TẠP CHÍ KHOA HỌC ĐHQGHN, KHTN & CN. T.XXIII, s ố 1, 2007

NGHIÊN CỨU CÁC CHẤT ứ c CHẾ TRIPXIN (TI)
VÀ KIMOTRIPXIN (KI) CỦA HẠT THANH LONG
(HYLOCEREUS UNDATUS (Haw.) B ritto n & Rose)
Hoàng Thu Hà, Phạm Thị Trân Châu
Trung tăm Công nghệ S in h học, Đại học quốc gia H à N ội

1. Mở đầu
Cây th a n h long được trồ n g phổ biến ồ nước ta cũ n g n h ư các nước Đ ông N am Á
khác. Q ủa th a n h long có tác d ụ n g giải n h iệt, lợi tiểu, n h u ậ n tr à n g [2]. P h ầ n ăn được
của quả chứa 82 - 83% nưốc, g iầu v itam in c và m ột sô' v ita m in nhóm B [5]. Công bố
của P erez 2005 [6] cho b iế t n h iề u bộ p h ậ n của cây th a n h long tro n g đó có q u ả còn có tác
dụng làm liền v ết th ư ơ n g ỏ người bị tiể u đường. T heo n h iề u tá c giả, các c h ấ t ức c h ế
p ro tein az có th ể có n h iều triể n vọng sử dụ n g làm thuốc ch ữ a n h iề u b ệ n h tro n g đó có các
bệnh liên q u an đến v ế t th ư ơ n g p h ầ n m ềm . T uy n h iên chư a có công b ố n ào vể các c h ấ t
ức c h ế p ro te in a z của loại q u ả qu í giá này. P h ầ n ăn được củ a q u ả bao gồm n h iều h ạ t r ấ t
nhỏ xen lẫn với th ịt quả, rấ t khó tách riêng, có lẽ vì vậy chưa có các nghiên cứu phân
tích riê n g về h ạ t th a n h long. Để tìm h iểu kỹ hơn về các h o ạ t c h ấ t củ a q u ả th a n h long,
chúng tôi tiế n h à n h tá c h riê n g h ạ t khỏi th ịt quả và n g h iê n cứu đ iều tr a sơ bộ các c h ấ t
ức ch ế p ro te in a z của h ạ t.

2. Nguyên liệu và Phương pháp
- Q uả th a n h long chín tách h ạ t, ho n g khô ờ n h iệ t độ b ìn h thường, bảo q uản trong
tù lạn h , d ù n g cho các lầ n p h â n tích k hác n h au .
- Xác đ ịn h h à m lượng c h ấ t khô tu y ệ t đối b ằn g cân S caltex.
- Xác đ ịn h p ro te in th eo phương p h áp B rađíord [1]
- Xác đ ịn h h o ạ t độ pro tein az: b ằn g phương ph áp k h u ếch tố n tr ê n đ ĩa th ạch (điểu
tra sơ bộ) và phương p h áp A nson cải tiế n [7] với cơ c h ấ t cazein.

- Xác định h o ạt độ ức chế tripxin (TIA), kim otripxin (KIA) cũng thực hiên theo

h ai phương p h á p trê n n h ư n g enzim được ủ với d u n g dịch n g h iên cứu tro n g 10 p h ú t ờ
n hiệt độ phòng trước khi xác định hoạt độ như đã mô tả trước đây [3].
Công trinh được hỗ trợ về kinh phí của Chương trinh NCCB, đề tài 621306.
Chơ viết tắt: DC: dịch chiết; DCTL: dịch chiết hạt thanh long; Đ1: đỉnh 1; Đ2: đĩnh 2; HĐR: hoạt độ riỏng; KI: chát ú t chí
kimotripxin; KIA: hoạt đô ức chố kimotripxin; LC: dịch lên cột; PA: hoạt độ proteỉnaz; PAGE: điện di trên gd
poliacrylamit; TL: thanh long; TI: chất ức chố tripxin; TIA: hoạt độ ứd chế tripxỉn; Rm: độ dỉ động*

26


27

N g h itn cứu các chất ức c h ế tripxin (TI) ■

- Đ iện di p ro te in th e o phương p h á p L aem m li [4], gel 12,5%.
- Đ iện di đ ể p h á t h iệ n trự c tiếp p ro tein az, các c h ấ t ức c h ế proteinaz: gel 12,5%
đồng trù n g hợp với casein , nồn g độ casein tro n g gel 0,1%, đ iện di khô n g có SDS, không
có ch ất khử, m ẫ u k h ô n g xử lý n h iệt.

