SV: Vũ Thị Thu Trang – Lớp:12-01

Khóa luận tốt nghiệp

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
-----

-----

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Đề tài:
NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH KHÁNG
VIÊM, TĂNG CƯỜNG MIỄN DỊCH CỦA POLISACCARIT TỪ CÂY
THUỐC XUÂN HOA P. PALATIFERUM

Người hường dẫn

: TS VÕ HOÀI BẮC

Sinh viên thực hiện

: VŨ THỊ THU TRANG

Lớp

: 12-01

HÀ NỘI - 2016

SV: Vũ Thị Thu Trang – Lớp:12-01

Khóa luận tốt nghiệp

LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên tôi xin chân thành cảm ơn viện Công nghệ Sinh học thuộc
Viện Hàn lâm – Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện , môi
trường tốt giúp tôi thực hiện tốt khóa luận này.
Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới TS.Võ Hoài Bắc đã tận tình chỉ
bảo, hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành
khóa luận tốt nghiệp.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu trường Viện Đại Học Mở
Hà Nội, các phòng ban liên quan, Ban Chủ Nhiệm khoa công nghệ sinh học,
cùng toàn thể các thầy cô giáo đã giảng dạy, hướng dẫn để tôi có những kiến
thức như ngày hôm nay.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ tình cảm và lòng biết ơn chân thành nhất tới
gia đình, bạn bè đã tận tình giúp đỡ, động viên tôi trong suốt thời gian qua.
Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 20 tháng 05 năm 2016
Sinh viên
VŨ THỊ THU TRANG


SV: Vũ Thị Thu Trang – Lớp:12-01

Khóa luận tốt nghiệp

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN

MỤC LỤC
DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT
DANH MỤC BẢNG
DANH MỤC HÌNH
MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 1
1. Đặt vấn đề ...............................................................................................................1
2. Mục tiêu nghiên cứu ...............................................................................................1
PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................ 2
1.1. Giới thiệu chung về cây Xuân Hoa.....................................................................2
1.1.1. Đặc điểm thực vật. ................................................................................ 2
1.1.2. Kinh nghiệm dân gian sử dụng lá cây Xuân Hoa. ................................. 3
1.1.3. Tình hình nghiên cứu về thành phần hóa học trong lá cây Xuân Hoa. .. 5
1.1.4. Những nghiên cứu in vitro về dược tính. ............................................... 5
1.1.5. Những nghiên cứu in vivo về dược tính. ................................................ 6
1.2. Polisaccarit. ..........................................................................................................8
1.2.1.Oligosaccarit. ........................................................................................ 8
1.2.2. Polisaccarit. ......................................................................................... 9
1.3. Vai trò sinh học và tác dụng của polisaccarit thực vật. ....................................13
1.3.1. Vai trò sinh học và ý nghĩa kinh tế...................................................... 13
1.3.2. Tác dụng chữa bệnh của một số polisaccarit thực vật. ....................... 14
PHẦN II ....................................................................................................... 17
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CƯÚ ....................................... 17
2.1. Vật liệu...............................................................................................................17
2.1.1. Nguyên liệu thực vật. .......................................................................... 17
2.1.2. Hóa chất, thiết bị. ............................................................................... 17
2.2. Phương pháp nghiên cứu...................................................................................17
2.2.1. Xử lý nguyên liệu. ............................................................................... 17
2.2.2. Các phản ứng định tính đặc trưng. ..................................................... 17



SV: Vũ Thị Thu Trang – Lớp:12-01

Khóa luận tốt nghiệp

2.2.3. Định lượng polisaccarit bằng phương pháp phenol-sunfuric axit. ...... 18
2.2.4. Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Lowry. ...................... 19
2.2.5. Phương pháp tách chiết và tinh sạch polisaccarit............................... 20
2.2.6. Đo độ hấp thụ quang phổ của dung dịch polisaccarit ......................... 20
2.2.7. Xác định độ nhớt polisaccarit ............................................................. 20
2.2.8. Ảnh hưởng của pH và nhiệt độ tới chất lượng của chế phẩm polisaccarit.21
2.2.9. Xác định hoạt tính kháng viêm trên invitro sử dụng phương pháp ức
chế enzyme hyaluronidase theo phương pháp Reissig ................................. 21
2.2.10. Thử nghiệm tác dụng của chế phẩm polisaccarit trên chuột được tiêm
cyclophosphamide . ...................................................................................... 23
PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................... 24
3.1. Nghiên cứu thành phần polisaccarit của nguyên liệu.......................................24
3.1.1. Các phản ứng phát hiện polisaccarit và polisaccarit peptic. .............. 24
3.1.2. Thu nhận polisaccarit tinh sạch từ lá cây Xuân Hoa. ........................ 25
3.2. Nghiên cứu một số đặc tính sinh hóa của polisccarit tinh sạch. ......................31
3.2.1. Xác định độ hấp thụ quang phổ của polisaccarit. ............................... 31
3.2.2. Độ nhớt của dung dịch polisaccarit. ................................................... 31
3.2.3 Ảnh hưởng của pH và nhiệt độ tới chất lượng của chế phẩm polisaccarit.32
3.3. Nghiên cứu một số tác dụng sinh học của polisaccarit tinh sạch được từ lá
Xuân Hoa ..................................................................................................................33
3.3.1. Xác định hoạt tính kháng viêm của polisaccarit từ cây Xuân hoa trên
in vitro.......................................................................................................... 33
3.3.2 Thử nghiệm chế phẩm polisaccarit trên chuột được tiêm
cyclophosphamide . ...................................................................................... 34
KẾT LUẬN.................................................................................................. 37
1. Kết luận. ................................................................................................................37

2. Đề nghị..................................................................................................................37
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 38
PHỤ LỤC .................................................................................................... 44


