1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Những năm gần đây, ở nước ta các bệnh về máu nói chung và đặc biệt
là các bệnh của hệ thống tạo máu ngày càng có xu hướng gia tăng mạnh mẽ.
Theo số liệu thống kê chưa đầy đủ từ các cơ sở y tế chuyên điều trị các bệnh
về máu như Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương, Bệnh viện Nhi trung
ương, Quân y 108, Trung tâm Huyết học và Truyền máu, Bệnh viện Trung
ương Huế cho thấy trong vòng 10 năm trở lại đây đã có 7200 ca mắc bệnh về
máu, trong đó các bệnh liên quan đến ung thư máu chiếm tỷ lệ khoảng 70%.
Nguyên nhân gia tăng các bệnh về máu có thể do ô nhiễm môi trường, hóa chất,
các loại virus, các chất độc từ thời chiến tranh, đặc biệt là chất độc da cam đang
phát tán hậu quả. Điều đáng lo ngại là bệnh thường được phát hiện hầu hết ở các
bệnh nhân còn trẻ tuổi ở lứa tuổi lao động và gây tỷ lệ tử vong cao.
Hiện nay vẫn chưa có phương pháp điều trị hữu hiệu cho các bệnh về
máu. Phương pháp điều trị ung thư máu và suy tủy xương được xem là tối ưu
nhất hiện nay là ghép tế bào gốc . Khác với phương pháp truyền hoá chất và
xạ trị, các phương pháp điều trị bằng ghép tế bào gốc và tế bào gốc tạo máu
giúp kéo dài tuổi thọ và đảm bảo chất lượng cuộc sống của người bệnh. Trong
trường hợp điều trị bằng kết hợp nhiều phương pháp, ghép tế bào gốc có vai
trò cứu vớt, giúp người bệnh có thể chịu được liều lượng hoá chất và tia xạ
cao hơn, và do đó có thể nâng cao tỉ lệ kéo dài thời gan lui bệnh. Trong thực
tế, ghép tế bào gốc đồng loại giúp chữa khỏi 90% các bệnh nhân bị rối loạn về
máu. Tuy nhiên chi phí cho một ca ghép tế bào gốc hiện nay vẫn còn khá cao
từ 400 triệu đồng đến hơn 1 tỷ đồng. Hơn nữa để ghép được đòi hỏi giữa
người cho và người nhận phải tương hợp về kháng nguyên hòa hợp tổ chức
HLA. Với mức chi phí và yêu cầu phù hợp HLA như vậy, thực tế chỉ có
khoảng 2-3% người bệnh ung thư máu có đủ điều kiện để thực hiện ghép tế

2

bào gốc. Do vậy, việc nghiên cứu tìm ra các công nghệ, các phương cách, các
loại thuốc an toàn và rẻ tiền hơn để cứu sống những bệnh nhân mắc các bệnh
về máu là điều hết sức quan trọng và bức thiết hiện nay.
IL-11 là một cytokin có vai trò quan trọng trong quá trình tạo máu và
cytokine tạo máu này đã được tiến hành tìm hiểu trên nhiều mô hình hóa trị
liệu hay mô hình ghép tủy xương nhằm xác định khả năng ứng dụng như là
một yếu tố kích thích tạo tiểu cầu . Với các kết quả thu được khi thử nghiệm
trên chuột và khỉ đều cho kết quả khả quan về khả năng kích thích tạo tiểu cầu
của IL-11, vào năm 1997, hãng Neumega đã được cơ quan Quản lý Thực
phẩm và Dược phẩm Mỹ (US Food and Drug Administration - FDA) cấp
phép cho việc áp dụng IL-11 tái tổ hợp để kiểm soát bệnh thiếu hụt tiểu cầu
và giảm bớt nhu cầu về tiểu cầu trong quá trình truyền máu sau khi hóa trị liệu
ức chế tủy đối với những bệnh nhân bị u tủy ác tính - những người có nguy cơ
cao về sự thiếu hụt tiểu cầu . Tuy nhiên, giá thành còn cao trên thị trường,
chưa phù hợp với người Việt nam.
Trên cơ sở đó, Viện công nghệ sinh học đã nghiên cứu tái tổ hợp và tinh
chế thành công IL-11 bằng công nghệ hiện đại. Sản phẩm IL-11 được tạo ra
cần phải được đánh giá tính an toàn và hoạt tính sinh học, trước khi sử dụng
trên lâm sàng. Chúng tôi sử dụng sản phẩm để nghiên cứu trên mô hình nuôi
cấy tế bào gốc sau khi đã có đánh giá tính an toàn chung, độc tính cấp, độc
tính bán trường diễn, chí nhiệt tố và các nội độc tố trong mẫu sản phẩm Il-11.
Đồng thời hoạt tính IL-11 cũng đã được đánh giá trên tế bào dòng TF-1, tế
bào dòng ung thư dòng hồng cầu, mục tiêu của đề tài:
1. Áp dụng quy trình tách và nuôi cấy tế bào gốc tạo máu tủy xương.
2. Đánh giá tác dụng in vitro của IL-11 tái tổ hợp lên tế bào gốc tạo máu
tủy xương.



