PCR và gi i trình t
Gi i trình t là gì?
DNA là c s hóa h c c a gen. Phân t DNA là m t chu i xo n kép c a hai m ch

n

c c u t o t 4 lo i nucleotide khác nhau nh các base c a chúng, ó là: A (adenine),
C (cytosine), G (guanine) và T (thymine). Các nucleotide này n i k t liên ti p v i nhau
theo m t th t xác

nh. Gi i trình t c a gen t c là phát hi n

c th t s p x p c a 4

lo i nucleotide này trên phân t DNA.
Các ph
1.

ng pháp gi i trình t gene

Ph

ng pháp hóa h c gi i trình t DNA

Vào n m 1977, Maxam và Guilbert

phát minh

có th gi i trình t m t o n DNA. Nguyên t c c a ph
h t là ph i ánh d u m t

ng pháp hóa h c

ng pháp này là: (1) Tr

c

u c a o n DNA c n ph i gi i trình t b ng m t g c
32

ng v phóng x ( P); (2) X lý các o n DNA ã ánh d u này v i ch t

phospho

hóa h c có th làm bi n

i

DNA. Ví d , dimethylsulphate

c hi u m t ho c hai lo i base c a nucleotide trên o n
bi n

i Guanine b ng các thêm m t g c methyl

trí nitrogen th 7 (N7), hydrazine làm bi n
NaCl

c m t ph

làm bi n


làm bi n

i Cytosine, acid

v

i Thymine và Cytosine, hydrazine và

làm bi n

i Guanine và Adenine, NaOH

i Adenine và Cytosine v i Adenine u tiên h n Cytosine. Nh v y trong

giai o n này, ph i dùng ít nh t 4 ng nghi m và trong m i ng nghi m, DNA
lý v i m t l

ng r t gi i h n c a m t trong các ch t hóa h c nêu trên

cx
m i ng

nghi m ch có ch a các o n DNA mà trên m i o n DNA này ch có m t v trí
nucleotide

c hi u v i ch t hóa h c là b bi n

s b l y ra kh i m ch khung
DNA và nh


ó tách ra

i; (3) Các nucleotide b bi n

i này

ng-phosphate (sugar-phosphate backbone) c a o n

c các o n m ch

n có m t

u ánh d u 32P và m t

u

b m t phân t base vì phân t này ã b l y ra kh i m ch khung (hình 37). (4) Th c
hi n i n di m u DNA ã x lý trong 4 ng nghi m này trên 4 hàng c a m t gel
polyacrylamide bi n tính

các m ch

i trong quá trình i n di. Nh

n trong m u di chuy n trong gel không b bi n

ó, sau khi hoàn t t i n di, các m ch

t i các v trí khác nhau, tùy thu c vào m ch


n s b d ng

n này dài ng n khác nhau, theo hàng d c

su t chi u dài c a gel. Áp gel ã i n di này trên m t phim nh y tia X, các v trí d ng
79


l i c a các m ch
ub

n trên gel i n di s t o thành các v ch trên phim vì các v trí này

ánh d u phóng x do các m ch

n

u có m t

u

c ánh d u b ng 32P.

T các v ch trên phim x ký t ghi này (autoradiography), có th

c

c trình t c a


các nucleotide c a o n DNA (hình 38).
Ph

ng pháp hóa h c xác

nh trình t DNA c a Maxam và Gilbert trên th c t

không ph i d th c hi n vì c n ph i xác
trong ó khó nh t là ph i xác

nh

nh khá nhi u thông s t i u cho thí nghi m,

c n ng

gi i h n nh t c a các ch t hóa h c sao

cho khi x lý m u DNA thì trên m i o n DNA ch có m t base b bi n
m i v trí c a base b bi n

i thì s có m t m ch

Chính vì s ph c t p này, ph

n có

u ánh d u P

ng pháp Maxam Gilbert hi n nay ít


thay vào ó các nhà khoa h c dùng ph

i

32

ng v i
c tách ra.

c s d ng, mà

ng pháp enzyme v i nhi u u i m v

t tr i

h n.
M ch

n DNA

32

P A p G p C p T p T p T p G p A p G p G p A p C p G p A..

32

Các m ch DNA
n có u b
ánh d u 32P


P
P
32
P
32
P
32
P
32

Hình 37: Các m ch
n có m t u ánh d u v i 32P và m t u base Guanine b l y kh i m ch khung do b
bi n
i. Các m ch
n này có chi u dài ng n khác nhau tùy thu c vào v trí c a Guanidine trên
o n DNA.

3
5
GCCCACTTCAGAAGAAAAAGG

C
T+G
G
A>C

Hình 38: Hình x ký t ghi trên phim nh y tia X m t gel polyacrylamide sau khi ã i n di. Các v ch là v trí các
n
m ch n b d ng l i sau i n di. Các v trí này g n hay xa kh i i m là tu kích th c c a m ch

dài hay ng n khác nhau. T các v ch này, c trình t c a o n DNA trong m u.

80


2.

Ph

ng pháp enzyme gi i trình t DNA

Ph

ng pháp enzyme

và ngày hôm nay ph

c Sanger và các c ng s phát minh c ng vào n m 1977,

ng pháp này càng ngày càng

c hoàn thi n và th c hi n d

dàng t i các phòng thí nghi m. Nguyên t c chung c a ph

ng pháp này có th tóm t t

nh sau:

CATACGTGG


CCTTACG

m i GGAATGC

CATACGTGG

t❤ê♠

thêm
d*NTP, DNA
polymerase,
ddCTP

d*NTP, DNA
polymerase,
ddATP

CGTAAGG*C*CdA
CGTAAGG*C*C*A*C*G*TdA

CCTTACG
GGAATGC

thêm
d*NTP, DNA
polymerase,
ddGTP

thêm

d*NTP, DNA
polymerase,
ddTTP

CGTAAGG*C*C*A*CdG
CGTAAGG*C*C*A*C*G*T*A *TdG

CGTAAGGdC
CGTAAGG*CdC
CGTAAGG*C*C*AdC

CGTAAGG*C*C*A*C*GdT
CGTAAGG*C*C*A*C*G*T*AdT

i n di trên gel
CGTAAGG*C*C*A*C*G*T*A *TdG
CGTAAGG*C*C*A*C*G*T*AdT
CGTAAGG*C*C*A*C*G*TdA
CGTAAGG*C*C*A*C*GdT
CGTAAGG*C*C*A*CdG
CGTAAGG*C*C*AdC
CGTAAGG*C*CdA
CGTAAGG*CdC
CGTAAGGdC

Hình 39:

Chi u i n di

c chèn vào m t vector t i m t v trí bi t rõ

Ph ng pháp Enzyme gi i trình t DNA. o n DNA
trình t , nh
ó có th t ng h p
c các m ch
n có m t u là m i, m t u là các nucleotide
c dánh d u 35S, nh v y các m ch
t n. Trong hình các nucleotide ánh d u * là các nucleotide
n
c ánh d u.

81


c h t chèn các o n DNA c n ph i xác

Tr

nh trình t vào m t vector là phage

hay plasmid t i m t v trí mà trình t chu i c a v trí này ã
th t c là

c xác

nh rõ. Chuy n

a các vector mang o n chèn DNA này vào t bào vi khu n

nhân b n


các vector này thành nhi u b n sao, sau ó tách chi t và tinh khi t các vector t vi
khu n

thành các vector t do.

Dùng các o n m i b sung m t cách

c hi u v i trình t c a vector t i v trí

chèn o n DNA. Thêm vào ng ph n ng men DNA polymerase và 4 lo i nucleotide
do (g i là dNTP: deoxynucleotide triphosphate) và m t l

t

ng r t gi i h n các

nucleotide t n (terminator, là ddNTP: dideoxynucleotide triphosphate, c ng nh dNTP,
có 4 lo i ddNTP t

ng ng v i 4 base A, T, C và G). Ph n ng

ng, và m i ng cho m t lo i ddNTP khác nhau. B t
polymerase s kéo các dNTP vào

t ng h p m ch

trên vector, và s t ng h p m ch

n s b d ng


l i t i v trí mà ddNTP
dNTP. Lý do s

c th c hi n trong 4

ut

o n m i, men DNA

n b sung v i m ch DNA chèn
❆

c kéo vào thay vì

C

G

T

T

t ng h p b d ng l i là vì

3

C
G

ddNTP có c u trúc hóa h c b m t i g c OH t i


C
A

v trí carbon th 3 c a

ng deoxyribose, mà

G
T

g c OH t i v trí này chính là n i
ti p

C

dNTP k

C
T

c g n vào. Nh v y trong ng ph n ng

có các m ch
nhau t

ng

A
G


n DNA có các chi u dài khác
ng v i các v trí trình t

C
T

các

T
A

nucleotide trên o n DNA g c (hình 39).

