BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ LÊ
MÃ SINH VIÊN: 1201310

BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG
PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG
RUBIADIN TRONG DƯỢC LIỆU BA
KÍCH BẰNG HPLC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2017


BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ LÊ
MÃ SINH VIÊN: 1201310

BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG
PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG
RUBIADIN TRONG DƯỢC LIỆU BA
KÍCH BẰNG HPLC
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
1.TS.Lê Thị Kim Vân

2.ThS.Tống Thị Thanh Vượng
Nơi thực hiện:
1.Viện Dược liệu
2.Bộ môn Hóa phân tích – Độc chất

HÀ NỘI - 2017


LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình thực hiện đề tài“Bước đầu nghiên cứu xây dựng phương
pháp định lượng rubiadin trong dược liệu Ba kích bằng HPLC”, ngoài sự làm
việc nghiêm túc, nỗ lực của bản thân, em đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ từ phía
trường Đại học Dược Hà Nội, Viện Dược liệu, thầy cô, gia đình và bạn bè.
Trước hết em xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Viện Dược liệu đã tạo
rất nhiều điều kiện thuận lợi để em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.
Em xin gửi lời cảm ơn đến ThS.Tống Thị Thanh Vượng – GV Bộ môn Hóa
phân tích – Độc chất đã đóng góp ý kiến, tận tình sửa chữa giúp em hoàn thành
khóa luận này.
Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS. Lê Thị Kim Vân – Khoa Bào chế Chế
biến – Viện Dược liệu, người đã tận tình hướng dẫn em trong quá trình thực hiện đề
tài.
Em xin gửi lời cảm ơn đến các anh chị trong khoa Bào chế Chế biến – Viện
Dược liệu đã hỗ trợ em trong quá trình nghiên cứu.
Xin trân trọng cảm ơn quý thầy cô trường Đại học Dược Hà Nội, đặc biệt là
những thầy cô đã trực tiếp giảng dạy em suốt thời gian học tập tại trường.
Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình, bạn bè đã động viên và giúp đỡ em trong
quá trình học tập, nghiên cứu.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, tháng 05 năm 2017
Nguyễn Thị Lê



MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ................................................... 5
ĐẶT VẤN ĐỀ.................................................................................................................. 1
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN DƯỢC LIỆU BA KÍCH .................................................... 2
1.1.

Ba kích ...........................................................................................................2

1.1.1.

Tên khoa học ...........................................................................................2

1.1.2.

Mô tả .......................................................................................................2

1.1.3.

Bộ phận dùng ..........................................................................................2

1.1.4.

Nơi sống và thu hái .................................................................................2

1.1.5.

Thành phần hóa học ................................................................................3


1.1.6.

Tác dụng dược lý ....................................................................................5

1.2.

Tình hình nghiên cứu đánh giá Dược liệu Ba kích........................................7

1.2.1.

Tiêu chuẩn Dược điển .............................................................................8

1.2.2.

Tại Việt Nam ........................................................................................11

1.2.3.

Trên thế giới ..........................................................................................11

1.3.

Rubiadin.......................................................................................................13

1.3.1.

Công thức cấu tạo .................................................................................13

1.3.2.


Tác dụng dược lý ..................................................................................13

1.3.3.

Sự phân bố rubiadin trong chi Morinda ................................................14

CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................ 16
2.1.

Đối tượng nghiên cứu ..................................................................................16

2.2.

Trang thiết bị, dụng cụ và hóa chất. ............................................................16

2.3.

Nội dung nghiên cứu ...................................................................................17

2.4.

Phương pháp nghiên cứu .............................................................................17

2.4.1.

Định tính các nhóm chất hóa học. ........................................................17

2.4.2. Xác định hàm lượng anthranoid toàn phần trong Ba kích bằng phương
pháp đo quang phổ hấp thụ UV-VIS ..................................................................20
2.4.3.

2.5.

Xác định hàm lượng rubiadin bằng phương pháp HPLC .....................21

Phương pháp xử lý số liệu. ..........................................................................25

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN. .................................................................. 27


3.1. Xác định sự có mặt của một số nhóm chất trong Ba kích và một số hoạt
chất nhóm anthranoid ............................................................................................27
3.1.1.

Kết quả xác định một số nhóm chất bằng phản ứng hóa học ...............27

3.1.2.

Xác định sự có mặt của một số hoạt chất nhóm anthranoid bằng TLC 28

3.2.

Xác định hàm lượng anthranoid toàn phần trong Ba kích ...........................30

3.2.1.

Chuẩn bị dung dịch sắc ký ....................................................................30

3.2.2.

Xây dựng đường chuẩn .........................................................................30


3.2.3.

Xác định hàm lượng anthranoid toàn phần ...........................................31

3.3.

Xác định hàm lượng rubiadin trong Ba kích bằng HPLC ...........................31

3.3.1.

Khảo sát điều kiện sắc ký và chuẩn bị các dung dịch sắc ký ...............31

3.3.2. Thẩm định phương pháp định lượng rubiadin trong Ba kích theo
AOAC 36
3.3.3.
3.4.

Xác định hàm lượng Rubiadin trong Ba kích .......................................42

Bàn luận .......................................................................................................43

3.4.1.

Mẫu nghiên cứu ....................................................................................43

3.4.2.