3. K ết q u ả

và

th ả o lu ậ n

K ết q uả p h â n tích sơ bộ quả th a n h long cho th ấ y
Protein (mg)

Trọng lượng
qua (kg)


Phần ăn được
(gam)

Dịch thu được
(ml)

Trọng lượng hạt
(gam)

s-f]

hat

1

670

470(,)

10,8

328,3

301,4

(,) dịch ép n h ậ n được từ p h ầ n th ịt q u ả (670g) đã bỏ h ạ t (viết t ắ t là 8-fj)
K ết q u ả tr ê n cho th ấ y h ạ t chỉ chiếm k h o ản g 1,6% trọ n g lượng p h ầ n ă n được của
q u ả n h ư n g p ro te in củ a h ạ t đ ạ t k h o ản g g ần 92% p ro te in của s-fj. N goài ra, k h i p h â n
tích dịch ép t h ị t q u ả cũ n g k h ô n g p h á t h iện được p ro te in a z, h o ạ t độ ức c h ế trip x in (TIA)

cũng n h ư h o ạ t độ ức c h ế k im o trip x in (KIA). Vì vậy, c h ú n g tôi chỉ tiế n h à n h n g h iên cứu
với h ạ t th a n h long.

3.1. Hàm lượng protein, hoạt độ ức c h ế trypxin (TIA) và kimotripxin (KIA)
củ a h ạt th a n h lo n g c h iế t bằng các d u n g d ịch đệm k h ác nhau
Đ ể lựa chọn d u n g dịch c h iế t các c h ấ t ức c h ế try p x in (TI), k im o trip x in (KI), chúng
tôi đã s ử d ụ n g 4 loại d u n g dịch khác n h a u để ch iết r ú t. K ết q u ả trê n b ả n g 1 cho th ấy
khi sử d ụ n g nước M ili Q h a y d u n g dịch a x it axetic 0,005 M, TIA tổ n g 8ố cũ n g n h ư KLA
tổng 80 tro n g các d ịch c h iế t n à y đều cao hơn k h i sử d ụ n g các d u n g dịch khác. D ung dịch
đệm S o ren sen c h iế t r ú t được n h iểu p ro tein n h ấ t, n h ư n g TLA, KIA đểu th ấ p hơn 80 với
dịch c h iế t b ằ n g nước h a y b ằ n g a x it axetic. Do đó, h o ạ t độ riê n g của dịch ch iết b ằn g đệm
S o ren sen th ấ p h ơ n k h i sử d ụ n g các d u n g dịch khác. Vì vậy, để tin h sạch TI hoặc K3
cùa h ạ t th a n h long có th ể d ừ n g nưỏc M ili Q hoặc d u n g dịch a. axetic 0,005M .
Bảng 1. So sánh cầc loại

dung d|ch khác nhau dùng đ i c h iít TI vè KI từ hạt thanh long
TIA

STT

1
2

Dung dịch dùng để
chiết rút

Nước Mili Q
Đêm Sorensen 1/15M
pH 6.5


Protein
(mg/100
gam hạt)

KIA

Hoat độ tổng
số (IU/100g
hạt)

HĐR
miu/mg
protein

Hoạt đô tổng
số (IU/100g
hạt)

miu/mg

2831

872,6

237,10

227,9

80,51


4290

695,8

162,19

255,9

59,65

HĐR
protein

3

Đệm natri axetat
0.Ò2M pH 4,5

2925

626,2

214,10

188,9

64,58

4


Axit axetic 0.005M

3315

872,6

202,48

236,9

72,05

T jp c h í Klu>a học D H Q G H N . K H T N & C N . T J 0 ữ ll, S Ã I . 2 0 0 7


H oàng Thu Hà, Phạm Thị Trân Châiu

28

T heo k ế t q u ả n g h iên cứu củ a ch ú n g tôi, h à m lượng c h ấ t k h ô củ a h ạ t th a n h long l;à
91% do đó, n ếu tín h h à m lượng p ro te in trê n c h ấ t khô sẽ b ằ n g 3,1%.