SV: Vũ Thị Thu Trang – Lớp:12-01

Khóa luận tốt nghiệp

DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT
A490

: Bước sóng

A585

: Bước sóng 585nm

BSA

: Bovine seurum albumin

CY

: Cyclophosphamide

OD

: Optical density


TCA

: Axit tricloaxetic

Hb

: Hemoglobin

HC

: Hồng cầu

BC

: Bạch cầu


SV: Vũ Thị Thu Trang – Lớp:12-01

Khóa luận tốt nghiệp

DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1: Xây dựng đồ thị chuẩn glucoz theo DuBoietal ............................. 18
Bảng 2.2: Xây dựng đồ thị chuẩn protein theo phương pháp Lowry ............. 20
Bảng 2.3: Xác định khả năng kháng viêm của polisacarit Xuân Hoa ............ 22
Bảng 3.1: Phản ứng định tính nhận biết polisaccarit và polisaccarit peptic ... 24
Bảng 3.2: Phản ứng định tính so sánh các dung môi chiết polisaccarit ......... 27
Bảng 3.3: Hàm lượng polisaccarit trong các dung môi chiết ......................... 27
Bảng 3.4: So sánh phương pháp loại protein bằng Sevag và TCA ................ 29
Bảng 3.5: Xác định tác dụng ức chế hyaluronidase của polisaccarit ............. 33

Bảng 3.6: Sự thay đổi trọng lượng của chuột trong 5 ngày thí nghiệm ......... 35
Bảng 3.7: Trọng lượng tương đối của tuyến ức , lách, hàm lượng
hemoglobin(Hb), số lượng hồng cầu (HC), bạch cầu(BC) ............................ 35


SV: Vũ Thị Thu Trang – Lớp:12-01

Khóa luận tốt nghiệp

DANH MỤC HÌNH
Hình 3.1. Phản ứng định tính nhận biết polisaccarit ..................................... 24
Hình 3.2 Sơ đồ chiết rút chế phẩm polisaccarit............................................. 30
Hình 3.3: Đồ thị biểu diễn phổ hấp thụ ánh sáng của polisaccarit chiết từ lá
cây Xuân Hoa ............................................................................................... 31
Hình 3.4: Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của pH đến chế phẩm polisaccarit 32
Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến chất lượng chế phẩm
polisaccarit ................................................................................................... 32


MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Theo Y học cổ truyền, nhiều vị thuốc chứa chất nhầy được dùng phổ
biến trong tạo máu, chống viêm, chữa lành vết thương... Trong những năm
gần đây polisaccarit là những nhóm hợp chất rất được các nhà khoa học trên
thế giới quan tâm do các tác dụng quan trọng của chúng về tăng cường miễn
dịch, kháng bổ thể, kháng viêm, chống loét, chống đông máu, phân hủy fibrin.
Các nghiên cứu trước đây cho thấy trong lá cây Xuân Hoa P. palatiferum
chứa hàm lượng cao polisaccarit.
Cây Xuân Hoa Pseuderanthemum palatiferum (Nees) Radlk thuộc họ
Ôrô Acanthaceae được dùng trong dân gian Việt Nam để chữa nhiều bệnh

như: nhiễm khuẩn tiêu hoá, trĩ, chấn thương chảy máu, tiêu mủ các vết
thương…Trong khoảng 15 năm gần đây, nhiều nhà khoa học Việt Nam và thế
giới đã xác minh được một số tác dụng sinh học của lá cây thuốc này như:
kháng khuẩn, kháng nấm, tác dụng chống oxi hóa, giảm huyết áp, hạ đường
huyết... Tuy nhiên việc nghiên cứu cấu trúc, đặc tính và tác dụng dược lý chỉ
tập trung vào nhóm các chất như: flavonoids, phytol, triterponoid saponin,
stigmasterol, salicylic acid… Cho đến nay chưa có công bố nào nghiên cứu
về các đặc tính sinh hóa , dụng tác dụng kháng viêm và tăng cường miễn dịch
của polisaccarit từ cây thuốc Xuân Hoa.
2. Mục tiêu nghiên cứu
- Chiết rút và tinh sạch được polisaccarit từ lá cây thuốc Xuân Hoa P.
palatiferum (Ness) Radlk có độ sạch đạt 70% đến 80%.
- Xác định được một số đặc tính sinh hóa như: độ nhớt, độ sạch của
polisaccarit, ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến chất lượng của chế phẩm
polisaccarit.
- Điều tra một số tác dụng dược lý (tác dụng kháng viêm và tăng cường
miễn dịch) của polisaccarit từ cây thuốc này.
1


PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu chung về cây Xuân Hoa.
1.1.1. Đặc điểm thực vật.
Bộ phận dùng: Lá.
Cây Xuân Hoa thuộc họ Acanthaceae, còn có tên là cây Tu Linh, cây Nhật
Nguyệt hay cây Con Khỉ, cây Hoàn Ngọc, cây Thần dưỡng sinh, cây Trắc Mã,
cây Điền Tích, cây Lan Điều. Tên khoa học là Pseuderanthemum Palatiferum
Radik (Nees).
Họ Ô rô (Acanthaceae) là một họ thực vật hai lá mầm trong thực vật có
hoa, chứa khoảng 250 chi và khoảng 2.700 loài .Theo Phạm Hoàng Hộ

(2000), chi Pseuderanthemum có khoảng 196 loài. Ở Việt Nam, chi
Pseuderanthemum có 9 loài và 2 thứ.
Đề tài của chúng tôi nghiên cứu polisaccarit trên đối tượng là cây Xuân
Hoa Pseuderanthemum palatiferum (Nees) Radlk.
Mô tả: Cây có thể mọc cao từ 1-2m sống lâu năm, thân cây xanh màu
tím lục, khi già chuyển thành màu nâu, phân ra nhiều nhánh, lá mọc đối
diện có hình mũi mác, dài từ 12-15cm, rộng 3,5-5cm, nếp lá nguyên, cuống
lá dài 1-2,5cm, cụm hoa dài 10-16cm. Hoa mọc ở kẽ lá hoặc ở đầu cành.
Hoa lưỡng tính, không đều.
Phân bố: Cây Xuân Hoa mọc hoang ở nhiều nơi, được coi là cây thuốc
quí có uy tín trong dân gian ở các tỉnh thành miền Bắc, nhất là thủ đô Hà Nội.
Từ năm 1998, rộ lên việc trồng cây Xuân Hoa để chữa những bệnh thuộc về
nhóm bệnh đường tiêu hóa.

