BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI



NGUYỄN THỊ NHUNG


NGHIÊN CỨU ÐỊNH LƯỢNG FLAVONOID
VÀ POLYSACCHARID TRONG CÂY
Ô ÐẦU (A. carmichaeli Debx.) TRỒNG Ở
TỈNH HÀ GIANG



KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ



HÀ NỘI - 2014
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI


NGUYỄN THỊ NHUNG


NGHIÊN CỨU ÐỊNH LƯỢNG FLAVONOID
VÀ POLYSACCHARID TRONG CÂY
Ô ÐẦU (A.carmichaeli Debx.) TRỒNG Ở
TỈNH HÀ GIANG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn: 1. PGS.TS. Nguyễn Tiến Vững
2. ThS. Đỗ Thị Thanh Thủy
Nơi thực hiện: 1. Bộ môn hóa dược
2. Khoa Y Dược, ĐHQGHN

HÀ NỘI - 2014

LỜI CẢM ƠN

Trước hết, em xin chân thành bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc
tới PGS. TS. Nguyễn Tiến Vững - Phó Viện trưởng Viện Pháp y Quốc gia và
ThS. Đỗ Thị Thanh Thủy - Giảng viên bộ môn Hóa Dược, đã hướng dẫn tận
tình, động viên và giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn tới ThS.Vũ Đức Lợi – Giảng viên Khoa Y
Dược Đại học Quốc gia Hà Nội, các anh chị kĩ thuật viên bộ môn Hóa Dược
Trường Đại học Dược Hà Nội và khoa Y dược Trường Đại học Quốc gia Hà
Nội, đã giúp đỡ em trong suốt quá trình làm thực nghiệm.
Xin cảm ơn Ban giám hiệu, Phòng đào tạo, các phòng ban đã tạo mọi
điều kiện giúp em hoàn thành khóa luận. Cảm ơn các thầy cô trường Đại học
Dược Hà Nội đã quan tâm dìu dắt và truyền thụ kiến thức cho em trong 5
năm học vừa qua.
Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè đã luôn ủng hộ,
động viên và khích lệ em trong quá trình học tập và làm khóa luận.

Hà Nội, tháng 5 năm 2014
Sinh viên


Nguyễn Thị Nhung
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
MỤC LỤC
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 2
1.1. Tổng quan về cây Ô Đầu 2
1.1.1. Đặc điểm thực vật 2
1.1.2. Phân bố và trồng hái 3
1.1.3. Bộ phận dùng 3
1.1.4. Thành phần hóa học 3
1.2. Tổng quan về Flavonoid 4
1.2.1. Định nghĩa, cấu trúc và phân loại 4
1.2.2. Tính chất 4
1.2.3. Các phương pháp định lượng flavonoid trong dược liệu 5
1.3. Tổng quan về polysaccharid 7
1.3.1. Định nghĩa, cấu trúc và phân loại 7
1.3.2. Tính chất 7
1.3.3. Phương pháp định lượng polysaccharid trong dược liệu 8
1.4. Tổng quan về phương pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại khả kiến (UV-VIS)
…… 9
1.4.1. Nguyên tắc 9
1.4.2. Các kỹ thuật định lượng bằng phương pháp đo quang 11
1.5. Thẩm định phương pháp phân tích 13
1.5.1. Độ đặc hiệu 13
1.5.2. Độ tuyến tính 13
1.5.3. Độ lặp lại 13
1.5.4. Độ đúng 14

1.5.5. Giới hạn phát hiện (LOD) 14
1.5.6. Giới hạn định lượng (LOQ) 15
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị 16
2.1.1. Nguyên vật liệu 16
2.1.2. Dụng cụ thiết bị 16
2.2. Nội dung nghiên cứu 17
2.2.1. Xây dựng và thẩm định phương pháp đo quang để định lượng flavonoid
toàn phần trong lá cây Ô đầu 17
2.2.2. Xây dựng và thẩm định phương pháp đo quang để định lượng
polysaccharid toàn phần trong phụ tử 17
2.3. Phương pháp nghiên cứu 18
2.3.1. Xây dựng phương pháp phân tích 18
2.3.2. Thẩm định phương pháp phân tích 18
2.3.3. Phương pháp xử lý số liệu 19
CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 20
3.1. Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng Flavonoid toàn phần
trong lá Ô Đầu 20
3.1.1. Xây dựng phương pháp định lượng flavonoid toàn phần trong lá Ô Đầu
….…… 20
3.1.2. Thẩm định phương pháp định lượng flavonoid toàn phần trong lá Ô đầu
…………… 22
3.1.3. Ứng dụng phương pháp định lượng đã xây dựng và thẩm định để định
lượng flavonoid toàn phần trong mẫu lá Ô đầu Hà Giang 27
3.2. Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng Polysaccharid toàn
phần trong phụ tử 28
3.2.1. Xây dựng phương pháp định lượng polysaccharid toàn phần trong phụ
tử…………. 28
3.2.2. Thẩm định phương pháp định lượng polysaccharid toàn phần trong phụ
tử…………… 30

