ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
----------------------

PHẠM THẾ ANH
Tên đề tài:
TÁCH DÕNG VÀ GIẢI TRÌNH TỰ GENE MÃ HOÁ ENZYME
NATTOKINASE TỪ BACILLUS SUBTILIS

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo

: Đại học chính quy

Chuyên ngành

: Công nghệ sinh học

Khoa

: CNSH - CNTP

Khóa học

: 2011-2015

Thái Nguyên - 2015


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
----------------------

PHẠM THẾ ANH
Tên đề tài:
TÁCH DÕNG VÀ GIẢI TRÌNH TỰ GENE MÃ HOÁ ENZYME
NATTOKINASE TỪ BACILLUS SUBTILIS

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Hệ đào tạo

: Chính quy

Chuyên ngành

: Công nghệ sinh học

Lớp

: Công nghệ sinh học 43

Khoa

: CNSH - CNTP

Khóa học

: 2011 - 2015

Giảng viên hƣớng dẫn : 1. TS. Dƣơng Văn Cƣờng

2. Th.S Ma Thị Trang

Thái Nguyên - 2015


i
LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình học tập và nghiên cứu để hoàn thành đƣợc khóa luận tốt
nghiệp này tôi đã nhận đƣợc sự quan tâm, hƣớng dẫn, giúp đỡ rất tận tình của thầy
cô, bạn bè và gia đình. Nhân dịp hoàn thành luận văn:
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Dƣơng Văn Cƣờng – Trƣởng Bộ
môn Công nghệ sinh học Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm –
Trƣờng Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, Th.S Ma Thị Trang, Cán bộ tại Bộ môn
Sinh học Phân tử và Công nghệ Gene – Viện Khoa học Sự Sống – Đại học Thái
Nguyên ngƣời đã tận tình chỉ bảo, trực tiếp hƣớng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt thời
gian thực hiện để tài cũng nhƣ trong quá trình hoàn chỉnh luận văn tốt nghiệp.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Khoa học Sự sống – Đại học
Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm
– Trƣờng Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, các cán bộ, anh chị làm việc tại Bộ môn
Sinh học Phân tử và Công nghệ Gene – Viện Khoa học Sự Sống – Đại học Thái
Nguyên đã giúp đỡ, tạo mọi điều kiện để tôi học tập và nghiên cứu.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, bạn bè đã luôn
động viên, chia sẻ giúp đỡ tôi vƣợt qua mọi khó khăn trong quá trình học tập,
nghiên cứu và hoàn thành luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Thái Nguyên, ngày 18 tháng 6 năm 2015
Sinh viên

Phạm Thế Anh



ii

DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG KHOÁ LUẬN
Trang
Bảng 1: Đặc điểm của Nattokinase (Kim, Gum et al. 2008) ......................................4
Bảng 2: Cặp mồi sử dụng nhân gene aprE ...............................................................13
Bảng 3: Danh mục các thiết bị sử dụng trong đề tài .................................................16
Bảng 4: Thành phần phản ứng PCR ..........................................................................20
Bảng 5: Thành phần phản ứng gắn nối .....................................................................23
Bảng 6: Thành phần phản ứng cắt với HindIII và EcoRI .........................................26
Bảng 7: Thành phần phản ứng cắt với BamHI và SacI .............................................26


iii

DANH MỤC CÁC HÌNH TRONG KHOÁ LUẬN
Trang
Hình 1:

Sản phẩm natto sau khi lên men .................................................................3

Hình 2:

Sơ đồ hoá quy trình lên men dịch thể Nattokinase .....................................8

Hình 3:

Cấu trúc vector pTUAF ............................................................................15


Hình 4:

Quy trình tách dòng và xác định trình tự gene aprE từ vi khuẩn B. subtilis ...... 18

Hình 5:

Chu trình nhiệt của phản ứng PCR ...........................................................21

Hình 6:

Hình ảnh tách chiết DNA tổng số của B. subtilis .....................................28

Hình 7:

Sản phẩm PCR gene aprE từ B. subtilis ..................................................28

Hình 8:

Sản phẩm PCR trƣớc và sau khi tinh sạch................................................29

Hình 9:

Đĩa chứa khuẩn lạc mang plasmid nghi ngờ mang đoạn xen ...................30

Hình 10: Kết quả điện di plasmid của các dòng khuẩn lạc đã chọn ........................31
Hình 11: PCR kiểm tra các dòng khuẩn lạc nghi ngờ .............................................32
Hình 12: Sản phẩm cắt bằng enzyme giới hạn ........................................................33
Hình 13: Trình tự gene aprE ...................................................................................34
Hình 15: Sắc ký đồ một số điểm sai khác................................................................37
Hình 16: Dịch mã trình tự gene aprE ......................................................................38

Hình 17: So sánh trình tự peptide ............................................................................39


iv

DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT

Amp

Ampicillin

Bp

Base pair – cặp base nito

BLAST

Basic Local Aligenment Search Tool

DNA

Deoxyribonucleic axit

dNTP

Deoxynucleotide Triphotphate

E. coli

Escherichia coli


B. subtilis

Bacillus subtilis

Et al.

Cộng sự

IPTG

Isopropyl Thiogalactoside

Kb

Kilo base –kilo base nito

LB

Lauria Broth

SDS

Sodium Dodecyl Sulfate

PCR

Polymerase Chain Reaction - Phản ứng
chuỗi trùng hợp


TAE

Tris- acetate- EDTA

EDTA

Etilenduamin tetraacetic acid

TE

Tris- EDTA

X -gal

5-bromo-4-chloro-3indoly-β-D-galactoside


v

MỤC LỤC
PHẦN 1: MỞ ĐẦU ............................................................................................................... 1
1.1.Đặt vấn đề ........................................................................................................................ 1
1.2. Mục tiêu đề tài ................................................................................................................ 2
1.3. Yêu cầu của đề tài ........................................................................................................... 2
1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn đề tài.............................................................................. 2
1.4.1. Ý nghĩa khoa học ......................................................................................................... 2
1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn .......................................................................................................... 2
PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................................... 3
2.1. Nguồn gốc thực vật của Nattokinase .............................................................................. 3
2.2 Đặc điểm, cấu trúc của Nattokinase................................................................................. 4

