Marker chọn lọc sử dụng trong công nghệ tạo
cây GM và các chiến lược cải tiến
GVHD:


Khái quát nội dung
1. Đặt vấn đề
2. Hệ thống chỉ thị trong công nghệ sinh học
3. Các nguy cơ gặp phải khi sử dụng các hệ thống marker
4. Các chiến lược cải tiến các hệ thống marker
5. Kết luận
6. Tài liệu tham khảo
1. Đặt vấn đề
- Hiện nay cây trồng biến đổi được phát triển và sử dụng rộng rãi trên thế giới. Để
tạo được cây chuyển gen thì ta phải thực hiện chuyển một đoạn gen mà mình mong
muốn vào thực vật.
- Vậy làm thế nào để biết được gen cần chuyển đã được chuyển vào thực vật hay
chưa?
- Để giải quyết vấn đề này ta cần sử dụng một hệ thống chỉ thị sinh học gọi là
marker.
- Vậy marker là gì, những nguy cơ mà ta có thể gặp phải khi sử dụng các hệ thống
marker và đề ra những phương pháp cải tiến các hệ thống marker.
2. Hệ thống chỉ thị trong công nghệ sinh học
* Khái niệm: Chỉ thị sinh học (marker) là đoạn gene mã hóa cho một đặc điểm
dễ dàng nhận diện được sử dụng để xác định xem đoạn gen mà mình cần chuyển
vào đã thành công hay chưa.
Marker chọn lọc (hay lựa chọn - selectable marker gene)
Các gen chọn lọc thường có tính trội, thường có nguồn gốc từ vi khuẩn nhưng
hoạt động của chúng được kiểm soát bởi các promoter kiểu Eukaryote.
- Các gen chọn lọc này sẽ bảo vệ cơ thể khỏi một nhân tố chọn lọc mà thông
thường sẽ giết hoặc ngăn chặn sự phát triển của nó.

- Thuốc kháng sinh là nhân tố chọn lọc phổ biến nhất, một số nhân tố chọn lọc:
+ Kanamycin

+ Manose

+ Hygromycin

+ Ampicilin

+ Basta

+ Tetracycline

PBR 322 có 2 gen kháng kháng sinh Ampiciline và Tetracycline
Plasmid này có một gốc tái bản và chỉ hoạt động trong E.coli

Khi nuôi cấy trong môi trường chọn lọc chứa ampicillin và tetracycline thì những mô hay tế bào có chứa plasmid sẽ sống còn các mô, tế bào ko chứa
plasmid sẽ chết


CÁC GEN CHỌN LỌC PHỔ BIẾN

Các gen kháng kháng sinh như kanamycin
(neomycin phosphotransferase-nptII);
hygromycin (hygromycin
phosphostransferase-hpt); streptomycin
(streptomycin phosphotransferaza),...


Các gen kháng chất diệt cỏ như glyphosate,
bialaphos : gen bar có nguồn gốc vi khuẩn
mã hoá cho enzyme làm bất hoạt BASTA là
phosphinothricin acetyltransferaza (PAT).

Các gen khác (gen pmi–phosphate manose
isomerase- chuyển hoá manose thành
glucose. Nhờ vậy, cây có thể sống trên môi
trường không có glucose (manose là nhân tố
chọn lọc).

Một số gen chỉ thị được liệt kê trong thông báo kiểm tra thực địa Mỹ và được phép
phát hành trong những năm 2001 và 2002
Enzyme

Số lượng hồ sơ trong năm 2001 và 2002

Neomycin phosphotransferase II (NPTII)

949

Hygromycin B phosphotransferase (hpt)

65

Phosphinothricin N-acetyltransferase (PAT)

327

5-Enolpyruvylshikimate-3-phosphate

synthase

(EPSP)

507

Acetolactate synthase or acetohydroxyacid synthase

5

Nitrilase

0

Cyanamide hydratase

2

Glucuronidase (GUS)

91

Luciferase

4

Green fluorescent protein (GFP)

20



(Trích xuất dữ liệu từ ISB, 2003)