3

CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN
1.1. Tế bào gốc
Tế bào gốc (Stem Cell) đã được phát hiện từ trên 60 năm nay, kể từ khi
nghiên cứu thành công tạo cụm tế bào lách trong nghiên cứu sinh máu ở
chuột (1950). Từ đó dựa trên các tiến bộ về khoa học kỹ thuật; hình thái
học; hóa học tế bào; miễn dịch, lai phân tử, huỳnh quang, PCR, RT-PCR,
nuôi cấy tế bào người ta đã phân lập và biết được quá trình phát triển của
cơ thể người và động vật bắt đầu từ tế bào gốc toàn năng (totipotent stem
cell) . Từ đó, khái niệm tế bào gốc (TBG) là tế bào có khả năng sinh sản, tự
tái sinh và biệt hóa thành các tế bào gốc kế cận, rồi phát triển thành TBG
có chức năng riêng, cuối cùng trở thành tế bào trưởng thành của toàn cơ thể
người và động vật .
Đặc điểm của tế bào gốc toàn năng là tế bào có khả năng tạo ra tất cả
các tế bào gốc của các cơ quan trong cơ thể và có nhiều đặc điểm như khả
năng sinh sản và biệt hóa cao, tạo ra thai nhi ; có khả năng tự tái sinh để duy
trì nguồn gốc của chúng; có số lượng rất ít nhưng khả năng sinh sản và biệt
hóa rất lớn, tuy nhiên chưa có dấu ấn riêng để nhận biết tế bào gốc toàn năng.
Ở điều kiện bình thường tế bào gốc toàn năng ở trạng thái nghỉ ngơi, nhưng
khi có kích thích từ môi trường chúng sinh sản và biệt hóa nhanh để tạo ra các
tế bào gốc kế cận, các tế bào gốc kế cận này là các tế bào gốc của các cơ quan
riêng biệt, lúc này chúng mới có dấu ấn riêng để có thể nhận biết được, ví dụ
tế bào gốc của cơ quan tạo máu có dấu ấn CD34+…đây là dấu ấn riêng đầu
tiên của tế bào gốc tạo máu kể từ khi tách khỏi tế bào gốc toàn năng .
Trong cơ thể người và động vật, tế bào gốc có mặt ở các vị trí gồm tủy
xương, máu ngoại vi, máu dây rốn; ở các cơ quan đặc như dây rốn, giác mạc,



4

não, cơ tim, xương, gan, da… Ở đây chúng vừa là tế bào dạng “nghỉ ngơi”,
vừa là dạng tế bào thường trực để khi cần thiết có nhu cầu chúng sẽ sinh sản
và biệt hóa thành các tế bào gốc kế cận, rồi tạo ra các tế bào chức năng, thay
thế thường xuyên cho tế bào già .
1.2. Tế bào gốc tủy xương
Trong tủy xương có nhiều loại tế bào gốc khác nhau về các đặc điểm
như tuổi của tế bào, về hình thái và chủng loại. Người ta xếp các tế bào này
thành 2 nhóm lớn là tế bào gốc tạo máu và tế bào gốc không tạo máu.
Tế bào gốc tạo máu là các tế bào được tách ra từ tế bào gốc toàn năng
của toàn bộ cơ thể, là tế bào gốc vạn năng của cơ quan sinh máu, chúng có
khả năng tạo ra tất cả các tế bào gốc đầu dòng của tế bào máu, có khả
năng tự tái sinh để duy trì dòng tế bào, nhưng chỉ có tế bào gốc tạo máu
vạn năng có dấu ấn CD34+ mới có khả năng này. Các tế bào này còn có
các dấu ấn đặc hiệu khác như CD45, CD47 có thể nhận biết được. Các tế
bào gốc tạo máu có khả năng sinh sản và biệt hóa thành các tế bào máu
trưởng thành. Khả năng sinh sản rất lớn, mặc dù trong tủy xương chỉ có từ
khoảng 1/100 đến 1/10000 tế bào gốc .
Quá trình sản sinh và biệt hóa của tế bào gốc tạo máu được bắt đầu từ
tế bào gốc đa năng của lá phôi trung bì. Các tế bào gốc tạo máu đầu tiên này
được phát triển và biệt hóa thành tế bào gốc đa năng dòng tủy, dòng lympho
rồi thành tế bào gốc đầu dòng của các dòng tế bào máu như hồng cầu, bạch
cầu và tiểu cầu. Từ các tế bào này, chúng tiếp tục sinh sản và biệt hóa thành
các tế bào con trưởng thành có chức năng cụ thể như: hồng cầu, bạch cầu hạt,
mono, lympho…Quá trình trên có thể chia ra 3 giai đoạn hay 3 khu vực, bao
gồm tủy xương, máu ngoại vi và tổ chức (Hình 1) .