Phương pháp nghiên cứu ......................................................................44


CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT .................................................................. 46
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
STT

PHầN VIếT TắT

1

ACN

2

AOAC

PHầN VIếT ĐầY Đủ
Acetonitril
Hiệp hội các nhà hóa học phân tích (Association of
analytical chemists)

3

BHC

Benzene hexachloride (C6H6C6)

4


DAD

Detector mảng diod (Diod Array Detector)

5

DDT

Dichloro diphenyl trichlorothane (C14H9C15)

6

EtOH

Ethanol

7

HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High-Performance Liquid
Chromatography)

8

HSCCC

Sắc ký phân bố ngược dòng tốc độ cao (High speed
countercurrent chromatography)


9

LOD

Giới hạn phát hiện (Limit of Detection)

10

LOQ

Giới hạn định lượng (Limit of Qualification)

11

MeOH

Methanol

12

ELSD

Tán xạ bay hơi

13

RSD

Độ lệch chuẩn tương đối (Relactive Standard

Deviation)

14

SKĐ

Sắc ký đồ

15

S/N

Tín hiệu/nhiễu đường nền (Signal/Noise)

16

STT

Số thứ tự

17

TLC

Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography)

18

TT


19

UV-VIS

Thuốc thử
Phổ tử ngoại – khả kiến (Ultraviolet Visible)


DANH MỤC CÁC BẢNG

STT

Tên bảng

Trang

3.1

Kết quả định tính một số nhóm chất trong Ba kích

27

3.2

Gia trị Rf của chất chuẩn

29

3.3


Độ hấp thụ của dãy dung dịch chuẩn rubiadin

30

3.4

Hàm lượng anthranoid toàn phần của các mẫu thử tính theo

31

rubiadin
3.5

So sánh hàm lượng rubiadin khi chiết ở nồng độ EtOH khác nhau

31

3.6

So sánh hàm lượng rubiadin khi chiết trong thời gian khác nhau

32

3.7

Kết quả khảo sát hệ pha động

35

3.8


Thời gian lưu của mẫu chuẩn và mẫu thử

37

3.9

Kết quả khảo sát độ thích hợp của hệ thống sắc ký

38

3.10 Kết quả khảo sát độ lặp lại

39

3.11 Diện tích pic của dãy dung dịch chuẩn

39

3.12 Kết quả xác định khả năng thu hồi của phương pháp

41

3.13 Kết quả giá trị LOD, LOQ

42

3.14 Kết quả định lượng rubiadin trong các mẫu thử

43


3.15 Tỉ lệrubiadin so với anthranoid toàn phần tính theo chuẩn rubiadin

43


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ ĐỒ THỊ
STT

Tên ảnh, đồ thị

Trang

3.1

Sắc ký bản mỏng sau khi khai triển

29

3.2

Đồ thị tương quan giữa nồng độ chuẩn rubiadin và độ hấp thụ

30

3.3

SKĐ rubiadin chuẩn với pha động MeOH:H3PO4 0,1% (85:15)

33


3.4

SKĐ rubiadin chuẩn với pha động MeOH:H3PO4 0,1% (80:20)

33

3.5

SKĐrubiadin chuẩn pha loãng trog dịch chiết dược liệu với pha

34

động MeOH:H3PO4 0,1% (70:30)
3.6

SKĐ rubiadin chuẩn pha loãng trog dịch chiết dược liệu với pha

34

động MeOH:ACN:H3PO4 0,1% (42,5:42,5:15)
3.7

SKĐ rubiadin chuẩn với pha động MeOH:ACN:H3PO4 0,1%

35

(56,7:26,3:15)
3.8


SKĐ mẫu thử với pha động MeOH:ACN:H3PO4 0,1%

35

(56,7:26,3:15)
3.9

Hình ảnh chồng phổ sắc ký của mẫu chuẩn và mẫu thử

36

3.10

SKĐ rubiadin chuẩn

37

3.11

SKĐ rubiadin trong mẫu thử

37

3.12

Đồ thị tương quan giữa diện tích pic và nồng độ

40



ĐẶT VẤN ĐỀ
Ba kích là một loại dược liệu quý trong y học cổ truyền. Rễ Ba kích được sử
dụng rộng rãi với mục đích ôn thận, tráng dương, kiện cân cốt, khử phong và hàn
thấp. Nhiều nghiên cứu về tác dụng dược lý của dịch chiết rễ Ba kích đã được tiến
hành, chứng minh tác dụng chống viêm, chống loãng xương, điều hòa đường huyết,
giảm huyết áp.
Ở Việt Nam, Ba kíchphân bố rộng rãi ở các tỉnh phía Bắc, đặc biệt là Quảng
Ninh. Trong những năm gần đây, Quảng Ninh đã chủ trương phát triển Ba kích trở
thành dược liệu đặc trưng của tỉnh: mở rộng khu vực trồng Ba kích và phát triển các
thương phẩm Ba kích. Tuy nhiên hiện nay trên thị trường dược liệu, Ba kích có rất
nhiều nguồn như: Ba kích nhập từ Trung Quốc, Ba kích Quảng Ninh, Ba kích Bắc
Cạn..., rất khó để kiểm soát chất lượng dược liệu.
Với mong muốn tìm hiểu về chất lượng dược liệu Ba kích, chúng tôi tiến hành
đề tài: “Bước đầu nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng rubiadin
trong dược liệu Ba kích bằng HPLC”. Đề tài được thực hiện với mục tiêu:
-

Xây dựng phương pháp định lượng rubiadin trong Ba kích.

-

Sơ bộ xác định hàm lượng anthranoid toàn phần và hàm lượng rubiadin
trong Ba kích.

-

So sánh hàm lượng rubiadin so với anthranoid toàn phần và rubiadin trong
Ba kích Quảng Ninh so với các mẫu Ba kích khác trên thị trường.

1



CHƯƠNG I: TỔNG QUAN DƯỢC LIỆU BA KÍCH
1.1.

Ba kích

1.1.1. Tên khoa học
-

Morinda officinalis How.,họ Cà Phê Rubiaceae [3][4][6].