2.2.1. Đặc điểm ...................................................................................................................... 4
2.2.2. Cấu trúc phân tử Nattokinase ....................................................................................... 4
2.3. Hoạt tính của Nattokinase .............................................................................................. 4
2.3.1. Hoạt tính ...................................................................................................................... 4
2.3.2. So sánh các tác nhân tiêu sợi ....................................................................................... 5
2.4. Tác dụng của Nattokinase ............................................................................................... 6
2.4.1. Khả năng làm tam cục máu đông................................................................................. 6
2.4.2. Đề phòng , hỗ trợ các bệnh liên quan đến tim mạch.................................................... 7
2.4.3. Giảm huyết áp, giúp lƣu thông máu ............................................................................ 7
2.4.4. Các lợi ích khác ........................................................................................................... 8
2.5. Các phƣơng pháp sản xuất Nattokinase .......................................................................... 8
2.5.1. Phƣơng pháp lên men dịch thể ..................................................................................... 8
2.5.2. Phƣơng pháp sản xuất từ vi sinh vật ............................................................................ 9
2.6. Tình hình nghiên cứu sản xuất Nattokinase trong và ngoài nƣớc ................................ 10
2.6.1. Trên thế giới ............................................................................................................... 10
2.6.2. Tình hình trong nƣớc ................................................................................................. 11
PHẦN 3: VẬT LIỆU, NỘI DUNG, PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................. 12
3.1. Vật liệu nghiên cứu ....................................................................................................... 12
3.1.1. Vi khuẩn B. subtilis .................................................................................................... 12


vi
3.1.2. Hóa chất ..................................................................................................................... 12
3.1.3. Vật liệu ....................................................................................................................... 13
3.1.4. Thiết bị sử dụng ......................................................................................................... 16
3.2. Địa điểm và thời gian thực tập ...................................................................................... 17
3.3. Nội dung nghiên cứu ..................................................................................................... 17
3.4. Phƣơng pháp nghiên cứu .............................................................................................. 18
3.4.1. Quy trình tách dòng, xác định trình tự gene aprE từ vi khuẩn B. subtilis ................. 18
3.4.2. Phƣơng pháp nuôi phục hồi vi khuẩn từ chủng gốc .................................................. 19

3.4.3. Phƣơng pháp thu cặn tế bào vi khuẩn ........................................................................ 19
3.4.4. Phƣơng pháp tách chiết DNA tổng số ....................................................................... 19
3.4.5. Phƣơng pháp PCR...................................................................................................... 20
3.4.6. Điện di sản phẩm trên gel agarose ............................................................................. 21
3.4.7. Tinh sạch sản phẩm PCR bằng thu nhận lại DNA từ gel........................................... 22
3.4.8. Phƣơng pháp gắn nối gene đã khuếch đại vào vetor tách dòng pTUAF .................. 23
3.4.9. Phƣơng pháp biến nạp DNA plasmid tái tổ hợp vào tế bào E.coli DH5α ................. 24
3.4.10. Phƣơng pháp tách chiết DNA plasmid bằng bộ Kit thƣơng mại ............................. 24
3.4.11. Phƣơng pháp cắt kiểm tra các dòng plasmid với enzyme cắt giới hạn ............. 26
3.4.12. Phƣơng pháp xác định trình tự nucleotide của Sanger và các cộng sự .................... 26
3.4.13. Phƣơng pháp so sánh trình tự gene aprE đã tách dòng với các trình tự đã công bố
trên ngân hàng gene thế giới – Ngân hàng Gen bank .......................................................... 27
PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................................. 28
4.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số từ vi khuẩn B. subtilis ............................................... 28
4.2. Kết quả nhân gene aprE từ vi khuẩn B. subtilis bằng phƣơng pháp PCR. ............................. 28
4.3. Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR bằng thu nhận lại DNA từ gel agarose ..................... 29
4.4. Kết quả biến nạp sản phẩm gắn nối .............................................................................. 30
4.5. Kết quả chọn lọc dòng .................................................................................................. 31
4.5.1. Kết quả sàng lọc dòng bằng điện di so sánh kích thƣớc plasmid .............................. 31
4.5.2. Kết quả chọn lọc dòng bằng PCR .............................................................................. 32
4.5.3. Kết quả chọn lọc dòng plasmid bằng lập bản đồ giới hạn ......................................... 32
4.6. Kết quả giải trình tự gene ............................................................................................. 34
4.6.1 Kết quả phân tích các thành phần của gene aprE sau khi giải trình tự ....................... 34
4.6.2. Kết quả dịch mã của gene aprE ................................................................................. 38


vii
PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................................. 40
5.1. Kết luận ......................................................................................................................... 40
5.2. Kiến nghị....................................................................................................................... 40

TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................... 41
Tài liệu trong nƣớc. .............................................................................................................. 41
Tài liệu nƣớc ngoài. ............................................................................................................. 41


1

PHẦN 1
MỞ ĐẦU
1.1.Đặt vấn đề
Hiện nay, trên thế giới mỗi năm, có hàng triệu bệnh nhân tử vong do các
bệnh liên quan đến tim mạch và huyết áp. Theo thống kê của Tổ chức Y tế thế giới
(WHO), hàng năm trên thế giới có khoảng 17 triệu ngƣời tử vong do bệnh lý tim
mạch .Tại Việt Nam, theo PGS.TS Phạm Nguyễn Vinh (Phó chủ tịch Hội Tim mạch
TP.HCM), hiện nƣớc ta có khoảng 10 triệu ngƣời mắc bệnh tăng huyết áp. Nguyên
nhân chủ yếu đó là sự tắc nghẽn mạch máu mà tác nhân chính là việc hình thành các
cục máu đông hay còn gọi là sự tăng sợi huyết. Điều này đặt ra thách thức lớn cho
không chỉ ngành Y tế mà còn là một áp lực không nhỏ đối với những ngành khoa
học khác, trong đó có công nghệ sinh học.
Nattokinase là một loại enzyme có khả năng phân hủy huyết khối một cách
hiệu quả trong các loại enzyme hoạt huyết, gấp 4 lần Plasmin - enzyme nội sinh làm
tan máu đông, đồng thời an toàn cho cơ thể khi hấp thụ qua đƣờng ăn uống
(Yanagisawa, Chatake et al. 2010)
Từ trƣớc đến nay, Nattokinase đƣợc thu nhận chủ yếu bằng con đƣờng lên
men bán rắn chủng B. subtilis trên cơ chất đậu nành nấu chín hay lên men dịch thể
(Sumi, Hamada et al. 1987). Thực tế, Nattokinase đƣợc ly trích từ cơ chất hay môi
trƣờng lỏng thƣờng có hàm lƣợng không cao và hoạt tính ít ổn định. Vì thực nghiệm
đã cho thấy rằng sự tổng hợp Nattokinase trong tự nhiên ở B. subtilis khá phức tạp
và chỉ đạt mức độ giới hạn. Hay nói cách khác, cách tiếp cận trên thƣờng chỉ hiệu
quả nếu đi kèm công nghệ lên men hoàn hảo với các thông số đã đƣợc nghiên cứu