G
C

gi i trình t , ng

i ta dùng ph

i n di trên gel polyacrylamide bi n tính. V i
ph

ng pháp ánh d u m i hay các dNTP b ng

ng v phóng x

G


ng pháp

G 5

Hình 40: Hình x ký t ghi m t k t qu gi i
DNA
trên
gel
trình
t
polyacrylamide. T k t qu này,
c
c trình t DNA

32

c ng gi ng nh ph

P hay 35S thì sau khi i n di,
ng pháp c a Maxam và Gilbert, ng

i ta phát hi n các v ch i n

di b ng k thu t x ký t ghi, và t các v ch này gi i

c trình t c a o n DNA

(hình 40).

82



3.

Gi i trình t b ng máy t

ng (automated sequencer)

Các phòng thí nghi m hi n nay

u dùng ph n ng gi i trình t b ng ph

enzyme, nh ng khi làm gi i trình t thì th
k thu t x ký t ghi nh tr
thì các m ch DNA
hu nh quang

c ây.

ng dùng các máy t

th c hi n

ng ch không dùng

c gi i trình t b ng máy t

n s n sinh trong ng ph n ng gi i trình t ph i

các v ch i n di c a các m ch


tia sáng laser. C u t o c a m t máy t

ng pháp

ng

c ánh d u

n này phát sáng khi i qua m t chùm

ng gi i trình t g m hai ph n chính y u, ó

là: ph n i n di v i gel polyacrylamide và ph n phát hi n các v ch i n di. Ph n i n

M t c m quang

Tia
LASER

A G C T T A C G G A C T A A TGC
Màu 1
Màu 2

Máy tính

Màu 3
Màu 4

Hình 41: S

kh i m t máy t
ng gi i trình t dùng b n gel polyacrylamide. Máy g m hai ph n: ph n
i n di gel polyacrylamide, ph n phát hi n các v ch i n di. Các v ch i n di
c các con m t c m
c m t c m quang truy n v
quang phát hi n khi i qua chùm tia laser và phát sáng lên. Tín hi u
máy tính
hi n th thành các nh c ng
sáng

83


di polyacrylamide có th là m t b n gel hay là m t ng mao qu n ch a gel. Ph n phát
hi n v ch i n di là nh ng con m t c m quang và m t chùm tia laser i qua tr
Nguyên t c ho t

c nó.

ng c a máy là trong su t quá trình i n di, m i khi có m t v ch

i n di i qua chùm tia laser thì v ch i n di s phát sáng lên và s phát sáng này s
c con m t c m quang
CATACGTGG CCTTACG
GGAATGC

ghi nh n và l u l i thành
m t

nh c


ng

trong bi u
c a các

sáng
thêm
dNTP, DNA
polymerase,
ddATP, ddTTP,
ddGTP, ddCTP

. T bi u
nh c

ng

CGTAAGGCCdA
❈●❚  ●●❈❈❞ 
CGTAAGGCdC
❈●❚  ●●❈❞❈
CGTAAGGCCACdG
❈●❚  ●●❈❈ ❈❞●
CGTAAGGCCACGTdA
❈●❚  ●●❈❈ ❈●❚❞ 
CGTAAGGdC
❈●❚  ●●❞❈
CGTAAGGCCACGTA TdG
❈●❚  ●●❈❈ ❈●❚ 


sáng này, máy s so dòng
c a các

nh t

v i các màu

ng

ng

cu i cùng

CGTAAGGCCAdC
CGTAAGGCCACGdT
CGTAAGGCCACGTAdT

phân tích thành trình t
c a o n DNA (hình 41).
V i các máy th h
m i sau này, ng
th

i ta có

dùng 4 màu hu nh

quang khác nhau


ánh

d u 4 lo i ddNTP, nh v y
ph n ng gi i trình t có
th

th c hi n

c ch

*CGTAAGGCCACGTA TdG
*CGTAAGGCCACGTAdT
*CGTAAGGCCACGTdA
*CGTAAGGCCACGdT
*CGTAAGGCCACdG
*CGTAAGGCCAdC
*CGTAAGGCCdA
*CGTAAGGCdC
*CGTAAGGdC

Chi u i n di

Hình 42: V i các ddNTP ánh d u hùynh quang khác nhau, các an
trình t t n cùng
u 5 s
c ánh d u b ng 4 màu
hùynh quang khác nhau t ng ng v i nuleotide t n là A,
hay T, hay C hay G. Chính nh v y không c n ph i th c
hi n ph n ng gi i trình t trong 4 ng ph n ng.


trong m t ng nghi m và
khi gi i trình t ch c n i n di trên m t hàng mà không c n ph i trên 4 hàng khác nhau
nh tr

c ây (hình 42). N u dùng di n di mao qu n thì tùy thu c vào s mao qu n có

th ch y m t l n mà ng
hay ít. Hình 43 là s

i làm thí nghi m có th có s m u cho m i l n ch y nhi u
kh i minh h a cho m t gi i trình t 8 mao qu n (CEQ8000,

hay CEQ8800). Tùy thu c vào qui mô c a phòng thí nghi m cùng v i s m u gi i
trình t mà phòng thí nghi m có th trang b gi i trình t ít hay nhi u mao qu n. Ví d
v i ABI thì có nhi u lo i: ch 1 mao qu n, 4 mao qu n, 16 mao qu n, 48 mao qu n, r i
96 mao qu n. Phòng thí nghi m R&D c a công ty Nam Khoa tr

c ây nhu c u gi i

trình t không nhi u nên ch trang b CEQ8000 có 8 mao qu n (hình 44). Nh ng nay
84


do nhu c u nghiên c u và d ch v ngày càng nhi u nên ã trang b thêm ABI 3130XL
có

n 16 mao qu n (hình 44).
Các th h máy v sau ngày càng có nh ng ch

có th hi n th t


ng trình i kèm

ch ng nh ng

ng các ký t hoá h c c a trình t DNA mà còn giúp các nhà nghiên

c u có th : (1) Phát hi n các chi ti t c n thi t trên trình t nh mã kh i
thúc, vùng

c m (ORF: Open Reading Frame), trình t

u, mã k t

c hi u cho các enzyme c t

gi i h n (restriction enzyme), các d u n di truy n...mà các chi ti t này r t c n thi t
l pb n

gen...(2) Phiên d ch trình t trong vùng

ngh a) thành trình t acid amin c a m t protein, nh
hay làm c s ban

u

hi u

c m (t c là vùng trình t có ý
ó có th xác


c ch c n ng c a gen...(3) T

nh, ph ng oán,
ng so sánh trình t

DNA trong thí nghi m hay
m t trình t

DNA n p vào

máy, hay có th trình t acid

C m
quang

amin c a protein, v i các
trình t khác ã có trong ngân
hàng d
cs t
t

li u

phát hi n

ng

ng v i trình


ã bi t, nh
xác

Mao
qu n

✂C ❝c [-]

ó làm c s

Laser

nh gen và ch c n ng
i n th cao

gen...