-

Tên khác: Ba kích thiên, dây ruột gà, chồi hoàng kim, sáy cày[3][4][6].

1.1.2. Mô tả
Ba kích là một loại cây thân thảo, sống lâu năm, leo bằng thân quấn, dài hàng
mét. Thân non màu tím, có lông, sau nhẵn. Cành non có cạnh, lá mọc đối, hình mác
hoặc bầu dục, thuôn nhọn, dày và cứng, cuống ngắn, lúc non có lông dày hơn ở mặt
dưới, màu xanh lục, sau già lá ít lông hơn và có màu trắng mốc; lá kèm mỏng, ôm
sát vào thân. Hoa nhỏ, màu trắng sau hơi vàng, tập trung thành tán ở đầu cành; đài
hoa hình chén hay hình ống gồm những lá đài nhỏ phát triển không đều; tràng hoa
hàn liền ở phía dưới thành ống ngắn, nhị 4, bầu hạ. Quả hình cầu, rời nhau hoặc
dính liền thành khối, khi chín màu đỏ, mang đài còn lại ở đỉnh. Mùa hoa: tháng 5-6.
Mùa quả: tháng 7-10 [3][4][6].
1.1.3. Bộ phận dùng
Bộ phận dùng: Rễ phơi hoặc sấy khô (Radix morindae) [3][4][6].
Đặc điểm: Rễ cong queo. Thịt đứt thành từng đoạn, để lộ lõi nhỏ ở bên trong,
vỏ ngoài màu hồng nhạt, thịt màu hồng hay tím, trên mặt vỏ có nhiều vân dọc. Cắt

ngang thấy lớp vỏ ngoài rất mỏng, dính chặt vào thịt, thịt dày, giữa có lõi như lõi
sắn. Lớp gỗ rắn chắc, màu vàng nâu hoặc vàng trắng, đường kính 1-5mm [3][4][6].
1.1.4. Nơi sống và thu hái
Mọc hoang ở ven rừng thứ sinh trung du và miền núi. Gặp nhiều ở Quảng
Ninh, Hà Tây, Ninh Bình, Vĩnh Phúc, Lạng Sơn, Hà Giang, Hòa Bình. Có nhiều nơi
như Quảng Ninh, Hà Tây, Vĩnh Phúc trồng để đảm bảo nhu cầu trong nước
[3][4][6].

2


Có thể đào rễ quanh năm, tốt nhất là vào mùa thu-đông, rửa sạch, cắt bỏ rễ
con, phơi sấy cho gần khô, dập dẹt rồi phơi sấy tiếp đến độ ẩm 13% [3][4][6].
1.1.5. Thành phần hóa học
a. Thành phần hóa học
Theo nhiều nghiên cứu đã công bố, thành phần chính của Ba kích là
anthranoid, iridoid và polysaccharide. Ngoài ra Ba kích còn chứa một số thành phần
khác như: saponin, đường khử, acid hữu cơ [3][4][6].
STT

Nhóm hoạt chất

1

Iridoid glycoside

Đặc điểm, đại diện
Trong rễ của cây Ba kích đã tìm thấy các iridoid
glycoside:


asperulosid,

monotropein,

morofficinalosid, acid deacetyl asperulosidic, acid
asperosidic, acelat apserulosid, morindolide.
2

Anthranoid

Các anthranoid phân lập được từ rễ cây Ba kích
khá đa dạng:1-hydroxy-2-methylanthraquinone; 2hydroxy-1-methoxyanthraquinone;rubiadin,physcion,
1,3-dihydroxy-2-methoxyanthraquinone;
2-methylanthraquimone,
ethyl

ether;

3-hydroxy-

digiferruginol,lucidin

anthraquinone-2-carboxylic

wacid,

rubiadin-1-methylether,…
3

Polysaccharide


Một số polysaccharid được tìm thấy trong rễ cây
Ba kích như: nystose, fructofuranosylnystose, inulintype

hexasaccharide,

sucrose,

inulin-type

inulotretrose,

inulin-type

heptasaccharid,

trisaccharid,

inulopentose,

1-ketose,

inulotriose,
arabinose,

galactose, galacturonic acid, acidic polysaccharide…
1.1.5.2.

Nhóm anthranoid


 Đặc điểm[1]

3


Đây là nhóm hoạạt chất có vai trò quan trọng trong dượcc li
liệu Ba kích, thành
phần rất phong phú, 90% hoạt
ho chất thuộc nhóm này có khung 9,10
9,10-anthraquinone.

Đặc điểm,
m, tính chất
ch nhóm anthraquinone:
-

Có màu từ vàng, vàng cam đến
đ đỏ.

-

Dễ thăng hoa.Có
hoa. thể lợi dụng tính chất này để định
nh tính bbằng phản ứng vi
thăng hoa trên lam kính.

-

Tồn tạii trong ở dạng tự do và dạng glycoside. Dạạng glycoside dễ tan
trong nước,

c, dạng tự do thì tan trong các dung môi hữuu cơ
cơ.

-

Các anthraquinone
nthraquinone phát huỳnh quang dướii UV (365nm) cho hhuỳnh quang
tím hoặc đỏ nâu.

-

Các anthraquinone
nthraquinone có nhóm –OH ở vị trí α có tính acid yyếu hơn
anthraquinone có –OH ở vị trí β.

-

Các

anthraquinone

tan

trong

dung

dịch
ch NaOH,


ca
carbonat

và

hydrocarbonat.
-

Các dẫnn chất
ch 1,8-dihydroxy
roxy anthraquinone trong dung ddịch kiềm tạo
phenolat có màu đỏ,
đ dưới UV (365nm) cho huỳnh
nh quang tím ho
hoặc đỏ
nâu.