3.2.

So sán h p hổ đ iện di p rotein củ a 4 loại d ịch c h iế t

Hình 1. Phổ đỉện di proteỉn hạt thanh long (TlL)
trong các dung dịch chiết khác nhau

1. Nước Mili Q

2. Dung dịch đệm Sorensen 1/15M pH 6,5
3. Dung dịch đệm Natri axeỉat 0 f02M pH 4,5
4. Dung dịch axit axetic 0.005M
(ghi chú này dùng cho cả hình 2 và 3)

Hlnh 2. Phổ điện di PA của hạt TL trong
4 dung dịch chiết khác nhau

Hình 3. Phổ điện di TIA của hạt TL trong
4 dung dịch chiết kháo nhau

Để so sá n h tiế p k h ả n ă n g c h iế t r ú t p ro te in của các d u n g dịch trê n , đã tiế n h à n h
điện di p ro tein có tro n g 4 loại d u n g dịch trê n . K ết q u ả trê n h ìn h 1 cho th ấ y phổ điện di
p ro te in củ a các d u n g dịch tư ờng tự n h a u .

3.3.

So sán h p hổ đ iện di PA* TI, KI củ a 4 lo ạ i d ịch c h iế t

Sử d ụ n g phư ơng p h á p đ iện di trê n gel p o ly acrilam it 12,5% đồng tr ù n g hợp với cơ
c h ấ t cazein 0,1% là phư ơng p h á p n h ạy , cho phép p h á t h iệ n trự c tiế p p ro te in a z, các c h ấ t
ức c h ế p ro te in a z từ dịch c h iế t n g u y ên liệu m à không c ầ n p h ả i tin h sạch. S au khi điện
di, giữ gel tro n g đ iều k iệ n th ích hợp, ở vị tr í có p ro te in a z , ca se in tro n g gel sẽ bị p h ân
giải, gel k h ông b ắ t m ầ u k h i n h u ộ m với Coom asie B lue, tạ o th à n h n h ữ n g b ă n g sán g trê n
n ề n gel m ầu đậm . K ết q u ả trê n h ìn h 2 cho th ấ y tấ t cả 4 loại dịch c h iế t đ ều có m ột b ăng
sáng, chứ ng tỏ h ạ t th a n h long có proteinaz.

T ạ p c h i K h o a h ọ c Đ H Q G H N , K H T N ả C N , T X Q Ì Ì . S ổ ì . 2007



29

Nghiên cứu các chất ức ch ế tripxin ( T I ) .

Đ iện di các T I có tro n g dịch ch iết (hình 3) đã p h á t h iệ n được 2 b ăn g TI (băng m àu
đậm hơn nền gel): b ă n g c h ín h có độ di động (Rm) » 0,97, b ă n g nhỏ có R m w 0,53. Điểu
n ày ch ứ n g tỏ p h ầ n lớn các T I của h ạ t th a n h long có th ể có tín h a x it và có khôi lượng
p h ân tử th ấ p . K ết q u ả đ iện di song song vối các p ro tein c h u ẩ n (không trìn h bày ở đây)
cho th ấ y b ăn g T I/K I ch ín h có khối lượng p h â n tử th ấ p hơ n 14,4 kD.
Đ iện di KI c ũ n g n h ậ n được phổ đ iện di tư ơng tự với phổ điện di TI.
T ừ các k ế t q u ả trê n , tro n g các th í nghiệm tiếp th eo ch ú n g tôi đ ã sử dụ n g nước
M ili Q để ch iết r ú t T I và KI củ a h ạ t th a n h long, vừa đơn g iản và rẻ tiền.

3.4. S ắc ký qua c ộ t S ep h a d ex G-25
Để sơ bộ tá c h từ n g p h ầ n các p ro tein của dịch ch iết, đ ã tiế n h à n h sắc ký qua cột
S ephad ex G-25. C â n b ằ n g cột và c h iế t r ú t p ro tein b ằ n g d u n g dịch a x it axetic 0.005M ,
pH 4,5. Xác đ ịn h p ro te in tro n g các p h â n đoạn th u được b ằ n g phư ơng p h áp B radíord,
n h ận được 2 đ ỉn h p ro te in (h ìn h 4), ký h iệu là Đ l và Đ2 th e o th ứ tự được r ú t xuống cột.

