BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ THỊ MAI ANH
1101017

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT
VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA
CÂY RẬN TRÂU (DIOSCOREA SP.) HỌ
CỦ NÂU (DIOSCOREACEAE)
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2016


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ THỊ MAI ANH
1101017

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT
VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY
RẬN TRÂU (DIOSCOREA SP.) HỌ CỦ
NÂU (DIOSCOREACEAE)
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
TS. Nguyễn Hoàng Tuấn
DS. Nguyễn Thị Tươi
Nơi thực hiện:
1. Bộ môn Dược liệu

2. Viện Dược liệu

HÀ NỘI – 2016


LỜI CẢM ƠN
Trong thời gian nghiên cứu và thực hiện khóa luận tốt nghiệp, tôi đã nhận được rất
nhiều sự quan tâm, ủng hộ, hướng dẫn của thầy cô, bạn bè và gia đình.
Với lòng biết ơn và kính trọng sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS.
Nguyễn Hoàng Tuấn – giảng viên bộ môn Dược liệu trường Đại học Dược Hà Nội,
DS. Nguyễn Thị Tươi đã trực tiếp hướng dẫn, tận tình chỉ bảo, cho tôi những lời
khuyên quý báu trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.
Tôi xin chân thành cảm ơn các anh chị trong khoa Hóa Thực vật – Viện Dược liệu,
đặc biệt là ThS. Nguyễn Thị Duyên đã hỗ trợ, tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn
thành tốt khóa luận.
Tôi xin cảm ơn toàn thể các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên Bộ môn Dược liệu
đã tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ tôi xuyên suốt quá trình nghiên cứu.
Tôi xin cảm ơn Ban giám hiệu, phòng Đào tạo và toàn thể thầy cô giáo giảng viên
Trường Đại học Dược Hà Nội đã truyền cho tôi kiến thức cùng nhiệt huyết của thầy cô
trong suốt những năm học tập tại trường.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn vô hạn tới gia đình, bạn bè đã luôn ở bên
động viên, khích lệ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu.
Hà Nội, ngày 10 tháng 5 năm 2016
Sinh viên

Lê Thị Mai Anh


MỤC LỤC


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................................. 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN .......................................................................................... 3
1.1.

Chi Dioscorea L. ................................................................................................... 3

1.1.1. Vị trí phân loại của chi Dioscorea L. ................................................................ 3
1.1.2. Đặc điểm thực vật của chi Dioscorea L. .......................................................... 3
1.1.3. Phân bố ............................................................................................................. 4
1.1.4. Ứng dụng của chi Dioscorea L. ....................................................................... 4
1.1.4.1. Ứng dụng trong đời sống ............................................................................ 4
1.1.4.2. Ứng dụng trong y học ................................................................................. 4
1.2.

Diosgenin ............................................................................................................. 5

1.2.1. Ứng dụng của diosgenin.................................................................................... 5
1.2.2. Các loài thuộc chi Dioscorea dùng làm nguyên liệu chiết xuất diosgenin ....... 6
1.2.3. Các phương pháp chiết xuất diosgenin ............................................................. 8
1.2.4. Các phương pháp định lượng diosgenin ........................................................... 9
1.3.

Nần gừng (Dioscorea dissimulans) .................................................................... 10

1.3.1. Đặc điểm thực vật ........................................................................................... 10
1.3.2. Đặc điểm sinh học, sinh thái và phân bố......................................................... 11
1.3.3. Ứng dụng ......................................................................................................... 11

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................ 12
2.1.

Nguyên vật liệu, thiết bị ..................................................................................... 12

2.1.1. Nguyên liệu .................................................................................................... 12
2.1.2. Hóa chất, dụng cụ ........................................................................................... 12


2.1.3. Thiết bị ........................................................................................................... 13
2.2.

Nội dung nghiên cứu .......................................................................................... 13

2.2.1. Nghiên cứu đặc điểm thực vật......................................................................... 13
2.2.2. Nghiên cứu thành phần hóa học ...................................................................... 13
2.3.

Phương pháp nghiên cứu.................................................................................... 13

2.3.1. Nghiên cứu về thực vật ................................................................................... 13
2.3.2. Nghiên cứu về thành phần hóa học .................................................................. 14
CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ................................. 15
3.1.

Kết quả nghiên cứu về thực vật.......................................................................... 15

3.1.1. Mô tả đặc điểm thực vật và xác định tên khoa học của cây Rận trâu ............ 15
3.1.2. Đặc điểm vi phẫu ........................................................................................... 19
3.1.2.1. Vi phẫu lá .................................................................................................. 19

3.1.2.2. Vi phẫu thân .............................................................................................. 20
3.1.2.3. Vi phẫu thân rễ .......................................................................................... 21
3.1.3. Đặc điểm bột .................................................................................................. 22
3.1.3.1. Đặc điểm bột lá ......................................................................................... 22
3.1.3.2. Đặc điểm bột thân ..................................................................................... 23
3.1.3.3. Đặc điểm bột thân rễ ................................................................................. 24
3.2.

