BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THU HƢƠNG
MÃ SINH VIÊN: 1101243

NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƢỢNG
SAPONIN TOÀN PHẦN TRONG
GIẢO CỔ LAM
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

HÀ NỘI - 2016


BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THU HƢƠNG
MÃ SINH VIÊN : 1101243

NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƢỢNG
SAPONIN TOÀN PHẦN TRONG
GIẢO CỔ LAM
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ
Người hướng dẫn:
1. PGS.TS Nguyễn Thị Kiều Anh
2. ThS. Ngô Minh Thúy
Nơi thực hiện:
Bộ môn Vật lý – Hóa lý

HÀ NỘI - 2016

LỜI CẢM ƠN
Để có thể hoàn thành khóa luận này, trước hết tôi xin bày tỏ lòng
kính trọng và sự biết ơn sâu sắc đến PGS.TS. Nguyễn Thị Kiều Anh,
người thầy đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và truyền đạt cho tôi những
kinh nghiệm nghiên cứu khoa học quý báu. Tôi cũng xin trân trọng gửi
lời cảm ơn đến ThS. Ngô Minh Thúy, người đã luôn giúp đỡ tôi giải
quyết những tình huống cấp bách và khó khăn trong suốt quá trình thực
hiện khóa luận này.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, các anh chị kĩ thuật
viên tại Bộ môn Vật lý – Hóa lý và Hóa phân tích – Độc chất, trường Đại
học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi nhất để tôi có thể hoàn thành
khóa luận tốt nghiệp đúng hạn.
Tôi rất cảm ơn công ty Traphaco đã hỗ trợ và giúp đỡ tôi có đầy
đủ hóa chất và nguyên vật liệu để tôi hoàn thành khóa luận này với kết
quả tốt nhất.
Cuối cùng, tôi muốn cảm ơn mọi người trong gia đình và bạn bè
đã dành cho tôi những tình cảm, sự cổ vũ và động viên trong cuộc sống
và học tập.
Hà Nôi, ngày 12 tháng 05 năm 2016

Sinh viên
Nguyễn Thu Hƣơng


Mục ục
LỜI CÁM ƠN
ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................... 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN .......................................................................... 2

1.1. TỔNG QUAN VỀ GIẢO CỔ LAM ................................................... 2
1.1.1. Đặc điểm chi Gynostemma Blume .................................................. 2
1.1.1.1. Vị trí phân loại chi Gynostemma Blume ................................... 2
1.1.1.2. Đặc điểm thực vật của chi Gynostemma Blume ....................... 2
1.1.1.3. Các loài trong chi Gynostemma tại Việt Nam .......................... 3
1.1.2. Đặc điểm loài Gynostemmsa pentaphyllum .................................... 3
1.1.2.1. Đặc điểm thực vật: .................................................................... 3
1.1.2.2. Thành phần hóa học của G. Pentaphyllum: .............................. 4
1.1.2.3. Phân bố:..................................................................................... 5
1.1.3. Tác dụng dược lý và độc tính .......................................................... 5
1.1.4. Một số ứng dụng làm thuốc và thực phẩm chức năng. ................... 6
1.2. ĐỊNH LƢỢNG HOẠT CHẤT TRONG GIẢO CỔ LAM ............. 6
1.2.1.

Phương pháp cân ............................................................................ 7

1.2.2.

Phương pháp đo quang ................................................................... 7

1.2.3.

Phương pháp HPLC........................................................................ 9

1.3. TỔNG QUAN VỀ PHỔ HẤP THỤ TỬ NGOẠI KHẢ KIẾN ( UVVIS) .............................................................................................................. 11
1.3.1. Phổ hấp thụ UV-VIS. .................................................................... 11
1.3.2. Định luật Lambert-Beer................................................................. 11
1.3.3. Ứng dụng quang phổ UV-VIS trong phân tích định lượng dung dịch
một thành phần .......................................................................................... 13
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........ 16



2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ .................................................... 16
2.1.1. Nguyên liệu ................................................................................... 16
2.1.2. Chất chuẩn, hóa chất, thuốc thử .................................................... 16
2.1.3. Dụng cụ, thiết bị ............................................................................ 17
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..................................................... 17
2.2.1. Xây dựng phương pháp phân tích ................................................. 17
2.2.2. Thẩm định phương pháp................................................................ 17
2.2.3. Phân tích mẫu thực ........................................................................ 18
2.2.4. Xử lý số liệu .................................................................................. 18
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN ...................... 19
3. 1. NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG . 19
3.1.1. Lựa chọn điều kiện đo quang ........................................................ 19
3.1.2. Khảo sát và lựa chọn quy trình xử lý mẫu .................................... 20
3.1.3. Quy trình phân tích ........................................................................ 24
3.2. THẨM ĐỊNH PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ............................... 25
3.2.1. Tính chọn lọc ................................................................................. 25
3.2.3. Độ lặp lại ....................................................................................... 28
3.2.4. Độ đúng ......................................................................................... 30
3.3. PHÂN TÍCH MẪU THỰC ............................................................... 31
3.4. BÀN LUẬN ......................................................................................... 33
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ........................................................................... 37
1. Kết uận .................................................................................................... 37
2. Đề xuất ..................................................................................................... 38
TÀI LIỆU THAM KHẢO