5


Hình 1.1: Sơ đồ phát triển của tế bào gốc tạo máu
Tế bào gốc phát triển được là nhờ quá trình tự tái sinh, quá trình sinh
sản, biệt hóa và quá trình chết theo chương trình . Các hoạt động này luôn
luôn được điều hòa bởi các yếu tố kích thích phát triển và các yếu tố ức chế .
Khi sự sinh sản và biệt hóa hoạt động mạnh nhờ các yếu tố kích thích như các
cytokin, chemokin, yếu tố phát triển đơn dòng, đa dòng… nếu vượt ngưỡng
bình thường thì các yếu tố ức chế và yếu tố của con đường chết theo chương
trình tăng hoạt động. Do đó, các yếu tố này tham gia điều chỉnh cân bằng nội
môi, cân bằng 2 quá trình sản sinh và biệt hóa . Các yếu tố tham gia quá trình
phát triển bao gồm các cytokin như IL-3, IL-11, IL-6,… các yếu tố kích thích
như GM-CSF, G-CSF, SF…


6

1.3. Một số yếu tố tham gia quá trình biệt hóa tế bào gốc tạo máu
Tác dụng của các cytokin ở các giai đoạn khác nhau của quá trình phát
triển và biệt hóa của dòng hồng cầu được minh họa trong Hình 2, có vai trò
của IL-3, IL-11, GM-CSF. Mỗi cytokin có tác dụng ở một giai đoạn nhất định
của quá trình phát triển và biệt hóa, nhưng chúng thường có những điểm tác
động chung trong quá trình này. Các yếu tố này cũng có tác dụng trong dòng
tiểu cầu, tuy nhiên các thời điểm tác dụng cũng khác so với dòng hồng cầu
(Hình 3). Riêng dòng bạch cầu, có vai trò của IL-3, nhưng không có vai trò
của IL-11 (Hình 4).

Hình 1.2: Vị trí tác dụng của các cytokin phát triển và biệt hóa dòng hồng
cầu



7

Hình 1.3: Vị trí tác dụng của các cytokin phát triển và biệt hóa dòng tiểu
cầu

Hình 1.4 : Vị trí tác dụng của các cytokin phát triển và biệt hóa dòng bạch
cầu


8

1.3.1. Interleukin-11 (IL-11)
Với IL-11, định nghĩa ban đầu chỉ là một yếu tố hòa tan trong môi
trường với sự tham gia của chất cảm ứng IL-1α trên dòng tế bào đệm tủy
xương, PU-34, nó được cung cấp lâu dài cho quá trình nuôi cấy tế bào . Hiện
nay, IL-11 được biết tới là một cytokin tạo máu với vai trò là yếu tố sinh
trưởng cho tế bào nguồn của u tương bào (plasmacytomas), tế bào tạo máu
tiềm năng, nguyên mẫu tiểu cầu, đại thực bào, đồng thời ức chế chứng phát
phì với tiền tế bào mỡ . Chính vì vậy, IL-11 còn có tên gọi khác là yếu tố ức
chế chứng phát phì. Nhiều nghiên cứu trên tế bào và trên các mô của các cơ
quan đã chỉ ra IL-11 còn có hoạt tính bảo vệ và hồi phục màng nhày của hệ
tiêu hóa; tác động như là tác nhân điều biến miễn dịch hay tham gia vào các
hoạt động trao đổi chất trong xương .
Trong cơ thể người, gen hoàn chỉnh mã hóa cho IL-11 chiếm kích
thước khoảng 7 kb trong DNA của hệ gen, định vị trên cánh dài của nhiễm
sắc thể số 19, tại vị trí 19q13.3-q13.4 . Gen này chứa 5 vùng exon và 4 vùng
intron. Một điểm khá đặc biệt là mặc dù IL-11 nằm trong họ của IL-6 nhưng
trình tự DNA của gen il-11 lại khó tìm thấy sự tương đồng ở cấp độ
nucleotid. Một vài vùng nằm ở đầu 5’ của gen lại có trình tự nucleotid tương
đồng đến 70% khi so sánh với các gen mã hóa cho các cytokin khác như IL2, IL-3, IL-9 và GM-CSF.

Interleukin-11 là một phân tử protein có mức độ ổn định cao trước
điều kiện nhiệt độ mặc dù trong cấu trúc không tồn tại acid amin cystein
nào. Dạng tiền IL-11 bao gồm 199 acid amin. Đoạn peptid tín hiệu gồm 21
acid amin sẽ được loại bỏ sau dịch mã để tạo nên dạng IL-11 có hoạt tính
với 178 acid amin. Mức độ tương đồng của IL-11 ở người với thỏ là 88%,
với linh trưởng khác là 94%. Các vị trí acid amin 59 (methionin), 42 (lysin)


9

và 99 (lysin) là các vị trí cốt yếu để protein có thể gắn kết với thụ thể . Cấu
trúc không gian của IL-11 được mô phỏng cũng gồm 4 chuỗi xoắn A, B, C,
D (Hình 6). Tuy nhiên, không có vị trí nào của asparagin để hình thành cấu
trúc glycosyl hóa hay sự biến đổi của chuỗi carbonhydrat. Hơn nữa, với
thành phần acid amin gồm prolin (12%), leucin (23%) và các acid amin tích
điện dương khác (14%) làm điểm đẳng điện của protein có giá trị khác với
các cytokin khác (pI = 11,7).