Kết quả nghiên cứu về hóa học .......................................................................... 25

3.2.1. Định tính sơ bộ các nhóm chất bằng phản ứng hóa học ................................ 25
3.2.1.1. Định tính flavonoid ................................................................................... 25
3.2.1.2. Định tính alcaloid ..................................................................................... 26
3.2.1.3. Định tính glycosid tim ............................................................................... 26
3.2.1.4. Định tính coumarin ................................................................................... 28
3.2.1.5. Định tính tanin .......................................................................................... 29
3.2.1.6. Định tính anthranoid ................................................................................. 29
3.2.1.7. Định tính chất béo, caroten, sterol ........................................................... 30
3.2.1.8. Định tính đường khử, acid hữu cơ, acid amin .......................................... 30


3.2.1.9. Định tính polysaccarid .............................................................................. 31
3.2.1.10. Định tính saponin .................................................................................... 31
3.2.2. Chiết xuất, phân lập và xác minh diosgenin .................................................. 34
3.2.2.1. Chiết xuất .................................................................................................. 34
3.2.2.2. Phân lập diosgenin.................................................................................... 35
3.2.2.3. Xác minh chất D2 ...................................................................................... 36
3.2.3. Định lượng diosgenin ..................................................................................... 37
3.2.3.1. Chuẩn bị mẫu ............................................................................................ 37
3.2.3.2. Phân tích mẫu ........................................................................................... 38

3.3.

Bàn luận ............................................................................................................. 40

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ......................................................................................... 43
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

16 – DPA:

16-dehydro pregnenolon acetat

HPLC

High Performance Liquid Chromatography

:

(Sắc ký lỏng hiệu năng cao)
HPTLC

:

High Performance Thin Layer Chromatography
(Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao)

SKLM


:

Sắc ký lớp mỏng

STT

:

Số thứ tự

TT

:

Thuốc thử

SD

:

Standard deviation (Độ lệch chuẩn)

UV

:

Ultra violet (Phổ tử ngoại)

DD


:

Dung dịch


DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 1.1. Các loài Dioscorea quan trọng được sử dụng để sản xuất
diosgenin trong công nghiệp
Bảng 3.1. So sánh đặc điểm thực vật của cây Rận trâu với loài có đặc điểm gần
nhất thuộc chi Dioscorea L., họ Củ nâu (Dioscoreaceae)

7
17

Bảng 3.2. Tiến hành xác định chỉ số phá huyết

32

Bảng 3.3. Kết quả định tính sơ bộ các nhóm chất trong thân rễ Rận trâu

33

Bảng 3.4. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của diosgenin

38

Bảng 3.5. Hàm lượng diosgenin trong thân rễ Rận trâu


39


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Trang
Hình 3.1.1. Một số đặc điểm hình thái của cây Rận trâu

16

Hình 3.1.2. Vi phẫu lá Rận trâu

20

Hình 3.1.3. Vi phẫu thân Rận trâu

21

Hình 3.1.4. Vi phẫu thân rễ Rận trâu

22

Hình 3.1.5. Một số đặc điểm bột lá Rận trâu

23

Hình 3.1.6. Một số đặc điểm bột thân Rận trâu

24

Hình 3.1.7. Một số đặc điểm bột thân rễ Rận trâu


25

Hình 3.2.1. Sắc ký lớp mỏng chất D2 với diosgenin đối chiếu

37

Hình 3.2.2. Đồ thị biểu diễn đường chuẩn của diosgenin

39


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Việt Nam là nước nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới, có thảm thực vật rất phong
phú và đa dạng với hơn một nghìn loài thực vật bậc cao, trong đó có hàng nghìn loài
cây có ích, được sử dụng làm thuốc, rau, gỗ, nhuộm… Cha ông ta từ xưa đã biết dùng
cây cỏ để phòng và chữa bệnh, tuy nhiên việc sử dụng chủ yếu dựa vào kinh nghiệm
của nhân dân từng địa phương. Do đó việc nghiên cứu cây thuốc nhằm làm sáng tỏ cơ
sở khoa học của kinh nghiệm dân gian là vấn đề rất cấp bách và cần thiết.
Ngày nay, Dược liệu không những được sử dụng trong những bài thuốc hay bào
chế dưới dạng các biệt dược mà còn là nguồn nguyên liệu chiết xuất ra các chất tinh
khiết để bào chế thuốc hoặc làm nguyên liệu bán tổng hợp ra các thuốc khác. Nhờ
những tiến bộ khoa học kỹ thuật, con người có thể tách được ngày càng nhiều chất tinh
khiết từ dược liệu, trong đó không thể không nhắc đến diosgenin.
Khoảng 50 – 60% dẫn chất steroid dùng làm thuốc trên toàn cầu được sản xuất từ
diosgenin. Tuy chất này có mặt trong nhiều họ thực vật, song “chỉ có họ Dioscoreaceae
(chi Dioscorea L.) thì mới có giá trị thực tế” trong việc khai thác chiết xuất diosgenin
[17]. Hằng năm, ước tính ngành Dược cần 10.000 tấn thân rễ các loài thuộc chi

Dioscorea để sản xuất diosgenin [29]. Nhu cầu về lượng thân rễ các loài thuộc chi
Dioscorea để sản xuất diosgenin ngày càng lớn, trong khi nguồn nguyên liệu cung cấp
ngày càng giảm do sự khai thác quá mức [22], [29], [31]. Điều này đòi hỏi cần tìm
thêm những nguồn nguyên liệu khác cung cấp diosgenin.
Gần đây chúng tôi mới phát hiện một loài Dioscorea sp. tại Đà Nẵng mà người dân
địa phương gọi là cây Rận trâu. Cho đến nay, theo tổng quan tài liệu chưa thấy có
nghiên cứu nào sâu về cây này ở Việt Nam. Để góp phần vào việc tìm hiểu và nâng cao
giá trị sử dụng dược liệu Rận trâu, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm


2

thực vật và thành phần hóa học của cây Rận trâu (Dioscorea sp.) họ Củ nâu
(Dioscoreaceae)” với mục tiêu:
 Góp phần xây dựng tiêu chuẩn dược liệu và giám định tên khoa học cây Rận
trâu.
 Chiết xuất và phân lập diosgenin trong thân rễ Rận trâu.
 Định lượng diosgenin trong thân rễ Rận trâu


3

Chương 1. TỔNG QUAN
1.1.

