TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM HUẾ
KHOA THỦY SẢN
----------

BÁO CÁO
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Tên đề tài:

Nghiên cứu phân lập một số chủng xạ khuẩn
có khả năng kháng khuẩn tại Thừa Thiên Huế
SVTH : Nguyễn Phương Nam
Lớp : Ngư Y 46
GVHD : TS. Nguyễn Ngọc Phước

NĂM 2016

1


NỘI DUNG THUYẾT TRÌNH

I

ĐẶT VẤN ĐỀ

II

NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

III

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

IV

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

2


I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong tình hình nuôi tôm thâm canh và bán thâm ngày càng khó khăn,
người nông dân thường lạm dụng việc sử dụng hóa chất và thuốc
kháng sinh, gây ra suy thoái môi trường và tạo ra các vi khuẩn đa
kháng thuốc . . .(Cục Thủy sản, 2014)
Xu hướng hiện nay là sử dụng các chủng vi khuẩn cụ thể được phân
lập từ các trang trại nuôi tôm bị ô nhiễm để nâng cao hiệu quả xử lý ô
nhiễm môi trường ở các khu vực nông nghiệp (Kumar, 2009),
Trong môi trường nước, xạ khuẩn tiết ra các loại kháng sinh làm ức
chế sự tăng trưởng của vi khuẩn gây bệnh trong ao nuôi, đặc biệt là
Vibrio harveyi, V. alginolitycus, V. Vulnificus (Mohanraj và Sekar,
2013)
3


II. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
2.1 Đối tượng nghiên cứu
Xạ khuẩn (Actinobacteria).
2.2. Phạm vi nghiên cứu
- Thời gian nghiên cứu: 05/01/2016 đến 08/05/2016.

- Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm bộ môn bệnh
Thủy Sản, khoa Thủy Sản, trường Đại học Nông Lâm Huế.

4


II. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
Phân lập các chủng xạ khuẩn từ các ao nuôi công
nghiệp tôm thẻ chân trắng và vùng đất ngập mặn
(Rú Chá) ở Thừa Thiên-Huế.

2.1 Nội dung
nghiên cứu

Đánh giá khả năng kháng khuẩn của các chủng xạ khuẩn
phân lập được với các vi khuẩn gây bệnh trên tôm
(Vibrio parahaemolyticus).

Đánh giá khả năng sản xuất enzyme
của các chủng xạ khuẩn phân lập được.
5


2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Phương pháp phân lập xạ khuẩn
Phân lập chọn lọc các xạ khuẩn theo Laskshmi, (2008)

Thu mẫu


Cấy truyền MT2

xử lý tại 55°C trong
60 phút

Cấy trang MT1

Xử lý CaCO3, ủ ở 28°C/
7 ngày

Pha loãng,10^-3

6


2.2.2 Thử khả năng kháng khuẩn của các chủng xạ khuẩn
2.2.2.1 Phương pháp đục lỗ thạch

Tăng sinh Vibrio
parahaemolyticus
trong 20 ml môi
tường TSA 2 %
NaCl, ủ ở 28oC

4-5
ngày

Cấy trang 20 μl
dịch nuôi cấy lên
TSA 2 % NaCl


Đục
lỗ

100 μl dịch xạ
khuẩn vào các
lỗ, để khô ủ
280C 4 – 5
ngày và đọc
kết quả

7


2.2.2 Thử khả năng kháng khuẩn của các chủng xạ khuẩn
2.2.2.2 Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC)
dung dịch 1 - Tăng sinh Vibrio parahaemolyticus TSB ở 28oC , sau 24h, 5000
vòng/phút trong 15 phút, pha loãng với nước muối sính lý về 10^5 cfu/ml .
dung dịch 2 - Tăng sinh xạ khuẩn trong môi trường lỏng MT2 ,33oC, 5 - 7 ngày, 5000
vòng/phút trong 15 phút, phần lỏng sau ly tâm sẽ được sử dụng trong thí nghiệm

150 μl (dd1) + 150 μl
(dd2)
1(-)
(dd 1)

2(2-1)

Khuấy đều,
150 μl


3(2-2),
...,
11(2-9)