3.2.3. Ứng dụng phương pháp vừa xây dựng để xác định hàm lượng
polysaccharid toàn phần trong mẫu phụ tử Hà Giang 35
BÀN LUẬN 37
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 38
A. KẾT LUẬN 38
B. KIẾN NGHỊ 40
TÀI LIỆU THAM KHẢO
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

EtOH:
Ethanol
MeOH:
Methanol
2,4-DNP:
2,4- dinitrophenylhydrazin
UV-VIS:
Ultraviolet-Visible (Tử ngoại-khả kiến)
HPLC:
High Performance Liquid Chromatography ( Sắc kí lỏng hiệu năng cao)
PA:
Pure Analysis ( Tinh khiết phân tích)
PTN:
Phòng thí nghiệm
LOD:
Limit of detection (giới hạn phát hiện)
LOQ:
Limit of quanlity (giới hạn định lượng)






DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. Một số nghiên cứu định lượng flavonoid toàn phần trong dược liệu bằng
phương pháp đo quang 6
Bảng 1.2. Một số nghiên cứu định lượng polysaccharid toàn phần trong dược liệu
bằng phương pháp đo quang sử dụng thuốc thử phenol-acid sulfuric 8
Bảng 3.1. Cách pha dãy chuẩn quercetin để đo quang 21
Bảng 3.2: Kết quả khảo sát độ tuyến tính giữa nồng độ và độ hấp thụ của dung dịch
chuẩn quercetin 24
Bảng 3.3 : Kết quả độ lặp lại của phương pháp định lượng flavonoid toàn phần 25
Bảng 3.4. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp định lượng flavonoid toàn
phần 26
Bảng 3.5. Kết quả xác định độ lệch chuẩn của mẫu trắng khi định lượng flavonoid
toàn phần 26
Bảng 3.6. Kết quả xác định hàm lượng flavonoid toàn phần trong mẫu lá Ô đầu Hà
Giang 27
Bảng 3.7. Cách pha dãy chuẩn glucose để đo quang 29
Bảng 3.8: Kết quả khảo sát độ tuyến tính giữa nồng độ và độ hấp thụ của dung dịch
chuẩn glucose 32
Bảng 3.9. Kết quả độ lặp lại của phương pháp định lượng polysaccharid toàn phần 33
Bảng 3.10. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp định lượng polysaccharid
toàn phần 34
Bảng 3.11. Kết quả xác định độ lệch chuẩn của mẫu trắng khi định lượng
polysaccharid toàn phần 35
Bảng 3.12. Kết quả xác định hàm lượng polysaccharid toàn phần trong mẫu Phụ tử
Hà Giang 36
DANH MỤC CÁC HÌNH


Hình 1.1. Tiêu bản cây Ô đầu 2
Hình 1.2. Cành mang hoa, quả của cây Ô đầu 2
Hình 1.3. Rễ củ ô đầu, phụ tử 3
Hình 1.4. Lá của cây Ô đầu 3
Hình 3.1. Phổ hấp thụ của mẫu trắng, mẫu chuẩn quercetin và mẫu thử 23
Hình 3.2: Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính của độ hấp thụ và nồng độ
quercetin. 24
Hình 3.3. Phổ hấp thụ của mẫu trắng, mẫu chuẩn glucose và mẫu thử 31
Hình 3.4. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính của độ hấp thụ và nồng độ glucose….33