Chi Dioscorea L.

1.1.1. Vị trí phân loại của chi Dioscorea L.
Vị trí phân loại của chi Dioscorea L. trong hệ thống phân loại thực vật của
Takhatajan 1987 [4] như sau:

Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta)
Lớp Hành (Liliopsida)
Phân lớp Hành (Liliidae)
Bộ Củ nâu (Dioscoreales)
Họ Củ nâu (Dioscoreaceae)
Chi Dioscorea L.
1.1.2. Đặc điểm thực vật của chi Dioscorea L.
 Thực vật chí Trung Quốc [33] mô tả:
Cây thảo có thân quấn. Thân rễ hay rễ củ, đa dạng về màu sắc, hình dạng, thành
phần hóa học và khả năng cắm sâu dưới mặt đất. Có hành con ở nách lá hoặc không có
hành con. Lá có cuống, mọc so le hay mọc đối, đơn hay kép chân vịt, có 3 – 9 gân
chính. Hoa đơn tính (cây khác gốc, hiếm khi lưỡng tính), sắp xếp theo hình xoắn ốc ở
nách lá, cụm hoa bông thon dài hay chùm, hay theo cụm hoa xim, thường kết hợp đồng
thời nhiều kiểu, đôi lúc tập hợp lại thành chùm kép ở ngọn hay nách lá bằng cách giảm
bớt những lá mọc đối diện. Hoa đực: nhị 6 hoặc 3 có khi lép hay không có. Hoa cái
mọc thành cụm bông dài 3,5 – 10cm, hoa thưa, bộ nhụy gồm 3 lá noãn, bầu dưới 3 ô,
mỗi ô chứa 2 noãn. Quả nang 3 cánh, mở từ đỉnh khi chín. Hạt nhỏ thường có cánh
chạy dọc quả.
 Thực vật chí Đông Dương [21] mô tả:
Cây cỏ lâu năm hoặc hàng năm. Bộ phận dưới mặt đất giàu chất dự trữ (tinh bột).
Thân leo, có những loài thì thân quấn sang phải, số khác thì quấn sang trái. Lá nguyên,


4

một số ít trường hợp là lá kép, lá mọc xen kẽ hoặc mọc đối. Kiểu hoa: đa phần là hoa
đơn tính, hiếm khi gặp kiểu hoa khác. Hoa thường không có cuống hoặc có cuống rất
ngắn, mọc thành chùm hay bông rủ xuống. Lá đài và cánh hoa giống nhau, lá đài 3,
cánh hoa 3. Hoa đực: nhị 6 hoặc 3 có khi lép hay không có và nhị rất ngắn. Hoa cái
giữa các loài trong chi không khác nhau lắm, các đặc điểm không phong phú như hoa

đực. Bầu 3 ô, mỗi ô chứa 2 noãn, noãn ngược, đầu nhụy 6 tạo thành 3 cặp. Quả nang
chẻ ô có 3 cánh. Quả mở bằng cách nứt dọc theo mép của cánh với trục quả. Hạt 6, có
cánh ở tất cả các loài.
1.1.3. Phân bố
Chi có khoảng 600 loài, phân bố rộng ở vùng nhiệt đới châu Á, Australia, châu Mỹ
[9]. Ở châu Á có khoảng 140 loài [21]. Ở Việt Nam có khoảng hơn 40 loài [4], [6], [9],
[33].
1.1.4. Ứng dụng của chi Dioscorea L.
1.1.4.1. Ứng dụng trong đời sống
 Do thân rễ chứa nhiều chất dinh dưỡng nên một số loài thuộc chi Dioscorea
được sử dụng làm lương thực, chế biến thức ăn, đặc biệt khi thiếu đói, giáp hạt như:
Khoai mỡ (D. alata), Củ từ (D. esculenta), Khoai rạng (D. glabra), Củ mài (D.
persimilis)… [4], [6], [9], [20].
 Thân rễ chứa tanin, dùng để nhuộm lưới và quần áo như: Củ nâu (D. cirrhosa),
Từ ngược mùa (D. intempestiva) … [4], [6], [9], [20].
 Thân rễ một số loài có độc, dùng để diệt chấy rận, duốc cá, tẩm mũi tên như:
củ Mài gừng (D. zingiberensis), Từ poilane (D. poilanei), Từ tam giác (D. deltoidea),
Củ nần (D. hispida)… [6], [9], [20].
1.1.4.2. Ứng dụng trong y học
 Một số loài dùng để chiết xuất diosgenin từ thân rễ. Ngoài ra, nhiều loài thuộc
chi Dioscorea được sử dụng làm thuốc. Dưới đây là một số tác dụng của các loài
Dioscorea:


5

 Bổ dưỡng, nhất là khi cơ thể suy nhược, thận suy: D. alata, D. esculenta, D.
glabra, D. persimilis… [4], [6].
 Chỉ huyết, tiêu ứ huyết: D. bulbifera, D. cirrhosa, D. esculenta… [4], [6], [9].
 Mạnh gân xương, trị phong thấp, đau lưng, mỏi gối: D. hispida, D.

pentaphylla, D. collettii… [4], [6], [9].
 Trị sưng tấy, vết thương phần mềm: D. esculenta, D. chingii, D. subcalva, D.
pentaphylla, D. hispida …[4], [6], [9].
 Giải các loại thuốc độc: D. esculenta [4], [6], [9].
 Các loài thuộc chi Dioscorea có chứa phytoestrogens, các chất này có nhiều
tác dụng kháng độc tố như làm chậm quá trình lão hóa của cơ thể và tăng cường sức
khỏe toàn diện nhất là ở phụ nữ. Gần đây, thân rễ của các loài thuộc chi Dioscorea
được xác định có tác dụng điều chỉnh đáp ứng miễn dịch, kháng viêm, chống loãng
xương. Thêm nữa, tác dụng chống oxy hóa của dioscorin – một protein dự trữ trong
thân rễ của các loài thuộc chi Dioscorea cũng được nghiên cứu rộng rãi. Các nhà khoa
học đã chứng minh được rằng sử dụng thân rễ các loài thuộc chi Dioscorea có thể cải
thiện một số bất thường về chuyển hóa, bao gồm tăng đường huyết, bất thường chức
năng ruột và chuyển hóa lipid [30].
1.2.

Diosgenin

1.2.1. Ứng dụng của diosgenin
Diosgenin được chứng minh là có tác dụng duy trì ổn định mức cholesterol máu và
là nguyên liệu khởi đầu cho việc tổng hợp một số sản phẩm nội tiết như:
dehydroepiandrosteron, progesteron. Diosgenin có tác dụng ngăn ngừa sự mất xương ở
mức độ tương tự estrogen. Do vậy diosgenin được sử dụng để điều trị cho bệnh nhân
sau mãn kinh để làm giảm sự tiến triển loãng xương [34].
Diosgenin có tác dụng ức chế kết tập tiểu cầu và huyết khối, kéo dài thời gian
thromboplastin (APTT), thời gian thrombin (TT), thời gian prothrombin (PT). Do đó,


6

nó có tác dụng trong việc điều trị các bệnh về tim mạch như bệnh mạch vành và cơn

đau thắt ngực [25].
Bên cạnh đó diosgenin còn có khả năng ức chế sự tồn tại, sự phát triển và gia tăng
của các tế bào ung thư vú [23], [26].
Ứng dụng quan trọng của diosgenin đó là nguồn nguyên liệu bán tổng hợp ra 16 –
dehydro pregnenolon acetat (16 – DPA), là chất trung gian để tổng hợp các dẫn xuất
steroid. Khoảng 50 – 60% dẫn chất steroid dùng làm thuốc trên toàn cầu được sản xuất
từ diosgenin. Hàng năm, ước tính ngành dược cần 10.000 tấn thân rễ các loài thuộc chi
Dioscorea để sản xuất diosgenin [29], [31].
Trong số hàng trăm sapogenin steroid được biết cho đến nay, thực tế cũng chỉ có
khoảng mười chất có giá trị kinh tế lớn vì 2 lí do:
 Có nguồn nguyên liệu tự nhiên dồi dào hoặc trồng trọt dễ, có năng suất cao.
 Hệ thống Spiroketal trong cấu trúc của chúng dễ dàng bị phá để cho ra hợp chất
trung gian là dehidropregnenolon acetat (DPA) là khung cơ bản để tổng hợp các
thuốc steroid.
Diosgenin là chất có ưu thế nhất về 2 phương diện trên [8].
1.2.2. Các loài thuộc chi Dioscorea dùng làm nguyên liệu chiết xuất diosgenin
Trong thực tế, để tổng hợp các hormon steroid, người ta dùng chủ yếu diosgenin vì
khoảng 90% các dẫn chất steroid dùng làm thuốc được sản xuất đều đi từ nguyên liệu
là diosgenin. Mặc dù diosgenin có gặp trong họ Liliaceae (chi Trillium), họ
Zygophyllaceae (chi Tribulus), họ Solanaceae (chi Solanum), họ Leguminosaceae (chi
Trigoella), họ Zingiberaceae (chi Costus), họ Taccaceae (chi Tacca) nhưng chỉ có họ
Dioscoreaceae mới có giá trị thực tế [17].
Theo số liệu của Barua và cộng sự năm 1954, 1956 có trên 50 loài thuộc chi
Dioscorea chứa diosgenin [30]. Những loài thuộc chi Dioscorea như D. deltoidea
Wall, D. composita Hemsl., D. floribunda M.Martens & Galeotti chứa hàm lượng
saponin steroid đáng kể thường có thân quấn ngược chiều kim đồng hồ [17]. Phần lớn