-

Dẫn chấtt oxyanthraquinone có ít nhất
nh mộtt nhóm OH α thì cho màu với
magie acetat trong cồn.
c
Màu đậm nhạt phụ thuộcc vào vvị trí của nhóm OH
khác, dẫnn chất
ch 1,2-dihydroxy cho màu tím; 1,4-dihydroxy
dihydroxy cho maù tía,
còn 1,6-dihydroxy
dihydroxy và 1,8-dihydroxy
1,8

cho màu đỏ cam.

 Một số anthraquinone
nthraquinone đã phân lập được trong dược liệu Ba kích
Hoạt chất

Công th
thức cấu tạo

4


Rubiadin:
-

Công thức phân tử:: C15H10O4.

-

Tên khoa học: 1,3-dihydroxy-2-methylanthracene1,3
9,10-dione.

Rubiadin-1-methyl
methyl ether:
-

Công thức phân tử:: C16H12O4.
Tên

khoa


h
học:

3-hydroxy-1-methoxy-2-

methylanthracene-9,10
9,10-dione.
Physcion:
-

Công thức phân tử:: C16H12O5.

- Tên khoa học: 1,8--Dihydroxy-3-methoxy-6-methyl9,10-anthrachinon.
1,2-dihydroxy-3-methyl
methyl-anthracene-9,10-dione:
-

Công thức phân tử:C
:C15H10O4.

Alizarin
-

Công thức phân tử:: C14H8O4

-

Tên khoa học: 1,2--Dihydroxyanthracene-9,10-dione


1.1.6.

Tác dụng dượ
ợc lý

a. Tác dụng tăng lựcc
Trong mộtt nghiên cứu
c khi cho chuột dùng dịch chiết nướcc Ba kích với liều 510g/kg cơ thể dùng liên tiếp
ti 7 ngày thì thấy có tăng sức dẻoo dai.

5


Trong một nghiên cứu khác, khicho chuột uống dịch chiết nước Ba kích với
liều 15-20g/kg cơ thể bằng đường uống trước khi tiêm NH4Cl thì thấy Ba kích có
tác dụng tăng sức đề kháng chung của cơ thể với các yếu tố độc hại.
 Từ kết quả của 2 thí nghiệm trên chứng tỏ Ba kích có tác dụng bồi bổ cơ
thể[18][41].
b. Tác dụng trên nội tiết
Một nghiên cứu được tiến hành trên chuột cống đực cho thấyBa kích không có
tác dụng kiểu androgen, nhưng có thể có khả năng tăng cường hiệu lực của
androgen hoặc tăng cường quá trình chế tiết hoocmon androgen. Ba kích làm tăng
trọng lượng tinh hoàn, cơ nâng hậu môn và túi tinh còn trọng lượng tuyến tiền liệt
không thay đổi đáng kể[6][38].
c. Tác dụng trên xương
Anthraquinon và polysaccharid có liên quan đến việc điều chỉnh cũng như
tăng cường sự hình thành xương, tăng sinh tế bào tạo xương in vivo, có tác dụng
trong ngăn ngừa và điều trị bệnh liên quan đến sự tiêu xương.
Các polysaccharid: có tác dụng bảo vệ, chống mất xương, chống oxy hóa do
tăng hoạt tính của các enzym chống oxy hóa của cơ thể, làm giảm lượng MDA

(Malodialdehyd) trong chuột cống thử nghiệm. So sánh với chuột được kiểm soát
bình thường, Polysaccharid làm tăng sự xuất hiện của các gen như BMP-2, Cbfal,
Rrankl, rOPG, rPPARγ2 mARN. Các gen này đều đóng vai trò quan trọng trong sự
phát triển, trao đổi chất của xương và sụn [43][14][23][29.
Ba hợp chất anthraquinone: 1, 3, 8-trihydroxy-2-methoxy-anthraquinone; 2hydroxy-1-methoxy-anthraquinone và rubiadin được chứng minh là có tác dụng bảo
vệ xương khi cắt bỏ buồng trứng ở chuột. Chúng làm giảm các lỗ rò do tiêu xương,
làm giảm lượng tế bào hủy xương đa nhân, ức chế tartrate resistant acid
phosphates(TRAP), enzym cathepsin K, thụ thể calcitonin (CTR) và carbonic
anhydrase II (CAII) là những thành phần đặc hiệu cho hoạt động của tế bào hủy
xương. Ngoài ra, ba hợp chất này còn có tác dụng chặn tín hiệu cho tế bào hủy
xương của NK- B (nuclear factor kappa B) và JNK (c-Jun N-terminal inases) đồng
6


thời điều chỉnh tỉ lệ OPG/RANKL (Osteopro-tegerin / receptor activator of NF- B
ligand) của tế bào tạo xương [15][30].