tối ƣu hóa.Tuy nhiên các quy trình công nghệ này ít đƣợc công bố (Nguyen Sle,
Quyen et al. 2014). Ở các nƣớc đang phát triển nhƣ Trung Quốc và Việt Nam,
ngƣời dân đã bắt đầu quan tâm sử dụng. Do vậy, việc tìm hiểu, thu nhận nguồn gen
mã hóa Nattokinase từ các chủng B. subtilis, xây dựng, phát triển hệ thống tái tổ
hợp là cách tiếp cận mới mở ra triển vọng cho công nghệ sản xuất và thu nhận
Nattokinase hoạt tính cao nhằm làm nguyên liệu cho dƣợc phẩm, thực phẩm chức


2

năng. Nattokinase đƣợc mã hóa bởi gen aprE có trong hệ genenome của chủng vi
khuẩn B. subtilis (Nakamura, Yamagata et al. 1992) .Trong đề tài này thay vì sử dụng
B. subtilis tôi sử dụng E. coli DH5α để tạo dòng tái tổ hợp sản xuất Nattokinase. Sản

phẩm Nattokinase sản xuất từ chủng E. coli DH5α tái tổ hợp có giá trị, chất lƣợng và
độ an toàn nhƣ Nattokinase lên men tự nhiên.
Trong nƣớc, các doanh nghiệp dƣợc phẩm cũng bắt đầu cho ra các sản phẩm
Nattokinase với nguyên liệu ngoại nhập chủ yếu từ Nhật Bản, giá thành khá cao. Việc
tìm kiếm nguồn nguyên liệu Nattokinase có hoạt tính ổn định và giá cả phù hợp là
định hƣớng của nhiều công ty. Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn trên, tôi thực hiện đề tài:
“Tách dòng và giải trình tự gene mã hóa enzyme Nattokinase từ B. subtilis” nhằm
mục đích cung cấp vật liệu cho các nghiên cứu tạo chủng vi sinh vật có khả năng sản
xuất Nattokinase tái tổ hợp, trƣớc tiên là tạo chủng E. coli tái tổ hợp.
1.2. Mục tiêu đề tài
- Phân lập gene aprE từ vi khuẩn B. subtilis
- Xác định trình tự gene aprE đã phân lập và so sánh với trình tự trên ngân
hàng gene (Gene bank).
1.3. Yêu cầu của đề tài
- Nắm đƣợc các nguyên lý, kĩ thuật và các phƣơng pháp thực hiện trong quá
trình phân tích

- Thành thạo các thao tác và thực hiện đƣợc quy trình phân lập, tách dòng gene.
- Nắm đƣợc phƣơng pháp nghiên cứu cấu trúc và trình tự gene.
1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn đề tài
1.4.1. Ý nghĩa khoa học
Kết quả của đề tài là cơ sở cho các nghiên cứu kế tiếp có liên quan đến việc
sản xuất Nattokinase sau này.
1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn
Sản phẩm của nghiên cứu mở ra hƣớng nghiên cứu ứng dụng sản xuất
Nattokinase trên quy mô công nghiệp, rút ngắn thời gian sản xuất.


3

PHẦN 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Nguồn gốc thực vật của Nattokinase
Trong nhiề u nghiên cƣ́u về ngồ n gố c của Natto đã chỉ ra rằ ng Natto bắ t đầ u
trở thàn h mô ̣t phầ n văn hóa của Nhâ ̣t vào khoảng cuố i của thời kỳ EDO

(1600–

1868). Trong thời kỳ này , đâ ̣u tƣơng đƣơ ̣c gói trong rơm và chôn dƣới đấ t khoảng
mô ̣t tuầ n . Mô ̣t loa ̣i vi khuẩ n có sẵn trong rơm giúp cho quá trình lên men đâ ̣u tƣơ ng
mô ̣t cách tƣ̣ nhiên và ta ̣o ra natto . Phƣơng pháp hiê ̣n đa ̣i chỉ mới đƣợc phát hiện lầ n
đầ u tiên ở Sendai bằng cách tiêm vi khuẩ n giố ng tinh khiế t vào đâ ̣u tƣơng (Elahi,
Choi et al. 2015).
Ngày nay, natto đã phổ biế n ta ̣i Nhâ ̣t . Thông thƣờng nó đƣơ ̣c bán ta ̣i các cƣ̉a
hiê ̣u ta ̣p hóa trong các túi nilon . Ở Nhật, natto đƣơ ̣c sƣ̉ du ̣ng dƣới một số dạng nhƣ
trô ̣n với lúa mì , cải bắ p , trƣ́ng hoă ̣c trô ̣n salát, hoặc nhƣ mô ̣t loa ̣i gia vi .̣ Trong một
thƣ̉ nghiê ̣m kiể m chƣ́ng , natto đƣơ ̣c chuẩ n bi ̣bằ ng cách bổ sung B. subtilis vào đậu

tƣơng hấ p chín cho vào trong túi nylon rồ i để hỗn hơ ̣p lên men trong 24 giờ ở 37ºC.
Vi khuẩ n natto ở da ̣ng bô ̣t sấ y khô đạt đƣợc mâ ̣t đô ̣ khoảng 10 tỷ tế bào/gam sản
phẩm (Sumi 1999).