OD595nm

•protein xuống

CỘI

Thể tích rút (ml) không kể 20ml ban đáu

Hlnh 4. Sắc kỷ mẫu TL qua cột Sephadex G-25
Kích thước của cột: 1,2x55cm ; vận tốc 17ml/h ; thể tích mỗỉ phân đoạn 1ml
— ♦— proteỉn:

(xác định thớo Bradíord)

Đ I là đ ĩn h c h ín h (bảng 2), có th ể tích r ú t là 38m l (tương đương Ve của
riòonucleaz); Ve c ủ a Đ2 là 54m l (trước m uối llm l) . N h ư v ậy Đ2 có th ể là các
p ro tein /p o ly p ep tit có khôi lượng p h â n tử th ấ p hơn Đ l. K ết q u ả trê n b ả n g 2 cho th ấ y
TTA củ a Đ I gấp h ơ n 3 lầ n TIA của Đ2. T uy n h iên , tổ n g TIA của cả 2 đ ỉn h Đ I và Đ2

Tẹo c h i K h o a học D H Q G H N , K H T N & C N . TX X H Ị. S ổ ỉ , 2 0 0 7


Hoàng Thu Hà, Phạm Thị Trán Chiâu

30

cũng chỉ b ằn g 73,1% TIA củ a dịch lên cột, do đó h o ạ t độ riê n g của cả 2 đ ỉn h Đ I và D 2
đều bị giảm so với dịch lên cột. P h ả i ch ăn g TI của h ạ t th a n h long k h ông b ền ? H o ạt đ ộ
ức c h ế k im o trip x in lại k h ô n g bị giảm và tậ p tru n g ở Đ l: KIA củ a Đ I chiêm đên 98'%
KIA của dịch lên cột, gấp k h o ản g 10,8 lầ n KIA của Đ2; h o ạ t độ riê n g củ a đ ỉn h n ày t ă n g
lên gần 1,6 lầ n so với dịch lên cột. N hư vậy, để tin h sạch KI từ h ạ t th a n h long chỉ c ầ n
th u Đ l.
Đ iện di p ro te in củ a đ ỉn h 1 và đ ỉn h 2 cho th ấ y b ă n g p ro te in có R m = 0,97 chiếm tỉ
lệ lớn (h ìn h 5). Đ iện di T I (h ìn h 6) chứ ng tỏ b ă n g p ro te in với R m = 0,97 có h o ạ t tín h lức
chê trip x in . Đ iện di KI (h ìn h 7) đã p h á t h iện được Đ I và Đ2 đều có b ă n g KI với
Rm = 0,97, ngoài b ă n g này, Đ2 còn có th ê m 1 băn g K I n h ỏ với R m =0,53, giông với

D»c

lên cột (cột 1, h ìn h 7).
Bảng 2. Tóm tắt kết quả sắc ký dịch chỉất hạt thanh long qua cộ t Sephadex G-25
Prolein

mg
%

miu

%

100

20 592

100

Mau
Dich chiết hat
81,60
t L đả cô đặc

TIA
HĐR
miu/mg
protein

Số lần
tinh sạch

m iu

%


252,35

1

3 488

100

KIA
HĐR
miu/mg
protein

Số lần tinih
sạch

42,74

1

Sau qua cột
Sephadex
G25
Đỉnh 1

51,00

62.5

11 494


55,8

225.37

0,893 3 425

98,2

67,15

1,57

Đỉnh 2

30,30

37.5

3 577

17,3

116,89

0,463

316

9.0


10,33

0,24

Hỉnh 5. Phổ điện di protein của DCTL
qua cột G25
1.DC lên c ộ t; 2. 01 ; 3. Đ2 ;

Hỉnh 6. Phổ điện di TIA của DCTL qua cột G25
1.DC lên cộ t; 2. Đ1 ; 3. Đ2 ;
4. DC lên cột pha loăng

4. DC lên cột pha loãng

T ạ p c h í K h o a h ọ c Đ tìQ G H N , K tì T N & C N , TJO ữH. S ố ỉ , 2007


31

Nghiẽn cứu các chát ức ch ế tripxin ( T I ) .