2


Hình 1.1: Cây Xuân Hoa
1.1.2. Kinh nghiệm dân gian sử dụng lá cây Xuân Hoa.
Năm 2005, bác sĩ Xuân Lục đưa ra một số bài thuốc từ kinh nghiệm
dân gian đã sử dụng lá cây Xuân Hoa:
• Chữa bệnh về đường tiêu hóa (đi lỏng, rối loạn tiêu hóa, táo bón, đau
bụng không rõ nguyên nhân): ăn từ 7-9 lá, khoảng 2-3 lần/ngày cho đến khi
khỏi, có thể nấu canh nhạt để ăn.
• Bệnh kèm theo chảy máu (chảy máu dạ dày, đường ruột, đái ra máu,
phân ra máu kể cả đái buốt, đái rắt,…): ăn lá khi đói hoặc sắc nước lá đặc để
uống, có thể nấu canh độ một bát nhỏ. Ăn 1-5 lần, máu sẽ cầm, nên ăn ngày 2
lần.
• Các bệnh ung thư thời kì phát bệnh: ăn lá xong, cơn đau giảm dần,
người tỉnh táo, ăn ngủ tốt, có cảm giác như khỏi bệnh. Thử nghiệm qua một số

bệnh ung thư dạ dày, gan, phổi,… đều thấy có diễn biến tốt. Lượng lá dùng
thường xuyên theo mức độ đau, thông thường ngày 2 lần, mỗi lần 3-7 lá, tùy
theo hiệu quả giảm đau.
• Các bệnh u ở phổi, tiền liệt tuyến: liều dùng như trên, sau 1 tuần các
triệu chứng giảm hẳn, bệnh nhân ăn ngủ tốt. Riêng u xơ tiền liệt tuyến, ăn vào
cuối tháng, khoảng 3 tháng liên tục.

3


• Các bệnh về gan (xơ gan cổ trướng, viêm gan,…): ăn lá tươi như
trên ngày 2 lần khi đói. Bột lá khô cùng với bột Tam thất theo tỉ lệ 1:1 là
thuốc trị xơ gan đặc hiệu.
• Bệnh về thận (viêm thận cấp hoặc mãn, suy thận, các hiện tượng
nước đái đục, đái ra máu): điều trị như trên sau 1 tuần. Ăn 1 lần/ngày, nhưng
nếu nước giải chỉ trong được nửa ngày thì tăng lên 2 lần/ngày. Trong thời
gian nửa tháng, các triệu chứng bệnh giảm rõ rệt.
• Chữa viêm loét (loét dạ dày, hành tá tràng, đại tràng, trĩ nội ngoại,
trực tràng,…): ăn lá tươi khi đói (tốt nhất là vào buổi sáng). Với các vết
thương thuộc phạm vi dạ dày, chỉ cần ăn trong 1 tuần, tránh uống rượu mạnh.
Khi chữa vết loét thuộc phần ruột, liều lượng cần nhiểu hơn tùy theo nặng,
nhẹ.
• Điều chỉnh huyết áp, ổn định thần kinh: khi biến đổi huyết áp (cao
hay thấp) theo liều lượng trên, ăn xong chợp mắt nghỉ trong thời gian ngắn,
huyết áp sẽ trở lại bình thường, khi lên cơn rối loạn thần kinh thực vật, tùy
theo mức độ để định liều lượng, có thể ăn vào buổi sáng giúp cơ thể ổn định
trong ngày và đề phòng khi thời tiết thay đổi đột ngột.
• Chữa về chấn thương (các loại chấn thương, đặc biệt là chấn thương
sọ não, va đập, gãy dập xương hay bắp thịt): lá thuốc có tác dụng cầm máu,
khôi phục các mô cơ bị dập, kháng viêm nhiễm, lá làm cả thuốc đắp và thuốc

uống. Với vết thương kín, có thể nhai để đắp, vết thương hở thì nên giã để
đắp.
• Chữa cảm cúm: nếu kéo theo rối loạn tiêu hóa, đau đầu, mệt mỏi,
nhiệt độ cao, nên ăn lá cách 2 giờ, cơn sốt nhanh chóng hạ đồng thời rối loạn
tiêu hóa cũng khỏi. Sau cơn sốt, nên ăn cháo có lá thuốc trộn vào giúp cho
người bệnh mau chóng trở lại bình thường.
• Khôi phục sức khỏe: khi mệt mỏi toàn thân hoặc cần nâng cao sức
chịu đựng cường độ cao, nên ăn như liều đinh 5-7 lá trước nửa giờ. Trẻ con đi
lỏng nên lấy từ 1-2 lá giã lấy nước cho uống.
4


1.1.3. Tình hình nghiên cứu về thành phần hóa học trong lá cây Xuân Hoa.
Năm 2000, Nguyễn Thị Minh Thu và cộng sự đã cô lập được các hợp
chất phytol, β-sitosterol, hỗn hợp hai đồng phân stigmasterol và
poriferasterol, β-sitosterol 3- β-O-D-glucopyranoside từ lá cây Xuân Hoa
[Nguyễn Thị Minh Thu, 2000].
Năm 2003, Phan Minh Giang và cộng sự đã cô lập từ lá khô cây Xuân
Hoa hợp chất 1-pentacosanol, palmitic acid, β-sitosterol, stigmasterol, hỗn
hợp