d. Tác dụng chống viêm
Thí nghiệm được tiến hành trên chuột cống trắng với mô hình gây phù bàn
chân chuột bằng nhũ dịch kaolin 10%, Ba Kích được dùng với các liều lượng 5g,
10g và 20g/ kg cơ thể tiêm dưới da trước khi gây phù. Kết quả cho thấy Ba kích có
tác dụng chống viêm rõ rệt.
e. Hạ đường huyết và giảm stress
Dịch chiết cồn Ba Kích có tác dụng hạ đường huyết và giảm stress oxy hóa
trên chuột cống đái tháo đường giúp ngăn ngừa các biến chứng của đái tháo đường.
Ba Kích có tác dụng bảo vệ tế bào chống lại stress oxy hóa trên tế bào Leydig TM3
gây bởi hydrogen peroxide[21][24][26].
Oligosaccharid: có tác dụng chống trầm cảm, chống tổn thương tế bào thần
kinh do corticosteron, có rất nhiều thử nghiệm lâm sàng chứng minh viên nang
oligosaccharid từ Ba kích có thể chữa trị chứng trầm cảm mức độ nhẹ và vừa, hiệu

quả chữa trị tương đương với fluoxetin hydrochlorid, phản ứng phụ rất ít và nhẹ, có
thể áp dụng trong chữa trị chứng trầm cảm mức độ nhẹ và vừa [17].
Năm hợp chất có tác dụng chống trầm uất: acid succinic, nystose, 1-Ffructosefuranosylnystose, hexasaccarid và heptasaccarid [11].
f. Tác dụng dự phòng thiếu máu cục bộ
Với cơ chế ngăn chặn quá trình tang calci quá mức và các gốc oxy tự do, Ba
kích có vai trò dự phòng thiếu máu cục bộ. Tác dụng này đã được chứng minh qua
nghiên cứu quan sát ảnh hưởng của Ba Kích đối với tổn thương thiếu máu cục bộ tái tưới máu cơ tim chuột cống trắng16].
g. Liều độc
LD50 xác định trên chuột nhắt trắng bằng đường uống của Ba kích là 193g/kg.
Như vậyBa kích có độc tính rất thấp [12].
1.2.

Tình hình nghiên cứu đánh giáDược liệu Ba kích

7


1.2.1. Tiêu chuẩn Dược điển
a. Chuyên luận Ba Kích dược điển Việt Nam IV[5].
-

Định tính:

Lấy 0,10-0,20g bột dược liệu, tiến hành vi thăng hoa sẽ được tinh thể màu
vàng. Khi thêm dung dịch kiềm, sẽ ngả màu đỏ tím.
Đun sôi 0,10 g bột dược liệu với 1 ml dung dịch NaOH và 9 ml nước, rồi lọc.
Thêm HCl cho đến phản ứng hơi acid và 10 ml ether ethylic, lắc. Lớp ether sẽ
nhuộm màu vàng. Gạn riêng lớp ether, thêm 5 ml dung dịch amoniac, lắc, lớp dung
dịch amoniac sẽ nhuộm màu đỏ tím bền vững.
-


Sắc ký lớp mỏng:

Bản mỏng: Silicagel G
Hệ dung môi khai triển: Ether dầu: ethylacetat: acid acetic băng (7,5:2,5:0,25)
Dung dịch thử: Lấy khoảng 5 g dược liệu thêm 10 ml nước, lắc để nước thấm
đều dược liệu, để yên 15 phút, nghiền dược liệu trong cối sứ thành bột ướt, thêm 40
ml MeOH, cho vào bình cầu miệng mài, đun sôi hồi lưu trên cách thủy trong 30
phút, lọc, làm bay hơi dung môi đến cạn. Thêm 5 ml nước và 20 ml ether dầu hỏa,
lắc khoảng 3 - 5 phút, để lắng, gạn lấy phần dịch chiết, làm bay hơi hết dung môi.
Hòa cắn trong 2 ml MeOH làm dung dịch thử.
Dung dịch đối chiếu: Lấy 5 g dược liệu Ba kích (mẫu chuẩn) và tiến hành như
đối với dung dịch thử.
Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng 10 µl dung dịch đối chiếu và
dung dịch đối chiếu. Sau khi triển khai, lấy bản mỏng ra để khô ngoài không khí,
phun dung dịch kali hydroxyd trong EtOH. Sắc ký đồ của dung dịch thử phải có các
vết (2 - 3 vết) màu đỏ, cùng màu sắc và giá trị Rf với các vết trên sắc ký đồ của
dung dịch đối chiếu.
-

Độ ẩm: không quá 15%

-

Tỷ lệ vụn nát: không quá 5%
8


-


Tạp chất: không quá 1%

-

Tỷ lệ dược liệu xơ, hóa gỗ, đường kính dưới 3mm: không được có

-

Lượng chất gỗ: không nhiều hơn 35%

b. Chuyên luận Ba Kích dược điển Trung Quốc[16].
-

Định tính:

Cân 2,5g bột dược liệu, thêm 25ml EtOH, đun hồi lưu cách thủy trong 1 giờ,
để nguội, lọc. Bốc hơi dung môi đến khi còn khoảng 1ml làm dung dịch thử. Chuẩn
bị một dung dịch chuẩn đối chiếu với 2,5g bột dược liệu Ba kích chuẩn trong điều
kiện tương tự như chuẩn bị dung dịch thử.
Bản mỏng: Silicagel GF254
Dung môi khai triển: Toluen : ethylacetat : acid formic (8:2:0,1)
Tiến hành chấm riêng biệt lên bản mỏng 10µl dung dịch chuẩn và dung dịch
thử. Sau khi khai triển sắc ký, sấy khô, kiểm tra các vết dưới đèn tử ngoại 254nm.
Mẫu thử phải có các vết với vị trí và màu sắc tương tự như các vết có trong mẫu
chuẩn.
-

Độ ẩm: không quá 15%

-


Tỷ lệ vụn nát: không quá 5%

-

Tạp chất: không quá 1%

-

Tỷ lệ dược liệu xơ, hóa gỗ, đường kính dưới 3mm: không được có

-

Lượng chất gỗ: không nhiều hơn 35%

-

Hàm lượng các kim loại:
+ Chì: không nhiều hơn 5 ppm
+ Arsen: không nhiều hơn 3 ppm
+ Cadimi: không nhiều quá 0,3 ppm
+ Sulfur dioxide: không quá 0,2 ppm
+ Thủy ngân: không quá 0,2 ppm