Hình 1.5: Mô phỏng cấu trúc không gian của IL-11
Trong cơ thể, IL-11 có thể được tiết ra bởi nhiều loại tế bào ở các mô
khác nhau. Về mức độ tiết cơ bản của IL-11 được phát hiện ở các tế bào như
nguyên bào sợi, tế bào biểu mô phổi, tế bào sụn, tế bào dịch khớp, tế bào
sừng, tế bào nội mô, nguyên bào xương, một số dòng tế bào ung thư và một
số tế bào khác . Đã có nhiều nghiên cứu về IL-11 và không chỉ áp dụng sản


10

phẩm này vào trong điều trị bệnh mà còn áp dụng vào trong nghiên cứu cơ
bản để sáng tỏ các cơ chế hay những con đường tác dụng của interleukin

trong cơ thể. Những hướng nghiên cứu ấy được tiến hành trên cả in vitro và
in vivo. Trong in vitro, các nghiên cứu đã chứng minh được rằng, sinh phẩm
IL-11 có thể tác động lên nhiều dạng tế bào khác nhau, bao gồm như các tế
bào tạo máu, tế bào gan, tế bào mỡ, đại thực bào, tế bào biểu mô ruột, tế bào
khối u, tế bào tạo xương và tế bào hủy xương. Trong nghiên cứu dược phẩm
in vivo, dạng cytokin tạo máu này đã được tiến hành tìm hiểu trên nhiều mô
hình hóa trị liệu hay mô hình ghép tủy xương nhằm xác định khả năng ứng
dụng như là một yếu tố kích thích tạo tiểu cầu. Các kết quả thu được khi thử
nghiệm trên chuột và khỉ đều cho kết quả khả quan về khả năng kích thích
tạo tiểu cầu của IL-11. Chính vì vậy, năm 1997, hãng Neumega đã được cơ
quan Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Mỹ (FDA) cấp phép cho việc áp
dụng IL-11 tái tổ hợp để kiểm soát bệnh thiếu hụt tiểu cầu và giảm bớt nhu
cầu về tiểu cầu trong quá trình truyền máu sau khi hóa trị liệu ức chế tủy
đối với những bệnh nhân bị u tủy ác tính - những người có nguy cơ cao về
sự thiếu hụt tiểu cầu . Hơn nữa, những nghiên cứu gần đây nhất còn xác
nhận, IL-11 cũng có hiệu quả khi điều trị riêng rẽ hay hiệp đồng với G-CSF
trên bệnh nhân bị bệnh máu trắng và các bệnh ung thư liên quan đến các tế
bào máu .
1.3.2. Interleukin-3 (IL-3)
Trong số các interleukin, IL-3 được xem là loại cytokin có phổ tác
dụng rộng nhất trong hệ thống tạo máu do nó có nhiều chức năng đối với cơ
thể. Chính vì sự đa dạng về chức năng đó, hoạt tính của IL-3 được nghiên
cứu trên nhiều dòng tế bào khác nhau. Các tính chất hay hoạt tính của IL-3
được gắn liền với nhiều tên như yếu tố kích thích tế bào bền vững, yếu tố


11

kích thích tế bào tạo histamin, yếu tố kích thích các dòng bạch cầu , yếu tố
sinh trưởng tạo máu đa dòng, yếu tố kích ứng Thy-1, hoạt tính kích thích

CFU, yếu tố phát triển dòng tế bào mast, bạch cầu ái toan, mẫu tiểu cầu và
hồng cầu… . Chức năng sinh học của IL-3 không chỉ là sự kích thích các
dòng tế bào nguồn mà còn có ý nghĩa mật thiết với các tế bào nguồn trong
quá trình biệt hóa. Nhiều hoạt tính của IL-3 còn được tăng cường hay phụ
thuộc dựa vào sự đồng kích thích của các cytokin khác. Sự kích thích của
IL-3 mang tính phổ rộng với hàng loạt tế bào trong hệ tạo máu và với các
cytokin khác. Hơn nữa, IL-3 còn có khả năng kích thích đặc hiệu sự phát
triển của tế bào gốc sớm, tế bào nguồn của tế bào mast và nguyên mẫu tiểu
cầu hay tế bào nhân khổng lồ.
Ở người, gen mã hóa cho IL-3 được định vị trên nhiễm sắc thể số 5,
tại vị trí 5q31.1 . Sau quá trình phiên mã, tiền thân của IL-3 (152 amino
acid) được hình thành từ 5 đoạn exon với kích thước amino acid tương ứng
là 54, 14, 30 và 40. Tiếp theo là quá trình biến đổi sau dịch mã để loại bỏ
đoạn peptide tín hiệu (19 amino acid), IL-3 có hoạt tính bao gồm 133 amino
acid với khối lượng phân tử khoảng 15,1 kDa. Về cấu trúc, protein này cũng
bao gồm 4 chuỗi xoắn α A, B, C, D, có một cầu nối lưu huỳnh giữa amino
acid Cys16 và Cys84 (Hình 5). Các vị trí amino acid như Ser17, Asn18,
Asp21, Thr25 trên chuỗi xoắn A và Arg108, Phe113, Lys116, Glu119 trên
chuỗi D đóng vai trò không thể thiếu trong quá trình gắn kết giữa IL-3 với
thụ thể của nó trên bề mặt tế bào đích. Đặc biệt, nếu thay thế vị trí Glu22,
hoạt tính của IL-3 có thể bị mất hoàn toàn . Ngoài ra, dạng IL-3 tự nhiên
cũng có sự khác biệt so với IL-3 tổng hợp bởi sự đa dạng về thành phần
chuỗi carbonhydrat gắn kết vào trong quá trình hình thành cấu trúc glycosyl
hóa. Do đó, kích thước tự nhiên của IL-3 tiết ra bởi tế bào T hoạt hóa có thể
thay đổi từ 22, 28 hay 36 kDa .