1
ÐẶT VẤN ÐỀ
Cây Ô đầu (Aconitum sp.) là một loại cây thuốc quý được sử lâu đời trong y
học cổ truyền dân tộc với tên vị thuốc là Ô đầu (Radix aconiti) và phụ tử hay củ con
của cây Ô đầu (Radix aconiti lateralis). Ô đầu, phụ tử chưa chế biến chủ yếu dùng
ngoài để xoa bóp khi nhức đầu, mỏi tay chân, đau khớp, bong gân; phụ tử chế (diêm
phụ, bạch phụ, hắc phụ) y học cổ truyền coi là một vị thuốc hồi dương khử phong
hàn, dùng trong một số triệu chứng nguy cấp (trụy tim mạch, ra nhiều mồ hôi, chân
tay giá lạnh…) [3]. Cây Ô đầu Việt Nam (Aconitum carmichaeli) mọc hoang và
được trồng ở các vùng núi cao như Hà Giang, Lào Cai, Sa Pa [10], [11].
Trong cây Ô đầu hoạt chất chính và có tác dụng dược lý mạnh nhất là alcaloid
đã được ứng dụng nhiều trong y học cổ truyền. Ngày nay với sự phát triển của khoa
học kỹ thuật đã và đang có nhiều công trình nghiên cứu về tác dụng sinh học của các
thành phần khác trong cây Ô đầu để ứng dụng trong y học như: flavonoid trong lá và
polysaccharid trong rễ củ cây Ô đầu. Qua nhiều nghiên cứu cho thấy thành phần
flavonoid trong lá Ô đầu có tác dụng chống oxy hóa và khả năng dọn dẹp gốc tự do
[24], [27], [35], [37]. Polysacharaid trong rễ củ ô đầu có tác dụng: chống oxy hóa,

tăng khả năng miễn dịch, có hoạt động kháng u tốt, giảm cholesterol máu…cho kết
quả khả quan [25], [28], [34], [40], [41], [42]. Song song với việc nghiên cứu về tác
dụng sinh học của các thành phần trong dược liệu thì việc nghiên cứu xây dựng các
phương pháp định lượng các thành phần này cũng rất cần thiết cho công tác kiểm tra
chất lượng dược liệu. Tuy nhiên trong Dược điển Việt Nam chưa có các phương
pháp định lượng hai thành phần flavonoid và polysaccharid trong cây ô đầu.
Xuất phát từ các yêu cầu thực tế trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài "Nghiên
cứu định lượng flavonoid và polysaccharid trong cây Ô đầu (Aconitum
carmichaeli Debx.) trồng ở tỉnh Hà Giang" với các mục tiêu sau:
1. Xây dựng và thẩm định phương pháp đo quang để định lượng
flavonoid toàn phần trong lá cây Ô đầu.
2. Xây dựng và thẩm định phương pháp đo quang để định lượng
polysaccharid toàn phần trong phụ tử



2
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN

1.1. Tổng quan về cây Ô Đầu
Cây ô đầu Việt Nam có tên khoa học là Aconitum carmichaeli Debx., thuộc họ
Hoàng liên Ranunculaceae [10], [11].
1.1.1. Đặc điểm thực vật [3], [5], [8], [9], [15], [17], [18]
Cây ô đầu thuộc loại cây thảo, mọc hàng năm, cao chừng 0,6-1m. Rễ củ mập,
hình con quay, rễ cái to mang nhiều rễ nhỏ (nên có tên là phụ tử). Thân đứng, hình
trụ, ít phân nhánh. Lá mọc so le, có gân hình chân vịt, lá của cây con hình tim tròn,
có răng cưa to, lá già xẻ 3-5 thùy, mép khía răng cưa nhọn, hai mặt có lông ngắn,
mặt trên lục bóng, mặt dưới nhạt.
Cụm hoa mọc ở ngọn thân thành chùm, hoa lưỡng tính, không đều, hoa to màu
xanh lam hoặc xanh tím mọc sít nhau. Bao hoa gồm 5 lá đài, lá đài trên thẳng và

cong hình mũ chụp kín tràng hoa đã tiêu giảm, nhị nhiều, bầu có 3 ô chứa nhiều lá
noãn.
Quả gồm 5 đại mỏng, hạt nhiều, trên mặt có nhiều vảy nhỏ.

