose, giống như

sucrose (đường ăn) nó có thể được tiêu hóa thành glucose và fructose. Trong

khi sucrose glucose và fructose được liên kết với một liên kết gọi là α-1,2
glycosidic, trong isomaltulose liên kết là α-1,6 glycosidic nên isomaltulose
được người và động vật tiêu thụ chậm. Khi so sánh với sucrose, isomaltulose
phóng thích glucose vào máu với tốc độ chậm, điều này dẫn đến cung cấp
năng lượng cân bằng và kéo dài hơn dưới dạng glucose. Isomaltulose có trong
mật ong tự nhiên và chiết xuất mía đường, có vị tương tự như sucrose với độ
ngọt khoảng 42% so với sucrose [2]. Isomaltulose có thể được sử dụng trong
đồ uống, các sản phẩm ngũ cốc, các sản phẩm sữa dựa trên, bánh kẹo, các sản
phẩm bánh, mứt cam, súp, nước sốt và món tráng miệng và còn là một thành
phần trong mỹ phẩm, và thuốc men.
Enzyme và nguồn của isomaltulose đã được phát hiện ở Đức vào năm
1950. Đến năm 1957, nhà sinh hóa Weidenhagen Sudzucker đã đã phát hiện
ra cách sản xuất isomaltulose từ vi khuẩn Protaminobacter rubrum và thành
công kết tinh một loại đường đôi được tinh chế tự nhiên từ củ cải đường [5].
1.1.1 Cấu trúc của Isomaltulose
Tên hoá học của isomaltulose là 6-O-α-Dglucopyranosyl-D-fructofuranose
(CAS. 13718-94-0), là một đồng phân của sucrose. Isomaltulose được sản
xuất từ sucrose thông qua chuyển hóa enzyme trong đó liên kết 1,2-glycosid
giữa glucose và fructose được thay thế bằng liên kết 1,6-glycosid.

Sucrose (α1-β2) (không khử)
Trương Thị Tú Anh - 1302

Isomaltulose (α1-6) (đường
4


khử)

Sucrose

[glucose]

isomerase

[fructose]

[glucose]

[fructose]

Hình 1 Sơ đồ chuyển hóa của sucrose dưới tác dụng của sucrose.

1.1.2 Tính chất của đường Isomaltulose
Isomaltulose có tính chất vật lí và cảm quan gần giống với sucrose, có giá
trị năng lượng như sucrose. Độ nhớt của cả hai loại dịch đường là tương tự.
Isomaltulose nóng chảy ở nhiệt độ thấp (123-124°C). So với sucrose,
isomaltulose khó thủy phân hơn phụ thuộc vào pH. Isomaltulose (dung dịch
10%) ổn định trong hơn 30 phút khi ủ ở pH 1.0 ở 95°C, trong khi đó sucrose
(dung dịch 10%) gần như được thủy phân hoàn toàn trong cùng điều kiện [8].
Ngoài ra, isomaltulose cho thấy caramel hóa ít hơn trong quá trình xử lý nhiệt
hơn sucrose, vì nhiệt độ nóng chảy thấp hơn và sự ổn định cao hơn của liên
kết glycosid [8]. Isomaltulose tham gia vào các phản ứng màu nâu của
Maillard. Giống như sucrose, nó được tiêu hóa hoàn toàn và cung cấp cùng
một lượng calo khoảng 4 kcal nhưng với dòng năng lượng kéo dài so với
sucrose (160-185°C). Nhìn chung, tính chất hoá lý của isomaltulose cho phép
thay thế sucrose trong hầu hết thức ăn ngọt [6]. Hình 2 biểu diễn công thức
cấu tạo và một số thông số vật lý của isomaltulose.