Rm
ỊgyịTv. 1■ , 1'^ •ỈKỈàĐaSĨÉÌÌsẫ&kL''
I t e S " '"
jv

'■■uysị

M nL'


■ K IA

ị
B

.

i

_J

k ia

V #->

ỵ, ' k '

y H H B H B H l (0,53)W :•
KV

I in n

i
■■11 ■V 1,
- t 1

(0,97)

H ai-;

Hinh 7. Phổ diện di KIA của DCTL qua cột G25
1.LC ; 2. Đ1 ; 3. Đ2

Hinh 8. Đ1 DCTL qua cột G25 ức chế sinh
trưỏng của Pseudomonas aeruginosa

K ết q u ả kiểm tr a h o ạ t tín h k h á n g k h u ẩ n (hình 8) cho th ấy : ngoài h o ạ t tín h ức c h ế
trip x in , k im o trip x in , Đ l còn có tác d ụ n g ức c h ế s in h trư ở n g của P seudom onas
aeruginosa p h â n lậ p từ m ủ v ế t thư ơng bỏng của b ện h n h â n .

4. K ết lu â n
- H àm lượng p ro te in hòa ta n của h ạ t th a n h long vào k h o ản g 3% châ't khô của h ạ t.
- H ạ t th a n h long có p ro te in a z và các c h ấ t ức c h ế trip x in (T I), k im o trip x in (KI). Để
ch iết r ú t TI, KI từ h ạ t th a n h long và tiếp tục tin h 8ạch, n ê n d ù n g d u n g dịch a x it axetic
0,005M hoặc nước M iliQ.
- P h ổ điện di T I, KI củ a dịch ch iế t từ h ạ t th a n h long k h á giống n h a u về số băng,
độ di động cũng n h ư tỉ lệ giữ a các băng: có 2 b ă n g T I/K I, b ăn g ch ín h có độ di động
n h a n h hơn với Rm = 0,97; b ă n g p h ụ có độ di động vào k h o ả n g 0,53.
- Sắc ký q u a cột S ep h ad ex G-25 n h ậ n được 2 đ ỉn h p ro te in (xác đ ịn h theo
B radíord), đ ỉn h 1 (Đ l) là đ ỉn h chính, có TIA gấp hơn 3 lầ n và KIA gấp k h o ản g 10,6 lầ n
ở đỉnh 2 (Đ2).
- Đ l còn có h o ạ t tín h ức c h ế sin h trư ở ng của P seudom onas aeruginosa p h â n lập từ
mù v ế t th ư ơ n g bỏn g của b ện h n h ân .

Tạp c h i K h o a h ọ c D H Q G H N . K H T N & C N .

Txau.

S ố l . / '07



32

Hoàng Thu Hà, Phạm Thị Trân C hau

TÀI LIỆU THAM KHẢO
1.

B ra d íò r d M .M ., A r a p id a n d s e n s itiv e M e th o d fo r t h e q u a n t i t a t i o n o f m ic ro g ra m q u a n t i t i e s

of protein ultilizing the principle of protein - dye binding, Anal. Biochem. 1976, 72: 248-253.
2.

Đỗ H. Bích, Đặng Q. Chung, Bùi X. Chương, Nuyễn T. Dong, Đỗ T. Đàm, Phạm V. Hiển,
V ũ N L ộ, P h ạ m D. M a i, P h ạ m K. M ã n , Đ o à n T . N h u , N g u y ễ n T ậ p , T r ầ n T o à n , C â y th u ố c

và động vật làm thuốc ở Việt N am , NXB Khoa học & Kỷ thuật, Hà Nội 2004, Tập II, 1256
tr a n g , p p 8 2 6 -8 2 7 .
3.

H o àn g T h u H à, P h ạ m T h ị T râ n C h â u , M ột s ố th à n h p h ầ n hó a s in h và h o ạ t tín h s in h học

của dịch ép từ th ịt quả mướp đắng (Momordica charantia L.), Tạp chí Sinh học. V.28, NOI
(2 0 0 6 ), p p 7 5 -8 0 .

4.

Laemmli U.K., Cleavage of structure proteins during assembly of the head of bacteriophage
T4. Nature 227(1970), p 341-349.


5.