Hình 1.1. Tiêu bản cây Ô đầu
Hình 1.2. Cành mang hoa, quả của cây
Ô đầu



3

Hình 1.3. Rễ củ ô đầu, phụ tử Hình 1.4. Lá của cây Ô đầu
1.1.2. Phân bố và trồng hái
Ô đầu là cây của vùng ôn đới ẩm. Cây trồng ở Việt Nam thích nghi cao với
điều kiện khí hậu ẩm mát của vùng nhiệt đới núi cao như Sa Pa, Bắc Hà, Sìn Hồ,
Đồng Văn, Quảng Bạ… Cây ưa sáng, khi còn nhỏ là cây chịu bóng [8], [9], [15].
Ô đầu được trồng bằng hạt hoặc củ con. Người ta thường thu hoạch khi cây
trồng được 1-2 năm, cắt bỏ rễ con, rửa sạch đất, phơi hay sấy khô. Nếu cần thu lấy
hạt thì đợi khi thu hạt xong tiếp tục chăm sóc để thu củ vào mùa hoa năm sau. Ở
nước ta thu hái vào khoảng tháng 9, tháng 10 khi cây đang ra hoa. Trồng vào tháng
1, tháng 2 [3], [8], [18].
1.1.3. Bộ phận dùng
Bộ phận dùng của cây Ô đầu là rễ củ [2], [8] :
- Ô đầu là rễ củ mẹ của cây Ô đầu phơi hay sấy khô.
- Phụ tử là củ nhánh (củ con) của cây Ô đầu. Từ phụ tử có thể chế thành diêm
phụ, hắc phụ, bạch phụ.
1.1.4. Thành phần hóa học
Các thành phần hóa học trong cây Ô đầu khá đa dạng và phong phú. Theo một
số tài liệu tham khảo tất cả bộ phận của cây Ô đầu đều chứa alcaloid trong đó




4
alcaloid chính là aconitin [3], [8], [9]. Theo kết quả nghiên cứu của tác giả Bùi
Hồng Cường [10], [12] trong một số bộ phận của cây còn có nhiều thành phần như:
- Rễ củ có thêm polysaccharid, chất béo và sterol.
- Thân cây có thêm carotenoid.
- Lá và hoa có thêm carotenoid, sterol và flavonoid.
- Hạt có thêm chất béo và carotenoid.
1.2. Tổng quan về Flavonoid
1.2.1. Định nghĩa, cấu trúc và phân loại [1], [13]
- Flavonoid là nhóm hợp chất tự nhiên lớn thường gặp trong dược liệu nguồn gốc
thực vật, phần lớn có màu vàng.
- Về cấu trúc hóa học, flavonoid là nhóm hợp chất phenol, có cấu tạo khung cơ
bản theo kiểu C6-C3-C6 (khung cơ bản gồm 2 vòng benzen A và B nối với nhau
qua một mạch 3 carbon) và được chia làm nhiều nhóm khác nhau.


- Phân loại flavonoid: có nhiều cách khác nhau để phân loại flavonoid
+ Cách phân loại thường dùng là dựa vào vị trí của gốc aryl (vòng B) và các
mức độ oxy hoá của mạch 3C, người ta chia flavonoid thành ba nhóm chính:
euflavonoid, isoflavonoid và neoflavonoid.
+ Còn có thể phân loại: biflavonoid là những flavonoid dimer, triflavonoid
cấu tạo bởi 3 monomer flavonoid, flavolignan là những flavonoid mà phân tử có một
phần cấu trúc lignan.
1.2.2. Tính chất [1]
- Màu sắc: Các dẫn chất flavon có màu vàng rất nhạt có khi không màu (trường
hợp các nhóm OH đã methyl hoá), flavonol vàng nhạt đến vàng, chalcon và auron
vàng đậm đến đỏ cam. Các chất thuộc nhóm isoflavon, flavanon, isoflavanon,