12

Hình 1.6 : Mô phỏng cấu trúc không gian của IL-3

Trong cơ thể, nguồn sản xuất IL-3 chính là tế bào lympho T đã hoạt
hóa . Tế bào mast và bạch cầu ái toan cũng có thể tiết ra IL-3 khi được kích
thích và hoạt hóa . Sản phẩm IL-3 tạo ra theo con đường tế bào mast có ý
nghĩa quan trọng với quá trình biệt hóa các phân dòng tế bào tua . Sự hoạt
hóa tế bào mast và việc tiết ra IL-3 cũng giúp tăng nhanh hoạt động sản xuất
histamin.
Hiện nay, IL-3 vẫn còn đang được tiếp tục nghiên cứu lâm sàng để
đánh giá tác dụng của IL-3. Với khả năng kích hoạt các thành viên ban đầu
của các con đường biệt hóa tạo máu, IL-3 có thể ứng dụng trong nhiều mục
đích điều trị lâm sàng khác nhau. Các kết quả thu được khi sử dụng IL-3 cho
điều trị lâm sàng cho thấy IL-3 thúc đẩy sự phục hồi của tủy xương sau khi
ghép tủy xương hoặc phục hồi suy tủy thứ phát do hóa chất độc, kích thích sự
gia tăng của tiểu cầu . Các thử nghiệm lâm sàng trên động vật và người cho


13

thấy IL-3 kết hợp với G-CSF hoặc GM-CSF có thể kích thích mạnh mẽ khả
năng tạo tế bào tủy xương, ứng dụng trong điều trị bệnh thiếu máu bất sản
hoặc là các bệnh thiếu máu khác. Bên cạnh đó, cũng có nhiều nghiên cứu đã
và đang được tiến hành nhằm áp dụng IL-3 để điều trị các bệnh khác như để
kiềm chế một số bệnh nhiễm trùng, sử dụng để nâng cao hiệu quả tác động
cho tế bào trình diện kháng nguyên trong điều trị ung thư, kiểm soát các bệnh
hen phế quản và dị ứng.
1.3.3. GM-CSF (Granulocyte macrophage colony-stimulating factor)
GM-CSF được sản xuất chính từ các tế bào lympho, bạch cầu đơn
nhân, xơ non, nội mạc . Là một yếu tố kích thích tăng trưởng hệ tạo máu, nó
kích thích tế bào gốc tạo máu tạo ra một lượng lớn các tế bào tại tủy như bạch
cầu đơn nhân, bạch cầu đa nhân trung tính, bạch cầu ái toan, hồng cầu, tiểu
cầu, tế bào đuôi gai…. Do đó còn dùng điều trị các bệnh máu .

1.4. Tách tế bào gốc tạo máu và nuôi cấy in vitro
Để có thể nghiên cứu được về tế bào gốc tạo máu hoặc ứng dụng điều
trị, người ta có thể sử dụng các phương pháp tách khác nhau từ các nguồn
khác nhau như tủy xương, máu ngoại vi, máu cuống rốn,…. Trong đó có các
phương pháp miễn dịch như dùng kháng thể và hạt từ để có thể tách được các
tế bào có dấu ấn CD34+ riêng rẽ hoặc dùng máy đếm tế bào dòng chảy có bộ
phận tách riêng tế bào đặc hiệu này . Ngoài ra, các phương pháp tách tế bào
đơn nhân bằng phương pháp ly tâm tỷ trọng, trong đó có tế bào gốc CD34+
được sử dụng phổ biến trong nghiên cứu cũng như trong điều trị truyền tế bào
gốc tự thân hay đồng loài .
Khi đã có tế bào gốc, việc lựa chọn phương pháp nghiên cứu cũng phải
được cân nhắc. Thông thường, phương pháp nghiên cứu biệt hóa của tế bào


14

gốc được thực hiện theo phương pháp nuôi cấy trong môi trường bán lỏng và
cho thấy cụm tế bào đặc trưng . Nuôi cấy tế bào gốc đã được thực hiện từ lâu,
với các nghiên cứu về các thành phần môi trường nuôi cấy có bổ sung các
cytokin . Hiện tại môi trường nuôi cấy tế bào gốc có trên thị trường, cho phép
nuôi cấy tế bào gốc một cách dễ dàng hơn.
Hiện nay, các kỹ thuật hiện đại như đếm tế bào dòng chảy, sử dụng
kháng thể đơn dòng gắn chất huỳnh quang (FITC, PE) để xác định dấu ấn
kháng nguyên trên bề mặt tế bào xác định dấu ấn miễn dịch đặc trưng cho tế
bào gốc tạo máu CD34+ đã được sử dụng phổ biến hơn . Ngoài ra, người ta
còn sử dụng các phương pháp đổ lam và nhuộm Giêmsa để đánh giá hình thái,
tuổi tế bào…
1.5. Đặc điểm chung của bệnh suy tủy xương
Bình thường tủy xương có nhiệm vụ sinh sản các tế bào máu. Quá trình
sinh tế bào máu là quá trình tăng sinh (sinh sản tế bào) kèm biệt hóa và trưởng

thành để từ một tế bào gốc ban đầu hình thành nên nhiều tế bào trưởng thành
có hoạt động chức năng đi vào máu đó là hồng cầu, bạch cầu và tiểu cầu. Quá
trình này được mô tả ở trên. Quá trình sinh máu được điều hòa bởi các chất
kích thích tạo máu. Tổ chức tủy là môi trường gồm các khoang sinh máu để
các tế bào tạo máu sinh sản và biệt hóa trưởng thành. Khi tủy xương không
đảm bảo được quá trình trên thì gọi là suy tủy.
Suy tủy xương là tình trạng tủy xương không sinh sản đủ tế bào máu để
cung cấp cho nhu cầu bình thường của cơ thể dẫn đến hiện tượng giảm các tế
bào (hồng cầu bạch cầu hạt, tế bào mônô, tiểu cầu) ở máu ngoại vi. Sự giảm
sinh tế bào này không kèm theo rối loạn chất lượng tế bào. Trong thực tế có
nhiều trường hợp chỉ giảm một hoặc hai dòng tế bào. Trường hợp tủy giảm
hẳn (bất sản) cả 3 dòng tế bào gọi là suy tủy xương toàn bộ.