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
MeOH: Methanol

n-BuOH: n-Buthanol
G: Gynostemma


DANH MỤC CÁC BẢNG
STT

TÊN BẢNG

TRANG

1

Bảng 2.1. Các mẫu dược liệu Giảo cổ lam dùng trong nghiên
cứu

16

2

Bảng 3.1. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của dung môi chiết

26

3

Bảng 3.2. Kết quả khảo sát tuyến tính của quy trình định
lượng

27


4

Bảng 3.3. Kết quả đánh giá độ lặp lại của phương pháp với
mẫu M01

29

5

Bảng 3.4. Kết quả đánh giá độ đúng của phương pháp

30

6

Bảng 3.5. Kết quả hàm lượng saponin toàn phần tính theo
Gypenoside XVII trong các mẫu thử

32


DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH
STT

TÊN HÌNH

TRANG

1


Hình 1.1. Cấu trúc Dammaran thuộc nhóm Saponin
triterpen tetracyclic (a); Protopanaxadiol (b)

4

2

Hình 1.2. Cơ chế phản ứng tạo màu

8

3

Hình 1.3. Công thức cấu tạo của gypenoside XVII

10

4

Hình 1.4. Nguyên tắc của định luật Lambert-Beer

12

5

Hình 1.5. Đồ thị của phương pháp đường chuẩn A = f (C)

14


6

Hình 1.6. Đồ thị của phương pháp thêm đường chuẩn

15

7

Hình 3.1. Phổ hấp thụ của gypenoside XVII

20

8

Hình 3.2. Kết quả khảo sát kỹ thuật chiết

21

9

Hình 3.3. Kết quả khảo sát dung môi chiết

21

10

Hình 3.4. Kết quả khảo sát thời gian chiết

22


11

Hình 3.5. Kết quả khảo sát điều kiện tinh chế saponin (n
= 3)

23

12

Hình 3.6. Đồ thị biểu diễn tương quan tuyến tính giữa
nồng độ saponin gypenoside XVII và độ hấp thụ

27


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Hiện nay, xu hướng tìm kiếm nguồn thuốc mới và sử dụng thuốc từ thảo
dược ngày càng tăng. Việt Nam có ưu thế về nguồn cây phong phú và lịch sử
lâu đời sử dụng dược liệu trong phòng và điều trị bệnh, cũng như bổ dưỡng
nâng cao sức khỏe của người dân. Gỉao cổ lam hay Bổ đắng ( Việt Nam ) là
một cây được dùng phổ biến trong dân gian làm thuốc, chè uống và thức ăn.
Có nhiều nghiên cứu cho thấy chế phẩm G. Pentaphyllum rất có lợi cho sức
khỏe như điều trị bệnh tim mạch, bệnh tiểu đường, ung thư, viêm gan, các
bệnh thần kinh và có thể giúp giảm bớt căng thẳng, chống viêm, giảm mệt
mỏi, hạ cholesterol và triacylglycerol. Chất có hoạt tính trong G.
Pentaphyllum có thể là polysaccharide, flavonoid, saponin, carotenoid,
clorophyl và sterol. Trong đó, flavonoid và saponin được coi là nhóm chất có
hoạt tính sinh học chính.

Do có tác dụng tốt cho sức khỏe nên sản phẩm của G. Pentaphyllum được
tiêu thụ mạnh trên thị trường ở nhiều nước châu Á, châu Âu và cả ở Hoa Kỳ.
Các nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng có sự khác nhau lớn về thành phần hóa
học của các sản phẩm chứa G. Pentaphyllum lưu hành trên thị trường. Sự khác
nhau về thành phần hóa học có thể dẫn đến hiệu lực điều trị, liều, độ ổn định,
hạn dùng, độ an toàn... rất khác nhau, do đó cần thiết phải kiểm soát chất
lượng của sản phẩm. Xuất phát từ nhu cầu thực tế trên, khóa luận “định lượng
saponin toàn phần trong giảo cổ lam” được thực hiện với hai mục tiêu:
-

Xây dựng phương pháp định lượng saponin toàn phần

trong dược liệu Gỉao cổ lam bằng phương pháp quang phổ dùng
Gypenoside XVII làm chất đối chiếu.
-

Đánh giá hàm lượng saponin toàn phần trong một số mẫu

Giảo cổ lam thu thập được.