flavanonol, leuco-anthocyanidin, flavan-3-ol do không có nối đôi liên hiệp giữa



5
vòng B với nhóm carbonyl nên không màu. Các dẫn chất anthocyanidin thì màu
thay đổi tuỳ theo pH của môi trường. Tuy nhiên khi flavonoid ở trong các bộ phận
của cây thì màu sắc của chúng còn phụ thuộc vào hỗn hợp với các sắc tố khác.
- Ðộ tan: Độ tan của các flavonoid không giống nhau. Thường flavonoid glycosid
và flavonoid sulfat là những hợp chất phân cực nên không tan hoặc ít tan trong dung
môi hữu cơ, tan được trong nước và tan tốt nhất trong hỗn hợp cồn nước. Các
aglycon flavonoid thì tan được trong dung môi hữu cơ, không tan trong nước. Các
dẫn chất flavonoid có nhóm 7-hydroxy thường dễ tan trong dung dịch kiềm loãng.
1.2.3. Các phương pháp định lượng flavonoid trong dược liệu
1.2.3.1. Phương pháp cân
- Nguyên tắc: Chiết xuất và tinh chế thành phần flavonoid trong dược liệu sau đó
đem cân để tính ra hàm lượng flavonoid có trong dược liệu.
- Ứng dụng đối với nguyên liệu giàu flavonoid và dịch chiết ít tạp chất, ví dụ định
lượng rutin trong hoa hòe hay định lượng flavonoid trong thịt quả mơ :
+ Định lượng flavonoid trong thịt quả mơ (Prunus armeniaca) bằng phương
pháp cân [23]: Bột dược liệu chiết bằng CHCl
3
trên bình Soxhlet để loại tạp, sấy
khô. Chiết bằng EtOH 96% trên bình Soxhlet thu lấy dịch, sau đó bốc hơi dung môi.
Chiết lại bằng nước nóng sau đó chiết bằng EtOAc bay hơi dung môi. Thu được
cắn. Cân cắn để xác định lượng flavonoid toàn phần.
+ Định lượng rutin trong nụ hoa hòe (Sophora japonica) [1]: loại tạp bằng HCl
0.5%, chiết bằng EtOH 96% nóng, thủy phân bằng H
2
SO

4
, quercetin rất ít tan được
lọc và cân rồi tính ra rutin.
- Phương pháp này có ưu điểm là thực hiện nhanh, dễ thực hiện tuy nhiên sai số
mắc phải lớn.
1.2.3.2. Phương pháp đo quang phổ tử ngoại
- Nguyên tắc: Cho flavonoid phản ứng với thuốc thử để tạo các hợp chất màu có
độ hấp thụ xác định rồi định lượng bằng phương pháp đo quang: phản ứng cyanidin;
phản ứng kết hợp với muối diazoni; tạo phức màu với AlCl
3
, muối titan, muối
chrom …



6
Bảng 1.1. Một số nghiên cứu định lượng flavonoid toàn phần trong dược liệu
bằng phương pháp đo quang
STT
Tên loài
Mẫu
dược liệu
Thuốc thử
Chất chuẩn
Bước
sóng
TL
TK
1
Aconitum

heterophyllum
Bột củ
AlCl
3
/EtOH(20mg/
ml); AcOH
Rutin
415 nm
[36]
2
Trikarshika
*

Bột hỗn
hợp
2,4-DNP 1% ;
KOH 1%/ MeOH
70%
Quercetin
415 nm
[31]
3
Chrysanthemum
indicum L.
Bột hoa
khô
AlCl
3
2% /MeOH
Quercetin

415nm
[14]
4
Raw propolis
from northern
Croatia
Keo ong
nguyên
liệu
2,4-DNP 1%;
KOH 1%/ EtOH
70%
Naringenin

495nm


[30]

AlCl
3
10% ; kali
acetat 1M
Quercetin
415nm
5
Romanian
Propolis
Keo ong
AlCl

3
5% / MeOH
Galangin
425nm
[32]
2,4-DNP 1% ,
KOH 10 %/ MeOH
Pinocembrin
486nm
6
Crinum
lactifolium
Bột lá
AlCl
3
5% / MeOH
chứa 5% AcOH,
natri citrat 1%
Quercetin
425nm
[20]
7
Cleistocalyx
operculatus
Nụ và lá
NaNO
2
5% , AlCl
3


10% ,NaOH 1M
Catechin
510 nm
[22]

Ghi chú: (*)Trikarshika là hỗn hợp khô đồng lượng của thân rễ Zingiber
officinale, rễ củ Aconitum heterophyllum và thân rễ Cyperus pangore.
1.2.3.3. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
- Nguyên tắc: Dựa vào ái lực khác nhau của các chất khác nhau với hai pha luôn
tiếp xúc mà không đồng tan với nhau, một pha động và một pha tĩnh. Quá trình sắc