15

Nếu phân tích máu ngoại vi của người suy tủy thì thấy các dòng tế bào
hồng cầu, bạch cầu và tiểu cầu đều suy giảm. Đặc điểm dòng hồng cầu có
giảm số lượng, huyết sắc tố giảm, thường dưới 80g/1, thiếu máu bình sắc,
kích thước hồng cầu có thể to. Hồng cầu lưới ở máu giảm hầu hết dưới 50 x
109/l.Số lượng bạch cầu giảm, giảm số lượng tuyệt đối bạch cầu đoạn trung
tính, nhiều trường hợp bạch cầu đoạn trung tính còn dưới 0,2 x 10 9/l. Công
thức bạch cầu bất thường biểu hiện là tỷ lệ giữa bạch cầu đoạn trung tính/ tế
bào lympho thay đổi. Bình thường tỷ lệ này khoảng 1,5-3,0. Trong suy tủy
xương tỷ lệ này nhỏ hơn 1. Không có hình ảnh các tế bào bất thường. Số
lượng tiểu cầu giảm, có thể gặp một số tiểu cầu có kích thước to hơn bình
thường. Theo thống kê tại Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương thì 75%
bệnh nhân suy tủy xương có số lượng tiểu cầu dưới 80 x 109/l.
Khi xét nghiệm tế bào tủy xương thấy tủy nghèo tế bào, số lượng tế bào
tủy dưới 30 x 109/l. Tỷ lệ bạch cầu đoạn giảm nặng và không có tế bào ác

tính. Xét nghiệm sinh thiết tủy xương thấy các khoang sinh máu hoang vu,
không thấy hoặc thấy rất ít các tế bào dòng hạt, nguyên hồng cầu và mẫu tiểu
cầu, gặp tỷ lệ cao tế bào lympho, các khoang sinh máu thường bị mỡ hóa.
Về chẩn đoán xác định thường dựa vào lâm sàng và xét nghiệm. Xét
nghiệm máu có giảm cả 3 dòng tế bào, trong công thức bạch cầu có tăng tỷ lệ
lymphocyt, giảm tỷ lệ và số lượng tuyệt đối bạch cầu đoạn. Xét nghiệm tủy
đồ thấy hiện tượng giảm sinh, tủy nghèo tế bào, tăng tỷ lệ lympho/bạch cầu
đoạn trung tính (công thức đảo ngược). Xét nghiệm sinh thiết tủy là xét
nghiệm quyết định chẩn đoán với hình ảnh các khoang sinh máu hoang vu,
mỡ hóa, chỉ gặp các tế bào lympho.


16

CHƯƠNG 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
- Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 11/2015 đến tháng 8/2016.
- Khoa huyết học Bệnh viện Nhi Trung ương, Viện Huyết học Truyền
máu Trung ương, nơi cung cấp mẫu và dữ liệu liên quan.
- Phòng Kỹ thuật di truyền, Viện công nghệ sinh học, nơi cung cấp mẫu
IL-11 tái tổ hợp.
- Bộ môn Sinh lý bệnh-Miễn dịch, Trường đại học Y Hà Nội, nơi thực
hiện các kỹ thuật chiết tách, nuôi cấy tế bào gốc.
2.2. Đối tượng và mẫu nghiên cứu
- 10 bệnh nhân đến khám và điều trị tại Bệnh Viện Nhi Trung ương,
trong đó có 5 bệnh nhân có tủy xương bình thường và 5 bệnh nhân
được chẩn đoán là suy tủy. Mẫu được thu thập tại Khoa huyết học Bệnh
viện Nhi Trung ương
- 01 mẫu tế bào gốc được làm giàu từ máu ngoại vi ở người cho máu (có

kích thích tủy xương), Viện Huyết học Truyền máu Trung ương.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Tách tế bào gốc từ các nguồn mẫu
Để đánh giá tác dụng sinh học của IL-11, chúng ta cần có mô hình tách,
nuôi cấy và thử thích hợp. Chúng tôi chỉ áp dụng các phương pháp tách bạch
cầu đơn nhân/bạch cầu để sơ bộ đánh giá khả năng tăng sinh của IL-11. Các
phương pháp tách bao gồm:


17

2.3.1.1. Tách tế bào gốc từ tủy xương theo phương pháp ly tâm tỷ trọng
- Quy trình thực hiện với Ficoll 1.077, được tóm lược như sau :
- 1ml dịch tủy xương có chống đông EDTA đã được pha loãng gấp đôi
với môi trường RPMI.
- Cho 1 ml Ficoll vào tube nhựa 15ml sau đó cho từ từ dịch tủy xương
đã pha loãng vào trên lớp Ficoll (không được trộn lẫn Ficoll và dịch
tủy xương).
- Ly tâm 2500rpm x 20 phút ở nhiệt độ 40C bằng ly tâm.
- Hút phần bạch cầu đơn nhân (vòng trắng đục) sau khi ly tâm và cho
sang một tube mới.
- Rửa 2 lần tế bào thu được bằng dung dịch PBS 1x (1000rpm/5 phút).
- Hòa tan cặn tế bào trong 1ml môi trường nuôi cấy tế bào gốc tủy xương
StemPro34 với đầy đủ các thành phần cần thiết, trong đó có 100ng/ml
SCF, 50ng/ml IL-3 và 25ng/ml GM-CSF.
- Đếm tổng số tế bào bạch cầu thu được và tế bào CD34+.
Hình 2.1:
Hình ảnh
tách bạch
cầu đơn

nhân qua
Ficoll

Sau khi ly
tâm

các

thành phần của dịch tủy xương được tách ra thành các lớp từ trên xuống: 1)Huyết


18

tương (trong đó chứa tiểu cầu). 2) Bạch cầu đơn nhân. 3) Ficoll. 4) Bạch cầu hạt.
5) Hồng cầu.

2.3.1.2. Tách tế bào gốc từ máu ngoại vi có kích thích tăng sinh tủy
Bệnh nhân/người cho tế bào gốc được tiêm chất kích thích sinh tủy một
ngày trước khi gạn tách tế bào. Tế bào gốc được thu hoạch từ dòng máu ngoại
vi bằng cách cho dòng máu chảy qua máy gạn tách tế bào. Qui trình này thực
hiện trong đơn vị gạn tách. Máu tĩnh mạch đi vào trong máy, sau đó máu được
ly tâm và tách thành phần chứa tế bào gốc ra khỏi máu toàn phần, phần còn
lại được máy đưa ra và truyền trả lại bệnh nhân theo đường ven khác qua
catheter gạn tách. Cuối buổi gạn tách, phòng xét nghiệm tế bào gốc sẽ đếm số
lượng tế bào gốc. Sau lấy túi tế bào gốc từ máy tách tế bào, nhân viên sẽ tiến
hành ly tâm túi tế bào, tách lấy phần huyết tương để truyền lại cho người cho.
Khối tế bào gốc được mang đi xử lý, thêm chất bảo quản, chống đông, dung
dịch treo tế bào gốc rồi tiến hành bảo quản đông lạnh. Sau khi đếm tế bào, lấy
0.5ml dung dịch tế bào thu được và chuyển về lab để tiến hành nuôi cấy theo
quy trình.

2.3.2. Nuôi cấy tế bào gốc
Tế bào bạch cầu thu được (thường ở nồng độ cao) được pha loãng
thành 300000 bạch cầu/ml môi trường nuôi cấy StemPro34 hoàn chỉnh. Hút
200µl hỗn dịch tế bào cho vào mỗi giếng của bản nhựa nuôi cấy 96 giếng và
đặt trong tủ ấm 370C có 5% CO2. Hàng ngày kiểm tra sự phát triển của tế
bào, theo dõi đến khi thu hoạch đánh giá sự phát triển số lượng tế bào và tế
bào CD34+. Số tế bào tách được còn lại được lưu trong nitơ lỏng với môi
trường nuôi cấy có 10% DMSO và điều kiện làm lạnh từ từ.


19

2.3.3. Hình thái tế bào
Là phương pháp làm tiêu bản, cố định, nhuộm Giêmsa và quan sát hình
thái tế bào bởi kính hiển vi vật kính dầu 10x. Phương pháp này có thể phân
biệt được các tế bào non và tế bào trưởng thành, từ đó giúp đánh giá khả năng
tồn tại và phát triển của tế bào gốc. Kỹ thuật này thực hiện như sau:
− Các tế bào nuôi cấy thu hoạch xong được đổ lam bằng máy Cytotex;
− Để khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng 30 phút;
− Cố định bằng cồn tuyệt đối và để khô;
− Nhỏ 1ml Giêmsa 10%, phủ kín vị trí tế bào trên lam kính x 10 phút;
− Rửa Giêmsa bằng nước máy;
− Để khô ở nhiệt độ phòng;
− Đọc ở vật kính 40x và vật kính dầu 100x;
2.3.4. Đếm tế bào CD34+ bằng phương pháp đếm tế bào dòng chảy
Dựa trên kỹ thuật đếm tế bào dòng chảy. Sử dụng kháng thể đơn dòng
gắn chất huỳnh quang (FITC, PE) để xác định dấu ấn kháng nguyên trên bề
mặt tế bào xác định dấu ấn miễn dịch đặc trưng cho tế bào gốc tạo máu CD34.
Các bước tiến hành được thực hiện như sau:
- Đánh dấu ống (viết tên hoặc số);

- Dùng pipet cho 50µl mẫu vào ống Trucount. Lưu ý dùng phương pháp
hút pipet đảo ngược (reverse pipet);
- Thêm 20µl dung dịch CD45FITC/CD34PE, thêm 10µl dung dịch 7AAD;
- Đậy ống và lắc đều bằng vortex;
- Ủ trong tối 15 phút / nhiệt độ phòng (220C);
- Thêm 1ml dung dịch ammonium chlorid lysing;