3. Các nguy cơ gặp phải khi sử dụng các hệ thống marker
- Gây mất đa dạng sinh học: làm tăng khả năng gây độc của cây trồng biến đổi gen
với các sinh vật không phải mục tiêu, ảnh hưởng xấu đến môi trường
- Tạo ra các loài cỏ kháng thuốc trừ cỏ; tăng tính kháng của các loài sâu
- Ảnh hưởng xấu tới sức khỏe con người và vật nuôi: gây độc; gây dị ứng; tăng
tính kháng kháng sinh của vi khuẩn đường ruột
* Đối với con người:
Marker mã hóa cho các chất kháng thuốc trừ cỏ, kháng kháng sinh và
nhiều chất khác,… các chất này khi vào cơ thể có thể gây độc, gây ra các bệnh
nguy hiểm hoặc gây ra dị ứng sốc phản vệ.
L-tryptophan: Thực phẩm biến đổi gen bổ sung chất này đã gây ra 37 trường hợp
tử vong và ít nhất 1500 trường hợp tàn tật tại Mỹ do một chất độc không xác định
được. Công ty sản xuất đã bồi thường 2 tỷ USD cho trên 2000 nạn nhân.
Điều này đã được dự đoán trước là sẽ gây hại cho con người và khuyến cáo chỉ
dùng cho chăn nuôi.
=> Vậy con người ăn động vật sử dụng sản phẩm này có bị dị ứng?
Thực phẩm bình thường cũng có thể gây dị ứng và việc dị ứng là tùy thuộc vào
cơ địa từng người. Vì vậy rất khó để xác định là có bị dị ứng khi ăn động vật sử
dụng sản phẩm GMO.
Tuy nhiên gần đây, trong một nghiên cứu độc lập của các nhà khoa học Nga đã
thí nghiệm trên chuột khi ăn đậu tương biến đổi gen đã mất khả năng sinh sản. Kết
luận này cũng phù hợp với kết quả của các đồng nghiệp ở Pháp và Áo.
- Tính kháng:


Một số nhà nghiên cứu cho rằng marker kháng kháng sinh trong thực phẩm
GMO có thể bất ngờ tái hợp với vi khuẩn gây bệnh hoặc trong ruột của động

vật
Có thể xảy ra quá trình chuyển gen ngang từ thực vật sang động vật gây biến
đổi hệ gen người.
Dẫn chứng cụ thể
Nghiên cứu của Đại học Newcastle về chuyển nạp gen: Kết quả cho thấy khi
ăn thực phẩm chứa đậu nành biến đổi gen có hiện tượng gen chuyển nạp
thoát ra và chuyển nạp vào vi khuẩn đường ruột.
Các nhà nghiên cứu Đức đã tìm thấy vi khuẩn kháng kháng sinh trong ruột
của ong ăn phấn hoa cây cải dầu chuyển gen.
=> Hậu quả : một số bệnh nhiễm trùng không thể chữa trị bằng thuốc kháng
sinh truyền thống. Ví dụ như vi khuẩn Clostridium difficile (C. difficile),
E.coli…
Các yếu tố cho thấy nguy cơ này rất thấp:
+ Gen kháng kháng sinh dùng trong thực vật chuyển gen được lấy từ các plasmid
của vi khuẩn đã có sẵn trong tự nhiên chứ không phải tự tổng hợp trong phòng thí
nghiệm. Chẳng hạn như gen NptII kháng kanamycin được phát hiện năm 1979 từ
một chủng vi khuẩn E. coli.
=> Xét 1 cách tổng thể, nguy cơ phân tán gen của các gen kháng kháng sinh từ
thực vật biến đổi gen sang các vi sinh vật khác là thấp.

* Đối với môi trường:
Các gen kháng thuốc trừ cỏ khi được chuyển vào cây trồng có thể chuyển sang các
loài họ hàng hoang dại của chúng, tạo ra các loài siêu cỏ dại.
Ví dụ: Cải dầu đã bị biến đổi gen


Khi trồng cây chuyển gen kháng sâu, các loài sâu có khả năng kháng gen này sẽ
sống sót và di truyền cho các thế hệ sau làm tăng khả năng kháng của sâu bệnh với
cây chuyển gen.
Các nhà khoa học chỉ ra rằng dịch hại thực vật phổ biến như sâu đục quả bông,

sống dưới áp lực liên tục từ cây trồng chuyển gen, sẽ sớm phát triển thành siêu sâu
và hoàn toàn miễn dịch với thuốc trừ sâu Bt.
* Đối với đa dạng sinh học:
Khả năng gây độc của cây trồng biến đổi gen với các sinh vật không phải mục
tiêu.
Năm 1999, các nhà nghiên cứu của Đại học Cornell đã phát hiện đáng ngạc nhiên
ra rằng phấn hoa từ ngô chuyển gen Bt gây độc hại cho loài bướm chúa.
Nghiên cứu khác cũng cho thấy cây trồng GMO đang ảnh hưởng xấu đến một số
côn trùng có ích, bao gồm cả bọ rùa, cũng như vi sinh vật đất có lợi, ong, và các
loài chim.
4. Các chiến lược cải tiến các hệ thống marker
- Sử dụng những hệ thống marker chọn lọc mới ít nguy cơ, để thay thế
những hệ thống marker cũ ẩn chứa nhiều nguy cơ
- Loại bỏ marker chọn lọc ra khỏi bộ gen của thực vật
- Chuyển gen vào lục lạp
* Hệ thống marker chọn lọc mới:
•