β-sitosterol

3-O-β-D-glucopyranoside

và

stigmasterol

3-O-β-D-


glucopyranoside và apigenin 7-O-β-D-glucopyranoside [Phan Minh Giang,
2003].
Năm 2004, Nguyễn Văn Hùng và cộng sự đã cô lập từ lá cây Xuân Hoa
các hợp chất 1-triacotanol, hexadecanoate glycerol, salicylic acid và palmitic
acid [Nguyễn Văn Hùng, 2004].
Năm 2005, Mai Đình Trị và các cộng sự đã cô lập các hợp chất từ lá cây
Xuân Hoa bao gồm: β-amyrin, oleanolic, β-sitosterol, stigmasterol, hỗn hợp hợp
β-sitosterol 3-O-β-D-glucopyranoside và stigmasterol3-O-β-D-glucopyranoside
[Mai Đình Trị, 2005].
Năm 2007, Trần Kim Thu Liễu đã cô lập từ lá cây Xuân Hoa các hợp
chất squalene, dotriacontane, phytol, palmitic acid, β-sitosterol, stigmasterol,
hỗn hợp β-sitosterol 3-O-β-D-glucopyranoside, 24-methylenecycloartanol và
loliolide [Trần Kim Thu Liễu, 2007]
Các nghiên cứu trước đây cũng chỉ ra rằng lá Xuân Hoa chứa đầy đủ các
acid amin thiết yếu với hàm lượng tổng số khá cao (751 – 1365 mg%), đặc biệt
hàm lượng isoleucin, leucin và valin rất cao (25 – 150 mg%; 46 – 85 mg% và
29 – 1001 mg%). Không phát hiện các nguyên tố kim loại nặng như Cd, Pd,
As, Cr [Võ Hoài Bắc, 2003], phát hiện hàm lượng cao protease, polisaccarit từ
lá cây này [Lê Thị Lan Oanh, 1999].
1.1.4. Những nghiên cứu in vitro về dược tính.
a) Hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm

5


Năm 1998, Trần Công Khánh và cộng sự đã thử tác dụng kháng vi sinh
vật kiểm định (trong ống nghiệm) của cao đặc chiết từ lá cây Xuân Hoa, kết
quả cho thấy cao đặc có tác dụng kháng vi khuẩn Gram âm (Escherichia coli,
Pseudomonas aeruginosa), kháng vi khuẩn Gram dương (Bacillus subtilis,

Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes), nấm mốc (Aspergillus
niger, Fusarium oxysporum, Pyricularia oryzae, Rhezoctonia solanii), nấm
men (Saccharomyces cerevisiae, Candidaalbicans)[Trần Công Khánh, 1998].
Các nhà khoa học [Phan Minh Giang, 2005] đã khảo sát sơ bộ hoạt tính
kháng khuẩn và kháng nấm của cao ethyl acetate và n-butanol (ở nồng độ 10
mg/ml) từ lá cây Xuân Hoa, các kết quả cho thấy cả hai loại cao trích đều thể
hiện khả năng kháng các chủng vi khuẩn Gram dương (Bacillus subtilis,
Staphylococcus aureus), Gram âm (Escherichia coli) và vi nấm (Candida
albicans, Candida stellatoides), trong đó cao trích ethyl acetate có hoạt tính tốt
hơn cao trích n-butanol. Kết quả cũng cho thấy cao trích ethyl acetate kháng tốt
các chủng Salmonella typhi 158, Shigella flexneri và Escherichia coli, đây là
những vi khuẩn gây bệnh về đường ruột, tiêu chảy, viêm ruột, lị.
b) Hoạt tính kháng oxy hóa.
Các nghiên cứu [Phan Minh Giang, 2005] đã nghiên cứu hoạt tính
kháng oxy hóa của các loại cao ethyl acetate và n-butanol từ lá cây Xuân Hoa
bằng phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của các loại cao này lên độ hoạt
động của enzyme peroxydase trong máu. Kết quả cho thấy cả hai loại cao
ethyl acetate và n-butanol từ lá cây đều có tác dụng kháng oxy hóa .
1.1.5. Những nghiên cứu in vivo về dược tính.
a) Thử độc trên động vật thử nghiệm.
Năm 1999, Lê Thị Lan Oanh và cộng sự đã khảo sát độ độc của dịch chiết
lá cây Xuân Hoa trên cá chọi. Kết quả cho thấy dịch chiết lá không độc với cá
chọi vì với nồng độ 50% cá vẫn không chết sau 5 ngày [Lê Thị Lan Oanh,
1999].

6


Kết quả thử nghiệm độc tính của lá khô cây Xuân Hoa cũng đã được
thực hiện tại Viện Kiểm nghiệm, Bộ Y tế, áp dụng trên thỏ và chuột thí

nghiệm, cho thấy không có độc tính.
Các nghiên cứu [Nguyễn Thị Minh Thu, 1999] đã thử độc tính cấp diễn
của cây Xuân Hoa theo phương pháp của Behrens trên chuột nhắt trắng.
Phương pháp được tiến hành với các nồng độ thuốc khác nhau, liên tục theo
dõi diễn biến hành vi của chuột từ khi đưa thuốc trực tiếp vào dạ dày. Kết quả
cao đặc toàn phần lá cây không gây độc tính cấp tính trên chuột, chuột sống
hoàn toàn khỏe mạnh qua 48 giờ .
Năm 2009, Peerawit và cộng sự đã thử nghiệm độc tính của cao trích
ethanol 80% từ lá cây Xuân Hoa cả in vitro lẫn in vivo. Kết quả thử nghiệm
in vitro trên tế bào thận khỉ xanh châu Phi bằng phương pháp GFP (green
fluorescent protein) cho thấy mẫu thử không độc ở nồng độ 50 µg/ml, liều cao
nhất có thể pha được. Với thử nghiệm in vivo, thử nghiệm với cao trích
ethanol 80% được thực hiện trên chuột trưởng thành qua đường uống, với một
liều duy nhất ở các nồng độ khác nhau, 500, 1000, 1500 và 2000 mg mẫu cao
trích/kg trọng lượng chuột. Kết quả cho thấy chuột không có dấu hiệu ngộ độc
trong 24 giờ đầu và không chết qua 14 ngày thử nghiệm, không có sự khác
biệt về thể trọng giữa nhóm chuột thử nghiệm và nhóm chuột đối chứng. Với
thử nghiệm in vivo trên chuột qua đường uống, mỗi ngày, trong 14 ngày, ở
các nồng độ khác nhau, 250, 500, 1000 mg mẫu cao trích/kg trọng lượng
chuột, không có liều nào gây độc cho chuột. Các trị số hóa lý như creatinine,
triglyceride, cholesterol tổng, protein tổng và albumin không có sự khác biệt
giữa nhóm chuột thử nghiệm và nhóm chuột đối chứng [Peerawit, 2009].
b) Tác dụng bảo vệ tế bào gan.
Năm 1999, Các nhà khoa học Việt Nam đã thử tác dụng bảo vệ tế bào
gan của cao đặc toàn phần lá cây Xuân Hoa trên chuột nhắt trắng. Mô hình
gây ngộ độc gan bằng tetrachloromethane. Kết quả như sau: ở liều gây độc
gan 1 ml CCl4/kg thể trọng, hàm lượng men gan có giảm nhưng chưa đáng kể,
có dấu hiệu bình phục tế bào gan. Ở liều gây độc 0,5 ml CCl4/kg thể trọng,
7