Hình 1: Sản phẩm natto sau khi lên men


4

2.2 Đặc điểm, cấu trúc của Nattokinase
2.2.1. Đặc điểm
Bảng 1: Đặc điểm của Nattokinase (Kim, Gum et al. 2008)
Tên enzyme

Nattokinase

Tên thay thế

Cardiokinase

Gene mã hoá

aprE

Vi sinh vật thao tác

B. subtilis

Danh pháp công bố


86029 [NCBI]

Thứ tự phân loại vi khuẩn B.subtilis

Bacteria › Firmicutes › Bacillales ›
Bacillaceae › Bacillus

Chiều dài chuỗi acid amin

275 aa

Trọng lƣợng phân tử

28 kDalton

Điểm đẳng điện pI

6,79

Hoạt tính xúc tác

Thủy phân protein . thuỷ phân petitde

Dạng tiết protein thành phẩm

Tiết ngoài

2.2.2.Cấu trúc phân tử Nattokinase
Enzyme Nattokinase có tính tƣơng đồng cao với các enzyme subtilisin ở mức
độ trình tự trên 99% . Cấu trúc của Nattokinase có đặc điểm cấu hình linh hoạt phù

hợp với việc tác động lên cấu trúc fibrin, một tác nhân làm đông máu trong cơ thể
(Suzuki, Kondo et al. 2003), (Tai and Sweet 2006).
2.3. Hoạt tính của Nattokinase
2.3.1. Hoạt tính
Không giống nhƣ aspirin và hầu hết các thuốc chống đông máu khác sẽ ức
chế sản xuất fibrin, Nattokinase trực tiếp làm tiêu sợi fibrin nên giải phóng tiểu cầu
và giải tỏa những khu vực mà dòng máu lƣu thông bị cản trở không cần thiết. Bằng
cách kích thích cơ thể tăng cƣờng sản xuất plasmin, Nattokinase không những giúp
làm tan cục máu đông đã hình thành mà còn hoạt động nhƣ một thành phần chống
cục máu đông hình thành. Nattokinase cũng ức chế Plasminogen Activator PAL -1
vốn là thành phần hạn chế hoạt động của plasmin trong cơ thể.


5

Cục máu đông có thể hình thành trong động mạch, tĩnh mạch, hoặc trong các
buồng tim. Cục máu đông trong tĩnh mạch hình thành trong điều kiện dòng chảy
thấp, bao gồm chủ yếu của các tế bào máu với vài tiểu cầu và chứa một lƣợng lớn
các sợi fibrin xen kẽ. Các khối huyết

này có thể vẫn còn tồn tại trong mạch

máu. Tuy nhiên, cục máu đông cũng có thể di chuyể n hoặc bấ t đô ̣ng . Nếu cục máu
đông di chuyển từ một mạch ngoa ̣i biên đến phổi

, kết quả là một sự tắc nghẽn

phổi.Tƣơng tự nhƣ vậy , nếu một cục máu đông di chuyển từ tim hoặc động mạch
cảnh lên não, nó gây ra đột quỵ . Và, cuối cùng, nếu cục máu đông di chuyển tƣ̀ một
vị trí đế n biṭ kiń động mạch vành, nó gây ra một cơn đau tim.

Thông thƣờng, trong những trƣờng hợp trên thì trong cơ thể sẽ xuấ t hiê ̣n các
enzym huyết khối làm tan các cục

máu đông đƣợc tạo ra trong các tế bào nội

mô của mạch máu . Khi con ngƣời già đi

, viê ̣c sản xuất các enzym này chậm

lại và máu dễ bị làm đông hơn. Tuy nhiên, cục máu đông có thể hình thành ở bất cứ
độ tuổi nào .Vì vậy, viê ̣c phòng ngừa nên đƣơc ƣu tiên ngay cả đối với những
ngƣời trẻ tuổ i và việc sử dụng một sản phẩm có chứa thành phần Nattokinase để
phòng ngừa sẽ giúp hõ trợ một phần cho việc phòng ngừa và điều trị.
Đáng chú ý, fibrinolysis (hiệu ứng sinh lý chính của Nattokinase) là một quá
trình sinh lý tự nhiên. Fibrin, một thành phần làm đông máu nhanh đƣợc thủy
phân thành các sản phẩm an toàn hơn cho hệ mạch trong quá trình fib rinolysis. Khi
fibrin bi ̣thủy phân , thời gian đông máu chậm lại. Nattokinase thủy phân sợi tơ
fibrin và cơ chất của plasmin mô ̣t cách trực tiếp Trong quá trình điều chỉnh đông
máu, prourokinase đƣợc chuyển đổi thành urokinase, quá trình này đƣợc xúc tác
bởi Nattokinase. Bằng cách làm giảm sự hình thành huyết khối, Nattokinase giảm
tốc độ tiến triển của sự hình thành mảng bám và hạn chế việc làm tổn thƣơng động
mạch (Toki, Sumi et al. 1985).
2.3.2. So sánh các tác nhân tiêu sợi
2.3.2.1 Urokinase
Trong bệnh viện, Urokinase đƣợc thƣờng đƣợc sử dụng nhƣ là một enzyme
tiêu sợi huyết để xử lý các cục máu đông buồng tim tâm nhĩ , trong cơn đau tim và


6


đột quỵ do ngheñ ma ̣ch . Nó đƣợc chỉ định để hòa tan huyết khối trong tim, mạch
máu, hoặc phổi .Urokinase có chi phí giá thành cao hơn so với Nattokinase nhƣng
hoạt lực cũng chỉ tƣơng đƣơng với hiệu quả của 100 gam Natto. Nattokinase duy trì
hoạt động trong thời gian 4-6 giờ, thời gian tác du ̣ ng lâu hơn so với Urokinase.
2.3.2.2 Streptokinase
Đây cũng là một enzyme đƣợc sử dụng nhƣ một tác nhân tan huyết khối trong
các trƣờng hơ ̣p chăm sóc khẩn cấp

. Nó có giá thành thấp hơn so với Urokinase

trong mỗi lần điều trị. Streptokinase đƣợc chỉ định để điều trị nhồi máu cơ tim sớm,
đặc biệt là nhồi máu cơ tim cấp tính trong vòng 6 giờ trƣớc khi bắt đầu đau đớn dẫn
đến nhập viện.
2.3.2.3 Bromelain
Bromelain đƣợc sử dụng nhƣ một nhân tố tham gia vào quá trình chống đông
máu hiệu quả có khả năng hoạt hóa trong quá trình fibrinolysis thông qua việc
kích thích sản xuất plasmin. Vì nattokinase ức chế fibrin hiệu quả hơn plasmin
trong thƣ̉ nghiê ̣m In -vitro nên nattokinase là một tác nhân tiêu sợi huyết ma ̣nh hơn
nhiều so với bromelain .
2.3.2.4 Tỏi
Tỏi chiên và tỏi thô tăng hoạt tin
́ h tiêu sợi huyết trong huyết thanh đáng kể
và giảm fibrinogen và fibrinopeptide đến 10% (Mansell and Reckless 1991).
2.3.2.5 Nhân sâm
Nhân sâm có thể ức chế sƣ̣ chuyển hóa fibrinogen thành fibrin . Cơ chế hoạt
động của loại thảo dƣợc này là thông qua viê ̣c tăng hoa ̣t tin
́ h ti
Urokinase.