Phát triển hệ thống chỉ thị phân tử DNA

•

Hệ thống lựa chọn tích cực

•

Sử dụng các gen chỉ thị chọn lọc liên quan đến khả năng chống chịu

- Phát triển hệ thống chỉ thị phân tử DNA
Sử dụng các cặp mồi để nhân các đoạn gen đặc trưng liên kết chặt chẽ với gen

mình muốn đưa vào: SSR, MAS, RAP, PCR…


- Hệ thống lựa chọn tích cực
Một số marker lựa chọn tích cực cho phép việc xác định và lựa chọn các biến đổi
gen các tế bào mà không gây tổn thương hay gây chết cho tế bào.
Ví dụ: Gen GUS là một gen mã hóa β-glucuronidase (tức là, GUS protein) trong vi
khuẩn E.coli. Các gen GUS thường được sử dụng như một marker chọn lọc cho
GMO.
β-glucuronidase gây ra một sự thay đổi màu sắc, trong môi trường nuôi cấy có
chất X-gluc (không màu), enzyme này sẽ cắt X-gluc thành X (xanh) và gluc.
- Sử dụng các gen chỉ thị chọn lọc liên quan đến khả năng chống chịu
Được biết đến như là các gen mã hóa các protein khác nhau để bảo vệ cây trồng
tại thời điểm áp lực môi trường lớn như hạn hán, stress muối và stress oxi hóa.
Ví dụ: gen ESKIMO1 có khả năng giúp cây trồng chịu lạnh và muối. Sử dụng gen
này làm marker và môi trường chọn lọc là môi trường có hàm lượng muối cao.

*Loại bỏ gen chọn lọc:
•
•
•
•
•
•

Co-transformation (hệ thống đồng biến nạp ).
Transposon -based marker methods (hệ thống các yếu tố chuyển vị).
Multi-autotransformation (MAT).
Site-specific recombination (Tái tổ hợp tương đồng).
Chemical-inducible system (Hệ thống hóa chất cảm ứng ).

Heat-inducible system (Hệ thống cảm ứng nhiệt).

- Co-transformation (hệ thống đồng biến nạp )
Sử dụng cơ chế phân ly di truyền để loại bỏ marker chọn lọc ra khỏi hệ gen thực
vật.
Khi vi khuẩn Agrobacterium xâm nhập vào cây, 2 T-DNA này sẽ được tích
hợp vào hệ gen của thực vật.


Vị trí chèn của T-DNA vào hệ gen là ngẫu nhiên nên có khả năng 2 T-DNA sẽ
chèn vào 2 vị trí không liên kết với nhau .
Qua quá trình giảm phân, 2 T-DNA này sẽ phân ly và tách ra tạo 2 dòng chỉ chứa
1 trong 2 T-DNA.

- Multi-autotransformation (MAT)
Hệ thống vector MAT được thiết kế gồm gen cần chuyển, gen gây ung thư
(ipt, iaaM / H, rol), hệ thống tái tổ hợp cụ thể (R / RS) và các phần cần thiết.
Khi vi khuẩn Agrobacterium xâm nhập vào cây, T-DNA này sẽ được tích hợp
vào hệ gen của thực vật.
Gen gây ung thư tái sinh cây chuyển gen và sau đó được loại bỏ bởi hệ thống
R/RS để tạo ra cây chuyển gen không có marker.


- Transposon -based marker methods (hệ thống các yếu tố chuyển vị)
Các transposon là các trình tự di động, nó có khả năng tách ra và di chuyển đến
các vị trí khác trong genome. Do đó, hệ thống này được sử dụng trong việc tách
gen marker ra khỏi vị trí liên kết với gen mục tiêu.
Các transposon được cảm ứng bởi chất cảm ứng, khi có mặt chất này thì
transposon sẽ tách ra và di chuyển đến vị trí khác trong genome.
Trong phương pháp này, gen marker sẽ được đặt trong các yếu tố di động

transposon, khi có mặt chất cảm ứng, các transposon sẽ tách ra và di chuyển đến vị
trí khác, làm cho gen marker và gen mục tiêu không còn liên kết với nhau. Qua di
truyền, 2 gen này sẽ biểu hiện ở thế hệ sau một cách riêng rẽ và có thể chọn được
các cả thể chỉ mang gen mục tiêu.