-

Dư lượng thuốc trừ sâu: Tổng DDT: không quá 0,1 ppm, tổng BHC
không quá 0,2 ppm, tổng aldrin không quá 0,01ppm, endrin: không quá
0,01ppm


9


-

Tiêu chuẩn về hàm lượng nystose:
Điều kiện khai triển sắc ký:
 Cột: C18
 Pha động: MeOH-Nước (3:97)
 Detector: ELSD (tán xạ bay hơi)
 Số lượng đĩa cột ít nhất là 2000
 Thể tích tiêm mẫu: 10 µl
Yêu cầu: Hàm lượng nystose ít nhất là 2%.

c. Chuyên luận Ba kích dược điển Hàn Quốc[22]
-

Sắc ký bản mỏng:

Cân 2,0g bột dược liệu, thêm 15ml EtOH, đun hồi lưu cách thủy trong vòng 1
giờ, lọc. Bốc hơi dung môi, thu cắn. Hòa tan cắn trở lại bằng 1ml EtOH. Dung dịch
này được sử dụng làm dung dịch thử.
Bản mỏng: Silicagel G
Hệ dung môi khai triển: hexan:ethylacetat (3:2)
Tiến hành chấm lên bản mỏng 10µl dung dịch thử, khai triển sắc ký. Bản
mỏng sau khi khai triển được làm khô trong không khí, hiện màu bằng acid sulfuric
và đốt ở 105oC trong 10 phút.
Yêu cầu: Có vết màu tím xuất hiện ở giá trị Rf khoảng 0,6.
-


Lượng chất gỗ: không nhiều hơn 35%

-

Hàm lượng các kim loại nặng:
+ Chì: không nhiều hơn 5 ppm
+ Arsen: không nhiều hơn 3 ppm
+ Cadimi: không nhiều quá 0,3 ppm
+ Thủy ngân: không quá 0,2 ppm

-

Dư lượng thuốc trừ sâu:
+ Tổng DDT: không quá 0,1 ppm.
+ Tổng BHC không quá 0,2 ppm

10


+ Tổng aldrin không quá 0,01ppm, endrin: không quá 0,01ppm, diedrin
không quá 0,01ppm
-

Sulfur dioxide không quá 30ppm.

-

Mất khối lượng do làm khô không quá 13%.

-


Hàm lượng tro không quá 6%.

-

Hàm lượng acid không tan không quá 1%.

-

Hiệu suất chiết với EtOH pha loãng kgoong nhở hơn 52%.

1.2.2. Tại Việt Nam
Hiện tại ở Việt Nam đã có một số công trình nghiên cứu kiểm nghiệm Ba kích
như: Nghiên cứu tiến hành đánh giá Ba kích tím ở Ba Chẽ, Quảng Ninh, bước đầu
xây dựng tiêu chuẩn cho Ba kích Quảng Ninh, tuy nhiên nghiên cứu này chỉ mới
dừng lại ở mức độ định tính. Công trình nghiên cứu phân lập và định lượng
monotropein trong Ba kích ở cấp độ luận văn thạc sĩ thực hiện trên Ba kích trồng tại
Bắc Giang đã chiết xuất, phân lập, tinh chế và xác định được hàm lượng
monotropein [8][9] bằng phương pháp HPLC với các điều kiện:
-

Cột sắc ký Rp 18 (4,6mm x 250mm, 5µm)

-

Detector DAD, tốc độ dòng 1ml/phút

-

Thể tích tiêm 10µl.


-

Nhiệt độ cột 25oC

-

Hệ dung môi pha động: MeOH:H3PO4 0,5% (5:95).

-

Bước sóng phát hiện: 237nm

Kết quả phân lập được monotropein trong Ba kích với hiệu suất 0,05mg/g dược
liệu.
1.2.3. Trên thế giới
Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về phân lập, định tính và định lượng nhóm
chất trong dược liệu Ba kíchnhư sau[20][35][39][42][44][39]
Thứ nhất: Nghiên cứu phân lập và định tính anthranoid trên các mẫu Ba kích
Trung Quốc bằng phương pháp HPLC kết hợp với một HSCCC. Phương pháp
11


HPLC sử dụng cột C18(150mm × 4,6mm, 5µm), pha động MeOH-Acid acetic 1%
theo gradient:
Thời gian (phút)

MeOH (%)

Acid acetic 1% (%)


0-25

55%-75%

45-25%

Nghiên cứu này đã phân lập được 5 anthranoid gồm:
(1) alizarin-1-methylether
(2) 1,2-dimethoxy-3-hydroxyanthraquinone
(3) 1-hydroxy-3-hydroxymethylanthraquinone
(4) rubiadin-1-methylether
(5) anthragallol-2-methylether
Thứ hai: Nghiên cứu định lượng anthranoid toàn phần bằng phương pháp so
màu ở bước sóng 509nm được thực hiện trên các mẫu dược liệu Trung Quốc đã xác
định được hàm lượng anthranoid toàn phần là 0,023%.
Thứ ba: Nghiên cứu định lượng anthranoid bằng phương pháp HPLC sử dụng
cột C18(250mmx4,6mm, 5µm), hệ pha động: dung môi A: ACN; dung môi B: dung
dịch acid phosphoric 0,2% với gradient:
Thời gian (phút)

Dung môi A (%)

Dung môi B (%)

0-15

5%-30%

95%-70%


15-35

30%-40%

70%-60%

35-80

40%-80%

60%-20%

Nghiên cứu được thực hiện trên các mẫu Ba kích Trung Quốc cho kết quả hàm
lượng 4 hoạt chất thuộc nhóm anthraquinone có trong dược liệu Ba kích gồm:
(1) 2-hydroxy-3-hydroxymethethyl-anthraquinone: 0,84µg/g-111,15 µg/g.
(2) 2-hydroxy-1-methoxyanthraquinone: 3,67 µg/g- 211,57 µg/g.