Hình 43: S

kh i m t máy di n di mao qu n dùng gi i trình t DNA

Hình 44✿ Máy gi i trình t CEQ8000 có 8 mao qu n c a Becman Coulter và ABI 3130XL có 16 mao qu n
c trang b t i phòng thí nghi m R&D c a công ty Nam Khoa
c a Applied Biosystem

✽✁


PCR là công c giúp hoàn thi n và m r ng ph áp d ng k thu t gi i trình t
PCR ã óng góp r t nhi u vào công ngh gi i trình t làm cho công ngh gi i trình t

ngày càng d dàng h n và thu n ti n h n. Không ch v y PCR còn làm cho gi i trình t
có nhi u ng d ng h n không ch trong nghiên c u mà c trong ch n oán n a.
Tr

c khi có PCR thì ng

i ta ch có th gi i trình t các o n gene

chèn vào plasmid vì ch có nh v y thì m i có th nhân b n
trình t thành nhi u b n sao v i s l

ng

ch y

c cô l p và

c o n gene mu n gi i

c ph n ng gi i trình t . Ngoài

ra, enzyme polymerase c ng là lo i enzyme không ch u nhi t nên ph n ng gi i trình t
ch th c hi n

37oC, do v y mà v n

t i u các thành ph n c a ph n ng r t là khó

ng th i hi u qu c a ph n ng gi i trình t c ng không cao.
T khi có s ra

r tv

i c a k thu t PCR thì k thu t gi i trình t c ng có nh ng ti n b

t b c. Ch c n dùng PCR là có th nhân b n o n gene mu n gi i trình t thành

hàng t b n sao hoàn toàn gi ng h t nhau và s n ph m khu ch

i này có th

a vào

gi i trình t tr c ti p mà không c n ph i chèn vào m t plasmid gi i trình t n a. S phát
minh ra k thu t nhân b n DNA trong ng nghi m b ng PCR c ng giúp cho vi c c i ti n
ph n ng gi i trình t kém hi u qu tr
polymerase gi i trình t b n v i nhi t

c ây tr nên hi u qu h n nh áp d ng enzyme
ph n ng gi i trình t

c th c hi n qua các

chu k nhi t gi ng h t PCR, mà ngày nay chúng ta g i là ph n ng chu k nhi t gi i trình
t . V i ph n ng chu k nhi t gi i trình t thì hi u qu ph n ng t t h n r t nhi u,

ng

th i t i u hóa các thành ph n c a ph n ng c ng d dàng h n r t nhi u. Có th nói
chính s ra


i và hoàn thi n k thu t PCR ã giúp t ng t c k thu t gi i trình t không

nh ng trong v n

hoàn thi n nó, mà c trong v n

Gi i trình t b gene ng
1.

ph m vi áp d ng.

i

Làm th nào gi i trình t b gene ng
Gi i trình t b gen ng

i

i t c là gi i trình t toàn b th t s p x p các nucleotide

A, T, C, và G c a DNA trong 23 c p nhi m s c th t bào ng
gen ng

i

c Ti n S James Watson, cha

gi a th p niên 1980.

i. D án gi i trình t b


c a phát hi n c u trúc DNA,

n tháng 10 n m 1990, d án

c ra

ra t

i v i kinh phí 3 t M

kim do HGP (Human Genome Project) c a Vi n Qu c Gia Y T Hoa K lãnh
cùng v i s tham gia c a nhi u trung tâm nghiên c u b gen ng
✄☎

o

i c a nhi u qu c gia


trên th gi i. Do tiên oán giá tr kinh t mang l i t vi c gi i mã thành công b gen
ng

i s r t l n, nên ã có m t s công ty sinh h c chuyên v b gen ng

i ã

c

hình thành. S nh p cu c c a các công ty t nhân này ã t o nên m t b u không khí thi

ua cho vi c khai phá bí m t v b gen c a loài ng
ngày

n ích càng c c k ngo n m c. Trong cu c ch y ua này, nh
ng pháp c c k

ph

i chúng ta, càng g n

n nh ng

ã áp d ng m t

c áo k t h p gi a công ngh PCR, công ngh gi i trình t

DNA v i công ngh tin h c, nên ch v i kinh phí kho ng 200 tri u m kim, Ti n S
Crag Venter c a Celera Genomics tr thành ng
gi i trình t

c g n nh hoàn toàn b gen ng

id n

u thành công nh t trong vi c

i.

Cái khó kh n c a vi c gi i trình t b gene ng


i là không th nào tách t ng

phân t DNA c a t ng nhi m s c th r i em gi i trình t

i

i phân t DNA nguyên

v n này. Các nhà khoa h c c a HGP c ng nh các trung tâm khác trên th gi i nghiên
c u v b gen ng

i th

h

di truy n, r i em gi i trình t các o n c t DNA này, và cu i cùng

ng theo b n

ng c t các

i phân t DNA c a nhi m s c th m t cách

tìm cách ghép n i chúng l i v i nhau cho úng v trí c a chúng trên

nh

i phân t DNA.

ng pháp này òi h i ph i t n nhi u th i gian và công s c vì có nhi u khi các o n


Ph

c t DNA quá l n, r t khó gi i trình t c ng nh khó cho k t qu gi i trình t chính xác.
Do ó, v i m i m t o n DNA các nhà khoa h c ph i th c hi n gi i trình t ít nh t là
7l n

mb o

l p l i. Chính vì v y, v i cách ti p c n này, nhi u v trí trên các

i phân t DNA v n không th gi i trình t

c mà t

ó các nhà khoa h c c a HGP

có th hoàn t t vi c x p úng v trí các o n DNA ã gi i trình t trên

i phân t

DNA c a nhi m s c th .
Ti n s Crag Venter ã th c hi n m t ph
cách hoàn toàn khác h n (hình 45). Tr
s c th t bào ng

ng pháp gi i trình t b gen ng

c h t ông cho tách chi t toàn b DNA nhi m


i r i phá bung m t cách không

thành các m nh DNA nh h n.

im t

nh h

ng các

i phân t DNA

em gi i trình t t t c các m nh DNA nh này. Cu i

cùng dùng nh ng máy i n toán c c m nh mà ông ã h p tác v i công ty ABI ch t o
ra, dò tìm các
c a chúng trên

u trùng l p c a các m nh DNA nh này

l p n i vào úng các v trí

i phân t DNA c a nhi m s c th . Chính nh áp d ng chi n l

c gi i

trình t này mà Celera Genomics ã gi i trình t r t nhanh các m nh DNA, ch c n l p
l i cho m i m nh DNA có 5 l n, và ã x p úng g n nh h u h t v trí c a các m nh
✆✝



DNA ã gi i trình t trên

i phân t DNA c a nhi m s c th . H n th n a, TS. Crag

Venter c ng tuyên b công ty ã tri n khai m t k thu t m i có th làm cho ph
pháp gi i trình t b gen c a công ty, v n d

ã là ph

ng

ng pháp nhanh nh t r i, tr

thành nhanh h n n a. Cu i n m 2000, Celera Genomics ã hoàn thành vi c gi i trình
t b gen c a chu t v i 2.3 t
gen ng

ký t hóa h c! trong ó có r t nhi u t

ng

ng v i b

i, nh v y s giúp các nhà khoa h c d dàng h n trong vi c truy tìm các ch c

n ng c a các gen.
2.

K t qu gi i trình t b gene ng


i

Sau g n 10 n m nghiên c u
th c hi n v i nh ng n m càng v
sau càng sôi

❉◆✟ t

ng không khí thi

mhi m s c th
c phá bung thành
nhi u mãnh nh

ua do s nh p cu c c a các công
ty t nhân, ngày 26 tháng 6 n m
2000, t i Tòa B ch

c v i s

Các mãnh DNA nh
c gi i trình t

hi n di n c a T ng Th ng Hoa

cag

K Bill Clinton, hai khoa h c gia
M là Ti n S Crag Venter


Francis Collins

Institute of Health) công b m t
cách long tr ng là ch
gi i trình t
hoàn t t.

b

i

c ag c

g a g a ca g c
g gag
c ca gc a t
g
g
g g cggc g ga ca
cc a g c
ca g g ca t t t
tgtac
c g a g cg g c g g
g a g a c a gc
g a g t g ag
t cc a c
t
a
t

g
g
c
ggc g g a g ca
c gagc g g c

ccgtcaaccggagtta

ng trình

gen ng

a gc

Các mãnh DNA nh
c ch ng trình phân tích
t
ng tìm các u trùng l p, nh
ó tái hi n
c trình t c a i phân t DNA

i di n cho

Project) c a NIH (NIH: National

g g a g ca g

c g a g c g g cg g

i


HGP (HGP: Human Genome

g g cggc
t t t cc

g a ga
g gag
c ca gc a t

di n cho Celera Genomic và Ti n
S

g ca

ã

acgttct

ây chính là m t th i

kh c l ch s c c k quan tr ng và
áng nh c a nhân lo i, ánh d u
ngày nhân lo i ã có trong tay
m tb n
b

sinh h c c n thi t

c vào k


nguyên m i v i

nhi u h a h n các thành t u v

Hình 45✠

€✡ ♥❣ pháp gi

i trình t b gen ng i c a công ty Celera
Genomics: tr c h t tách chi t toàn b DNA c a nhi m s c
th t bào ng i, sau ó phá tung DNA thành các m nh nh ,
gi i trình t t t c các m nh nh này, cu i cùng nh ch ng
trình vi tính c c m nh
n i k t các o n DAN nh này l i
v i nhau b ng cách dò tìm các u trùng l p nh v y tái hi n
c m ch DNA nguyên th y