Morton, Julia F., Miami, FL. Morton, J. 1987. In: Fruits o f wam climates. Strawberry Pear.
p 347 - 348.

6.

P e r e z G. R .M ., V a r g a s S .R .,O rtiz H .Y .D ., W o u n d h e a lin g p r o p e r tie s o f H y lo c e re u s u n d a t u s
o n d ia b e te s , P h y to th e r a p y R e s e a rc h . V .19, N 0 8 (2 0 0 5 ), p .6 6 5 -6 6 8 .

7.

Pietrowa J.s., Wincjunajte M. M.f Opredelenie proteolyticheskoi aktivnosti fermentnykh
p r e p a r a to ư m ic r o b io lo g ic h e s k o v o p r o is k h o z h d e n ỉe , P r i k l a d . B io c h e m . M ik ro b io l., 2 (1 9 6 6 ),
p .2 3 2 - 2 3 6 ( tiế n g N g a).

VNU. JOURNAL OF SCIEN CE, Nat., Sci., & Tech., T.XXI1I, NọỊ, 2007

STUDY ON TRYPSIN INHIBITOR (TI) AND CHYMOTRYPSIN
INHIBITOR (KI) FROM SEEDS OF BLƯE DRAGON (HYLOCEREUS
UNDATUS (Haw.) B ritton & Rose)
Hoang Thu Ha, Pham Thi Tran Chau
C enter fo r Biotechnology, V ietnam N a tio n a l U niưersity, H anoi

Blue d ragon (or s tra w b e rry pear) p la n ts have b e e n w idely p la n te d in V iet Nam
an d o th e r co u n tries of S o u th E a st A sian region. T h e ir fru it juice h a s been enjoyed as a
cool d rink. M oreover, th e w ound h ealin g p ro p erties of fru it pulp have also been found
recently. H ence, it is w o rth y to in v estig ate biochem ical com ponents of th is fru its. In
th is work, we focused on try p sin an d chym otrypsin in h ib ito rs of seeds s e p a ra te d frcm
edible p ortion of íru its .


T ạ p c h i K h o a h ọ c Đ H Q G H N , K tìT N & C N , T.XXIII, S ô '1 ,2 (0 7


33

Nghiên cứu các chấl ức chế tripxin ( T I ) .

T he o b tain ed re su lts in d icated th a t soluble p ro te in s c o n ten t of th e seeds w as
aro u n d 3% of d ry su b sta n c e s of seeds. By u sin g sev e ra l m ethods docum ented th a t H.
u n d a tu s seeds co n ta in in g p ro tein ase, try p sin in h ib ito rs an d ch y m o try p sin inhibitors,
w hich could be e x tra c te d by e ith e r Mili Q w ater, or acetic acid 0.005M , S orensen b u íĩer
pH 6.5, n a tr i a c e ta te b u íĩe r pH 4.5. T he to ta l an d speciíic in h ib ito ry activ ity in th e fĩrst
two e x tra c t so lu tio n s w ere h ig h er th a n those of th e la te r ones. H owever, th e
electro p h o retic p a tte r n s of pro tein , PA, T I an d KI from th e se 4 seed e x tra c ts w ere
ra th e r sim ilar:

One PA b an d

an d

two in h ib ito r b a n d s on

polyacrylam ide

gel

copolym erized w ith casein w ere detected. T he m obility (Rm) of th e m ajor TI/KI ban d
w as a ro u n d 0.97 an d th a t of th e m inor TI/K I w as a ro u n d 0.53.
By íra c tio n a tin g seed aq u eo u s e x tra c t on S ep h ad ex G-25 colum n, two protein

peaks w ere o b tain ed , d esig n a te d as D l a n d D2. B oth of th em exhibited inhibitory
activity a g a in s t try p sin (TIA) an d chym otrypsin (KIA). M oreover, in h ib ito ry activity
co n cen trated on p eak 1: TIA an d KIA of D l w ere h ig h e r th a n th o se of D2 three- an d
teníold, respectively. I t 18 in te re ste d th a t D l also in h ib ited grow th of Pseudom onas
aeruginosa iso lated from pus of p a tie n t’s infected b u rn w ound.

T ip c h i K hoa h ọ c D H Q G H N . K IỈT N & C N . T XXIII. Sứ' 1 . 2 0 0 7