12(+)
(dd 2)

ủ 33oC
24 giờ, kiểm
tra sự phát
triển vi khuẩn
ở các giếng

Đối chứng
8


2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.3 Khảo sát khả năng phân giải enzyme của xạ khuẩn.
Dùng khuẩn lạc của xạ khuẩn trong ống thạch nghiêng cấy lên các môi
trường, ủ trong 4-5 (28 ± 2°C) ngày và đọc kết quả

Amylase

Lipase

Gelatinase

Cellulase


Thạch tinh bột
Harigan và
Maccance
(1972)

Tributyrin Agar
(Rhodes, 1959)
pH 7

Fraziers gelatin
pH 7.0

Cellulose
Riviere, (1961)
pH 6.8

Xuất hiện các
vòng có dạng
trong xung quanh
khuẩn lạc của xạ
khuẩn.

Ngâm các giấy
với Fraziers có
chlorua thủy
ngân đặt vào
trong đĩa có xạ
khuẩn phát triển,
xuất hiện các

vòng

Xuất hiện vòng
xung quanh
khuẩn lạc của xạ
khuẩn

Nhỏ dung dịch
Iodine lên khuẩn
lạc của xạ khuẩn
phát triển, dung
dịch không đổi
sang màu xanh

9


III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1 Phân lập xạ khuẩn từ mẫu bùn đáy
Bảng 3.1.1. Kết quả phân lập xạ khuẩn ở các vùng nuôi và thời gian
thu mẫu.
Lần
1
2
3
4
5

Thời gian thu mẫu


Địa điểm thu mẫu

Chủng xạ khuẩn

20/01/2016

Phong Hải

Chủng PH 1.3

20/01/2016

Rú Chá

Không có

23/02/2016

Phong Hải

Chủng PH 5.1

23/02/2016

Điền Lộc

Không có

27/02/2016


Phú Vang

Không có

27/02/2016

Phú Mỹ

Không có

01/03/2016

Phong Điền

Không có

01/03/2016

Phú Hải

Không có

25/04/2016

Phú Thanh

Không có

25/04/2016


Phú Thuận

Không có
10


III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Bảng 3.1.2. Đặc điểm hình thái của hai chủng xạ khuẩn phân lập trên các
môi trường nuôi cấy MT1 và MT2.
Môi trường

Đặc điểm

Khuẩn lạc
MT1
Nhuộm
Gram

Khuẩn lạc
MT2

Nhuộm Gram

Chủng PH 1.3
Đều, tròn màu trắng
đục,khuẩn lạc phẳng, khô
mặt không trơn, thời gian
xuất hiện 6 ngày , đường
kính 8 mm (hình 3.1)


Chủng PH 5.1
Đều, khuẩn lạc ăn sâu vào
môi trường, màu trắng,
mặt không trơn, thời gian
xuất hiện khuẩn lạc 7
ngày, đường kính 10 mm (
hình 3.3)

+, dang sợi, không có vách
+, dạng sợi mảnh, dính
ngăn, có sinh nhánh không
chùm (Hình 3.7)
bị đứt (hình 3.5)
Đều, nhô cao, màu trắng
đục tròn, khô mặt không
trơn, thời gian xuất hiện 3
ngày, đường kính 12 mm
(hình 3.2)

Đều, nhô cao, màu trắng
tròn, khô mặt không trơn,
thời gian xuất hiện 4 ngày,
đường kính 18 mm ( hình
3.4)

+, dang sợi, không có vách
+, dạng sợi mảnh, dính
ngăn, có sinh nhánh không
chùm (hình 3.8)
bị đứt (hình 3.6)


11


III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1.1 Khuẩn lạc của hai chủng PH 1.3 và PH 5.1 trên mt MT1 và MT2