- Site-specific recombination (Tái tổ hợp tương đồng)
Hệ thống vector được thiết kế gồm gen cần chuyển, marker chọn lọc, hệ thống
tái tổ hợp cụ thể (R / RS) và các phần cần thiết.
Khi vi khuẩn Agrobacterium xâm nhập vào cây, T-DNA này sẽ được tích hợp
vào hệ gen của thực vật.
Khi được cảm ứng, gen R hoạt động tạo RE cắt ở 2 vị trí RS, 2 đầu của marker
có trình tự bổ sung nên sẽ gắn vào với nhau và tách ra khỏi bộ gen của thực vật.


- Heat-inducible system (Hệ thống cảm ứng nhiệt)


- Chemical-inducible system (Hệ thống hóa chất cảm ứng )
Ví dụ chuyển gen Cry1Ac vào cây cà bằng cách sử dụng hệ thống tái tổ hợp quy
định về mặt hóa học Cre / LOX. Khi cảm ứng bởi 2μM β-estradiol, gen
marker npt II đã bị loại bỏ.
* Chuyển gene vào lục lạp:
- Là một kĩ thuật mới cho phép biểu hiện gene ở lục lạp.


- Chuyển nạp gen HIV-1 p24 vào lạp thể cây cà chua cùng với gen chọn lọc aadA
kháng spectinomycin và streptomycin được thực hiện bằng cách bắn gien vào lá
thật và lá mầm.
- Kĩ thuật này có nhiều ưu điểm như số lượng bản copy của gene lớn, biểu hiện

gene chuyển ở mức cao, dễ dàng kiểm soát biểu hiện gene theo cấu trúc operon,
nâng cao tính an toàn sinh học…
- Hạt phấn ở đa số thực vật có hoa không chứa DNA lục nạp và lục nạp chỉ di
truyền theo dòng mẹ vì vậy nó giải quyết được vấn đề phát tán gen chuyển thông
qua hạt phấn.
5. Kết luận
- Marker chọn lọc là một thành phần không thể thiếu của vecter trong công nghệ
tạo cây GMO.
- Tuy nhiên hệ thống marker có rất nhiều nguy cơ gây hại tới sức khỏe con người,
sinh vật, môi trường… nhất là hệ thống marker chỉ thị là các gen kháng kháng
sinh.
- Không sử dụng các gen marker có tính kháng kháng sinh phổ biến.
- Sử dụng hệ thống chỉ thị phân tử DNA và chuyển gen lục lạp trong tạo cây trồng
chuyển gen mang lại hiệu quả cao.
6. Tài liệu tham khảo
1. Nguyễn Thị Phương Thảo, Nguyễn Thị Thùy Linh. Cây trồng công nghệ sinh
học.
2. Charles P. Scutt, Elena Zubko, Peter Meyer. Techniques for the removal of
marker genes from transgenic plants. 24 October 2002.
3. />%2F5824557%2FRisk_of_selectable_markers_and_recent_methods_to_reduce_th
ese_risk&h=wAQHy_Nus
4. />%2Fstaff%2FAggarwal%2Fpap_36.pdf&h=wAQHy_NUs


Một số câu hỏi và câu trả lời
- Có phải tất cả các cây đều có thể sử dụng marker chống chịu lạnh và chịu muối
không?
Trả lời: Tất cả các cây đều có thể sử dụng marker này để làm chỉ thị miễn là có
thể chuyển được gen này vào hệ gen của thực vật.
- Quan điểm của nhóm có lên sử dụng marker trong chuyển gen hay không?

Trả lời: Lên sử dụng marker chỉ thị trong chuyển gen vì nếu không sử dụng các
marker chỉ thị thì sẽ không thể xác định được gen mình cần chuyển đã được
chuyển vào thực vật hay chưa.
- Sản phẩm của cây chuyển gen dùng marer có lên sử dụng hay không?
Trả lời: Chúng ta không lên đặt ra câu hỏi là có lên sử dụng hay không lên sử
dụng cây chuyển gen có chứa marker, mà ta phải quản lý việc sử dụng các sản
phẩm đó như thế nào. Vì hiện nay sản phẩm biến đổi gen vẫn đang được con người
sử dụng làm thực phẩm hàng ngày như đậu tương chuyển gen, và cây đậu tương
này chắc chắn có sử dụng marker chỉ thị vì thế dù ta có muốn hay không muốn thì
ta vẫn cứ phải sử dụng nó.