12


(3) Rubiadin-11-methyl ether: 1,94 µg/g- 98,56 µg/g.
(4) Rubiadin:: 0,78 µg/gµg/g 21,53 µg/g.
Thứ 4:: Nghiên cứu
c xác định hàm lượng 7 hoạt chấtt oligosaccharide. N
Nghiên
cứu đã dùng phương
ương pháp sắc
s ký lớp mỏng hiệu năng cao vớii bbản mỏng silica gel
60, hệ dung môi khai triển:

tri
n-butanol-isopropanol-nước-acetic
acetic acid (7:5:2:1, v/v).
Sau khai triển cho kếtt quả
qu phân tách tốt 6 inulin-type
type oligosaccharide và cho kkết quả
bán định lượng
ng 6 loại
lo oligosaccharide (DP3-DP9):: DP3: 1.77%
1.77%-10.94%, DP4:
5.07%-32.31%,
32.31%, DP5: 7.54%-35.53%,
7.54%
DP6: 9.37%-41.09%,
41.09%, DP7: 9.36%
9.36%-36.36%,
DP8: 12.74%-48.75%,
48.75%, DP9: 5.34%-21.72%.
5.34%
Thứ 5: Nghiên cứu
c định tính oligosaccharide bằng HPLC vvới cộtcyclobond I
2000, pha động: ACN-nước
ACN
(65:35), tốc độ dòng: 0.4 mL/phút, tthể tích tiêm: 10µl.
Trên sắc ký đồ có các pic đặc
đ trưng của 11 inulin-type
type oligosaccharide ((DP1DP11).
1.3.

Rubiadin


1.3.1. Công thức cấu
u tạo
t

1.3.2. Tác dụng dượcc lý
Rubiadin có nhiềều tác dụng dược lý đã được chứng
ng minh như tác ddụng chống
oxi hóa, tác dụng
ng kháng nấm,
n
tác dụng ức chế tế bào ung thư, ch
chống loãng xương và
bảo vệ tế bào gan [37][
][28][15][31][34][30].
a. Tác dụng chống
ng oxi hóa

13


Rubiadinđược chứng minh có khả năng chống lại sự peroxyd hóa lipid gây ra
bởi FeSO4 và t-butylhydroperoxyd (tBHP) và khả năng này tốt hơn EDTA, vitamin
E, p-benzoquinone [34].
b. Tác dụng ức chế tế bào ung thư
Rubiadin đã được chứng minh có khả năng gây độc đối với tế bào ung thư
người. Có thể xem rubiadin như là một chất độc quang học tự nhiên chống lại tế bào
ung thư [31].

c. Tác dụng trên xương

Rubiadin được chứng minh là có tác dụng bảo vệ xương khi cắt bỏ buồng
trứng ở chuột. Chúng làm giảm các lỗ rò do tiêu xương, làm giảm lượng tế bào hủy
xương đa nhân, ức chế tartrate resistant acid phosphates (TRAP), enzym cathepsin
K, thụ thể calcitonin (CTR) và carbonic anhydrase II (CAII) là những thành phần
đặc hiệu cho hoạt động của tế bào hủy xương. Ngoài ra, ba hợp chất này còn có tác
dụng chặn tín hiệu cho tế bào hủy xương của NK- B (nuclear factor kappa B) và
JNK (c-Jun N-terminal inases) đồng thời điều chỉnh tỉ lệ OPG/RANKL (Osteoprotegerin / receptor activator of NF- B ligand) của tế bào tạo xương [15][30].
d. Tác dụng bảo vệ tế bào gan
Rubiadin có khả năng bảo vệ tế bào gan, làm giảm tỉ lệ phá hủy tế bào gan
dưới tác nhân CCl4 ở chuột cống khi dùng 1 lần trên ngày trong 14 ngày liên tiếp
[37].
1.3.3. Sự phân bốrubiadin trong chi Morinda
Rubiadin rất phổ biến trong chi Morinda, đã được tìm thấy trong Morinda
citrifolia, Morinda jasminoides, Morinda lucida, Morinda umbellata, Morinda
officinalis, Morinda elliptica[1].

14


Riêng trong Morinda officinalis, đã có nghiên cứu định lượng hàm lượng
rubiadin có trong các mẫu Trung Quốc: 0,78 µg/g – 21,53 µg/g. Trong khi đó các
anthraquinon khác được nghiên cứu đồng thời có hàm lượng là:
-

2-hydroxy-3-hydroxymethethyl-anthraquinone: 0,84µg/g-111,15 µg/g

-

2-hydroxy-1-methoxyanthraquinone: 3,67 µg/g- 211,57 µg/g


-

Rubiadin-1-methyl ether: 1,94 µg/g- 98,56 µg/g

Nhận xét: Rubiadin là một trong những hoạt chất quan trọng thuộc nhóm
anthranoid trong dược liệu Ba kích. Rubiadin đã được chúng minh có nhiều tác
dụng dược lý như chống oxy hóa, bảo vệ xương, bảo vệ tế bào gan, ức chế tế bào
ung thư. Riêng trong dược liệu Ba kích đã có nghiên cứu tiến hành định lượng
rubiadin trên các mẫu Ba kích Trung Quốc và cho kết quảrubiadin có tỉ lệ đáng kể
so với các anthraquinone khác.
Những nghiên cứu định lượng hoạt chất của dược liệu Ba kích chưa công bố
nhiều. Cùng với với sự phổ biến và nhu cầu lớn của dược liệu ba kích trên thị
trường hiện nay, nên chúng tôi tiến hành đề tài “Bước đầu nghiên cứu xây dựng
phương pháp định lượng anthranoid trong dược liệu Ba kích bằng HPLC”, với
mục tiêugóp phần tìm hiểu về dược liệu Ba kích trên thị trường Việt Nam trên tiêu
chí định lượng nhóm anthranoid, nhóm hoạt chất chính trong Ba kích.Trong nghiên
cứu này, chúng tôi xây dựng phương pháp định lượng rubiadin (như là marker)
bằng phương pháp HPLC, và đồng thời tiến hành định lượng anthranoid toàn phần
theo phương pháp đo quang phổ hấp thụ UV-VIS.