2

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. TỔNG QUAN VỀ GIẢO CỔ LAM

1.1.1. Đặc điểm chi Gynostemma Blume
1.1.1.1. Vị trí phân loại chi Gynostemma Blume
Theo các tài liệu Thực vật dược và phân loại thực vật, Cây cỏ Việt Nam
[15], chi Gynostemma Blume được xếp vào họ Cucurbitaceae (họ Bầu bí).

Vị trí của chi Gynostemma Blume trong hệ thống phân loại thực vật dược
như sau:


Ngành Ngọc lan Magnoliophyta



Lớp Ngọc lan Magnoliopsida



Phân lớp Sổ Dilleniidae



Liên bộ Hoa tím Violanae



Bộ Bí Cucurbitales



Họ Bầu bí Cucurbitaceae



Chi Gynostemma.


1.1.1.2. Đặc điểm thực vật của chi Gynostemma Blume
Chi Gynostemma Blume được mô tả đầu tiên bởi Blume vào năm 1825 dựa
trên đặc điểm hình thái của loài G. simplicifolium. Từ đó đến nay, đã có thêm
nhiều loài được mô tả. Các loài thuộc chi Gynostemma có các đặc điểm chung
như sau [15], [30]: Cây thảo, mảnh, thân leo, sống lâu năm. Lá kép, ít khi là lá
đơn, lá khía răng cưa. Tua cuốn chẻ đôi, đôi khi có tua cuốn đơn. Cụm hoa
khác gốc, dạng chùy mảnh, dài, nhất là đối với hoa đực. Hoa nhỏ, màu trắng
hoặc lục nhạt, có 3 lá bắc con, cuống hoa có đốt. Đài hoa hình bánh xe, chia 5


3

thùy, ngắn. Tràng hình bánh xe, hơi hàn liền phần gốc tràng, có đầu nhọn. Nhị
5, ở phần gốc chỉ nhị hàn liền thành cột. Bao phấn 1 ô, nhưng nhìn có vẻ như 2
ô. Nhụy: bầu hình cầu nhỏ, 2 – 3 ngăn, 2 – 3 vòi nhụy với đầu nhụy chia 2 – 3
đầu nhọn. Quả hình cầu lớn hơn hạt đậu, không mở, 2 – 3 hạt hình trứng hơi
dẹt 2 bên hoặc có 3 góc. Hạt sần sùi.

1.1.1.3. Các loài trong chi Gynostemma tại Việt Nam
Các loài của chi Gynostemma phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới châu Á và
Đông Nam Á từ Himalaya tới Nhật Bản, Malaysia và Tân Guinea. Tại Trung
Quốc có 14 loài (trong đó có 9 loài đặc thù). Tính đến nay đã có 3 loài thuộc
chi Gynostemma được công bố ở Việt Nam là Gynostemmsa pentaphyllum
(Thunb.) Makino, Gynostemma laxum (Wall.) Cogn và Gynostemma longipes
C.Y. Wu in C.Y. WU & S.K. Chen [16]. Loài G. pentaphyllum, loài phổ biến
nhất và được sử dụng làm thuốc.

1.1.2. Đặc điểm loài Gynostemmsa pentaphyllum
1.1.2.1. Đặc điểm thực vật:
Cây thảo, mọc leo, thân cành mảnh, có góc cạnh, không lông hoặc lông thưa

thớt ở mấu. Lá kép chân vịt – bàn đạp, 5 – 7 lá chét dài 3 – 9cm, rộng 1,5 –
3cm, mép lá có răng cưa.Tua cuốn mảnh, xẻ đôi ở đỉnh [10]. Cụm hoa đực
dạng chùm kép. Hoa có cuống mảnh cỡ 1 – 4 mm; ống đài rất ngắn, thùy đài
hình tam giác, dài khoảng 0,7 mm, đỉnh nhọn, thùy tràng hình bầu dục hoặc
mũi mác, đỉnh nhọn có một gân, nhị 5. Cụm hoa cái dạng chùm ngắn hơn hoa
đực. Hoa cái có đài và tràng giống hoa đực, bầu hình cầu 2 – 3 ô, vòi nhụy 3,
nhị lép 5, ngắn. Quả không tự mở, hình cầu, đường kính 5 – 6 mm, khi chín
màu đen. Hạt hình trứng hoặc hình tim, đường kính 4 mm, màu nâu, đỉnh tù,
gốc hình tim dẹt. Mùa hoa tháng 3 – 10, quả tháng 4 – 12 [3], [9], [10].
Cây mọc trên đá vôi, đá hoa cương và đất núi lửa, trong rừng thưa, lùm bụi
từ vùng đồng bằng đến vùng núi cao 2000m [10].