hàm lượng men gan có giảm nhưng không đáng kể, có dấu hiệu bình phục tế
bào gan [Nguyễn Thị Minh Thu, 1999].
c) Tác dụng trị tiêu chảy.
Năm 2006, Diệu HK và cộng sự đã xác định hiệu quả của bột lá Xuân
Hoa trong trị bệnh tiêu chảy heo con theo mẹ, so sánh với hai chế phẩm Colinorgent và Cotrimxazol. Kết quả 3 ngày điều trị cho thấy bột lá khô có tỉ lệ
khỏi bệnh cao hơn và tỉ lệ tái phát thấp hơn so với kháng sinh Coli-norgent
(90,48% / 9,52%) và Cotrimxazol (83,33% / 14,29%)[ Diệu, 2006].
1.2. Polisaccarit.
Polisaccarit là các saccarit bao gồm từ hai đến hiều gốc đường đơn kết
hợp với nhau. Polysaccarit được chia thành 2 phân nhóm oligosaccarit và
polisaccarit.
1.2.1.Oligosaccarit.
Oligosaccarit bao gồm không quá 10 gốc monosaccarit kết hợp với
nhau bằng liên kết O-glucozit. Oligosaccarit phổ biến nhất là nhóm disaccarit
bao gồm các đường kép điển hình. Ngoài disaccarit còn có trisaccarit,
tetrasaccarit.
Các disaccarit phổ biến là mantoz,lactoz và saccatoz. Ví dụ :
+ Mantoz( còn gọi là đường mạch nha), được cấu tạo từ 2 phân tử α-Dglucoz. Liên kết glucozit được tạo thành giữa một OH-glucozit với OH ở C4
của gốc glucoz thứ hai. Do đó phân tử manozo vẫn còn chứa một nhóm OHglucozit tự do, nên vẫn giữ được tính khử nhưng chỉ bằng một nửa của
glucoz.
+ Saccaroz (đường mía) được cấu tạo từ α-D-glucoz và β-D-glucoz. Hai
monosaccarit này kết hợp với nhau qua liên kết glucozit được tạo thành giữa hai
nhóm OH-glucozit của chúng. Vì vậy sacaroz không có tính khử, sacaroz hòa
tan tốt trong nước.
+ Trisaccarit phổ biến và được biết rõ hơn cả là rafinoz. Rafinoz được
cấu tạo chủ yếu từ 3 monosaccarit là glucoz và fructoz.

8



+ Tetrasaccarit phổ biến được biết đến là stakioz cấu tạo từ 4 gốc
monosaccarit, trong đó có 2 gốc α-D-galactoz, một gốc α-D-glucoz và một
gốc β-D-glucoz.
+ Stakioz và ranfinoz không có tính khử vì tất cả các nhóm OH-glucozit
đều tham gia tạo thành liên kết glucozit [Phạm Thị Trân Châu, 1997].
1.2.2. Polisaccarit.
Polisaccarit do nhiều gốc monosaccarit kết hợp với nhau có khối lượng
phân tử lớn. Các monosaccarit trong phân tử polisaccarit có thể thuộc một hay
nhiều loại khác nhau. Trong một số trường hợp các gốc monosaccarit có chứa
các nhóm thế glucozit trong phân tử polisaccarit có thể là α- hoặc β-glucozit.
Tên gọi polisaccarit phân theo tên của monosaccarit cấu tạo nên nó nhưng đổi
đuôi ‘oz’ thành đuôi ‘an’
Ví dụ : D-glucan, D-Fructan, D-galactan, D-galactoglucan,.v..v[Phạm
Thị Trân Châu,1997].
Những monosaccarit thường gặp trong phân tử polisaccarit là hexoz
(glucoz, galactoz, mantozo) hoặc pentozo (arabinoz, xiloz,…). So với aldoz
thì xetoz ít tham gia tạo thành phần polisaccarit hơn. Những polisaccarit chứa
hơn 5-6 loại monosaccarit khác nhau rất ít gặp.
Tùy theo nguồn gốc tự nhiên, polisaccarit chia thành 3 nhóm lớn:
Polisaccarit vi sinh vật, polisaccarit động vật và polisaccarit thực vật.
• Polisaccarit vi sinh vật điển hình [Phạm Thị Trân Châu,1997].
Nhóm polisaccarit này được tích tụ một lượng đáng kể trong dịch nuôi
cấy của vi sinh vật do đó có thể tách ra một cách cụ thể dễ dàng.Ví dụ :
+ Nigeran là polysaccarit được tách ra từ dịch nuôi cấy của aspergilus
niger , nigenran do các gốc D-glucopiranoz kết hợp với nhau bằng liên kết α1→3 và α-1→4 glucozit luân phiên nhau.
+ Dextran là glucan do một số vi khuẩn giống Leuconostoc
Streptococus tổng hợp khi nuôi cấy trên dung dịch có chứa xacaroz. Trong đó
các vi khẩn này có enzyme dextran-sucraza xúc tác quá trình biến sacaroz
9