Trương Thị Tú Anh - 1302


5


Hình 2 Công thức cấu tạo của Isomaltulose
Isomaltulose
CAS: 13718-94-0
Công thức phân tử: C12H22O11·H2O
Khối lượng phân tử: 360.3
Nhiệt độ nóng chảy: 123-124 °C
Biểu hiện bên ngoài: Tinh thể trắng

1.1.3 Enzyme chuyển hóa sucrose thành isomaltulose
Isomaltulose được tạo thành bởi sự sắp xếp lại liên kết α-1,2 glycosidic
thành α-1,6 glycosidic dưới sự xúc tác của enzyme sucrose-isomerase [10]
Nhiều enzyme sản xuất isomaltulose vi khuẩn đã được tinh chế và đặc trưng.
Bao gồm các dạng tự nhiên của enzyme từ Ervinia rhapontici NX-5, Ervinia
sp. D12, Serratia plymuthica ATCC15928, Klebsiella sp., Pseudomonas
mesoacidophila MX-45, và dạng tái tổ hợp các enzyme từ E. rhapontici
NCPPB 1578, dạng tái tổ hợp các enzyme từ E. rhapontici DSM 4484
(GenBank accession No. AAK28735. 1), E. rhapontici NX-5(ADJ56407.2),
Enterobacter sp. FMB-1(ACF42098.1), P.mesoacidophila MX-45
(ACO05018.1), Protaminobacter rubrum CBS 574.77 (CAF32985.1),
Klebsiella pneumonia NK33-98-8 (AAM96902.1), Pantoea dispersa UQ68J

Trương Thị Tú Anh - 1302

6


(AAP57083.1), Klebsiella planticola UQ14S (AAP57085.1) và Klebsiella

sp. LX3 (AAK82938.1).
Sucrose isomerase của P. rubrum gồm 628 axit amin, khối lượng phân
tử 69,8 kDa. Bởi vì sự khác biệt đáng kể trong trình tự và tính chất enzyme,
sucrose isomerase với các tên gọi khác nhau được sử dụng để phân biệt gen
sucrose isomerase trong các vi sinh vật khác nhau: smuA cho P. rubrum, PalI
cho Erwinia, Klebsiella, Enterobacter; sim cho P. dispersa và mutB cho
isomerase sucrose-trehalulose của P. mesoacidophila. Trong thiên nhiên,
isomaltulose có lẽ đóng vai trò giúp vật chủ cạnh tranh giành nguồn dinh
dưỡng với các vi sinh vật khác trong môi trường giàu sucrose bởi phần lớn vi
sinh vật không có khả năng sử dụng isomaltulose. Ngoài ra, isomaltulose còn
có khả năng ức chế enzyme invertase của nấm men và do vậy hạn chế việc sử
dụng đường sucrose trong môi trường.
Enzyme sucrose isomerase (SI) (EC 5.4.99.11) (còn gọi là isomaltulose
synthase) chịu trách nhiệm chuyển hóa sucrose thành isomaltulose lần đầu
tiên được tách chiết từ Protaminobacter rubrum bởi Weidenhagen và Lorenz
năm 1957. Isomaltulose tồn tại với số lượng rất nhỏ trong tự nhiên và rất khó
để được tổng hợp hóa học. Vì vậy Isomaltulose được tạo thành bởi sự sắp xếp
lại liên kết α-1,2 glycosidic thành α-1,6 glycosidic dưới sự xúc tác của enzym
sucrose-isomerase Hiện nay sản xuất isomaltulose công nghiệp vẫn được
thực hiện sử dụng tế bào cố định của Protaminobacter rubrum. Sucrose
isomerase ngoài ra còn được tìm thấy ở nhiều vi sinh vật khác, trong đó có
Serratia plymuthica

NCIB 8285, Erwinia rhapontici NCPPB 1579,

Klebsiella sp. LX3, K. planticola CCRC 19112, Pantoea dispersa,
Agrobacterium radiobacter MX-332 và Pseudomonas mesoacidophila MX45, Enterobacter sp. FMB-1 [11]. Chủng công nghiệp Protaminobacter rubrum
CBS 574.77 (CBS) là vi khuẩn Gram âm, yếm khí tùy ý, không di chuyển và

Trương Thị Tú Anh - 1302


7


hình que. Isomaltulose đã được các nhà khoa học nước Nhật Bản nghiên cứu
từ những năm 1980 để xem xét độ an toàn. Đến năm 1985, chúng được kết
luận là sản phẩm tiêu dùng an toàn và chính phủ đã phê duyệt sử dụng
Isomaltulose vào công nghệ thực phẩm và đồ uống.