4

1.1.2.2. Thành phần hóa học của G. Pentaphyllum:
Các nghiên cứu đầu tiên đã phát hiện saponin có mặt trong giảo cổ lam
thuộc nhóm dammaran (hình 1.1.a). Đã có trên 100 saponin trong thành phần
Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino được phân lập và nhận dạng cấu
trúc, trong đó có 8 saponin giống như loại protopanaxadiol trong ginsenoside
của Panax ginseng C. A. Mayer là Rb1 (Gypenoside III) [24], [25], Rc [33],
Rb3 (Gypenoside IV), Rd (Gypenoside VIII), F2 [33], Rg3, malonyl-Rb1 và
malonyl-Rd [25]. Ngoài ra cũng phát hiện Rf là 1 protopanaxatriol [33] (hình
1b). Những ginsenoside đó chiếm khoảng 25% tổng gypenoside toàn phần
trong cây và là minh chứng đầu tiên của nhóm saponin nhân sâm được tìm
thấy ngoài họ Araliaceae [32]. Một số Gypenoside XXVIII, XXXVII, LV,
LXII, LXIII cũng tìm thấy trong loài Gymnema sylvestre (Retz) Schult [19].
Các saponin còn lại chiếm phần lớn các gypenoside được phát hiện lần đầu ở
loài G. pentaphyllum (Thunb.) Makino.


a

b

Hình 1. 1. Cấu trúc Dammaran thuộc nhóm
Saponin triterpen tetracyclic (a); Protopanaxadiol (b)


5

- Giảo cổ lam gồm 2 loại có vị ngọt và vị đắng. Nghiên cứu của tác giả [30]
so sánh thành phần các ginsenoside Rb1, Rb3, Rd, and F2 và saponin 20(S)panaxadiol trong dịch thủy phân của G.Pentaphyllum. Kết quả cho thấy hàm
lượng 4 ginsenoside và 20(S)-panaxadiol trong Gỉao cổ lam, vị ngọt lớn hơn
nhiều so với Giảo cổ lam vị đắng.
- Flavonoid trong Giảo cổ lam cũng được xác định, gồm có quercetin-di(rhamno)-hexoside, kaempferol 3-O-di-p-coumaroylh-exoside, kaempferol 3O-di-p-coumaroylhexoside, quercetin-rhamno-hexoside, rutin, kaempferolrhamno-hexoside, kaempferol-3-O-rutinoside, quercetin and kaempferol [18].

1.1.2.3. Phân bố:
- Loài G. pentaphyllum, loài phổ biến nhất và được sử dụng làm thuốc, phân
bố ở Ấn Độ, Nepal, Bangladesh, Srilanca, Lào, Myama, Hàn Quốc, Nhật Bản
và Việt Nam.

1.1.3. Tác dụng dược lý và độc tính
Về tác dụng dược lý
Trên thế giới loài G. pentaphyllum đã được nghiên cứu nhiều về tác dụng sinh
học, bao gồm tác dụng hạ đường huyết [12], [28], [34], điều trị bệnh tim mạch
[29], viêm gan [21], các bệnh thần kinh [13] và có thể làm giảm bớt căng thẳng
[17], [22], chống viêm [21], [23] giảm mệt mỏi [31]. Đặc biệt, tác dụng hạ
cholesterol và triacylglycerol [7], [14] đã được nghiên cứu thử nghiệm lâm
sàng và được sử dụng làm thuốc tại Trung Quốc, Nhật Bản.
Các nghiên cứu về loài G. pentaphyllum ở Việt Nam cũng cho thấy dược

liệu Giảo cổ lam có tác dụng chống oxy hóa, hạ cholesterol máu, hạ đường
huyết, chống khối u [6] và tăng đáp ứng miễn dịch [7].


6

Về độc tính
Nhóm

tác

giả

Thái

Lan

Natthakarn

Chiranthanut,

Supanimit

Teekachunhatean và cộng sự (2013) đã đánh giá độc tính của dịch chiết
Gynostemma pentaphyllum Makino trên chuột thí nghiệm kết quả không phát
hiện được liều gây độc trên chuột (liều 750 mg dược liệu/kg chuột không phát
hiện gây độc) [26].
Thực tế cho thấy, Giảo cổ lam đã được dùng từ lâu đời nhưng vẫn chưa có
ghi nhận nào về độc tính của dược liệu này được công bố.