thành dextran. Dextran được dùng làm chất thay thế huyết thanh của máu và
nó cũng là nguyên liệu ban đầu sản xuất sephadex – là những rây phân tử có
nhiều ứng dụng thực tế trong phòng thí nghiệm.
• Polisaccarit động vật điển hình [Phạm Thị Trân Châu,1997]:
Trong hàm lượng nhỏ hơn so với polisaccarit ở thực vật nhưng
polisaccarit ở động vật giữ vai trò quan trọng trong cơ thể động vật.
Polisaccarit ở động vật chia thành các loại như glicogen, kitin, heparin,…
+ Glicogen cũng thuộc glucan, là polysaccarit dự trữ ở động vật và
người. Trong đó, glicogen có cấu tạo phân nhánh tương tự amilopectin của
tinh bột nhưng có độ phân nhánh nhiều hơn. Phần lớn các gốc glucoz trong
phân tử kết hợp với nhau tạo liên kết α-1→4-glucozit, liên kết α-1→6glucozit ở chỗ phân nhánh của phân tử. Glicogen có thể bị thủy phân dưới tác
dụng của enzymee hoặc axit, khi thủy phân hoàn toàn nhận được α-D-glucoz.
Glicogen hòa tan trong nước nóng, và có màu đỏ tím hoặc đỏ nâu với Iot. Ở
động vật glicogen tập trung chủ yếu ở gan và cơ [Trần Thị Áng,1997]
+ Kitin do các gốc N-axetil β-glucozamin kết hợp với nhau bằng liên
kết β-1→4-glucozit. Kitin là hợp phần chính của bộ khung bên ngoài của
ngành chân khớp và một số động vật không xương sống khác. Về số lượng
kitin chiếm vị trí thứ 2 trong xenluloz, trong các hợp chất hữu cơ có trên quả
đất. Nếu xử lý kitin bằng kiềm đặc kết hợp với nung nóng 1 phần nhóm Naxetil sẽ bị tách và tạo thành chitozan. Chitozan đang được ứng dụng rộng rãi
trong các lĩnh vực khác nhau: thực phẩm, dược phẩm, công nông nghiệp…
+ Heparin là một mucopolysaccarit có tính chất sinh học quan trọng, là
chất chống đông máu. Heparin có trong nhiều tổ chức của cơ thể, nhưng chủ
yếu là ở gan , phổi và cơ. Thường heparin được liên kết với protein.
• Các polisaccarit thực vật điển hình [Phạm Thị Trân Châu ,1997 ]:
Trong tự nhiên polisaccarit thực vật có tầm quan trọng đặc biệt đối với
cuộc sống và có nhiều hoạt tính sinh học có giá trị.

10



+ Axit anginic là hợp phần chính của thành tế bào rong nâu. Axit
anginic của các rong khác nhau về thành phần đơn phân, chúng đều chứa axit
D-manuronic và L-gluronic với tỉ lệ xê dịch trong khoảng 0,5-3. Các
monosaccarit trong axit anginic kết hợp với nhau bằng liên kết 1→4-glucozit
và tạo thành mạch thẳng.
+ Thạch (agar) là một sunfat của polisaccarit tích tụ nhiều ở trong loại
rong đỏ gồm 2 dạng polisaccarit : agaroz và agaropectin. Agaroz do Dgalactopiranoz và 3,6 anhidro L-galactopiranoz tạo nên bằng liên kết 1→4 và
liên kết 1→3- glucozit
Agaropectin khác với agaroz về hàm lượng nhóm sunfat. Cấu tạo chi tiết
của agaropectin chưa được sáng tỏ. Thạch cũng như axit anginic có nhiều ứng
dụng trong công nghiệp dệt, công nghiệp thực phẩm và một số ngành sản xuất
khác.
+ Inulin là polisaccarit dự trữ của nhiều loại thực vật do D-fructoz tạo
nên và inulin chứa một polisaccarit có tên là fructan gồm các D-fructo
furanoz kết hợp với nhau bằng liên kết (2→1)-glucozit và tận cùng bằng một
sacaroz không khử. Inulin có nhiều nhất trong củ mẫu đơn (12%) rễ cải đắng
(10%) cũng như trong cây họ nhà hòa thảo. Người và động vật đồng hóa
inulin dễ dàng. Inulin dễ hòa tan trong nước nóng, để lạnh lắng xuống thành
kết tủa. Khối lượng phân tử của inulin tương đối thấp (5000-6000) Da.
+ Tinh bột là polisaccarit dự trữ chủ yêu trong thế giới thực vật. Tinh
bột có nhiều trong quả, hạt (trong hạt thóc, ngô, lúa mì tinh bột chiếm 70%),
củ và trái cây. Tinh bột cũng có một ít trong lá. Tinh bột gồm 2 cấu tử là
amiloz và amilopectin đều do các đơn vị glucoz tạo nên. Trong amiloz các
gốc glucoz kết hợp với nhau bằng liên kết α-1→4-glucozit tạo thành mạch
thẳng. Amilopectin có cấu tạo nhánh, ở điểm phân nhánh các gốc glucoz kết
hợp với nhau bằng liên kết α-1→4-glucozit và liên kết phụ α-1→6-glucozit.
Amiloz hòa tan dễ dàng trong nước ấm và trong dung dịch có độ nhớt không
cao. Amilopectin chỉ hòa tan trong nước nóng khi có áp suất và trong dung