1.2

Đặc điểm sinh hóa
Quá trình tiêu hóa và trao đổi chất trong các nghiên cứu in vitro cho thấy

isomaltulose có thể bị thủy phân bởi các enzym đường ruột, nhưng tốc độ
chậm lại đáng kể so với sucrose. Isomaltulose sử dụng niêm mạc ruột non ở
người như là một nguồn enzyme, việc bổ sung sucrose dẫn đến sự phóng
thích glucose cao gấp sáu lần so với sau khi bổ sung một lượng isomaltulose.
Các thí nghiệm in vivo cho thấy isomaltulose gần như được thủy phân hoàn
toàn và hấp thu vào ruột non [6].
1.2.1 Khả năng tiêu hóa
Các nghiên cứu in vitro cho thấy disaccharidase đường ruột từ các loài
khác nhau có thể thủy phân isomaltulose, nhưng tỷ lệ này chậm so với các
loại đường như sucrose hoặc maltose.
Trong nghiên cứu trên chuột cống [9, 12] Vmax cho sự thủy phân của
isomaltulose bằng các màng ngoài của màng nhầy là 2- 4% so với Vmax đối
với maltoza và 11-12% so với sucrose. Enzyme đường ruột đồng nhất từ heo
trưởng thành thủy phân isomaltulose với tỷ lệ 2-5% so với maltose và 10-20%
so với sucrose. Trong các nghiên cứu sử dụng niêm mạc ruột non ở người nhỏ
như là nguồn enzyme, isomaltulose đã được thủy phân với Vmax = 8 so với

maltose, và 26-45% so với 11% như sucrose [6].
Các phức hợp sucrose / isomaltase, như đã được làm sạch từ ruột chuột và
người, thấy thủy phân isomaltulose trong ruột với tỉ lệ gần như đồng nhất.
Trương Thị Tú Anh - 1302

8


Phức hệ glucoamylase / maltase của chuột và người không thể thủy phân
isomaltulose. Ở lợn, isomaltulose được cắt bằng đường sucrase / isomaltase ở
ruột cũng như glucoamylase / maltase. Các nghiên cứu tiếp theo chỉ ra rằng,
trong ruột non ở người, thủy phân isomaltulose được xúc tác bởi isomaltase,
vì nhiệt không hoạt hóa của isomaltase, trong khi hoạt tính sucrose hầu như
không bị ảnh hưởng bởi quá trình xử lý nhiệt [6].
Các nghiên cứu với liều lặp lại đã được thực hiện ở lợn với một tổ chức tái
tổ chức ở cuối ruột cũng như ở heo không định tính, để theo dõi quá trình tiêu
hóa enzyme trong ruột non riêng biệt với quá trình lên men ở ruột già. Mặc dù
liều lượng tương đối cao (20% isomaltulose hoặc sucrose trong khẩu phần)
không có sự khác biệt rõ rệt giữa chuyển hóa giữa sucrose và isomaltulose. Ở
chuột, chỉ có một lượng nhỏ chất phóng xạ có thể tìm thấy trong phân và nước
tiểu sau khi uống liều uống đơn(lên đến 0,5 g / kg thể trọng) của isomaltulose
[6]. Các nghiên cứu in vivo với chuột và lợn đã chỉ ra rằng isomaltulose hầu
như được thủy phân hoàn toàn và hấp thu vào ruột non.

1.2.2 Sự trao đổi chất
Do quá trình thủy phân chậm trong suốt quá trình đi tiêu hóa, tăng đường
huyết, fructose và insulin sau khi uống isomaltulose chậm hơn so với sucrose.
Điều này đã được tìm thấy trong cả hai đối tượng khỏe mạnh và bệnh tiểu
đường [6]. Điều này làm cho isomaltulose một đường đầy hứa hẹn cho người
bị tiểu đường và những người bị các chứng bệnh tiền tiểu đường như kháng

insulin hoặc hội chứng chuyển hóa.
Trong các nghiên cứu thử nghiệm trên động vật và người đã chỉ ra rằng
isomaltulose được chuyển hóa và bài tiết qua nước tiểu.