20

- Đậy nắp ống và lắc đều bằng vortex;
- Ủ trong tối 15 phút / nhiệt độ phòng (220C);
- Tiến hành phân tích mẫu bằng phần mềm FACS Canto;
2.3.5. Quy trình thử hoạt tính của IL-11
Các tế bào được rã đông bằng cách lấy tube tế bào từ nitơ lỏng cho ngay
vào 370C cho đến khi tan hoàn toàn, cho thêm môi trường RPMI và ly tâm bỏ
dịch nổi, sau đó hoà tan cặn và đếm tế bào, sau đó pha loãng theo quy trình
nuôi cấy với số lượng tế bào 300000 tế bào sống/ml, sau đó nuôi cấy 72 giờ
mới cho thuốc gồm các giếng chứng âm, chứng dương và thử nghiệm. Tiếp
tục nuôi cấy 72 giờ kể từ khi cho IL-11, tiến hành thu hoạch tế bào để đổ lam
và đếm CD34+. Nồng độ Il-11 là 1ng, 10ng và 50ng/ml, dựa theo nồng độ thử
trên tế bào dòng.
Sơ đồ 1. Sơ đồ thử nghiệm tác dụng sinh học của IL-11


21

2.3.6. Xử lý số liệu
Các số liệu được xử lý bằng phần mềm GRAPH PRISM 7.02
2.4. Vật liệu, dụng cụ nghiên cứu

2.4.1. Vật liệu nghiên cứu
- Tủy xương bình thường và tủy xương bệnh nhân suy tủy
- IL-11 chuẩn do hãng Biovision cung cấp (tên thương phẩm)
- IL-11 tái tổ hợp do viện công nghệ sinh học cung cấp
- Nitơ lỏng
- PBS1x
- Môi trường StemPro
- IL-3
- SCF
- GM-CSF
- Thuốc nhộm Giêm sa, eosin
- Penicillin-Streptomycin
- Nước cất vô trùng
- Cồn sát trùng 700 có 5% Iốt
- Dung dịch nhuộm màu Bromthymol blue 0,25%
- L-Glutamin 5%
2.4.2. Dụng cụ nghiên cứu
- Bơm tiêm nhựa các loại: 1ml, 3ml, 5ml
- Pipette man các loại từ 10-1000µl
- Đầu côn các loại
- Pipet điện tử dùng cho pipet nhựa các loại 5m, 10ml, 20ml


22

- Lọ nuôi cấy
- Đĩa (plate) nuôi cấy 12, 24, 96 giếng
- Cốc thủy tinh chia vạch các loại
- Bình đong 50, 100, 500 và 1000ml
- Ống thuỷ tinh vô trùng

- Bông thấm nước
- Lam kính
- Bút viết kính
- Lọc hóa chất loại 0.2µm
- Vật tư bảo hộ bao gồm: quần áo, mũ, khẩu trang, găng tay y tế.
- Giấy bạc
- Giấy paraffin
- Giấy thấm/lau loại không tan
2.4.3. Trang thiết bị phục vụ nghiên cứu
- Máy ly tâm lạnh
- Hood Laminar vô trùng
- Kính hiển vi ánh sáng ngược có chụp hình
- Máy trộn vortex.
- Tủ hút khử độc
- Cân điện tử
- Cân phân tích
- Máy đo pH
- Tủ ấm CO2
- Tủ ấm 370C
- Tủ sấy khô
- Máy hấp ướt vô trùng
- Tủ lạnh thường


23

- Tủ âm sâu -800C
- Máy đếm tế bào dòng chảy
2.5. Đạo đức nghiên cứu
Chúng tôi sử dụng mẫu tủy xương của những bệnh nhân đã được làm

xét nghiệm và chẩn đoán, được sự cho phép của khoa Huyết học Bệnh viện
Nhi Trung Ương.
Đảm bảo giữ bí mật về các thông tin liên quan đến sức khỏe cũng như
các thông tin cá nhân khác của đối tượng nghiên cứu. Mẫu tủy xương chỉ sử
dụng cho mục đích nghiên cứu phục vụ sức khỏe bệnh nhân.


24

CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Hình thái tế bào
3.1.1. Hình thái tế bào trước và sau khi nuôi cấy chưa thử thuốc
Các tế bào trước nuôi cấy (A) chủ yếu là bạch cầu đơn nhân, có lẫn
bạch cầu trung tính, hồng cầu. Sau nuôi cấy 72h (B) có thấy tế bào non (mũi
tên màu đỏ). Có tế bào trung gian.

A

B

Nhận xét:
Hình 3.1: (A) Trước nuôi cấy 72h; (B) Sau nuôi cấy
Nhận xét: Các tế bào trước nuôi cấy có mật độ thấp hơn, có tuổi trung gian,
nhưng ít hơn so với sau nuôi cấy 72h.


25

3.1.2. Hình thái tế bào ở các nhóm thử thuốc 72 giờ (IL-11: 50ng/ml)

A

(A). Có tế bào trung gian, kiềm tính, nhân lớn (mũi tên màu đỏ)

B

(B) : Chứng dương IL-11. Tế bào non (kích thước lớn, kiềm tính (mũi tên màu
trắng). Tế bào trung gian, kiềm tính, nhân lớn (mũi tên màu đỏ). Tế bào hồng
cầu non (mũi tên màu xanh)