êu sợi huyết của

.

Từ các so sánh trên, có thể Nattokinae có hoạt tính tác động mạnh hơn và có
tác dụng lâu hơn, điều đó nâng cao khả năng điều trị cho các bệnh nhân mắc các
bệnh liên quan đến tắc nghẽn mạch hoặc suy tim do nguyên nhân bị hình thành các
cục máu đông.
2.4. Tác dụng của Nattokinase
2.4.1. Khả năng làm tan cục máu đông
Năm 1990, Sumi và công sƣ̣ của ông báo cáo về hiệu quả của viên nang
Nattokinase trong thƣ̉ nghiê ̣m phân giải huyết khối ở chó . Một trong những thử


7

nghiệm đầu tiên trên ngƣời tiế n hành với 12 tình nguyện viên khỏe mạnh ngƣời
Nhật Bản. Mỗi ngƣời tham gia sƣ̉ du ̣ng 200 g Natto một lần mỗi ngày trƣớc bữa ăn
sáng, tiếp theo là kiểm tra định kỳ lƣợng plasmin trong máu . Sau một khoảng thời
gian 2 tuần, mỗi ngƣời lại ăn 200 g đậu nành luô ̣c vào trƣớc bữa ăn sáng

và lại

kiểm tra định kỳ plasmin trong máu . Chỉ có một biế n đổi nhỏ trong kết quả của
nhóm kiểm chƣ́ng là những ngƣời ăn đậu nành luộc . Ngƣợc lại, nhóm ăn natto cho
thấy thời gian thủy phân fibrin (euglobulin lysis time-ELT) giảm đáng kể và hoạt độ
enzyme tiêu sợi huyết tăng sau khi sƣ̉ du ̣ng natto (Sumi, Hamada et al. 1990).
Trong một thử nghiệm khác trên ngƣời , Okamoto và cô ̣ng sƣ̣ đã báo cáo sự
hiện diện của chất chống huyết áp cao của natto (Okamoto, Hanagata et al. 1995).
Trong nghiên cứu này nhỏ , Natto đông khô đƣơ ̣c chiế t bằ ng ethanol 80% rồ i cho 5
tình nguyện viên sƣ̉ du ̣ng. Có 4 trong 5 đối tƣợng, huyết áp tâm thu trung bình giảm
từ 173,8 ± 20,5 mm Hg thành 154,8 ± 12,6 mm Hg và huyết áp tâm trƣơng giảm từ

101,0 ± 11,4 mm Hg đến 91,2 ± 6,6 mm Hg.
2.4.2. Đề phòng, hỗ trợ các bệnh liên quan đến tim mạch
Nattokinase làm tan cục máu đông bằng cách làm tan sợi fibrin (chất sợi
buộc các tiểu cầu vón kết lại với nhau hình thành cục máu đông). Nattokinase hoạt
động mạnh gấp 4 lần plasmin nội sinh (loại enzyme duy nhất trong cơ thể làm
nhiệm vụ phá tan sợi fibrin) với cơ chế tƣơng tự nhƣ plasmin này. Do sức khỏe và
tuổi tác, cơ thể giảm sản sinh plasmin càng làm tăng nguy cơ hình thành cục máu
đông. Nattokinase cũng giúp tăng cƣờng lƣợng plasmin của cơ thể và các thành
phần chống đông máu khác nhƣ urokinase.
2.4.3. Giảm huyết áp, giúp lưu thông máu
Nattokinase làm giảm huyết áp. Ngƣời Nhật đã sử dụng đậu tƣơng lên men
đã khá lâu vì mục đích này. Các nghiên cứu chỉ ra rằng nó làm giảm huyết áp bằng
cách ức chế enzyme chuyển đổi angiotensin (ACE). ACE khiến mạch máu bị hẹp
lại và huyết áp tăng cao. Nattokinase có khả năng ức chế ACE, trợ giúp máu lƣu
thông bằng cách hỗ trợ bù trừ trong tuần hoàn. Nó cũng đƣợc chứng minh là có tác
dụng ngăn chặn xơ vữa mạch.


8

2.4.4. Các lợi ích khác
Làm chắc xƣơng, hỗ trợ điều trị đau khớp, giảm nhức đầu, kháng khuẩn,
ngừa bệnh tả, thƣơng hàn, bệnh lị. Cục máu đông làm tắc mạch máu là nguyên nhân
chính dẫn đến sa sút trí nhớ, xuất huyết não, nhồi máu cơ tim, đau thắt ngực và
giảm trí nhớ. Lợi ích từ Nattokinase có thể hỗ trợ điều trị và phòng ngừa các bệnh
trên hứa hẹn sẽ mang lại nhiều lợi ích cho những ngƣời bệnh này.
2.5. Các phƣơng pháp sản xuất Nattokinase
2.5.1. Phương pháp lên men dịch thể
Lựa chọn nguyên liệu
Đậu tƣơng

Rửa sạch

Ngâm
Nấu chín ở 115 - 121o C
trong 40 – 60 phút
Trộn giống Natto

Cho vào khay chứa
Lên men 12 – 24 giờ ở
45 -50o C
Để chín

Natto thành phẩm
Hình 2: Sơ đồ hoá quy trình lên men dịch thể Nattokinase


9

Thuyết minh tổng quát phƣơng pháp
-

Lựa chọn nguyên liệu: Chọn những hạt đậu tƣơng khô dồng đều, không
sauu bệnh, không bị nhiễm nấm mốc.