7
ký xảy ra dựa trên các cơ chế: hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hoặc rây phân tử. Thời
gian lưu của một chất tính từ lúc tiêm mẫu vào cột đến khi chất đó ra khỏi cột đạt
giá trị cực đại cho pic trên sắc ký đồ.
- Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) có thể ứng dụng định lượng
flavonoid trong dược liệu cho kết quả tin cậy và độ chính xác cao. Tuy nhiên chỉ
định lượng được một vài chất cụ thể, không xác định hàm lượng toàn phần được. Ví
dụ : Định lượng flavonoid (baicalein) trong vỏ cây núc nác (Oroxylum indicum)
bằng HPLC [21].
1.3. Tổng quan về polysaccharid
1.3.1. Định nghĩa, cấu trúc và phân loại [1]
- Polysaccharid là những hợp chất bao gồm hàng trăm đến hàng nghìn
monosaccharid kết hợp với nhau bằng liên kết glycosid.

- Phân loại:
+ Phân tử polysaccharid có thể gồm một hoặc vài loại monome khác nhau, do
đó người ta chia ra polysaccharid đồng thể (homopolysaccharid) và polysaccharid

dị thể (heteropolysaccharid).
+ Tùy theo nguồn gốc người ta phân các polysaccharid tự nhiên ra ba nhóm
lớn: Pytopolysaccharid (polysaccharid thực vật), Zoopolysaccharid (polysaccharid
động vật) và Polysaccharid vi sinh vật.

1.3.2. Tính chất [1]
Polysaccharid mang nhiều tính chất khác mono- và disaccharid như không có
phản ứng khử, không có vị ngọt, thường không tan trong nước, khi hòa tan dễ hình
thành dung dịch keo.



8
1.3.3. Phương pháp định lượng polysaccharid trong dược liệu
Trong số nhiều phương pháp so màu định lượng carbohydrat, phương pháp
dùng thuốc thử phenol-acid sulfuric là phương pháp đơn giản, nhanh chóng và đáng
tin cậy nhất để xác định hàm lượng carbohydrat toàn phần trong mẫu. Phương pháp
có thể áp dụng định lượng tất cả các loại carbohydrat: mono-, di- , oligosaccharid,và
polysaccharid; kể cả lượng đường trong proteoglycan, glycoprotein và glycolipid
[38], [39]. Phương pháp sử dụng thuốc thử phenol- acid sulfuric được sử dụng rộng
rãi vì độ nhạy và cách tiến hành đơn giản [39].
- Nguyên tắc:
Trong phương pháp này dung dịch acid sulfuric đậm đặc thủy phân
polysaccharid, oligosaccharid, và disaccharid thành các monosaccharid. Sau đó các
monosaccharid mất nước tạo thành furfural (Pentose) hoặc hydroxymethyl furfural
(hexose). Các hợp chất này phản ứng với phenol tạo thành hợp chất màu vàng. Đối
với các mẫu thử có hàm lượng đường pentose cao sẽ có cực đại hấp thụ tại 480 nm.
Đối với mẫu thử có hàm lượng đường đường hexose cao sẽ có cực đại hấp thụ tại
490 nm. Màu sắc của sản phẩm tạo màu ổn định trong vài giờ, và độ chính xác của
phương pháp tương đối cao [35].

Phương pháp tạo màu với thuốc thử phenol-H
2
SO
4
đo quang phổ UV-VIS
được sử dụng phổ biến để đinh lượng polysaccharid trong dược liệu nói chung cũng
như trong rễ củ cây Ô đầu nói riêng.

Bảng 1.2. Một số nghiên cứu định lượng polysaccharid toàn phần trong dược
liệu bằng phương pháp đo quang sử dụng thuốc thử phenol-acid sulfuric

STT
Tên loài
Mẫu dược liệu
Bước sóng
định lượng
Hàm lượng
TLTK
1
Aconitum
carmichaeli
Bột củ
484 nm
18,156 %
[45]
2
Aconitum
coreanum
Bột rễ
490nm

4,62 %
[43]



9
3
Aconitum
carmichaeli
Phụ tử (củ con)
Ô đầu (củ mẹ)
Rễ con
484 nm
22,02 %
33, 53%
6,10%
[44]
4
Aconitum
coreanum
Bột rễ
490 nm
5,7%
[34]
5
Aconitum
kusnezoffii
Bột rễ
490nm
6,0%