1.1.4. Một số ứng dụng làm thuốc và thực phẩm chức năng.
Giảo cổ lam được dùng chủ yếu dưới 2 dạng là trà giảo cổ lam và viên nang
giảo cổ lam. Các sản phẩm này đều là thực phẩm chức năng, giúp hỗ trợ điều
trị bệnh mỡ máu cao, huyết áp cao, tiểu đường tuýp II. Ngoài ra các chế phẩm
còn tăng lưu thông máu, hỗ trợ điều trị đau đầu, hoa mắt, chóng mặt, giúp dễ
ngủ, ngủ sâu giấc, tăng khả năng làm việc, giảm căng thẳng, mệt mỏi.
Các sản phẩm từ Giảo cổ lam được lưu thông rộng rãi trên thị trường như
Giảo cổ lam Tuệ Linh, Giảo cổ lam Thiên Bảo, Giảo cổ lam Ba Tri, Giảo cổ
lam Tam Đảo… Các sản phẩm từ Giảo cổ lam cũng được lưu thông nhiều tại
các nước châu Á như Nhật Bản, Trung Quốc, Thái Lan, Việt Nam, châu Âu,
Mỹ,… Hiện nay, công ty Traphaco đang nghiên cứu để sản xuất dạng chế
phẩm thuốc.
1.2. ĐỊNH LƢỢNG HOẠT CHẤT TRONG GIẢO CỔ LAM
Các tài liệu công bố gần đây đã khẳng định thành phần hoạt chất chính
trong dược liệu Giảo cổ lam là saponin, flavonoid và các polysaccharid. Các
nghiên cứu đã phát hiện được khoảng hơn 100 saponin trong Giảo cổ lam, hầu
hết các chất này đều có khung dammaran, tuy vậy, không có chất nào chiếm đa
số.
Có nhiều phương pháp xác định hàm lượng saponin trong các mẫu giảo cổ


7

lam như phương pháp cân, phương pháp quang phổ, phương pháp HPLC.

1.2.1. Phương pháp cân
Cân chính xác khoảng 10 g bột dược liệu (qua rây số 355) đã xác định độ ẩm
cho vào túi giấy lọc, đặt túi vào bình Soxhlet, chiết bằng cloroform đến khi dịch
chiết không còn màu. Loại bỏ dịch cloroform. Chiết bằng methanol trong 2 giờ.
Lọc, lấy dịch lọc cất thu hồi dung môi đến còn khoảng 10 ml, rót từ từ vào 100 ml

aceton, khuấy đều. Lọc lấy tủa, hòa tan tủa trong 50 ml nước nóng, đun cách thủy
cho tan hết. Lọc lấy dịch lọc vào bình gạn và chiết saponin bằng n-butanol 8 lần,
mỗi lần với 25 ml n-butanol. Gộp dịch chiết, cất thu hồi dung môi, cô cách thủy
đến khô. Sấy cắn ở 60oC đến khối lượng không đổi. Cân và tính hàm lượng
saponin toàn phần theo dược liệu khô [1].

1.2.2. Phương pháp đo quang
Phương pháp đo quang có nhiều ưu thế khi áp dụng cho những hoạt chất
trong nhóm có cùng dạng cấu trúc, cùng tác dụng sinh học. Đa số các saponin
ít có nối đôi nên thường chỉ hấp thụ tử ngoại ở vùng sóng ngắn 210 - 195 nm.
Để có thể định lượng được cần thực hiện phản ứng với các thuốc thử khác
nhau tùy theo cấu trúc của saponin, sản phẩm tạo thành có khả năng hấp thụ ở
vùng khả kiến. Đo độ hấp thụ của dung dịch sau phản ứng, dựa vào chuẩn làm
trong cùng điều kiện, tính được hàm lượng saponin toàn phần.
Đối với nhóm triterpenoid có thể dùng thuốc thử vanillin – sulfuric; các
saponin cho màu tím với thuốc thử này. Một số nghiên cứu phản ứng màu của
saponin khung dammaran, cho thấy chính nhóm OH tại C3 là nguyên nhân gây
phản ứng loại H2O tạo ra sản phẩm có màu khi tác dụng với Vanillin/acid
sulfuric đặc. Cơ chế trình bày theo hình 1.2.
Phạm Tuấn Anh, Phạm Thanh Kỳ, Trịnh Thị Diệp Thanh [4] sử dụng
ethanol 70% chiết saponin từ 10 g dược liệu bằng chiết siêu âm, cất thu hồi


8

dung môi dưới áp suất giảm đến cắn, sấy ở 60oC đến cắn khô. Hòa tan cắn
trong nước cất và cho hấp phụ vào cột chứa Diaion HP-20 theo tỉ lệ 1:4 (thể
tích/thể tích). Để yên 1 giờ, rửa lần lượt bằng nước cất, MeOH 20% và MeOH
80% đến kiệt saponin (khoảng 200 ml). Thu dịch MeOH 80%, bốc hơi đến
cắn. Hòa tan cắn thu được bằng MeOH và đem phản ứng với thuốc thử

vanillin/acid acetic băng 3% và acid perchloric 70%, đặt lên bể điều nhiệt ở
80oC trong 10 phút. Làm lạnh nhanh bằng nước đá và đo quang ở bước sóng
550 nm. Tính kết quả saponin toàn phần dựa vào chuẩn ginsenoside Rb1.