11


dịch có độ nhớt rất cao. Amiloz có phân tử lượng 10.000-100.000 Da, còn
phân tử lượng của amilopectin lại xê dịch 50.000-1.000.000 Da. Hóa tính đặc
trưng nhất của tinh bột là phản ứng màu với iot. Tinh bột tương tác với iot tạo
màu xanh và đôi khi thấy màu đỏ. Tinh bột được dùng để sản xuất glucoz,
rượu etylic, thuốc thử iot, tá dược trong viên nén,…
+ Xenluloz là polisaccarit cấu trúc phổ biến nhất của thực vật và cũng là
chất hữu cơ phổ biến nhất trên hành tinh của chúng ta. Hằng năm lượng
xenluloz do cây trồng tổng hợp nên là 1011tấn. Xenluloz là thành phần chính
của màng tế bào thực vật. xenluloz chiếm 50% trong gỗ và 90% trong bông.
Xenluloz là glucan không phân nhánh, trong đó các gốc glucoz kết hợp với
nhau qua liên kết β-1→4-glucozit. Số gốc glucoz trong xenluloz xê dịch
50.000-106 Da. Xenluloz và dẫn xuất của nó có giá trị to lớn trong nhiều
ngành (sợi, giấy sợi nhân tạo, chất dẻo, chất nổ...).
+ Pectin là những chất polisaccarit pectin có phân tử lớn mà phần tử
chính của phân tử cấu tạo bởi axit poligalacturonic, do đó được xếp vào nhóm
poliuronic. Pectin thường gặp trong các bộ phận của cây và một tảo. Đặc biệt
cùi trắng của một số cây họ cam quýt (rutaceate) như bưởi, cam, chanh chứa
hàm lượng pectin rất cao, có thể lên đến 30%. Pectin chia làm 2 loại : pectin
hòa tan có trong dịch tế bào và protopectin là dạng không hòa tan nằm trong
thành tế bào và các lớp gian bào.
+ Gôm và các chất nhầy : Gôm là những polisaccarit được tiết ra ở
dạng dịch keo khô ở những vết nứt, vết chặt, lỗ đục sâu,…như gôm arập từ
cây Acacia verele mọc ở ven vùng sa mạc Ai cập. Gôm có nguồn gốc bệnh lý
và sự tiết ra gôm là một phản ứng với điều kiện bất lợi.
+ Chất nhầy phần lớn là polisaccarit thuộc nhóm galactomannan,
thường có cấu trúc mạch thẳng chủ yếu tạo bởi gốc D- manopiranoz, kết hợp
với nhau bằng mối liên kết β - 1→4 nhưng cũng có mạch nhánh tạo bởi các

D-galactopiranoz (α-1→6). Chất nhầy là thành phần cấu tạo của tế bào bình
thường.
12


Do cấu trúc của polisaccarit rất phức tạp cho nên việc nghiên cứu cấu
trúc, tính chất của từng loại polisaccarit còn có nhiều khó khăn và còn rất hạn
chế.
1.3. Vai trò sinh học và tác dụng của polisaccarit thực vật.
1.3.1. Vai trò sinh học và ý nghĩa kinh tế [Trần Thị Áng, 1997].
Polisaccarit thực vật cũng có các chức năng sinh học như học như các
polisaccarit trong cơ thể sống khác khác đã trình bày ở phần đầu:
- Chúng giữ vai trò là chất dự trữ ở thực vật, như tinh bột trong tế bào
chất, trong không bào và các cơ quan dự trữ, có nhiệm vụ giữ thế cân bằng áp
suất thẩm thấu và quá trình trao đổi chất của tế bào sống.
- Polisaccarit là thành phần cấu trúc chủ yếu của thành tế bào giữ vai trò
bảo vệ: celluloz, hemicelluloz, pectin,… Polisaccarit ngoại bào giữ vai trò
quan trọng trong các chức năng bảo vệ của thực vật như: chất nhầy ở các
màng tế bào mặt ngoài rễ, chất dịch tiết ra khi khối mô bị tổn thương,..
- Một số polisaccarit thực vật có tác dụng kiềm hãm quá trình lắng tụ
hồng cầu, một số glucoprotein có thành phần giống glucoprotein của huyết
thanh tham gia vào các “phản ứng miễn dịch” của thực vật. Một số
lipopolisaccarit có thành phần giống lipopolisaccarit của vi khuẩn gram (-). Các
chất trên cũng giữ vai trò trong phản ứng bảo vệ của thực vật. Do đó chứa 1
lượng lớn nhóm hydroxit (-OH) với đôi điện tử của nguyên tử oxi nên dọc theo
phân tử polisaccarit có mật độ điện tử đậm đặc, điều đó làm dễ dàng tạo mối
liên kết hydro giữa các phân tử làm bền cấu trúc bậc 2 của polisaccarit, đồng
thời chúng dễ dàng liên kết với các phân tử biopolime khác của tế bào.
- Pectin là polyuronic mạch thẳng chủ yếu là axit poligalacturonic được
dùng trong công nghiệp sản xuất bánh kẹo, dược phẩm và một số ngành công

nghiệp khác.
- Ngoài ra nhóm polisaccarit nhầy với cấu trúc phức tạp và đa dạng có
vai trò quan trọng trong y học, dược học, công nghiệp thực phẩm,…

13


1.3.2. Tác dụng chữa bệnh của một số polisaccarit thực vật.
Theo y học cổ truyền thì nhiều vị thuốc chứa chất nhầy được dùng phổ
biến trong tạo máu, chống viêm, chữa lành vết thương,…[Lê Xuân
Thám,1999]. Trong những năm gần đây polisaccarit là những nhóm hợp chất
rất được các nhà khoa học trên thế giới quan tâm do các tác dụng quan trọng
của chúng về tăng cường miễn dịch, kháng bổ thể, kháng virut, chống loét,
chống đông máu, phân hủy fibrin [Zheng, 2009]. Một số công trình nghiên
cứu về tính chất hóa học và tác dụng chữa bệnh của polisaccarit đã được công
bố trên tạp chí khoa học.
Năm 1992, Puhlann. J công bố hai loại polisaccarit peptin chứa ion kim
loại chiết xuất từ Achyrocline Satureioides có hoạt tính miễn dịch và kháng
bổ thể trong môi trường in vitro đã công bố quy trình tách chiết và phương
pháp nghiên cứu tính chất hóa học của polisaccarit từ cây cedrelatubifiora có
hoạt tính kháng bổ thể intro [Grabowska, 1997]. Một số galaclomannan và
các dẫn xuất chứa sunfat của chúng được chiết xuất từ một số cây họ đậu có
hoạt tính chống đông máu, phân hủy fibrin và kháng virut CB5 invitro
[Ooi,2000]. Polisaccarit trung tính (Seleroglucan) từ Selerotium glucanicum
có tác dụng kháng virut mụn rộp Herpes loại [Stimpel, 1984].
Nhiều nghiên cứu cho thấy các polysaccarit từ thực vật có khả năng
điều hòa miễn dich [Nath, 1992], kháng viêm [Ooi, 2000], làm tan các cục
máu đông [Puhlann,1992], cải thiện hệ tuần hoàn máu ở tim [Zeny, 2009], khả
năng quét các gốc tự do và chống ung thư [Ooi, 2000; Kainoor, 2009] . Ví dụ
các polysaccarit tách từ Agaricus subrufescens [Lowry,1951], Lentinula edodes