✞✞


i v sinh y h c trong t

ng lai. Dù thành công c a các nhà khoa h c gi i trình t

c 3.1 t các ký t hóa h c! làm nên b gen ng
con ng

ib


c ví nh s ki n l ch s

c lên m t tr ng (ngày 26 tháng 7 n m 1969, t khoang

Apollo, Neil Armstrong b
ng

i ã

i th c hi n

c xu ng i d o trên m t tr ng và ánh d u th i i m con

c hoàn toàn

cm

ã t ng ao

c b y lâu: kh c d u chân mình

trên b m t ch H ng), nh ng ây ch a ph i là th i i m mà con ng
c

c m hi u bi t t

Th t s cho

ng t n


òi h i ph i t 1

i ã to i nguy n

c b gen c a mình.

n th i i m ó các nhà khoa h c

còn ch a gi i trình t

b phi thuy n

c 3% b gen ng

Công ty Celera Genomic hãy

i, t c kho ng 150 tri u, và công vi c này

n 2 n m n a m i có th hoàn t t vì 3% còn l i này n m trên ph n

khó gi i trình t nh t. Còn HGP thì thành công ít h n, hãy còn nhi u o n trình t c a
b gen mà các nhà khoa h c c a HGP ch a gi i
gi i

c và c ng có nhi u o n trình t

ã

c nh ng h v n ch a s p x p vào úng v trí. Ngoài ra, cho dù các nhà khoa


h c có gi i trình t

c m t cách tr n v n b gen con ng

s ng (the book of life) này hãy còn ch a

c

i, thì cu n sách c a

i

c, nh Gerald Rubin, Phó Giám

c

Nghiên C u Y Sinh H c c a Vi n Y H c Howard Hughes gi i thích: Cu n sách

c

vi t b ng m t ngo i ng r t ph c t p, c n ph i có m t th i gian dài chúng ta m i hi u
c!. Th t v y, có th t

ng t

ng là n u các trình t c a b gen ng

i

c in ra


thành sách thì s c n ph i kho ng 200 cu n và m i cu n dày ph i 500 trang. Có 3000
trang n m r i rác trong 200 cu n sách trên là có ý ngh a t c là có gen, mà cho
nay ch m i có m t s ít trang trong 3 ngàn trang này là khoa h c ã
xác

nh

c

n hi n
c t c là

c gen. Hãy còn vài trang (kho ng 3%) ch a vi t xong và nh ng trang này

là nh ng trang khó vi t nh t vì thu c nh ng vùng khó gi i trình t nh t trong b gen
ng

i.
Cho

n tháng 4 n m 2003, các trang khuy t này ã

hoàn t t. Tuy v y, m t vi c r t l n hi n ang
ph i xác

t ra tr

c các nhà khoa h c vi t


c m t các nhà khoa h c ó là

nh

c các trình t nào là gen và ch c n ng c a các gen này. Ch có 3%

c a b gen ng

i là mang gen t c là mang trình t có ý ngh a và hi n nay các nhà khoa

h c c ng ch a bi t chính xác là th t s có bao nhiêu gen trong b gen ng
l i ph ng ch ng nh t là t 28.000

i. Câu tr

n 140.000 gen, và g n ây nh t có l là ang g n

n con s chính xác h n, ó là 30.000 gen. Trong kho ng 30.000 gen này, các nhà
☛☞


khoa h c hi n ch bi t

c ch c n ng c a kho ng 10.000 gen, hãy còn 20.000 ch a

bi t ch c n ng c a chúng.

ây chính là m t cu c ua m i c ng h a h n

y sôi


ng

vì k t qu t ng ch ng m t c a cu c ua, t c k t qu c a vi c xác

nh

c a t ng gen,

y tri n v ng trong

u h a h n nh ng áp d ng c c k ngo n m c và

c chúc n ng

sinh h c c ng nh y h c.
Gi i trình t b gene ng

3.

i cu c ua ch a k t thúc

Gen chính là trình t các nucleotide trong chu i DNA ch huy
m t protein. Chính vì v y xác

nh

c s t ng h p

c ch c n ng c a m t gen t c là xác


nh

c

protein mà gen t ng h p có c u trúc nh th nào và có nhi m v gì trong c th s ng.
Sau k t qu gi i trình t b gen ng
l

c

i, hi n nay các nhà khoa h c ang có nhi u chi n

có th nhanh chóng phát

hi n ch c n ng c a các gen trong
b gen ng

i. Chúng tôi xin trình

bày ra ây ba trong s nh ng chi n
l

✍ù✎✏ PCR

t ng
h p các gen

Clone vào các
vector


c ó.
(1) Nh k t qu gi i trình t

b gen ng

i, các nhà khoa h c s

nhanh chóng xác

a vào các
h th ng t
bào bi u hi n

nh các trình t

mang gen. V i các k thu t sinh
h c phân t hi n

i nh k thu t

L p th vi n
protein

PCR, các nhà khoa h c s d dàng
nhân b n các gen này trong

ng

Th nghi m trên các

lo i t bào ích

nghi m r i dòng hóa chúng vào các
vect
bi u hi n

sau ó nh các h t bào
bi u hi n các protein.

V i cách này các nhà khoa h c s
nhanh chóng thành l p

c m t

Hình 46: Chi n l c t o th vi n protein
ò tìm ch c n ng
c a gen, tóm t t là t gen t ng h p các protein, tr
trong th vi n protein, r i th trên các h th ng t bào
ích
phát hi n ch c n ng c a protein, t
ó bi t
c ch ng n ng c a gen.

th vi n các protein c a các gen có trong b gen ng

i. V n

nh các protein trong th vi n protein là có ch c n ng gì?

ti p theo là ph i xác

bi t

c ch c n ng c a

protein trong th vi n, các nhà khoa h c s th nghi m các protein này h th ng các
lo i nuôi c y t bào

tìm hi u m i giao ti p gi a protein th nghi m v i t bào ích,
✾✌


nh

ó xác

bi t

nh t bào ích nào có ph n ng v i protein th nghi m, và nh v y s

c ch c n ng protein

bi t

(2) Gi i trình t b gen c a

ng v t h u nh

nh dã nhân (r t gi ng b gen ng
ây là nh ng b gen c a các
t


ng

ng v i b gen ng

c ch c n ng c a gen. (hình 46).

i) hay chu t,

ng v t có nhi u

i, nh ng l i trên các

ng v t mà các nhà khoa h c r t d làm thí
nghi m. Trên b gen

ng v t này, các nhà khoa

h c s d dàng phát hi n các gen, và các ch c n ng
c a gen thông qua s thay
m t tính tr ng nào ó c a

i ho c bi u hi n c a
ng v t thí nghi m m t

khi các nhà nghiên c u dùng các k thu t sinh h c
phân t gây

Hình 47✓ Hình d ng c a phân t kháng th
c vi tính hóa


t bi n hay làm knock-out ngay trên nh ng vùng mang gen c a b gen.