Trương Thị Tú Anh - 1302

9


Sau khi truyền tĩnh mạch cho chó (2 g / con), bài tiết isomaltulose qua
đường tiểu (83% liều dùng) và sucrose (76%), cho thấy rằng chỉ có một phần
nhỏ các đường này được chuyển hóa. Isomaltulose tiêm tĩnh mạch (tiêm bắp,
0.5 g / kg thể trọng trên 90 phút) làm tăng glucose trong máu và nồng độ
insulin trong bệnh tiểu đường streptozotocin nhẹ và bình thường. Ở chuột và
chó,isomaltulose trong ruột ít nhất một phần bị thủy phân. Sau khi truyền tĩnh
mạch isomaltulose ở chó (5,5 mg / kg thể trọng / phút trong 90 phút), nồng độ
đường huyết và insulin trong huyết tương tăng trong vòng 15 phút sau khi
truyền bắt đầu. Mức isomaltulose tiếp tục gia tăng cho đến khi kết thúc truyền
dịch, và song song với sự tăng lên của isomaltulose và fructose trong nước
tiểu, trong khi fructose trong huyết tương không bị ảnh hưởng. Theo dõi đến
120 phút sau khi bắt đầu, vẫn ở mức cơ bản không có dấu hiệu tăng
triglycerid máu [6].
Từ những kết quả trên có thể thấy rằng ở ruột chuột và chó isomaltulose bị
thủy phân. Sau khi dùng isomaltulose cho người (0,5g), hơn 88% liều được
tìm thấy là disaccharide còn nguyên vẹn trong nước tiểu, cho thấy hầu như
không có hệ thống nào có sự trao đổi chất, 65% liều được bài tiết trong vòng
2,5 giờ sau khi dùng [6].
Vì isomaltulose cho thấy cung cấp glucose máu ổn định ở mức đường
huyết thấp và tương ứng với cấu hình insulin, việc uống isomaltulose có liên
quan đến sự oxy hóa chất béo được cải thiện so với các carbohydrate thực

phẩm thông thường. Như vậy, isomaltulose có thể làm tăng lượng chất béo
được sử dụng như năng lượng và do đó giúp ngăn ngừa tăng cân và sức đề
kháng [6].

Trương Thị Tú Anh - 1302

10


Ngoài ra, trái ngược với sucrose, isomaltulose được lên men và ức chế
hiệu quả sự hình thành glucans không hòa tan trong nước, cho thấy nó đặc
biệt thích hợp để dùng thay thế sucrose [6].
Một nghiên cứu in vitro và in vivo sinh hóa và độc tính ở nhiều loài khác
nhau, trong đó cả con người, đã được tiến hành để đánh giá sự an toàn của
isomaltulose để sử dụng như một đường không gây ung thư. Kết quả nghiên
cứu in vivo và in vitro cho thấy isomaltulose dần dần được tiêu hóa hoàn toàn
trong ruột non. Glucose và đường fructose được hấp thụ và chuyển hóa. Do
sự phân hủy và hấp thu hoàn toàn, ngay cả liều cao đường uống của
isomaltulose không gây khó chịu đường tiêu hóa. Đường glucose trong máu
và đáp ứng insulin chậm hơn có thể đặc biệt thuận lợi cho những bệnh tiểu
đường và tình trạng tiền tiểu đường [6].
Các nghiên cứu về độc tính và con người không tiết lộ các tác dụng phụ.Vì
vậy các nhà khoa học đã kết luận rằng việc sử dụng isomaltulose như một loại
đường khác có thể không gây nguy hiểm cho sức khoẻ [6].