Hình 3.1 Khuẩn lạc PH 1.3 trên môi trường MT 1

Hình 3.3 Khuẩn lạc PH 3.3 trên môi trường MT 1

Hình 3.2 Khuẩn lạc PH 1.3 trên môi trường MT 2

Hình 3.4 Khuẩn lạc PH 3.4 trên môi trường MT 2 12


3.1.2 Kết quả nhuộm Gram hai chủng PH 1.3 và PH 5.1

Hình 3.5. Tiêu bản nhuôm Gram PH 3.1 trên môi

Hình 3.6. Tiêu bản nhuôm Gram PH 3.1 trên môi
trường MT2 soi vật kính 100x

trường MT1 soi vật kính 100x

Hình 3.7. Tiêu bản nhuôm Gram PH 5.1 trên môi
trường MT1 soi vật kính 100x

Hình 3.8. Tiêu bản nhuôm Gram PH 5.1 trên môi
trường MT2 soi vật kính 100x


13


III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.2 Kết quả thử khả năng kháng khuẩn của chủng xạ khuẩn phân lâp
3.2.1 Kết quả thử khả năng kháng khuẩn của 2 chủng xạ khuẩn bằng phương
pháp đục lỗ thạch .

Hình 3.9 Kết quả kháng chủng vi
khuẩn Vibrio parahaemolyticus của
chủng xạ khuẩn PH 1.3

Hình 3.10 Kết quả kháng chủng vi
khuẩn Vibrio parahaemolyticus của
chủng xạ khuẩn PH 5.1
14


III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.2.2. Kết quả xác định nồng độ tối thiểu (MIC)
Bảng 3.2.2.2 Sự phát triển chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus với
các nồng độ pha loãng của 2 chủng xạ khuẩn PH 1.3 và PH 5.1
Nồng độ pha loãng xạ khuẩn
Chủng

ĐC
-

1:2


1:4

1:8

1:16

1:64

1:128

1:256

1:512

1:1024

1:2048

ĐC
+

PH
1.3

-

-

-


-

-

-

-

+

+

+

+

+

-

-

-

-

-

-


+

+

+

+

+

+

PH
5.1

- : Có sự xuất hiện vi khuẩn chết
+ : Không có sự xuất hiện của vi khuẩn chết
ĐC (-) chủng xạ khuẩn ban đầu
ĐC (+) chủng vi khuẩn không bổ sung xạ khuẩn
15


III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.3 Khảo sát khả năng phân giải enzyme của xạ khuẩn
Bảng 3.3.1 Kết quả khảo sát khả năng phân giải enzyme của 2 chủng xạ
khuẩn PH 1.3 và PH 5.1.
Chủng xạ khuẩn

cellulase


amylase

lipase

gelatinase

PH 1.3

+

-

-

+

PH 5.1

+

+

-

-

Ghi chú: (+) Có khả năng sinh enzyme;
(-) Không có khả năng sinh enzyme
16



IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
5.1 Kết luận
Từ 20 mẫu bùn thu từ các ao nuôi tôm tại Thừa Thiên Huế, phân
lập được 2 chủng xạ khuẩn PH 1.3 và PH 5.1
2 chủng xạ khuẩn phân lập được đều sản xuất enzyme cellulase,
chủng PH 1.3 sản xuất enzyme gelatinase, chủng PH 5.1 sản xuất
enzyme amylase..
Nồng độ tối thiểu ức chế của 2 chủng xạ khuẩn PH 1.3 và P.H 5.1
với chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus lần lượt là 1/128 và 1/64.

17


IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
5.1 Kiến nghị
Nghiên cứu sâu hơn đặc điểm, tính chất của 2 chủng xạ khuẩn để
phát triển và đưa vào ứng dụng trong thực tế.
Nghiên cứu tìm phương pháp thích hợp và cho kết quả chính xác
hơn trong thí nghiệm thử khả năng kháng khuẩn của xạ khuẩn bằng
phương pháp đục lỗ

18


Một số hình ảnh trong quá trình làm đề tài

Hố ga thu mẫu tại Phong Hải


Nuôi xạ khuẩn trong tủ ấm

Ly tâm xạ khuẩn

Pha loãng mẫu bùn đáy

19


Nhuộm Gram

Hấp môi trường

Đo OD
Kết quả MIC
20


XIN CHÂN THÀNH CẢM ƠN
QUÝ THẦY CÔ VÀ TẤT CẢ CÁC BẠN
ĐÃ CHÚ Ý THEO DÕI

21