M t khi ã xác

nh

c gen và ch c n ng c a m t gen trên

ng v t thí nghi m, các

nhà nghiên c u s d dàng truy t m và phát hi n gen và ch c n ng c a gen này trên b
gen ng

i nh phát hi n s t

ng

ng v trình t trong gen ng

i v i gen c a

ng

v t thí nghi m.
(3) Chúng ta bi t r ng m t protein

c t ng h p t gen ho t

ng nh m t vai trò


c u trúc ho c vai trò ch c n ng là nh hình dáng c a nó v i các h c nh hay các n p
g p. Chính vì v y cho nên dù m t gen có
thì c ng ch a th xác

nh

c gi i mã và bi u hi n

c m t protein,

c ch c n ng c a protein này n u ch a bi t

c các

hình dáng c a nó. Chính vì v y mà Vi n Qu c Gia Khoa H c Y Khoa T ng Quát t i
Hoa K

ang chi m t kho ng 20 tri u ô la

thành l p các trung tâm Proteomics, là

các trung tâm chuyên nghiên c u và l u tr các c u trúc và hình dáng

c vi tính hóa

(hình 47) c a các protein có trong thiên nhiên. Các vi n Proteomics nh v y c ng
ang và s thành l p t i các n

c khác. Các nhà khoa h c hy v ng r ng trong vòng 10


n m t i ây, các vi n proteomics s l u tr

c hình dáng c a g n 10.000 protein có

trong thiên nhiên. Con s này dù hãy còn r t nh so v i m t s l

ng khá l n các

protein th c s có trong thiên nhiên, nh ng các nhà khoa h c c ng hy v ng r ng th
vi n này

s c bao g m t t c hình d ng c a t t c các protein có liên quan

n sinh

h c và y h c, vì các protein khác không có trong danh sách c ng ch là các bi n th hay
✑✒


các

ng d ng v i các protein có trong danh sách mà thôi. Nh

các trung tâm

proteomics và th vi n các hình d ng protein, các nhà nghiên c u ch c ch n s d dàng
h n trong xác

nh các ch c n ng c a gen.


Vi t Nam có th tham gia vào cu c ua này không?

4.

Hi n nay các nhà khoa h c ang c g ng nghiên c u khai phá các bí m t trong
cu n sách

i s ng ghi chép

y

trình t b gen ng

i v i nhi u tri n v ng s có

các ng d ng cách m ng trong sinh h c, y h c, c ng nh các l nh v c khoa h c khác
và s

a

n nhi u ti n b m i cho loài ng

i trong k nguyên m i này. Các nhà y-

sinh h c c a chúng ta hoàn toàn có th tham gia trong cu c ua này, vì theo chúng tôi
thì sinh h c phân t

i v i các qu c gia thu nh p th p có th coi nh là m t ngành


khoa h c ti u th công nghi p hi n
ph i có các máy móc c c k hi n
thu t b ng các thi t b không quá
thu t d a trên các ki n th c hi n
vào kho tàng ki n th c hi n

i. Ti u th công nghi p vì không nh t thi t

i và t n kém mà v n có th th c hi n
t ti n. Hi n

i vì nhà nghiên c u th c hi n k

i v i các k t qu hoàn toàn có th có óng góp l n

i c a nhân lo i. V n

b nh th nào và ph i có chi n l

c các k

chính là chúng ta ph i có chu n

c tham gia vào cu c ua nh th nào.

chu n b , quan tr ng nh t là chúng ta ph i c g ng xây d ng và ào t o trong
c ng nh ngoài n

c


i ng các nhà nghiên c u y sinh h c có trình

và b n l nh

ngang t m v i th gi i. Các nhà nghiên c u c a chúng ta không ch ph i có ki n th c
và k n ng v chuyên môn sinh-y h c mà còn ph i có kh n ng ti p c n

khai thác

c kho tàng ki n th c c ng nh các d li u ngày càng c p nh t trên m ng internet.
Ngoài ra, chúng ta ph i tránh tình tr ng ào t o các nhà nghiên c u nh ng l i không
chu n b cho h các i u ki n c ng nh ph
i u ki n c ng nh ph
trình

và b n l nh

ng ti n làm vi c. Chính vì s thi u th n

ng ti n làm vi c mà các nhà nghiên c u c a chúng ta dù có

n âu c ng s thui ch t d n nhi t huy t c ng nh kh n ng theo

th i gian, và d n d n tình tr ng ch y máu ch t xám trong c ng nh ngoài n

c s

không th tránh kh i.
V chi n l


c, thì có l chúng ta c ng c g ng tham gia cu c ua v i nh ng ích

nh m là gi i quy t và khai thác nh ng
c u c ch

m c

c thù trong n

sinh h c phân t tác

ng c a các d

c. Ch n h n khai thác nghiên
c li u trong n

xây d ng các mô hình thí nghi m ex-vivo trên các c y t bào
✔✕

c b ng cách

phát hi n s c m ng


bi u hi n gen khi cho các h th ng nuôi c y t bào này ti p c n v i các trích phân c a
d

c li u. Phát hi n các c ch tác

ch n chúng ta s khai thác

n

ng c a d

c các ngu n d

c li u

m c

sinh h c phân t , ch c

c li u quí mà chúng ta v n có s n trong

c. Ngoài ra, dân t c Vi t c a chúng ta là m t dân t c khá thu n nh t, bên c nh ó

chúng ta c ng có nh ng dân t c ít ng

i s ng r t t p trung và ch a h b lai tr n, ây

chính là c s cho các nghiên c u v s phân b các gen c ng nh các mã di truy n
cho các nghiên c u ng d ng sau này

phát hi n, ch a tr ho c phòng ng a các b nh

lý di truy n.
Nhân lo i ang b
v

tb c


c vào thiên niên k 21 v i hành trang mang theo là các ti n b

nhi u l nh v c khoa h c khác nhau, trong ó có khoa h c Y h c và Sinh

h c. M t hành trang c n y u nh t cho m t cu c s ng d dàng h n và t t
cu n sách c a

i s ng v i h u nh toàn b trình t c a b gen ng

p h n là

i mà các nhà khoa

h c m i v a k p hoàn t t. Vi c khai thác cu n c m nang sinh h c c n y u nh t này c a
nhân lo i òi h i m t s h p tác a ngành c ng nh chuyên ngành. Chính vì v y nên
chúng tôi cho r ng chúng ta c ng không th b qua y u t h p tác và h c h i: chúng ta
ph i h p tác và h c h i t b n bè qu c t , và quan tr ng nh t là ph i bi t h c h i và
bi t h p tác gi a chúng ta v i nhau.
ng d ng công ngh gi i trình t t i phòng thí nghi m NK-Biotek
Phòng thí nghi m NK-Biotek và

n v R&D c a công ty Nam Khoa ã ng d ng khá

thành công k thu t gi i trình t vào các d ch v ch n oán và nghiên c u. D

i ây xin

a ra m t s thành t u tiêu bi u.
1.


ng d ng k thu t PCR và gi i trình t
Nh phát hi n

khu ch

i

c m t c p m i mà sau ó

nh danh vi khu n
c

t tên là

NK

16s-F và

NK

16s-R

c o n DNA dài 527 bps ch a các trình t giúp phân bi t gi ng và loài

các vi khu n, phòng thí nghi m NK-Biotek và

n v R&D c a công ty Nam Khoa ã

xây d ng thành công qui trình PCR cho gene 16s rDNA và qui trình gi i trình t tr c

ti p s n ph m PCR này
nghi m NK-Biotek và

nh danh vi khu n. Thành công này ã giúp phòng thí
n v R&D c a Nan Khoa th c hi n

trong các xét nghi m d ch v và nghiên c u

✖✗

c khá nhi u ng d ng


a.