-

Rửa sạch: Mục đích là để lại bỏ tạp chất, loại bỏ một số vi sinh vật bám trên
hạt đậu tƣơng. Quá trình rửa hoàn toàn bằng nƣớc lạnh

-


Ngâm: Hạt đậu đƣợc ngâm trong nƣớc lạnh trong vòng 12-20 giờ, nhằm làm
tăng kích thƣớc hạt, làm cho hạt nở ra.

-

Nấu chín: Hạt đƣợc hấp cách thuỷ trong khoảng 40-60 phút, ở 115-1210C.
Mục đích là để làm chín nguyên liệu, tiêu diệt vi sinh vật không có lợi trong
quá trình sản xuất

-

Trộn giống Natto: Công thức phối trộn nhƣ sau: 250 gram đậu tƣơng + một
nửa muỗng cafe bột natto + 2 muỗng canh nƣớc + hỗn hợp nƣớc muối đƣờng

-

Cho vào khay chứa: Vật liệu nuôi cấy có thể lên khay ( phƣơng pháp của
ngƣời Nhật Bản hay sử dụng), cấy trên rơm hoặc lá chuối ( Thái Lan)…

-

Lên men: Hỗn hợp đậu tƣơng và men đƣợc ủ ở 40-500 C,trong vòng 12-24
ngày sau đó đƣợc làm lạnh và cho vào tủ lạnh khoảng một tuần để Natto phát
triển và sinh sợ nhớt

-

Để chín: Sau giai đoạn lên men ta đã có đƣợc sản phẩm Natto có chứa
enzyme rất quý, đó là Nattokinase.


2.5.2. Phương pháp sản xuất từ vi sinh vật
Vi sinh vật với tốc độ tăng trƣởng nhanh chóng và dễ chịu tác động di truyền
phân tử là mục tiêu lý tƣởng cho công nghệ sinh học và có thể đƣợc lựa chọn cho
khả năng phát triển để sản xuất Nattokinase. Nattokinase sản xuất từ phƣơng pháp
vi sinh vật đƣợc coi là an toàn và hàm lƣợng các chỉ số dinh dƣỡng giống nhƣ
Nattokinase tự nhiên.
E. coli là một vi khuẩn Gram âm, hình que dài khoảng 2.5μm, có roi
(flagella) và bộ gene gồm 4639221 cặp base mã hóa ít nhất cho 4406 gene. Giống
nhƣ tất cả các vi khuẩn Gram âm khác, E. coli không có màng nhân và nhiễm sắc
thể là một phân tử sợi đôi dạng vòng rất lớn với những vị trí gắn màng và một vị trí


10

khởi đầu sao chép (origin of replication). E. coli là loài đƣợc chọn trong các phòng
thí nghiệm về sinh học phân tử bởi vì dễ nuôi cấy, bộ gene đơn giản và đã đƣợc giải
trình tự khả năng biểu hiện protein tái tổ hợp mạnh, chỉ sau 8 giờ nuôi cấy ở điều
kiện thích hợp đã có sản phẩm protein tái tổ hợp, khả năng tạo sản phẩm gene cao
từ 50 mg/l đến 500 mg/l. Các tế bào E. coli có thể hỗ trợ sự sao chép các plasmid
DNA và chọn lọc các DNA plasmid tái tổ hợp thông qua gen kháng kháng sinh hay
các phức hợp màu nhƣ Xgal –β –galactosidase .
Hơn nữa, E. coli là loài vi khuẩn lành tính, đặc điểm di truyền đã đƣợc công
bố rõ ràng, an toàn và dễ thao tác, rất phù hợp với mục đích của đề tài nghiên cứu.
Từ việc tách dòng thành công gene mã hoá cho enzyme Nattokinase là aprE
vật liệu này sẽ đƣợc sử dụng để tạo ra enzyme Nattokinase thông qua sự tạo thành
sản phẩm nhờ của các vector biểu vi khuẩn E. coli.
2.6. Tình hình nghiên cứu sản xuất Nattokinase trong và ngoài nƣớc
2.6.1. Trên thế giới
Tiến sĩ Hiroyuki Sumi khám phá ra Nattokinase vào năm 1980 trong khi tiến

hành nghiên cứu tại Đại học Chicago. Năm 1995, các nhà nghiên cứu ở phòng thí
nghiệm Nghiên cứu Công nghệ sinh học và JCR Pharmaceuticals của Kobe, Nhật
Bản đã thử nghiệm hiệu quả của Nattokinase trong việc giảm huyết khối động mạch
cảnh trên chuột. Một số chuột đƣợc tiêm huyết khối ở động mạch cảnh, nguồn cung
cấp dinh dƣỡng cho não. Ba enzym là Nattokinase, plasmin và elastase đƣợc dùng
để thử nghiệm trên chuột. Elastase cho thấy không mở đƣợc các động mạch bị chặn.
Nhóm ăn Plasmin cho thấy lƣu thông phục hồi 16% sau một giờ. Còn nhóm ăn
Nattokinase cho thấy phục hồi 62% lƣu thông trong cùng khoảng thời gian. Kết quả
này giúp nhà nghiên cứu kết luận rằng khả năng tiêu fibrin của Nattokinase là mạnh
hơn so với plasmin hoặc elastase trong cơ thể (Chan, Fan et al. 2000)
Cũng trong năm 1995, các nhà nghiên cứu từ Trƣờng y khoa Miyazaki
Kurashiki và Đại học Khoa học và Nghệ thuật tại Nhật Bản đã nghiên cứu tác dụng
của Nattokinase với huyết áp ở cả động vật và con ngƣời. Trong các thử nghiệm