1.2.3 Vai trò và chức năng của đường Isomaltulose
Isomaltulose đóng vai trò dự trữ carbohydrate hoặc cung cấp năng lượng
cho P. rubrum. Isomaltulose được đánh giá là một sự thay thế hợp lí cho
sucrose bởi rất nhiều ưu điểm:
- Không gây hại cho răng vì các vi khuẩn răng miệng không thể phân

hủy được loại đường này
- Không gây ảnh hưởng đáng kể tới nồng độ đường và insulin trong máu,
giúp ổn định đường huyết
- Isomaltulose là loại đường “chậm” có chỉ số đường huyết thấp (GI:32,
thấp tương đương với đậu nành, sữa chua trái cây).
Trương Thị Tú Anh - 1302

11


- Duy trì độ ngọt trong thực phẩm lên men và đồ uống
- Không hút ẩm như sucrose và lactose, do vậy thực phẩm chứa
isomaltulose bền và ổn định hơn.
- Kích thích sự phát triển của Bifidobacteria có ích trong hệ vi sinh vật
của ruột người.
- Có lợi cho sức khỏe con người, tốt cho chức năng não và làm chậm quá
trình lão hóa.

1.3

Tình hình sản xuất đường Isomaltulose trên thế giới
Hiện nay nhu cầu thay thế việc sử dụng sucrose bằng một loại đường khác

ngày càng gia tăng do những ảnh hưởng không tốt của nó tới sức khoẻ con
người. Đường isomaltulose được ứng dụng rộng rãi trong sản xuất thực phẩm
và dược phẩm. Nhu cầu sử dụng isomaltulose ước tính khoảng 3.000 tấn/năm.
Tại các nước Châu Âu, đi đầu trong sản xuất những sản phẩm này là tập
đoàn Südzucker của Đức cũng là nhà sản xuất đường lớn nhất của châu Âu,
với thương hiệu Palatinose do Beneo-Palatinit, với 2 sản phẩm là Palatinose™
(kẹo cao su, nước tăng lực, bột dinh dưỡng, bánh quy, chocolate, kem…) và

galenIQ™ (dược).
Cơ quan Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hòa Kỳ (FDA) đã công
nhận an toàn và phê chuẩn sử dụng sản phẩm Palatinose (Isomaltulose) vào
tháng 3/2006. Sau đó FDA còn tài trợ để phát triển việc dùng đường
Isomaltulose thay đường mía trong sản xuất chế biến một số thực phẩm.
Ở các nước Châu Á, Cerestar (thuộc tập đoàn Cargill) và Shin Mitsui
(Nhật) cũng là các công ty lớn sản xuất các chế phẩm của isomaltulose.
Ngoài ra, tại Hàn Quốc các nhà khoa học đã nghiên cứu chủng
Enterobacter sp. FMB-1 có khả năng chuyển hóa sucrose thành isomaltulose
Trương Thị Tú Anh - 1302

12


với hiệu suất trên 90%. Chủng Klebsiella sp. LX3 có khả năng chuyển hóa
trên 99% sucrose thành sản phẩm chứa trên 87% isomaltulose. Tại Malaysia:
Đại học Y khoa Putra Malaysia đã nghiên cứu về vai trò của isomaltulose trên
trẻ em. Họ cho nhóm trẻ tham gia nghiên cứu uống sữa tăng cường loại đường
này. Kết quả nhận được là trẻ em gia tăng nhận thức và tập trung học tập một
cách đáng kể. Vì vậy các nhà nghiên cứu nước này khuyến khích người dân
dùng đường isomaltulose trong các sản phẩm để giúp trẻ tăng nhận thức. Tại
Trung Quốc, các nhà nghiên cứu đã khẳng định lợi ích chống sâu răng của
isomaltulose. Hệ thống quy định trong luật của Trung Quốc cho thấy chất
ngọt trong thực phẩm có chứa từ 70% isomaltulose trở lên sẽ đủ điều kiện ghi
trên nhãn mác dòng chữ “không gây sâu răng”.

1.4

Tình hình sản xuất Isomaltulose ở Việt Nam
Isomaltulose mới xuất hiện ở Việt Nam trong vài năm gần đây nhưng thực


tế nhiều người dân đã biết đến loại đường này. Một số công ty kinh doanh
thực phẩm đang giới thiệu chào hàng sản phẩm này với mục đích ăn kiêng
giảm cân, phòng ngừa tiểu đường, hỗ trợ trẻ em phát triển trí não…Phổ biến
nhất là các công ty sản xuất sữa họ đã nắm bắt cơ hội để phát triển như nhãn
hàng Dutch Lady thuộc công ty FrieslandCampina Việt Nam đưa ra dòng sản
phẩm Dutch Lady Gold có bổ sung isomaltulose giúp cung cấp năng lượng
dài lâu cho não.
Đường isomaltulose đã được nghiên cứu ở Viện Công nghiệp Thực phẩm,
hiệu suất chuyển hóa sucrose thành hỗn hợp isomaltulose đạt xấp xỉ 80%.