ng d ng trong xét nghi m vi sinh lâm sàng

nh danh vi khu n k khí

Vi khu n k khí là các vi khu n ch có th t ng tr

ng trong i u ki n khí tr

không có oxygene phân t (O2). Vi khu n k khí có th là các vi khu n có l i

ng
cs

d ng trong công ngh vi sinh, tuy nhiên v m t y h c r t có nhi u loài vi khu n k khí
là các tác nhân nhi m khu n n i sinh hay ngo i sinh. B nh lý nhi m khu n k khí r t a

d ng, t các nhi m khu n t i ch k t h p v i các vi khu n không k khí, hay các nhi m
khu n h th ng, hay các nhi m khu n

c hi u. Do a d ng nh v y nên vi c xác

nh

m t nhi m khu n k khí v m t lâm sàng không ph i d dàng. Trong khi ó xét nghi m
vi sinh lâm sàng t i các phòng thí nghi m th

ng b h n xét nghi m vi khu n k khí vì

g p ph i nhi u tr ng i v k thu t nh là: (1) Có
ph m sao cho gi

c b nh ph m luôn

thí nghi m. (2) T o khí tr
b nh ph m. (3)

ng k khí

nh danh cho

c ph

ng ti n chuyên ch b nh

i u ki n k khí cho


n khi

n

c phòng

nuôi c y phân l p

c vi khu n k khí t các

c vi khu n k khí. (4) Làm

c kháng sinh

vi

khu n k khí.
Trong các tr ng i trên, tr ng i khó gi i quy t nh t là v n
k khí phân l p

nh danh vi khu n

c t các b nh ph m. Có nhi u b th nghi m nh API 20A c a Bio-

Merieux, RapIDTM ANA II c a Oxoid, PRAS II (Scott), AN Ident (Analytab), ANA
card (Vitek)...có s n trên th tr

ng

cho các phòng thí nghi m chuyên dùng cho


nh

danh vi khu n k khí. Tuy nhiên các b th nghi m này khó có s n t i Vi t Nam vì nhu
c u không nhi u. H n n a các b th nghi m này c ng có nhi u h n ch nh t l
danh sai khá cao (19%
th

nh danh

i v i RapIDTM ANA II), t l không

i v i API 20A, 10%

i v i RapIDTM ANA II, 29%

n loài c ng nhi u (38%

nh

i v i API

20A).
Chính vì v y nên

có th th c hi n

k khí, phòng thí nghi m NK-Biotek và

c xét nghi m vi sinh lâm sàng vi khu n

n v R&D c a công ty Nam Khoa ã tri n

khai m t gi i pháp toàn di n, bao g m ch t o
có th gi b nh ph m
thi t

ng chuyên ch CaryBac

i u ki n k khí trong th i gian 24 gi h n c th i gian c n

chuy n m u t lâm sàng

t o khí tr

c môi tr

n phòng thí nghi m, s d ng n

nh ph

ng k khí b ng các túi Anaerocult A c a Merck, th c hi n

vi khu n k khí b ng b th nghi m kháng sinh
c u và thi t k ra. Trong

k khí do

ng ti n

c kháng sinh


n v R&D nghiên

nh danh vi khu n k khí, phòng thí nghi m NK-Biotek và
✘✙


n v R&D c a công ty Nam Khoa ã

a ra m t ti p c n hoàn toàn m i và hi n

nh ng l i ít t n kém nh t, ó là gi i pháp gi i trình t m t o n ch a trình t

i,

c hi u

gi ng và loài n m trong gene 16S c a vi khu n.
Có th tóm t t qui trình nh sau: Vi khu n m c trên h p th ch phân l p
vào n

c mu i sinh lý vô khu n

trong 10 phút.

t

c 0.5

1 McF. Sau ó un cách th y sôi


ngu i r i ly tâm 13.000RPM trong 5#. L y 5 l d ch n i cho vào PCR

mix 45 l ch a s n các thành ph n k c c p m i
DNA dài 527 bps ch a trình t

NK

16s-F và NK16s-R khu ch

i o n

c hi u loài trên gene 16S c a vi khu n. Ch y ch

trình nhi t PCR g m 1 chu k 95oC/5#

ng

kích ho t enzyme hot start Taq polymerase,

r i 40 chu k 94oC/15 -60oC/30!-72oC/1#. S n ph m PCR sau ó
b

cg t

c tinh s ch b ng

Wizard SV Gel and PCR clean-up Sytem! c a Promega. S n ph m tinh s ch

i n di trên th ch và sau ó

ó

c

nh l

Ch

ng b ng quang ph GenQuant c a Pharmacia, sau

a vào ph n ng gi i trình t 2 chi u s d ng m i xuôi và m i ng

PCR th c hi n trên b thu c th

c

cc a

DTCS cycle sequencing kit! c a Becman Coulter.

ng trình luân nhi t c a ph n ng gi i trình t v i b thu c th trên là 30 chu k

96oC/20!-50oC/20!-60oC/4#. S n ph m c a ph n
ethanol, r i sau ó
qu gi i trình t

ng gi i trình t

c t a b ng


c ch y i n di gi i trình t trên máy gi i trình t CEQ8000. K t
c so chu i b ng ch

ng trình blast search trên ngân hàng d li u

gene c a NCBI. T k t qu so chu i, chúng ta s có
Sau này, v i các trang b thêm nh

c k t qu

nh danh vi khu n.

i n di b ng DNA chip c a Bio-analyzer và máy

gi i trình t ABI 3130XL 16 capillary, qui trình c a ph n ng gi i trình t và i n di
gi i trình t c ng ã

c nghiên c u

thay vì i n di trên gel r i
i n di và

nh l

nh l

t

ng thích v i các trang b này. C th là


ng b ng quang ph 260/280 thì k t h p c hai b ng

ng trên Bio-analyzer DNA chip c a Agilent; thay vì dùng DTCS

là ph n ng gi i trình t thì dùng BigDye Terminator V. 3.1 Cycle Sequencing kit!
c a ABI v i ch
o

ng trình luân nhi t c a ph n ng gi i trình t là tr
o

o

c h t 1 chu k

o

96 C/1#, theo sau 25 chu k 96 C/10!-50 C/5!-60 C/4#. S n ph m c a ph n ng gi i
trình t sau khi t a b ng ethanol,

c ch y i n di gi i trình t trên máy gi i trình t

ABI 3130XL v i gel POP 7 và mao qu n 50cm. Hình 48 là m t k t qu

nh danh

b ng gi i trình t 16s rDNA vi khu n k khí phân l p t m u m xoang c a b nh nhân.
Phòng thí nghi m NK biotek ã áp d ng ti p c n này trong n m 2008 cho xét nghi m
✚✛



vi sinh lâm sàng vi khu n k khí v i các m u b nh ph m là 39 m u m xoang l y t
b nh nhân b viêm xoang m n tính. K t qu xét nghi m cho th y có 31% (18/59) c y ra
tác nhân vi khu n k khí và k t qu

nh danh b ng ph

ng pháp gi i trình t 16s

rDNA cho th y có 11% (2/18) Veillonella (c u khu n Gram -), 17% (3/18) Prevotella
buccae (tr c khu n Gram -), 22% (4/18) là Propionibacterium acnes, 6% (1/18) là
Streptococcus aginosus, 17% (3/18) là Streptococcus constellatus, 17% (3/18) là
Streptococcus gordonii, 6% (1/18) là Peptostreptococcus micros, và 6% (1/18) là
Peptostreptococcus stomatis. K t qu này cho th y PCR và gi i trình t 16s rDNA là
m t gi i pháp k thu t hoàn toàn có th s d ng
quy t

nh danh vi khu n k khí, gi i

c khâu k thu t ph c t p và khó kh n nh t trong qui trình xét nghi m vi sinh

lâm sàng vi khu n k khí.

Hình 48✣ K t qu gi i trình t 16s rDNA tr c khu n Gram [+] phân l p k khí t
nhân cho phép k t lu n ây là Propionibacterium acnes

b.

Phát hi n ch t l


ng các s n ph m probiotic cho ng

Probiotic chính là các vi sinh v t không gây b nh,
sinh qua

ng n hay u ng s d ng trên ng

b nh ph m m xoang l y t

i và cho th y s n
c dùng làm s n ph m tr

i, gia súc, hay th y s n

phát huy hi u

qu ch ng l i các nhi m trùng nh các c ch nh c nh tranh ch t dinh d
✜✢

b nh

ng và ch


bám c a vi sinh v t gây b nh, ph c h i vi khu n chí bình th
tr

ng, kích thích h th ng mi n d ch không

ng cho ru t hay cho môi


c hi u c a c th v t ch ch ng l i vi

sinh v t gây b nh, hay ti t ra các ch t có tính kháng sinh kháng

c các vi sinh v t

gây b nh.
Các vi khu n th

ng

c dùng làm probiotic là Bacillus subtilis, Lactobacillus

acidophilus, Bifidobacterium...và th

ng

c cung c p d

i d ng b t ghi hàm l

và các lo i vi khu n có trong s n ph m. Do các vi khu n này th
m c nên ch v i các ph
th

c

ng nuôi c y thông


c các s n ph m probiotic nên hi n nay trên th tr

chúng ta xu t hi n khá nhi u s n ph m probiotic
và ngoài n

ng là các vi khu n d

ng ti n phòng thí nghi m và các môi tr

ng là có th s n xu t

mà nhi u ng

i. Chính vì

i r t quan tâm, ó là li u ch t l

c a các s n ph m probiotic hi n ang có m t trong th tr
s n xu t công b hay không,

ng c a

c s n xu t t r t nhi u c s trong

s d ng không ch cho gia súc, th y s n mà c cho ng

tình tr ng này nên có m t v n

ng


c bi t là li u các vi khu n

ng có th t s

ng

úng nh nhà

c ghi trong nhãn hi u s n

ph m có úng là vi khu n có trong s n ph m hay không, và hàm l

ng có

mb o

úng nh v y hay không.
tr l i câu h i trên, trong n m 2008 phòng thí nghi m NK-Biotek và b ph n
R&D c a Nam Khoa ã h
dung tìm hi u ch t l

khó, ch c n th c hi n c y
láng trên b m t môi tr
nh l

ng.