7


diosgenin được sản xuất trên thế giới xuất xứ từ các loài Trung Mỹ, chủ yếu là D.
floribunda và D. composita, cả hai loài đều mọc hoang ở bản địa [30]. Trong thân rễ
của D. floribunda và D. composita có thành phần diosgenin và yamogenin chiếm gần
90% glycosid toàn phần, cả hai đều là những tiền chất steroid có giá trị, D. deltoidea
chứa diosgenin ở trạng thái tinh khiết nhất, nên có giá cao trên thị trường steroid [24].
Tuy nhiên đáng buồn là các công ty đã khai thác một lượng lớn thân rễ loài này từ các
khu rừng, bất chấp những quy định nghiêm ngặt về khai thác, những vùng ở Kashmir
và Himachal Prades bị khai thác cạn kiệt hoàn toàn. Nghiêm trọng hơn là ở những nơi
D. deltoidea còn sót lại, thành phần diosgenin giảm mạnh so với trước [22]. Ngày nay,
đa phần thuốc tránh thai Tân dược được tổng hợp toàn phần, song ở Ấn Độ và Trung
Quốc thuốc tránh thai đường uống và một số thuốc có khung steroid khác lại được bán
tổng hợp từ diosgenin – một chất được chiết xuất từ các loài thuộc chi Dioscorea.
D. nipponica và D. zingiberensis chứa diosgenin và được trồng nhiều ở Trung
Quốc, nước sản xuất diosgenin nhiều nhất hiện nay [21].
Bảng 1.1. Các loài thuộc chi Dioscorea quan trọng được sử dụng để sản xuất
diosgenin trong công nghiệp trên thế giới [31]
Loài

Xuất xứ

D. composita Hemsl.
D. mexicana Scheidw.

Mexico

D. floribunda M.Martens & Galeotti
D. deltoidea Wall. ex Griseb.
D. sylvatica Eckl.

Ấn Độ

Nam Phi, Zimbabue

D. collettii Hook.f.
D. panthaica Prain & Burkill

Trung Quốc

D. nipponica Makino
Tại Việt Nam, vào những năm 1980, Nguyễn Hoàng, Lê Đình Bích, Nguyễn Bá
Hoạt và cộng sự đã tiến hành điều tra cơ bản nguồn nguyên liệu cung cấp diosgenin ở


8

Việt Nam trong 4 họ: Dioscoreaceae (chi Dioscorea), Costaceae (chi Costus),
Zygophyllaceae (chi Tribulus), Taccaceae (chi Tacca). Qua đó phát hiện 4 loài có triển
vọng làm nguyên liệu chiết xuất diosgenin [10], [11]:
+ D. dissimulans (hàm lượng diosgenin 2%)
+ D. membranaceae (hàm lượng diosgenin 2 – 2,3%)
+ D. collettii (hàm lượng diosgenin 2,5 – 4,4%)
+ D. zingiberensis (hàm lượng diosgenin 1,4 – 2,4%)
Về mối liên quan giữa hình thái thực vật và thành phần hóa học, các loài thuộc chi
Dioscorea có hàm lượng saponin steroid đáng kể ở Việt Nam, bên cạnh đặc điểm thân
rễ và dây leo quấn trái, đều có những cặp gai cong ở gốc cuống lá [10].
Cũng trong thời gian này, Viện Dược liệu [18], [20] di thực 3 loài thuộc chi
Dioscorea vào Việt Nam: D. composita, D. floribunda và D. deltoidea và đã xác định
điều kiện trồng, chăm sóc phù hợp với 3 loài trên. Tuy nhiên, sapogenin thu được từ D.
composita và D. floribunda đều có tạp chất pennogenin (hàm lượng pennogenin trong
sản phẩm từ vết đến 35% đối với D. composita và từ 1 – 5% đối với D. floribunda).
Các nhà khoa học đã nghiên cứu xử lý tạp chất pennogenin song không thành công.

Nghiên cứu bán tổng hợp 16 – DPA từ hỗn hơp diosgenin – pennogenin chưa biết tỷ lệ
thành phần, chiết xuất từ D. composita và D. floribunda cho thấy hiệu suất chỉ bằng 1/2
so với điều chế từ diosgenin có hàm lượng trên 90%.
Các nhà khoa học tại Viện Dược liệu đã xây dựng quy trình chiết xuất diosgenin từ
dược liệu, áp dụng để chiết diosgenin từ D. floribunda trên quy mô phòng thí nghiệm
và quy mô bán công nghiệp. Từ diosgenin chiết được đã tổng hợp 16 – DPA và các dẫn
xuất steroid [7], [18].
1.2.3. Các phương pháp chiết xuất diosgenin
Bột dược liệu sau khi thủy phân bằng acid, trung tính hóa và sấy khô ta được bột
dược liệu đã xử lý và là nguyên liệu chiết xuất diosgenin.
 Chiết bằng Soxhlet


9

Cân 1 lượng dược liệu đã xử lý, gói lại bằng giấy lọc. Chuyển gói dược liệu vào
trong Soxhlet, tiến hành chiết xuất diosgenin. Sử dụng dung môi chloroform để chiết
xuất.
 Chiết bằng CO2 siêu tới hạn
Cân 1 lượng dược liệu đã xử lý, ngâm trương nở dược liệu trong một lượng đồng
dung môi (tùy theo điều kiện khảo sát) trong khoảng 30 phút – 1 giờ.
Tiến hành chiết xuất bằng dung môi siêu tới hạn trong các điều kiện khảo sát cụ thể
về dung môi, áp suất, nhiệt độ, thời gian… Dịch chiết thu vào bình nón có nút. Cất
quay loại dung môi ta thu được cắn chiết [27].
1.2.4. Các phương pháp định lượng diosgenin
 Phương pháp cân
Bột dược liệu được thủy phân bằng acid, chiết bằng dung môi hữu cơ, sau đó bốc
hơi dung môi, sấy, cân [16].
 Phương pháp đo quang
Bột dược liệu được thủy phân, chiết bằng dung môi hữu cơ, sau đó tiến hành sắc ký