11

chuột đƣợc cho uống một liều duy nhất 400 - 450 gam Nattokinase. Tính trung bình
huyết áp tâm thu (SBP) của chuột giảm 12,7% trong 2 giờ.
Nhóm ngƣời tình nguyện tham gia có huyết áp cao đƣợc uống 30 gam
lyophilized trích xuất (tƣơng đƣơng 100 g natto). Trung bình huyết áp tâm thu SBP
giảm 10,9% và huyết áp tâm trƣơng (DBP) giảm 9,7%.
Thức ăn bổ sung đậu tƣơng lên men natto có khả năng ngăn chặn, ức chế,
điều trị sự tổn thƣơng nội mạc động mạch đùi ở chuột.
Tóm lại, Nattokinase là chủ đề của ít nhất 17 nghiên cứu từ năm 1986. Hoạt
tính của Fibrinolytic đã đƣơ ̣c xác đinh
̣ là khá tốt trong các cuộc thử nghiệm.
2.6.2. Tình hình trong nước
Ở Việt Nam, các nhà khoa học cũng đã nghiên cứu và công bố nhiều công
trình về Nattokinae khác nhau chủ yếu tập trung vào các mảng nội dung nhƣ tối ƣu

hoá quy trình sản xuất và các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình sản xuất Nattokinse
(Nguyen Sle, Quyen et al. 2014). Phân lập, tuyển chọn các chủng vi sinh vật sản xuất

Nattokinase hiệu suất cao (Lê Thị Bích Phƣợng, Võ Thị Hạnh, Trần Thạnh Phong,
Lê Tấn Hƣng, Trƣơng Thị Hồng Vân, Lê Thị Hƣơng) .Tăng cƣờng biểu hiện tiết và
khả năng sản xuất từ các chủng vi sinh vật phân lập đƣợc trên sản phẩm Nattokinase
thƣơng mại (Hoàng Thị Khánh Hồng). Bƣớc đầu nghiên cứu chiết tách và đánh giá
khả năng tiêu fibrin từ đậu tƣơng lên men ( Nguyễn Thị Lập, Nguyễn Thị Loan)….
Trong những năm trở lại đây, ngƣời tiêu dùng trong nƣớc cũng đã chu ý và
quan tâm hơn đến các sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên tốt cho sức khoẻ, đặc biệt là
các sản phẩm tốt cho tim mạch và vận động. Các sản phẩm có chứa Nattokinase vì
thế mà cũng đƣợc ƣa chuộng không chỉ bởi tính tiện lợi mà còn vì sự an toàn mà nó
mang lại. Tuy nhiên, những sản phẩm này lại có giá thành khá cao so với mặt bằng
chung của đại đa số ngƣời tiêu dùng. Vì thế câu hỏi đặt ra là làm thế nào để một
sản phẩm tốt nhƣ Nattokinase đến đƣợc nhiều hơn với ngƣời tiêu dùng với mức giá
cạnh tranh sẽ là hƣớng đi đúng đắn và là cơ hội mới hứa hẹn của các nhà khoa học
trong tƣơng lai.


12

PHẦN 3
VẬT LIỆU, NỘI DUNG, PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Vật liệu nghiên cứu
3.1.1. Vi khuẩn B. subtilis
Chủng vi khuẩn B. subtilis sử dụng trong nghiên cứu đƣợc cung cấp bởi Bộ
môn Công nghệ vi sinh và Sinh thái môi trƣờng, Viện Khoa học sự sống, Đại học
Thái Nguyên.
3.1.2. Hóa chất
 Môi trƣờng nuôi B. subtilis : môi trƣờng LB

- LB lỏng (1000 ml):
+ Bacto- tryptone : 10g
+Bacto Yeast extract : 5g
+ NaCl : 10g
+ Chuẩn pH môi trƣờng : 7,2
 Hóa chất PCR
+ Buffer
+ MgCl2 20mM
+ Taq- DNA Polymerase
+ dNTPs
+ Nƣớc khử ion
 Hóa chất điện di
+ Agarose 1 %
+ Hóa chất pha dung dịch đệm TAE (Tris base, EDTA, NaOH, Acid acetic
100%).
+ Loading dye 6X
+ Ethidium bromide
 Hoá chất dùng cho phản ứng gắn nối gene vào vector tách dòng
Bộ kit Thermo Scientific InsTAclone PCR Cloning Kit các thành phần bao gồm:


13

+ 10X Ligation Buffer
+ T4 DNA Ligase
+ Nƣớc khử ion
+ Vector pTUAF
 Hóa chất cho biến nạp và chọn lọc khuẩn lạc
- Môi trƣờng LB lỏng và LB-Agar- Amp- Xgal- IPTG
+ Kháng sinh Ampicilin 100mg/ml

+ X- gal stock solution (20mg/ml)
Cân 0,2g X-gal (5- bromo -4-Chloro -3 –indolyl- β- D- galactopyramoside) vào
10ml N- N- dimethylformamide và bảo quản ở - 20oC.
+ IPTG 100mM
Cân 1,2 g IPTG (isopropyl- β- D- thiogalactopyranmoside) vào 50 ml nƣớc
khử ion lắc đều. Bảo quản ở tủ 4oC.
 Hoá chất tách chiết DNA plasmid
Sử dụng bộ kit Thermo Scientific GeneJET Plasmid Miniprep Kit để tách
chiết DNA plasmid.
 Enzyme giới hạn: SacI, HindIII, BamHI, EcoRI của hãng Thermo Scientific.
3.1.3. Vật liệu
3.1.3.1 Mồi phản ứng PCR
Chúng tôi sử dụng cặp mồi đặc hiệu để nhân gene aprE . Trình tự mồi đƣợc
thiết kế dựa vào trình tự gene đã đƣợc công bố trên ngân hàng gene NCBI.
Bảng 2: Cặp mồi sử dụng nhân gene aprE
Tên
mồi