ki m tra hàm l

nh l


ng b ng ph

ng dinh d

ng và

ng chính xác hàm l

ph i ki m tra. Tuy nhiên
úng nh tên

tài t t nghi p lu n v n Th c S có n i

ng các s n ph m probiotic dùng cho ng

ang l u thông trên th tr

k t qu

ng d n m t s

xác

i và th y s n hi n

ng thì gi i pháp k thu t không

ng pháp th ch


hay ph

ng pháp

i u ki n thích h p là có th cho

c

ng vi khu n ích có trong m u s n ph m c n

nh chính xác tên vi khu n có trong s n ph m có

c nêu trong nhãn s n ph m hay không l i là m t v n

không

n

gi n vì các vi khu n probiotic nh B. subtilis, L. acidophilus...không ph i là các vi
khu n d dàng

c

nh danh

n loài n u ch d a vào các tính ch t sinh v t hóa h c.

Chính vì v y, chúng tôi ã gi i pháp PCR và gi i trình t gene 16s rDNA c a vi khu n
phân l p


c t các s n ph m probiotic

xác

nh danh tính c a vi khu n. K t qu

cho th y có khá nhi u lo i s n ph m probiotic s d ng cho ng
v n

v m t ch t l

ng c v hàm l

i và cho th y s n có

ng l n v vi khu n th t s có trong s n ph m.
✤✥


B ng 13 và 14 trình bày k t qu cho th y s khác bi t gi a vi khu n th t s có trong
s n ph m probiotic so v i k t qu

c nhà s n xu t công b trên nhãn.

B ng 13: K t qu
nh danh b ng k thu t PCR và gi i trình t
th t s có trong các probiotic s d ng trên ng i

❙★★
✶


Tên s n ph m

16s rDNA và k t qu

Tên vi khu n trên nhãn s n ph m
7

nh l

ng các vi khu n

K t qu PCR và gi i trình t

16sDNA
6

Biosubtyl DL

Bacillus subtilis

10 /gr

Bacillus subtilis

10 /gr

2

Bidisubtilis (gói gi y)


Bacillus subtilis

108/gr

Bacillus cereus

107/gr

3

Bidisubtilis (gói nhôm)

Bacillus subtilis

10 /gr

8

Bacillus subtilis

10 /gr

4

Bio ! Acimin

Bacillus subtilis

108/gr


Bacillus cereus

107/gr

7

Bacillus pumilus

107/gr

6

5

Biosubtyl II (gói)

Bacillus subtilis

10 /gr

6

Biosubtyl II (viên)

Bacillus subtilis

10 /gr

8


Bacillus subtilis

10 /gr

7

Subtyl

Bacillus subtilis

10 /gr

7

Bacillus cereus

10 /gr

Bacillus subtilis

6

10 /gr

Bacillus cereus

6

10 /gr


Bio Baby

Bacillus subtilis

6

10 /gr

Bacillus subtilis

10 /gr

Bio Vita

Bacillus subtilis

10 /gr

6

Bacillus subtilis

10 /gr

8
9
10

Medilac ! Vita


B ng 14: K t qu
nh danh b ng k thu t PCR và gi i trình t
th t s có trong các probiotic s d ng cho th y s n
STT

Tên s n ph m

16s rDNA và k t qu

Tên và l ng* vi khu n
trên nhãn s n ph m

1

DT-LACTO

Bacillus subtilis
Lactobacillus acidophilus

2

Bio-DW

Bacillus subtilis
Lactobacillus acidophilus

3

Probiotex-one


Bacillus subtilis

8

7

6

6

nh l

ng* các vi khu n

nh danh
K t qu
và nh l ng* th c t
Bacillus pumilus
Không tìm th yL. acidophilus
9

10 /gr

Bacillus subtilis
Không tìm th yL. acidophilus

6

10 /gr


B. megaterium
11

4

4

Vime-Subtyl

Bacillus subtilis

10 /gr

Bacillus subtilis

10 /gr

5

Biozyme for fish

Bacillus subtilis

10 /gr

9

Bacillus subtilis


10 /gr

6

Novazyme F

Bacillus subtilis

10 /gr

9

Bacillus subtilis

10 /gr

7

Subtyl-LA

Bacillus subtilis

8
9

NPV-Prozyme 90

6

5


Bacillus pumilus

Bacillus subtilis
Lactobacillus acidophilus

6

10 /gr
9

ProKura

Bacillus subtilis

10

Men g u vàng

10 /gr

Bacillus subtilis
Lactobacillus acidophilus

11

Biobac

Bacillus subtilis


Bacillus subtilis
Không tìm th yL. acidophilus
Bacillus subtilis

6

10 /gr
7

10 /gr

Bacillus cereus
Không tìm th yL. acidophilus
Bacillus pumilus

12

Pond clear

Bacillus subtilis
Lactobacillus acidophilus

10 /gr

Bacillus subtilis
Không tìm th yL. acidophilus

105/gr

13


Bio Pond

Bacillus subtilis
Lactobacillus acidophilus

108/gr

Bacillus subtilis
Không tìm th yL. acidophilus

105/gr

14

Men Bac

Bacillus subtilis
Lactobacillus acidophilus

15

Microzyme

Bacillus subtilis
Lactobacillus acidophilus

16

Zymmix


Lactobacillus acidophilus

17

Lactovet

Lactobacillus acidophilus

18

Zeofarm

Lactobacillus acidophilus

*Ch nêu lên l

ng các vi khu n mà

11

Bacillus cereus
Không tìm th yL. acidophilus
Bacillus subtilis
Không tìm th yL. acidophilus

?

5


10 /gr

Acidovorax sp.
Clostridium phylofermentant
9

10 /gr

L. acidophilus

6

10 /gr

nh danh b ng PCR và gi i trình t cho th y k t qu không sai l ch

✦✧


Phân tích các d ki n trình bày trong hai b ng trên, chúng ta th y
ph m probiotic dùng cho ng

i, s sai bi t v hàm l

ng gi a k t qu ki m tra so v i

công b trên nhãn không nhi u (không quá 10 l n), nh ng có
công b không úng v i k t qu
cereus, vi khu n không


i v i các s n

nh danh. Th m chí có

n 50% tên vi khu n

n 4 s n ph m l i s d ng B.

c phép có m t trong th c ph m vì có kh n ng gây tiêu

ch y và ói m a do có th ch a các toxin, làm vi khu n tr sinh.
probiotic dùng cho th y s n, k t qu ki m tra cho th y

i v i các s n ph m

i v i vi khu n B. subtilis, có

6/15 m u không ph i là B. subtilis mà là B. cereus hay B. pumilus; và ch có m t s n
ph m là có ch a L. acidophilus còn h u h t là không tìm th y vi khu n này nh công
b trên nhãn. Hình 49 minh h a m t k t qu gi i trình t gene 16s rDNA xác

nh vi

Hình 49✪ M t ch ng vi khu n phân l p t m t s n ph m probiotic n u chi d a vào tính ch t khu n l c và nhu m
Gram thì không th bi t ây không ph i là B. subtilis, nh ng khi gi i trình t 16s rDNA thì xác nh
c
ây là B. cereus.

khu n là B. cereus trong khi nhãn s n ph m l i là B. subtilis. Còn v m t hàm l
th t th m h i, trong các các s n ph m

thì a s hàm l

ng t t gi m t 104

m t ti ng chuông báo

ng

ng thì

c ki m tra th t s có vi khu n nh công b
n 105 so v i công b . K t qu c a nghiên c u là

các nhà s n xu t c ng nh các c quan ki m tra ch t
✩✩


l

ng nên quan tâm

ng

nv n

ch t l

ng c a các s n ph m probiotic s d ng cho

i và th y s n hi n ang l u hành t i Vi t Nam; và


ki m tra

c ch t l

ng

các s n ph m probiotic thì ph i s d ng PCR và gi i trình t gene 16s rDNA vì ch có
gi i pháp này m i có th

nh danh chính xác vi khu n

c s d ng làm probiotic,

tránh nh m l n v i các vi khu n không có tác d ng probiotic hay th m chí có th

c

h i.