lớp mỏng để xác minh diosgenin. Diosgenin được chiết bằng chloroform, lên màu bằng
FeCl3 và H3PO4 – H2SO4 (10:1) (tt/tt), đo ở bước sóng 485nm [16].
 Phương pháp sắc ký khí
Bột dược liệu được ủ men, thủy phân, trung tính hóa, sấy khô, hòa tan trong dung
môi với chất nội chuẩn cholesterol rồi phân tích bằng máy sắc ký khí [13].
 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
Bột dược liệu được thủy phân, chiết bằng dung môi hữu cơ, bốc hơi dung môi, hòa
tan trong methanol rồi phân tích bằng máy HPLC [32].
 Phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC)
Bột dược liệu được thủy phân, chiết bằng dung môi hữu cơ, bốc hơi dung môi, hòa
tan cắn trong chloroform. Chấm sắc ký của mẫu, cùng với dãy diosgenin đối chiếu. Sau
đó đo mật độ quang vết sắc ký bằng Densitometer [2], [28].


10

1.3.

Nần gừng (Dioscorea dissimulans)

1.3.1. Đặc điểm thực vật
 Sách đỏ Việt Nam mô tả [3]:
Dây leo bằng thân quấn về bên trái; dài 1,5 – 3m; đường kính thân leo 0,25 – 0,35
cm. Thân rễ nạc, nằm ngang, phân nhánh, màu vàng nhạt. Rễ chùm nhiều, cứng. Lá có
cuống, mọc so le, cuống dài 2,5 – 4 cm, gốc cuống lá có 2 u nhỏ giống như gai. Phiến
lá gồm 3 lá chét, hình thuôn hay elip nhọn đầu, 6 – 9 × 2 – 3 cm, lá chét giữa lớn hơn 2
lá bên, gốc 2 lá chét bên gần tròn và hơi lệch; 5 gân chính, gân phụ hơi rõ ở mặt dưới.
Hoa đơn tính khác gốc, cụm hoa dạng bông, mọc ở kẽ lá. Hoa đực không cuống, dạng
chuông, trên miệng xẻ 6 răng; 6 nhị, dẹt. Hoa cái có cuống ngắn, 2 mm; lá bắc nhỏ; bao
hoa 6 cánh; bầu 3 ngăn. Quả nang gồm 3 cánh, dài 25 – 28 mm, rộng 18 mm. Hạt hình

ovan, hơi dẹt, 5 × 8 mm, có cánh mỏng.
 Nguyễn Hoàng và cộng sự mô tả [14]:
Thân dây leo (hoặc bò lan trên mặt đất ở những bãi đất trống) quấn sang trái, dài
đến 5m, đường kính thân 2 – 3mm, thân có từng cặp gai cong, dài 1 – 2mm ở hai gốc
cuống lá. Lá mọc so le có cuống dài 5 – 7cm mang 3 lá chét, lá chét ở giữa to và dài
hơn, hình trứng nhọn ở đầu, hai lá bên bé hơn, hình trứng lệch, phiến lá có 3 gân xuất
phát từ gốc. Củ có nhiều nhánh, nhìn hao hao giống củ gừng, có nhiều gai nhọn và rễ
con cứng phân bố đều trên mặt củ. Cây tập trung ở những khu rừng thưa có ánh sáng
hoặc đồi chè, đất pha cát, ven các bờ mương, bờ suối.
 Cây cỏ Việt Nam mô tả [12]:
Củ dài 20 cm, to 3 – 4 cm, có u do đáy rễ, nạc trắng; thân leo, quấn qua trái, không
gai. Lá mọc xen, do 3 lá phụ thon dài, mỏng, không lông, lá giữa to hơn, gân từ đáy 5;
đáy cuống có u như gai. Chùm như gié thòng; hoa có cọng ngắn, 2 – 2,5 mm. Nang có
cánh cao 18 mm; hột xoan, to 5 – 8 mm, có một cánh nâu dợt quanh.
 Thực vật chí Việt Nam mô tả [9]:


11

Dây leo nhiều năm, dài 5 – 10 m, quấn trái; thân nhẵn hình trụ, không có lông; thân
rễ dạng củ, nằm ngang, có thể phân nhánh, dài 20 cm, đường kính 3 – 4 cm, có u lồi to,
vỏ ngoài màu vàng nâu, ruột màu trắng. Lá kép, 3 lá chét, mỏng, mọc cách, cuống dài
5 – 6 cm, 2 bên gốc cuống có u như gai; lá chét giữa to nhất, hình mũi giáo, dai, nhẵn,
5 gân từ gốc, kích thước 8 × 3 – 5 cm, chất giấy, mép nguyên, 2 mặt không có lông,
chóp nhọn, gốc tù, cuống ngắn; các lá chét bên kích thước chỉ bằng 1/2 lá chét giữa,
gốc lệch. Hoa đều, đơn tính, khác gốc, mẫu 3. Cụm hoa bông đực chưa thấy, có thể
giống với cụm hoa đực của loài Dioscorea simulans của Trung Quốc. Cụm hoa bông
cái rủ xuống. Hoa cái: cuống hoa dài 0,2 – 0,3 cm; bao hoa 6 mảnh, hình trứng hoặc
hình trứng rộng. Bầu hạ, 3 ô, mỗi ô 2 – nhiều noãn, đính noãn trung trụ; vòi nhụy hình
trụ; đầu nhụy 3 thùy, 6 nhị thoái hóa, đính đối diện với mảnh bao hoa. Quả nang, cuống