2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Nguyên vật liệu
Trương Thị Tú Anh - 1302

13


2.1.1

Chủng giống
Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng các chủng bao gồm 23 chủng vi

khuẩn có khả năng chuyển hóa sucrose thành isomaltulose trong bộ sưu tập
giống của Viện Công nghiệp Thực phẩm và 01 chủng tiếp nhận từ sưu tập
giống CBS (Hà Lan).
Bảng 1 Danh sách mẫu và các chủng vi khuẩn sinh isomaltulose
Stt

Loại mẫu


Địa điểm lấy mẫu

Chủng

phân

lập

được
1

Táo thối

Chợ Long Biên

ISB1

2

Quýt thối

Chợ Long Biên

ISB4

3

Đào thối


Chợ Long Biên

ISB5, ISB6

4

Đất đùn

Hồ Mễ Trì, Thanh ISB7
Xuân

5

Hồ Mễ Trì, Thanh ISB8

Đất đùn

Xuân
6

Phân sâu đục nõn Lát Hoa Ba Vì, Hà Tây

ISB9, ISB10, ISB12,

(Cây

ISB13, ISB15,

chủ


Chukrasia

tabularis A. Juss, sâu hại:

ISB16

Hipsipila robusta)
7

Hoa dại

Thanh Xuân, Hà ISB11
Nội

8

Phân giun, rác, hoa thối

Công
Thảo

viên

Bách ISB17, ISB18,
ISB19, ISB21, ISB
23, ISB 24, ISB25,

Trương Thị Tú Anh - 1302

14



Stt

Loại mẫu

Địa điểm lấy mẫu

Chủng

phân

lập

được
ISB26, ISB27,
ISB28, ISB29,
ISB30, ISB31
9

Phân sâu đục thân cây Vên Trạm lâm nghiệp ISB33, ISB36,
Vên (Cây chủ Anisoptera Bầu Bàn, Bến Cát, ISB38, ISB39,
costata Korth, Sâu hại: Bình Dương.

ISB41

Xén tóc vàng Colosterna
pollinosa

sulphurea


Heller) và sâu đục thân
cây Dầu Rái (Cây chủ
Dipterocarpus

alatus

Roxb, Sâu hại: Xén tóc
vàng)

2.1.2 Hóa chất
Hóa chất dùng trong môi trường phân lập, nuôi cấy và lên men
Sucrose; yeast extract; agar; peptone; CH3COOH; CH3COONa;
NaH2PO4.1H₂O; Na2HPO4.12H₂O.
Hóa chất dùng để xác định hình thái tế bào, dạng Gram
Crystal violet; ethanol 95%; Ammonium oxalate; Iodine; KI; Acetone;
Safranin O.

2.1.3 Thành phần các môi trường dùng trong nghiên cứu
Trương Thị Tú Anh - 1302

15


Môi trường sinh tổng hợp enzyme (SPY)
Sucrose 40 g
Peptone 10 g
Yeast extracts 4 g
Đệm phosphate pH 7,0 (0,1M) 1000 ml
Môi trường được hấp thanh trùng ở nhiệt độ 115°C trong 15 phút.

Môi trường chuyển hóa sucrose
Sucrose 200 g
Đệm phosphate pH 7,0 (0,1M) 1000 ml
Môi trường được hấp thanh trùng ở nhiệt độ 115°C trong 15 phút.