Hình 50✬ M t phi u lý l ch 16s rDNA c a m t ch ng vi khu n dùng trong ki m chu n v i các thông tin v tính ch t
khu n l c, hình nh Gram, các tính ch t sinh hóa c b n, và quan tr nh nh t là trình t gene 16s rDNA

✫✵✵


c.

Xây d ng lý l ch 16s rDNA c a các ch ng vi khu n dùng trong ki m chu n
Trong n i ki m hay ngo i ki m vi sinh, r t c n thi t ph i dùng các ch ng vi sinh


có lý l ch

nh danh ch ng chính xác. Các phòng thí nghi m vi sinh th

ng yêu c u

cung c p các ch ng qu c t v i lý l ch xu t phát t nhà cung c p ch ng. Hi n nay r t
khó

có th

t mua các ch ng g c qu c t vì v n

nguy c kh ng b sinh h c.

Chính vì v y gi i pháp hay nh t hi n nay là s d ng các ch ng g c qu c t hi n ang
l u gi t i các phòng thí nghi m, th m chí s d ng các ch ng g c phân l p
nh ng ph i có lý l ch d nh danh chính xác
nghi m NK-Biotek và

n loài.

ng tr

c

c yêu c u này, phòng thí

n v R&D c a Nam Khoa ã xây d ng lý l ch 16s rDNA c a


t t c các ch ng qu c t ATCC, c ng nh m t s ch ng phân l p

c và tiêu bi u cho

các gi ng và lo i vi khu n c n cho ki m chu n. Hình 50 minh h a m t lý l ch 16s
rDNA c a 1 ch ng vi khu n
Nam Khoa

c phòng thí nghi m NK-Biotek và

n vi R&D c a

cung c p dùng trong ki m chu n.

Hình 51✯ M t k t qu
nh danh b ng PCR và gi i trình t 16s rDNA c a m t ch ng vi sinh công nghi p cho
th y ây là Acrobacterium tumefaciens, là vi khu n r t khó nh danh b ng vi sinh kinh i n

✭✮✭


Làm xét nghi m d ch v

d.

nh danh vi khu n

C ng v i công ngh PCR và gi i trình t 16s rDNA c a vi khu n, phòng thí
nghi m NK-Biotek và

danh các vi khu n
cg i
M u

n v R&D c a Nam Khoa ã và ang th c hi n d ch v

c dùng trong vi sinh công nghi m c ng nh vi sinh nông nghi m

n t các công ty, nhà máy, hay t các yêu c u c a các
cg i

nh

n

tài nghiên c u.

nh danh có th là các ch ng vi khu n c y trên môi tr

ng nuôi

c y, hay là các d ch tách chi t DNA, hay huy n d ch vi khu n. Có th nói v i gi i pháp
k thu t PCR và gi i trình t gene 16s rDNA, các vi khu n dù l
danh

n âu c ng

u

c


nh danh

khu n dùng trong vi sinh công nghi m

n âu, dù khó

nh

n loài. Hình 51 là k t qu m t ch ng vi
c yêu c u

nh danh, và k t qu

nh danh

cho th y ây là vi khu n Agrobacterium tumefaciens.
2.

ng d ng k thu t PCR và gi i trình t
Trong các xét nghi m vi sinh thì

n u s d ng các ph

nh danh vi n m

nh danh vi n m có l là m t tr ng i l n nh t vì

ng pháp kinh i n thì không ch phân tích hình thái


th , v n d ph c t p và công phu, mà còn ph i làm cho
h c khác nh
th

ng hóa

Nh n di n

c các kh o sát sinh v t hóa

ng, phân tích các ch t bi n d

ng ít có phòng thí nghi m vi sinh làm

i th và vi

ng...Chính vì v y thông

c xét nghi m vi n m.

c tr ng i k thu t chính y u này, phòng thí nghi m NK-Biotek và

n v R&D công ty Nam Khoa ã c g ng tìm gi i pháp v
gian nghiên c u - th nghi m, ã xây d ng

t qua, và sau m t th i

c m t gi i pháp k thu t ó là s d ng

PCR và gi i trình t gene 28s rDNA. Nguyên t c c a gi i pháp này là s d ng b

NK

FUNGI-DNAPREP do

n v R&D c a công ty Nam Khoa ch t o

DNA toàn ph n t m u vi n m hay m u th ch a vi n m c n
d ng PCR v i m t c p m i

c

t tên là

DNA dài kho ng 260 bps có ch a các trình t

NK

28s-F và

NK

tách chi t

nh danh, sau ó s

28s-R

c hi u m t o n

c hi u gi ng và loài c a vi n m trên


gene 26s rDNA, và sau cùng là gi i trình t tr c ti p và 2 chi u s n ph m PCR

nh

danh vi n m qua blast search trên ngân hàng d li u gene c a NCBI.
ng d ng gi i pháp k thu t này, phòng thí nghi m NK-Biotek và
c a công ty Nam khoa ang th c hi n r t thành công hai d ch v , ó là:

✰02

n v R&D


a.

Phát hi n và

nh danh vi n m trong các bi n m l y ra t ph u thu t b nh nhân

viêm xoang
Tr

c ây, các b nh ph m bi n m (fungus ball) th

h ng g i

ng

n phòng thí nghi m gi i ph u b nh và k t qu th


c các bác s tai m i
ng

c nh n v sau 1

tu n là nhìn th y vi th các s i t n m nghi Aspergillus. Hi n nay v i xét nghi m PCR

Penicit rium cit rinum
3 (5%)
M alassezia rest ricta
2 (3%)

X ylar ia curt a
1 (2%)

Rhinocladiella at rovir ens
3 (5%)

Neosar to rya f ischeri
2 (3%)
A sper gillus niger
4 (7%)

Cand id a ort hopsilo sis
1 (2%)

A sper gillus f umigat us
23 (40 %)


zophyllum cominune
1 (2%)

Pichia guilliermondii
1 (2%)

Pseud allescheria b oydi
4 (7%)

12: T ng k t các k t qu phát hi n và nh danh n m b ng k thu t PCR và gi i trình t 28s rDNA trong
các m u bi n m l y t m viêm xoang trên b nh nhân

Bi u

và gi i trình t

c th c hi n t i phòng thí nghi m NK-biotek thì các nhà lâm sàng s

có k t qu sau 2 ngày v i
phát hi n và
Chí Minh g i

D ch v

nh danh vi n m

n loài. Bi u

nh danh vi n m trong các bi n m


12 t ng k t các k t qu

c b nh vi n Tai M i H ng TP.H

n trong th i gian g n ây. Có t ng c ng 58 m u

nghi m, và c 58
b.

A sper gillus oryzae
11 (19%)

A sperg illus f lavus
2 (3%)

u phát hi n và

nh danh

cg i

n làm xét

c vi n m là tác nhân gây b nh.

nh danh vi n m

Trên c s c a k thu t PCR và gi i trình t gene 28s rDNA, phòng thí nghi m
NK-Biotek và


n v R&D c a công ty Nam Khoa tri n khai

c xét nghi m d ch v

nh danh vi n m v i các ngu n m u là t các công ty, nhà máy trong l nh v c công
nông nghi p, hay là t các phòng thí nghi m c a các tr
tâm nghiên c u. Có th nói là cho

i h c hay c a các trung

n nay, h u nh không có m u vi n m nào g i

phòng thí nghi m NK-Biotek là không có k t qu
h a hai k t qu

ng

nh danh. Hình 52 và hình 53 minh

nh danh n m trong xét nghi m d ch v

Biotek.
✱03

n

nh danh vi n m c a NK-