dài 0,5 – 0,6 cm, cong gập lại, 3 cạnh dạng cánh, dài 2,5 – 2,8 cm, rộng 1,8, đỉnh tròn,
mở theo khe dọc từ đỉnh. Hạt hình trứng, kích thước 0,8 × 0,5 cm, có cánh dạng màng,
bao xung quanh.
1.3.2. Đặc điểm sinh học, sinh thái và phân bố
Mùa hoa tháng 6 – 7, quả tháng 7 – 9. Nhân giống tự nhiên chủ yếu từ hạt. Phần
thân leo lụi hàng năm vào mùa đông và mọc lại vào đầu năm sau.
Cây ưa sáng hoặc hơi chịu bóng. Thường leo lên cây bụi nhỏ hay cỏ ở ven rừng,
nhất là hành lang ven suối ở cửa rừng, hay bờ các nương rẫy, ở độ cao 400 – 600 m.
Phân bố: + Ở Việt Nam: Quảng Nam (Trà My: Trà Giác, Duy Xuyên), Quảng
Ngãi, Bình Định (An Lão: An Toàn), Khánh Hòa (Khánh Sơn: Trung Hạp; Khánh
Vĩnh), Đà Nẵng (Bà Nà), Phú Yên (Đồng Xuân: Đa Lộc) [3], [9].
+ Trên thế giới: Trung Quốc [3].
1.3.3. Ứng dụng
Thân rễ có diosgenin, làm nguyên liệu bán tổng hợp thuốc chống viêm, hormon
sinh dục, thuốc tránh thụ thai… (chú ý độc không ăn được) [3], [9].


12

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1.

Nguyên vật liệu, thiết bị

2.1.1. Nguyên liệu
Mẫu Rận trâu thu hái ở Đà Nẵng vào tháng 2 năm 2015.
Thân rễ được rửa sạch, thái lát mỏng, sấy khô ở 600C, nghiền thành bột thô, bảo
quản nơi khô thoáng.
Một phần thân, lá, thân rễ được bảo quản trong cồn 600C để nghiên cứu đặc điểm
vi phẫu.

Một phần thân, lá, thân rễ được rửa sạch, thái lát mỏng, sấy khô ở 600C, nghiền
thành bột mịn để nghiên cứu đặc điểm bột.
2.1.2. Hóa chất, dụng cụ
Các hóa chất và thuốc thử đạt tiêu chuẩn phân tích theo quy định của Dược Điển
Việt Nam IV.
 Diosgenin đối chiếu của Viện Dược liệu.
 Bản mỏng silica gel 60 F254 Merck (kích thước hạt 9,5 – 11,5µm).
 Silica gel 60 F254 Merck (kích thước hạt 60 – 200 µm) dùng cho sắc ký cột pha
thường.
 Silica gel GF254 Merck (kích thước hạt 5 – 30 µm) dùng cho sắc ký điều chế.
 Hóa chất:
+ Acid sulfuric, acid clohydric, natri hydroxyd, natri carbonat…
+ Các thuốc thử dùng trong các phản ứng định tính: TT Mayer, Dragendorff,
Ninhydrin, Diazo…
+ Cloramin, cloralhydrat, acid acetic, xanh methylen, đỏ son phèn.
+ Thuốc thử vanillin trong acid sulfuric đặc.
+ Dung dịch đệm phosphat – natri clorid.


13

 Dung môi: Chloroform, methanol công nghiệp, methanol Merck, ethanol,
aceton, nước cất.
 Dụng cụ: bát sứ, ống nghiệm, pipet chính xác, pipet paster, bình nón, bình định
mức, cốc có mỏ, ống đong.
2.1.3. Thiết bị
 Bếp cách thủy, sinh hàn hồi lưu, Soxhlet.
 Máy đo quang phổ UV.
 Cân phân tích Precisa, cân kỹ thuật Sartorius.
 Máy đo độ ẩm Sartorius.

 Tủ sấy (Memmert, Đức).
 Đèn tử ngoại 2 bước sóng 254nm và 366nm.
 Kính hiển vi Labomed.
 Máy cắt vi phẫu cầm tay.
2.2.

Nội dung nghiên cứu

2.2.1. Nghiên cứu đặc điểm thực vật
 Mô tả đặc điểm hình thái của mẫu nghiên cứu theo khóa phân loại theo đơn vị
thứ để xác định tên khoa học của mẫu nghiên cứu.
 Mô tả đặc điểm vi phẫu của mẫu nghiên cứu:
+ Vi phẫu: thân, thân rễ, lá.
+ Soi bột: thân, thân rễ, lá.
2.2.2. Nghiên cứu thành phần hóa học
 Định tính sơ bộ các nhóm chất có trong mẫu Rận trâu.
 Chiết xuất, phân lập, định lượng diosgenin trong mẫu Rận trâu.
2.3.

Phương pháp nghiên cứu

2.3.1. Nghiên cứu về thực vật
 Đặc điểm hình thái thực vật:


14

 Quan sát và mô tả đặc điểm hình thái thực vật tại thực địa và chụp ảnh theo
phương pháp mô tả phân tích [5].
 Thu hái, làm tiêu bản mẫu cây khô.