Trình tự mồi ( 5’ - 3’)

aprE - F

TGAGCTCTTATTGTGCAGCTGCTTG

Chiều dài
Enzyme
đoạn gene
thiết kế
aprE
SacI

825bp

aprE- R

CGCTGGATCCGCGCAATCTGTTCT

BamHI


14

Trình tự của mồi đƣợc thiết kế gồm hai phần chính:
- Phần thứ nhất là đầu treo của mồi (ở đầu 5’) không bắt cặp với trình tự gene
đích trong hệ gene, đầu treo bao gồm một số thành phần đƣợc thêm vào để phục vụ
các nghiên cứu tiếp theo, phần treo bao gồm:
+ Một nucleotide đƣợc thêm vào phía ngoài cùng ở đầu 5’để bảo vệ vị trí nhận
biết của các enzyme cắt giới hạn khỏi các tác động có thể làm thay đổi trình tự này.
+ Trình tự nhận biết của enzyme cắt giới hạn (phần chữ đậm gạch chân) ở phía
đầu treo 5’: BamHI –GGATCC ở mồi xuôi và SacI –GAGCTC ở mồi ngƣợc để phục
vụ cho công việc gắn nối gene aprE vào vector biểu hiện.
- Phần thứ hai là phần bắt cặp đặc hiệu với hai đầu của gene aprE trong hệ
gene của vi khuẩn B. subtilis nằm ở đầu 3’, trong đó bao gồm cả 3 nucleotide bổ
sung với mã kết thúc TTA trên gene aprE –SacI– F. Phần này cho phép khuếch đại
chính xác trình tự của gene aprE từ hệ gene của vi khuẩn B. subtilis.
3.1.3.2 Vector tách dòng pTUAF
Vector pTUAF là vector tách dòng TA, đã đƣợc thiết kế thành công dựa trên
vector thƣơng mại pTZ57R/T có kích thƣớc 2886 bp, thiết kế dựa vào hoạt tính
terminal transferase cuả enzyme Taq- DNA polymerase trong phản ứng PCR. Nó bổ
sung một nucleotide A (Adenosine) vào đầu 3’ của mạch tổng hợp trong sản phẩm
khuếch đại. Vector pTUAF có đầu dính là một nucleotide T (Thymine), cho phép

tách dòng tất cả các trình tự khuếch đại của phản ứng PCR do enzyme Taq- DNA
polymerase tổng hợp.
Trong cấu trúc của vector pTUAF bao gồm hai hệ thống chọn lọc, cho phép
chọn lọc các dòng tế bào mang plasmid đã gắn xen trình tự đích thành công. Hệ
thống chọn lọc thứ nhất là gene kháng kháng sinh ampicilin mã hóa cho enzyme
phân giải kháng sinh ampicilin (Amp resistant gene), điều này đồng nghĩa với việc
các tế bào mang vector pTUAF có thể sống sót và phát triển trên môi trƣờng có
chứa kháng sinh ampicilin. Hệ thống chọn lọc thứ hai là hệ thống chỉ thị màu Lacoperon, hệ thống này bao gồm gene LacZ mã hóa cho enzyme β –galactosidase và
Lac-promoter cảm ứng bởi IPTG. Vị trí của gene LacZ đƣợc thiết kế sao cho bao
gồm vị trí gắn xen, thiết kế này có ý nghĩa quan trọng trong chọn lọc, cho phép
phân biệt các dòng tế bào mang vector có hoặc không có đoạn xen. Với các tế bào


15

chủ mang vector pTUAF tự đóng vòng hay không có sự gắn đoạn xen xảy ra , Lacoperon hoạt động bình thƣờng. Trong môi trƣờng có IPTG Lac-promoter sẽ đƣợc
kích hoạt quá trình phiên mã xảy ra, sau đó là quá trình dịch mã tổng hợp enzyme β
-galactosidase. Enzyme này xúc tác cho phản ứng chuyển hóa cơ chất X –gal thành
chất có màu xanh, làm cho khuẩn lạc bao gồm các tế bào này có màu xanh. Trƣờng
hợp thứ hai là khi cấu trúc của Lac- operon bị phá vỡ do gắn xen thành công, dẫn
đến enzyme β –galactosidase không đƣợc tổng hợp, không có sự phân giải cơ chất X
–gal nên các khuẩn lạc này sẽ có màu trắng. Các khuẩn lạc màu trắng là những khuẩn lạc
mong muốn trong chọn lọc dòng.
Trong vị trí của Lac –operon còn có vị trí đa tách dòng bao gồm các vị trí
cắt của enzyme cắt giới hạn: EcoRI, Ecl136II, SacI, Acc65I, KpnI, Bsp68I,
Mva1269I, Mph1103I, Xbal, BamHI, Cfr9I, Eco88I, SmaI, ApaI, Bsp120I, HincII, SalI,
XmiI, PstI, AlfI, Eco147I, PaeI, HindIII. Chúng tôi quan tâm đến vị trí cắt của enzyme
SacI, BamHI nằm ở sát hai đầu của vị trí gắn xen và enzyme HindIII, do đó trong đề tài
này chúng tôi sử dụng ba enzyme này để kiểm tra đoạn xen trong vector tách dòng.


Hình 3: Cấu trúc vector pTUAF


16

Chú giải
Tên gọi pTUAF đƣợc đặt theo tên tiếng Anh của Trƣờng Đại học Nông lâm
Thái Nguyên (Thai Nguyen University of Agriculture and Forestry). Trong đó, ký
hiệu đầu tiên, chữ p, là ký hiệu của plasmid theo quy tắc quốc tế. Chữ T trong cụm
từ TUAF vừa có ý nghĩa là T-vector vừa trùng với chữ cái đầu tiên trong cụm từ
viết tắt của Trƣờng Đại học Nông lâm Thái Nguyên.
3.1.4. Thiết bị sử dụng
Bảng 3: Danh mục các thiết bị sử dụng trong đề tài
Tên thiết bị

Nguồn gốc xuất sứ

Máy PCR

Amplied Biosystems USA/ Singapore

Bộ điện di

Scie- plas Ltd- UK

Máy chụp ảnh gel

Gel logic 1500 – Kodak- USA

Máy lắc


SK3000 – Jeotech –Korea

Máy cất nƣớc

Canada Bio Water system- Pall Co- UK

Tủ an toàn sinh học cấp 2

Nu- 425- 400E- Nuaire - USA

Nồi hấp khử trùng

HV- 110- Hirayama- Japan

Máy Vortex

Vortex Genius 3 – IKA Genmany/ China

Máy Spindown

E- centrifuge- Wealtec – Taiwan/ USA

Máy đo pH

F- 51BW- Horiba- Japan

Lò vi song

MS- 2347AR- LG VN


Tủ lạnh -200C, -800C

Super freezer Ecol130- Ficchetti- Italia

Cân điện tử

TE 214S- Startorius Germany

Bể ổn nhiệt

Techne- OSI

Pipette

Thermo Labsystem- Finland

Bề rửa sóng siêu âm

Jeiotech – Korea

Máy li tâm

Eppendorf – CHLB Đức

Máy lọc nƣớc siêu sạch

Pal- Co- UK