Hình 1. 2. Cơ chế phản ứng tạo màu

Zhuohong Xie, et al., (2010), sử dụng ethanol tuyệt đối chiết 12 g dược liệu
(đã được làm nhỏ tới kích thước 40 mesh) bằng Soxhlet, dịch chiết cho phản
ứng với thuốc thử vanillin/ acid acetic 5% và acid perchloric 70%. Để hỗn hợp
ở 60oC trong 15 phút Làm lạnh nhanh bằng nước đá và đo quang ở bước sóng
550 nm. Tính kết quả saponin toàn phần dựa vào chuẩn là dịch chiết


9

gypenoside [36]

1.2.3. Phương pháp HPLC
Đây là phương pháp hiện nay được sử dụng nhiều trong định tính, định
lượng các chất nói chung và saponin nói riêng. Người ta có thể định lượng 1
thành phần hay đồng thời nhiều thành phần trong hỗn hợp. Để có thể áp dụng
cho định lượng 1 nhóm hoạt chất trong dược liệu cần chọn được 1 chất chỉ thị
(marker) có tác dụng hoặc chỉ thị phân tích – điều này rất khó giải quyết trong
định lượng saponin ở Giảo cổ lam vì hiện nay chưa phát hiện chất nào có tác
dụng nổi trội hoặc có hàm lượng lớn nhất.
Dược điển Hồng Kông, chuyên luận “Gynostemmatis Herba” đối với
Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino (Cucurbitaceae) tiến hành định
lượng panaxadiol trong mẫu dược liệu bằng cách hoạt chất được chiết bằng
methanol, sau đó cô dưới áp suất giảm được cắn. Hòa tan cắn trong acid
hydrocloric (29,5% kl/tt) và đun hồi lưu trong 4 giờ. Để nguội và chiết bằng

dicloromethan. Cô dưới áp suất giảm được cắn. Hòa tan cắn trong methanol và
tiến hành phân tích bằng HPLC với detector tán xạ ánh sáng bay hơi (ESLD).
Yêu cầu hàm lượng panaxadiol (C30H52O3) không nhỏ hơn 0,094% tính theo
dược liệu khô. Tuy nhiên, các công bố thu thập được và khảo sát sơ bộ bằng
thực nghiệm của nhóm nghiên cứu chúng tôi thì không phát hiện có panaxadiol
trong các mẫu Giảo cổ lam Việt Nam dùng trong nghiên cứu.
Tác giả Lu, J.G., et al., [20] đã so sánh hàm lượng các chất có trong
Gynostemma pentaphyllum vị ngọt và vị đắng. Nhóm nghiên cứu sử dụng
UPLC-Q-TOF-MS và HPLC-ELSD để định tính và định lượng các saponin
trong 21 mẫu dược liệu. Kết quả đã chỉ ra rằng 10/10 mẫu Giảo cổ lam đắng
hàm lượng 4 ginsenoside Rb1, Rb3, Rd, F2 hầu như không có hoặc rất thấp
trung bình 8,3 µg/g so với 823,9 µg/g của 11 mẫu Giảo cổ lam ngọt. Cụ thể là
10/10 mẫu không có Rb1, Rb3, Rd 5/10 mẫu không có, 5/10 mẫu có Rd nhưng
hàm lượng thấp hơn rất nhiều so với loại Giảo cổ lam ngọt (từ 3,6 – 33,7 g/g


10

so với 129 – 835 g/g – 11 mẫu nghiên cứu), F2 7/10 mẫu không có, 3/10 mẫu
có F2 nhưng hàm lượng thấp hơn rất nhiều so với loại Giảo cổ lam ngọt (từ 2,5
– 11,2 µg/g so với 8,4 – 476,2 µg/g– 11 mẫu nghiên cứu).Tác giả SHI Meirong et al. [27] dùng HPLC với detectơ UV đo ở bước sóng 203 nm định lượng
3 ginsenoside Rb1, Rb3, Rd và gypenoside XVII, XLIX trong 32 mẫu
Gynostemma pentaphyllum ngọt và đắng thu hái tại các cùng khác nhau ở
Trung Quốc kết quả cho thấy khoảng 2/3 số mẫu không có chứa Rb1, Rb3, đa
số các mẫu đều có Gypenoside XVII và XLIX và Rd.
Tác giả Kao, T.H., et al., đã xác định được 34 gypenoside trong
Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino bằng LC-MS/MS [18].
Từ những tài liệu thu thập được, chúng tôi thấy rằng trong Giảo cổ lam có
rất nhiều saponin (gypenoside) nhưng không có saponin gypenoside nào có
hàm lượng đủ lớn hoặc tác dụng dược lý nổi bật để làm đối tượng định lượng

do đó lựa chọn đối tượng định lượng là nhóm chất saponin sẽ phản ánh chất
lượng của dược liệu Giảo cổ lam khách quan hơn. Chất đối chiếu sử dụng là
một gypenoside có trong Giảo cổ lam là gypenoside XVII với cấu trúc được
trình bày ở hình 1.3.