[Vetvicka, 2008], Sclerotium rofsii [Rice, 2005], các furanose chiết tách từ P.
quiquefolium và pectin từ Buplerum falcatum và Malus (apple) spp đã tăng khả
năng miễn dịch trong các chuột khỏe mạnh [Biondo, 2008].

Fucans,

polysaccarit từ tảo Lobophora variegate có khả năng chống oxi hóa, quét các
gốc tự do [Kainoor, 2009], giảm sự giải phóng các TNFα [Almino , 2011].

14


Tuy nhiên, cho đến nay chưa có công bố nào nghiên cứu về các đặc
tính sinh hóa của polisaccarit từ cây thuốc Xuân Hoa.

15


16


PHẦN II
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CƯÚ
2.1. Vật liệu
2.1.1. Nguyên liệu thực vật.
Cây Xuân Hoa mọc hoang ở nhiều nơi, được coi là cây thuốc quí có uy
tín trong dân gian ở các tỉnh thành miền Bắc, nhất là thủ đô Hà Nội.
Lá Xuân Hoa dùng nghiên cứu được thu nhận tại Hà Nội (mùa hè và
mùa thu), được loại bỏ các lá nát, lá héo úa, lá sâu... sau đó được đưa về
phòng thí nghiệm rửa sạch, cắt bỏ cuống và sấy khô 60oC và nghiền nhỏ

thành bột mịn.
2.1.2. Hóa chất, thiết bị.
Hóa chất: Glucoz, phenol đỏ,axit sunfuaric, xanh bromnothymol,
butanol, trichloroaxetic, cresol, etalnol 96o, chlorophom, Na2SO4, HCl,
H2SO4, NaOH, xanh metylen, axetat chì. Dung dịch BSA (bovine seurum
albumin) , anthron, Các hóa chất khác có độ sạch phân tích.
Máy móc,

thiết bị:

máy quang

phổ 8452 ADIODEARAY

SPECTROPHOTOMETER, máy li tâm Sorvall RC26 plus, Máy đo độ nhớt
Fann VG, máy vontexed, tủ sấy, máy xay, cân kĩ thuật, bể ổn nhiệt, buret,ống
phancol, ống ependoc,..và các dụng cụ thủy tinh cần thiết
2.2. Phương pháp nghiên cứu.
2.2.1. Xử lý nguyên liệu.
Lá cây Xuân Hoa sau khi thu hái, rửa sạch, phơi chỗ râm mát đến ráo
nước rồi sấy khô ở nhiệt độ khoảng 50-60oC ở trong tủ sấy, xay nhỏ lá thành
bột.
2.2.2. Các phản ứng định tính đặc trưng.
+ Cho 1ml dung dịch mẫu đã chiết vào ống nghiệm, thêm 3ml etanol
96º,nếu xuất hiện tủa màu trắng chứng tỏ có polisaccarit.
+ Lấy 1ml dung dịch mẫu đã chiết vào ống nghiệm, trộn đều trong 1ml
NaOH 10% , nếu có polisaccarit thì dung dịch chuyển sang màu vàng.
17



+ Cho 3ml dung dịch đã chiết vào ống nghiệm, nhỏ 5 giọt axetat chì
10% nếu phản ứng có kết tủa trắng chứng tỏ có polisaccarit.
+ Cho 1ml dung dịch đã chiết vào ống nghiệm, thêm 2ml xanh metylen.
Nếu sản phẩm cho màu xanh da trời thì chứng tỏ nguyên liệu là polisaccarit
pectic.
2.2.3. Định lượng polisaccarit bằng phương pháp phenol-sunfuric axit.
- Nguyên lý cơ bản của phương pháp: Đây là phương pháp so màu
được sử dụng rộng rãi nhất hiện nay để xác định nồng độ carbohydrat trong
dung dịch [Dourado, 2004]. Nguyên tắc cơ bản của phương pháp này là
carbohydrat khi phản ứng với dung dịch axit sunfuric đặc, tạo ra sản phẩm là
các dẫn xuất furfural. Sự phát triển của các dẫn xuất furfural và phenol được
xác định bằng phương pháp so màu.
- Cách tiến hành phản ứng màu: Pha glucoz 1mg/ml rồi từ dung dịch
pha lấy ra lượng khác nhau( bảng 2.1), ống đối chứng thay bằng nước, cho tác
dụng với 200µl phenol 5%, cho thêm 1ml axit sunfuric, để 10 phút, sau đó
vortexed 30 giây và để 20 phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó đo ở bước sóng
490nm. Mẫu đối chứng được chuẩn bị giống như trên, chỉ thay 400µl mẫu
bằng nước cất.
Bảng 2.1: Xây dựng đồ thị chuẩn glucoz theo DuBoietal
STT

Glucoz

H20

Lượng

Phenol

Axit


Kết quả

(1mg/ml)

(µl)

glucoz

5%

sunfuric

đo OD

(µg)

(µl)

(ml)

(490nm)

(µl)
1

10

390


10

200

1

0,096

2

20

380

20

200

1

0,26

3

30

370

30


200

1

0,44

4

40

360

40

200

1

0,62

5

50

350

50

200


1

0,70

18