15


CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1.

Đối tượng nghiên cứu
Ba kích do hợp tác xã Toàn Dân, xã Thanh Lâm, huyện Ba Chẽ, tỉnh Quảng

Ninh cung cấp, 2 mẫu Ba kích thu mua tại cơ sở buôn bán dược liệu xã Ninh Hiệp,

quận Gia Lâm, Hà Nội và 2 mẫu Ba kích thu mua tại các cơ sở buôn bán dược liệu
phố Lãn Ông, quận Hoàn Kiếm, Hà Nội, 1 mẫu Ba kích Trung Quốc do công ty
rượu Hà Nội cung cấp.
Các mẫu được đánh số, dùng để chiết xuất và xác định hàm lượnganthranoid
toàn phần và hàm lượng rubiadin.
Mã số

Mẫu thử

1

Mẫu Ba kích Trung Quốc do công ty rượu Hà Nội cung cấp

2

Mẫu Ba kích tại cơ sở 24 Lãn Ông, quận Hoàn Kiếm, Hà Nội

3

Mẫu Ba kích tại cơ sở 67 Lãn Ông, quận Hoàn Kiếm, Hà Nội

4

Mẫu Ba kích 2,5 năm tuổi hợp tác xã Toàn Dân, xã Thanh Lâm, huyện Ba
Chẽ, tỉnh Quảng Ninh.

5

Mẫu Ba kích tại quầy thuốc YHCT, xóm 9, xã Ninh Hiệp, Gia Lâm, Hà
Nội


6

Mẫu Ba kích tại quầy thuốc Liên Khanh, xóm 8, xã Ninh Hiệp, Gia Lâm,
Hà Nội

2.2.

Trang thiết bị, dụng cụ và hóa chất.

 Trang thiết bị và dụng cụ:
Trong quá trình nghiên cứu, chúng tôi đã sử dụng các thiết bị, dụng cụ gồm:
Máy HPLC Shimazu (Nhật Bản), cột sắc ký C18 Waters (150mm x 4,6mm, 5µm),
cân phân tích Sartorius, cân hàm ẩm, máy đo quang Shimazu, tủ sấy, tủ hốt, tủ bảo
quản lạnh, máy lắc siêu âm, nồi cách thủ, máy cất quay chân không, bộ dụng cụ
sinh hàn, máy soi huỳnh quang, máy chấm sắc ký tự động, bộ lọc dung môi màng
lọc 0,45µm, pipet chính xác và các dụng cụ thủy tinh cần thiết khác.

16


 Dung môi, hóa chất:
Các hóa chất, thuốc thử dùng trong nghiên cứu gồm:rubiadin (ChemFaces –
CFN99270), phycsion (Chengdu Biopurify Phytochemical – 15061509), emodin
(ChemFaces - CFN98834), tectoquinon (ChemFaces), EtOH 96% (Merk), MeOH
(Merk-PA), natri hydroxyd (công ty hóa chất Đức Giang), bản mỏng silicagel
(Merk), ethylacetat (Trung Quốc), toluene (Trung Quốc), acid formic (Sigma-PA),
acid sulfuric (Trung Quốc), ACN (Sigma-PA), acid phosphoric (Merk-PA), thuốc
thử Fehling, natri carbonat, amoniac, chloroform, thuốc thử Mayer, thuốc thử
Dragendoff, thuốc thử Bouchardat, đồng sulfat (Bộ môn Hóa phân tích-Độc chất),

acid acetic (Trung Quốc), acid hydrochloric (Trung Quốc), ether (Trung Quốc),
nước RO, nước cất hai lần…
2.3.

Nội dung nghiên cứu
 Áp dụng các phương pháp định tính đã được khảo sát qua các tài liệu, xác
định sự có mặt của một số nhóm nhất trong Ba kích.
 Áp dụng phương pháp quang phổ UV-VIS để xác định hàm lượng
anthranoid toàn phần.
 Khảo sát điều kiện sắc ký với HPLC để phân tích rubiadin trong Ba kích
 Thẩm định các điều kiện định lượng rubiadin trong Ba kích Quảng Ninh.
 Áp dụng đểxác định hàm lượng rubiadin trong các mẫu Ba kích.So sánh
hàm lượng rubiadin giữa Ba kíchQuảng Ninh với các mẫu Ba kích trên thị
trường.So sánh hàm lượng rubiadin với hàm lượng anthranoid toàn phần.

2.4.

Phương pháp nghiên cứu

2.4.1. Định tính các nhóm chất hóa học.
a. Chuẩn bị mẫu
Ba kích tươi rửa sạch, bỏ lõi đem sấy ở nhiệt độ 60oC đến khô theo tiêu chuẩn
DĐVN IV, Ba kích khô đem sấy ở 60oC trong 24 giờ, sau đó kiểm tra dược liệu
theo các tiêu chuẩn trong chuyên luận Ba kích-DĐVN IV. Xay lấy bột để tiến hành
phân tích.

17