Hình 1. 3. Công thức cấu tạo của gypenoside XVII


11

Tên khoa học: 3β-(β-D-Glucopyranosyloxy)-12β-hydroxy-5α-dammar-24en-20-yl
(beta-D

6-O-β-D-glucopyranosyl-β-D-glucopyranoside;(3beta,12beta)-3Glucopyranosyloxy)-12-hydroxydammar-24-en-20-yl-6-O-beta-D-

glucopyranosyl-beta-D-glucopyranoside.
Công thức phân tử: C48H82O18
Trọng lượng phân tử: 947.158
Độ tan: Gypenoside XVII tan trong pyridin, methanol, ethanol.

1.3. TỔNG QUAN VỀ PHỔ HẤP THỤ TỬ NGOẠI KHẢ
KIẾN ( UV-VIS)
1.3.1. Phổ hấp thụ UV-VIS.
Khi tia bức xạ tương tác với vật chất có thể xảy ra một số quá trình: phản
xạ, hấp thụ, tán xạ, huỳnh quang và quang hóa. Khi đo quang phổ tử ngoại
khả kiến, người ta mong muốn chỉ có quá trình hấp thụ xảy ra. Vì bức xạ điện
từ là các hạt mang năng lượng nên khi phân tử hấp thụ, nó sẽ kích thích hệ
electron của phân tử và làm tăng nội năng của nó. Năng lượng tổng của một
phân tử bao gồm: năng lượng chuyển động tịnh tiến của phân tử ( Et ), năng
lượng của điện tử ( Ee ), năng lượng của các dao động ( Ev ) và năng lượng

của chuyển động quay ( Er )
Phương trình biểu diễn:

E_tổng = Et + Ee + Ev + Er
(Ee >> Ev >> Er)

Sự hấp thụ bức xạ tử ngoại – khả kiến có thể làm thay đổi mức năng lượng
điện tử Ee và là nguồn gốc của phổ UV-VIS. Do đó phổ UV-VIS được gọi là
phổ điện tử.

1.3.2. Định luật Lambert-Beer.


12

Định luật là cơ sở lý thuyết cho phép định lượng bằng quang phổ UV-VIS. Khi
chiếu một chùm tia sáng đơn sắc bước sóng  với cường độ ánh sáng I0 đi qua
dung dịch đồng nhất có nồng độ C, bề dày l thì cường độ ánh sáng sau đó chỉ
còn lại I.

Hình 1. 4. Nguyên tắc của định uật Lambert-Beer

Mối quan hệ giữa I và I0 được biểu diễn bằng biểu thức:
I = I0.10-.l.C
Trong đó:  là hệ số hấp thụ riêng của dung dịch, chỉ phụ thuộc vào bản chất
chất tan và bước sóng của ánh sáng chiếu vào dung dịch.
T=I/Io.100% được gọi là độ truyền qua.
A=(Io-I)/Io.100% được gọi là độ hấp thụ.
Độ lớn của độ truyền qua T hay độ hấp thụ A phụ thuộc bản chất của chất
tan, chiều dày lớp mỏng và nồng độ của dung dịch.

* Điều kiện áp dụng định luật:
- Chùm tia sáng phải đơn sắc.
- Dung dịch phải có nồng độ nằm trong khoảng thích hợp.
- Dung dịch phải trong suốt
- Chất thử phải bền trong dung dịch (khoảng 10-20’) và phải bền dưới tác


13

dụng của ánh sáng UV-VIS.

1.3.3. Ứng dụng quang phổ UV-VIS trong phân tích định lượng
dung dịch một thành phần
Đối với dung dịch một thành phần có thể sử dụng các kĩ thuật định lượng
sau:
 Tính toán trực tiếp từ mật độ quang đo đƣợc.
- Với các chất có mật độ hấp thụ riêng biết trước chính xác và ổn định ở một
bước sóng nào đó, người ta có thể đo mật độ quang của dung dịch chất đó
trong dung môi tương ứng tại bước sóng này.
- Nồng độ dung dịch tính theo công thức sau:
A = ε.l.C => C =
- Muốn áp dụng công thức thì máy quang phổ phải được chuẩn hóa về bước
sóng và mật độ quang, dung dịch phải trong suốt và có nồng độ đáp ứng của
định luật Lambert – Beer.
 So sánh với dung dịch chuẩn.
- Để xác định nồng độ Ct của dung dịch thử, ta tiến hành đo đông thời mật độ
quang At của dung dịch thử và Ac của dung dịch chuẩn có nồng độ Cc biết
trước trong cùng điều kiện thỏa mãn định luật Lambert – Beer.
- Nồng độ dung dịch thử được tính theo công thức sau:


 Kỹ thuật đƣờng chuẩn.