2.2

Máy móc, thiết bị
Box cấy
Cân điện tử

BioblockScientific, Pháp
Precisa, Thụy Điển

Kính hiển vi quang học

Eclipse E600, Nikon, Nhật

Lò vi sóng

LG, Hàn Quốc

Máy đo pH

Toledo, Anh

Máy lắc ổn nhiệt

Eppendorf, Đức


Máy ly tâm cao tốc

Heraeus - Sepatech

Nồi hấp thanh trùng

Himayatoko, Nhật

Tủ lạnh giữ giống

Electrolux, Thụy Điển

Tủ nuôi cấy

Sanyo, Nhật

Tủ sấy

Sanyo, Nhật

Trương Thị Tú Anh - 1302

16


Đĩa petri, ống nghiệm có nắp, ống Eppendorf, ống Falcon, Pipetman, đầu
côn các loại, que cấy các loại...

2.3


Các phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Nuôi cấy vi sinh vật
Giống vi khuẩn được nuôi trên thạch đĩa PCA, sau 24h ở 30°C. Chọn
khuẩn lạc riêng rẽ, tròn đều cấy sang thạch nghiêng PCA nuôi 24h ở 30°C
2.3.2 Nhuộm tế bào vi khuẩn Gram
Nhuộm Gram là một phương pháp thực nghiệm nhằm phân biệt các loài vi
khuẩn thành 2 nhóm (Gram dương và Gram âm) dựa trên các đặc tính hoá lý
của thành tế bào.
• Hóa chất
- Dung dịch tím kết tinh (crystal violet - C25N3H30Cl)
- Dung dịch Iod (Iodline)
- Dung dịch tẩy màu: ethanol 95%
- Dung dịch nhuộm bổ sung: Safranin O
• Các bước tiến hành
- Bước 1: Làm vết bôi và cố định tiêu bản
Dùng que cất vô trùng lấy một ít vi khuẩn từ ống giống thạch nghiêng
hòa vào 1 giọt nước cất ở giữa phiến kính, làm khô trong không khí,
hơ nhanh viết bôi trên ngọn lửa đèn cồn 2-3 lần để gắn chặt vi khuẩn
vào phiến kính.
Cố định vết bôi bằng cách nhỏ lên trên vết bôi 1-2 giọt cồn 95°. Đốt
cháy và dập tắt ngay khoảng 10 giây. Cố định vết bôi nhằm 3 mục

Trương Thị Tú Anh - 1302

17


địch: giết chết vi khuẩn, gắn chặt vi khuẩn vào phiến kính và làm vết
bôi bắt màu tốt hơn

- Bước 2: Nhuộm màu
1. Nhuộm bằng dung dịch tím kết tinh trong 30 giây đến 1 phút, rửa
nước.
2. Nhuộm thêm dung dịch lugol và giữ trong 1 phút, rửa nước.
3. Nhỏ dịch tẩy màu, giữ khoảng 30 giây (cho đến khi vừa thấy mất
màu), rửa nước.
4. Nhuộm tiếp bằng dung dịch safranin hoặc fuchsin trong 1 phút,
rửa nước, để khô. Lần nhuộm này cả 2 nhóm vi khuẩn đều bắt giữ
thuốc nhuộm, nhưng vi khuẩn Gram dương không bị thay đổi màu
nhiều, trong khi vi khuẩn Gram âm trở nê đỏ vàng (nhuộm
safranin) hay đỏ tía (nhuộm fuchsin).

2.3.3 Điều kiện chuyển hóa sucrose thành isomaltulose
- Giống vi khuẩn được nuôi trên thạch đĩa PCA, sau 24h ở 30°C, chọn
khuẩn lạc riêng rẽ, tròn đều cấy sang thạch nghiêng PCA.
- Sau 24h ở 30°C, cấy 2 vòng qua cấy vào 20ml môi trường SPY
- Nuôi qua đêm ở 30°C chế độ lắc 150 rpm.
- Ly tâm 5000 rpm trong 30 phút ở 10°C.
- Sinh khối được rửa 2 lần, đầu tiên rửa bằng nước muối sinh lý sau đó tiếp
tục rửa bằng đệm phosphate pH 7 (0,1 M)
Chuyển toàn bộ sinh khối đã rửa vào dung dịch sucrose 20%, lượng tế bào
sẽ chuyển hóa dung dịch sucrose trong 24h ở 40°C.

Trương Thị Tú Anh - 1302

18