 Nghiên cứu đặc điểm vi học
 Đặc điểm vi phẫu: vi phẫu được cắt bằng máy cắt cầm tay, tẩy và nhuộm bằng
phương pháp nhuộm kép, quan sát dưới kính hiển vi xác định đặc điểm vi phẫu
và chụp ảnh dưới kính hiển vi [5].
 Đặc điểm bột: lá, thân, thân rễ được sấy khô ở 600C, nghiền nhỏ thành bột bằng
cối sứ, rây lấy bột mịn, lên tiêu bản, quan sát dưới kính hiển vi để xác định đặc
điểm bột và chụp ảnh dưới kính hiển vi [15].
 Giám định tên khoa học của mẫu nghiên cứu:
Giám định tên khoa học của cây trên cơ sở phân tích các đặc điểm hình thái, đặc
điểm của bộ phận sinh sản, so sánh đối chiếu với mẫu tiêu bản lưu trữ tại một số phòng
tiêu bản mẫu khô, đối chiếu với khóa phân loại thực vật trong các tài liệu chuyên sâu
về thực vật [4], [6], [7], [9], [32] cùng với sự hỗ trợ của các chuyên gia phân loại thực
vật để xác định tên khoa học của loài.
2.3.2. Nghiên cứu về thành phần hóa học
 Định tính sơ bộ các nhóm chất: tiến hành các phản ứng định tính đặc trưng cho từng
nhóm chất [5].
 Chiết xuất diosgenin tham khảo phương pháp chiết xuất diosgenin từ D. floribunda
trong tài liệu [18]. Phân lập diosgenin bằng sắc ký cột, sử dụng pha tĩnh là Silicagel
60 Merck, rửa giải bằng các dung môi thích hợp và sắc ký điều chế. Xác minh
diosgenin bằng sắc ký lớp mỏng với chất đối chiếu.
 Định lượng diosgenin bằng phương pháp HPLC
Tiến hành định lượng diosgenin trong thân rễ Rận trâu bằng HPLC [1], [13], [14]
sử dụng phương pháp chuẩn ngoại, phương pháp chuẩn hóa nhiều điểm.Tham khảo
quy trình định lượng diosgenin trong D. zingiberensis bằng HPLC [25].


15

Chương 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1.


Kết quả nghiên cứu về thực vật

3.1.1. Mô tả đặc điểm thực vật và giám định tên khoa học của cây Rận trâu
 Mô tả đặc điểm thực vật:
Dây leo bằng thân quấn về bên trái, dài 2 – 4 m (Hình 3.1.1.A), thân leo nhẵn,
không lông, có những đốm màu tía nằm rải rác dọc thân và dày dần ở gốc cuống lá
(Hình 3.1.1.B,C). Thân leo hình trụ, nhỏ, đường kính 2,5 – 3,5 mm (Hình 3.1.1.B,C).
Thân rễ dài 10 – 15 cm, đường kính 0,8 – 1,5 cm, nạc, nằm ngang, có thể phân
nhánh, lớp vỏ ngoài sần sùi, màu vàng nâu, ruột màu trắng, hơi vàng, vị đắng (Hình
3.1.1.N). Thân rễ có những u lồi, đường kính khoảng 2mm (Hình 3.1.1.O). Rễ chùm
nhiều, cứng (Hình 3.1.1. L, M).
Lá có cuống, mọc so le, cuống dài 2 – 3 cm, thiết diện tròn, không lông, có đốm
màu tía, đốm thưa ở phần gốc cuống lá và dày dần khi đến gần thân; gốc cuống lá sát
với thân, tròn, hơi lõm, có kích thước lớn hơn phần cuống giữa, dài khoảng 5 mm, mọc
võng xuống dưới và không có đốm màu tía (Hình 3.1.1.E). Gốc cuống lá có 1 cặp gai
cong, nhọn, dài 1 – 2 mm (Hình 3.1.1.D). Lá kép hình chân vịt gồm 3 lá chét, phiến lá
hình bầu dục hay hình trứng, ngọn lá nhọn, gốc thuôn, kích thước 7 – 10 x 3 – 5 cm,
màu xanh lục, mặt dưới màu sậm hơn, cả 2 mặt đều không có lông, mép lá nguyên, hơi
gợn sóng. Lá chét giữa to và dài hơn; hai lá bên bé hơn, hình trứng lệch; phiến lá có 3
gân tỏa ra từ gốc, gân chính hơi lõm ở mặt trên, lồi lên ở mặt dưới. Gốc các lá chét
ngắn, có màu tía cả ở mặt trên và mặt dưới (Hình 3.1.1.F, G, H).
Cụm hoa chùm kép, mọc ở kẽ lá. Hoa nhỏ, đều, kích thước khoảng 1 × 1 mm, màu
xanh, có cuống rất ngắn, đơn tính khác gốc. Chùm đơn mọc ra từ kẽ mỗi lá bắc. Cả
cụm hoa được bao phủ bởi lớp lông tơ mềm (Hình 3.1.1.J, K).
Quả nang có 3 cánh, dài 1 – 2 cm, rộng 1,5 cm (Hình 3.1.1.I).
Mùa hoa tháng 6 – 7, mùa quả tháng 7 – 9.


16


Hình 3.1.1: Một số đặc điểm hình thái của cây Rận trâu
A – Dạng sống; B,C – Thân; D – Cặp gai cong; E, F, G, H – Lá; I – Quả; J, K – Cụm
hoa; L, M, N, O – Thân rễ