14

- Chuẩn bị từ 5-8 dung dịch chuẩn có nồng độ xác định và nằm trong khoảng
tuyến tính của định luật Lambert – Beer.
- Đo mật độ quang của từng dung dịch chuẩn và vẽ đồ thị biểu diễn mối tương
quan giữa mật độ quang và nồng độ của các dung dịch chuẩn. Từ đó rút ra
được phương trình đường chuẩn.
- Tiến hành đo đồng thời mật độ quang At của dung dịch thử có nồng độ Ct.
Dựa vào phương trình đường chuẩn thiết lập được ở trên ta tính được Ct khi đã
biết At.
- Trường hợp dãy chuẩn không tuân theo định luật Lambert – Beer (đường
chuẩn cong) thì cần làm thêm một số điểm chuẩn nữa với nồng độ gần nhau
hơn (khác nhau không quá 10%).

Hình 1.5. Đồ thị của phƣơng pháp đƣờng chuẩn A = f (C)

 Kỹ thuật thêm chuẩn.
- Thêm chính xác một được dung dịch chuẩn có nồng độ Cc xác định vào dung
dịch thử cần xác định nồng độ Ct.
- Tiến hành đo mật độ quang của 2 dung dịch trong cùng điều kiện thỏa mãn
định luật Lambert – Beer.
- Nồng độ dung dịch thử được tính theo côgn thức sau:


15

 Kỹ thuật thêm đƣờng chuẩn.

- Thêm những thể tích giống nhau của dãy thử vào dung dịch chuẩn chứa
những lượng khác nhau và chính xác của dãy chuẩn.
- Tiến hành đo mật độ quang của cả dãy nồng độ vừa thêm thử và xây dựng
đường chuẩn biểu thị mối tương quan giữa mật độ quang với lượng chất chuẩn
thêm vào.
- Giao điểm của đường chuẩn với trục hoành cho ta nồng độ của chất cần định
lượng:

Hình 1.6. Đồ thị của phƣơng pháp thêm đƣờng chuẩn


16

CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ

2.1.1. Nguyên liệu
Các mẫu Giảo cổ lam sử dụng trong nghiên cứu được xác định tên khoa học
(Gynostemma petaphyllum (Thunb.) Makino var. pentaphyllum) tại Lào Cai,
Hòa Bình và mẫu thu trên thị trường ... Bao gồm:
Bảng 2.1. Các mẫu Giảo cổ am dùng trong nghiên cứu

TT Tên mẫu

Nơi thu hái/

Mô tả

Nguồn gốc

Lào Cai

5 lá, bột thô, màu xanh nâu nhạt, mùi thơm dược

1

M01

2

M02

3

M03

Thị trường

Bột thô, màu xanh nâu nhạt, mùi thơm dược liệu

4

M04

Hòa Bình

Bột thô, màu xanh nâu nhạt, mùi thơm dược liệu

liệu
Lào Cai


7 lá, bột thô, màu xanh nâu nhạt, mùi thơm dược
liệu

2.1.2. Chất chuẩn, hóa chất, thuốc thử
- Chất chuẩn: Gypenoside XVII hàm lượng 98,0%, Số lô: CFS201502 của
Wuhan Chemfaces Biochemical Co. Ltd, Trung Quốc.
- Hóa chất, thuốc thử: vanilin (Reagent Plus – Sigma Aldrich, Mỹ), acid
acetic băng (Fluka, Mỹ), acid perchloric (ACS reagent – Sigma Aldrich, Mỹ),
methanol, ethyl acetat và n-butanol (Merck, Đức). Các hóa chất, thuốc thử đều
đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích


17

2.1.3. Dụng cụ, thiết bị
- Tủ sấy SHELLAB, Mĩ.
- Cân phân tích Metller Toledo (d = 0,01 mg), Thụy sỹ.
- Máy đo hàm ẩm Precisa XM 60, Thụy sỹ.
- Bể điều nhiệt Sartorius, Đức.
- Máy cất chân không BÜCHi ROTAVAPOR R-200, Canada.
- Máy quang phổ UV- VIS Hitachi U-1900 Nhật Bản.
- Pipet tự động 100 - 1000 µl.
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1. Xây dựng phương pháp phân tích
* Khảo sát và lựa chọn điều kiện chiết m ẫu
- Phương pháp chiết: chiết hoạt chất trong mẫu thử bằng
phương pháp Soxhlet và siêu âm. L ựa chọn phương pháp cho hi ệu
suất chiết cao với thời gian ngắn.

- Dung môi chiết: sử dụng các dung môi methanol, aceton và
ethanol. Lựa chọn dung môi cho hiệu suất chiết cao nhất.
- Thời gian chiết: chiết mẫu với thời gian chiết khác nhau. L ựa
chọn phương pháp cho hi ệu suất chiết cao.
* Điều kiện phản ứng và đo quang
Dựa vào tài liệu [2] đánh giá lại các điều kiện phân tích thay
đổi nếu cần thiết.

2.2.2. Thẩm định phương pháp
Thẩm định phương pháp phân tích theo hướng dẫn của AOAC với các chỉ
tiêu: tính chọn lọc, khoảng nồng độ tuyến tính, độ đúng, độ chính xác (độ lặp