[41]
6
Lentinus
edodes
Quả thể
(fruiting body)
492 nm
3,84%
[16]
7
rong mơ
(Sargassum)
Fucoidan
(Thân rong)
490 nm
50,63%
[19]

1.4. Tổng quan về phương pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại khả kiến (UV-VIS)
1.4.1. Nguyên tắc [2], [6]
1.4.1.1. Định luật Lambert- Beer
Chiếu một chùm ánh sáng đơn sắc có bước sóng λ và cường độ I
0
qua dung
dịch đồng nhất có nồng độ C bề dày lớp dung dịch L. khi đi qua dung dịch, một
phần ánh sáng sẽ bị hấp thụ lại, một phần bị phản xạ, phần còn lại sẽ đi qua dung
dịch với cường độ I.
Mối quan hệ giữa phần ánh sáng I và I
0
được thể hiện bằng định luật Lambert-Beer

CL
II

0
10




Trong đó : ε : là độ hấp thụ riêng của dung dịch. Hệ số này không phụ thuộc vào
nồng độ, chỉ phụ thuộc vào bản chất của chất tan và bước sóng của
chùm tia đơn sắc chiếu vào dung dịch.
L : là bề dày của lớp dung dịch (cm)
C : là nồng độ của dung dịch
- Điều kiện ứng dụng định luật
+ Chùm tia sáng phải đơn sắc.
+ Dung dịch phải nằm trong khoảng nồng độ thích hợp.
+ Dung dịch phải trong suốt.



10
+ Chất thử phải bền trong dung dịch và phải bền dưới tác dụng của ánh
sáng UV-VIS
1.4.1.2. Một số đại lượng thông dụng
- Độ truyền qua
Độ truyền qua hay còn gọi là độ thấu quang (T): Đặc trưng cho độ trong suốt
( về mặt quang học) của dung dịch, được tính theo công thức:
0
I

I
T 

T thường tính ra phần trăm. Một chất có T=1 ( hay 100%), nghĩa là hoàn toàn
không hấp thụ ánh sáng, người ta nói chất đó hoàn toàn trong suốt.
- Độ hấp thụ
Độ hấp thụ hay còn gọi là mật độ quang (A) , được tính theo công thức:
CL
T
LogA
1



Đối với một chất xác định (có ε xác định) đo trên một loại cuvet đo có bề dày
L= 1cm, độ hấp thụ tỉ lệ với nồng độ dung dịch :
CKA .

 
LK .



- Hệ số hấp thụ riêng (
cm
E
1
%1
):
cm

E
1
%1
chính là độ hấp thụ của dung dịch có nồng độ 1% khi dùng cuvet đo có bề
dày 1cm. Với một chất tan xác định, tại một bước sóng đo xác định,
cm
E
1
%1
là một
hằng số.
- Hệ số hấp thụ phân tử (
M

)
Hệ số hấp thụ phân tử còn gọi là hệ số hấp thụ mol là độ hấp thụ của dung dịch
có nồng độ 1M, khi dùng cuvet đo có bề dày 1cm.
Cũng như
cm
E
1
%1
, với một chất xác định, trong điều kiện đo nhất định( bước sóng,
dung môi, nhiệt độ…),
M


là hằng số.
Giữa
cm

E
1
%1
và
M

có mối liên hệ :
M
E
cm
M

10
1
%1


M là phân tử lượng của chất tan.



11
1.4.2. Các kỹ thuật định lượng bằng phương pháp đo quang [4], [6]
1.4.2.1. Xác định nồng độ khi biết hệ số hấp thụ riêng
Với các chất có mật độ hấp thụ riêng biết trước chính xác và ổn định ở một
bước sóng nào đó, người ta có thể đo mật độ quang của dung dịch chất đó trong
dung môi tương ứng tại bước sóng này. Thông thường đó là bước sóng có độ hấp
thụ cực đại. Nồng độ dung dịch được tính theo công thức:
cm
x

x
E
A
C
1
%1


Muốn áp dụng kĩ thuật này máy quang phổ phải được chuẩn hóa về bước sóng
và giá trị mật độ quang, dung dịch phải trong suốt và có nồng độ nằm trong vùng
đáp ứng của định luật Lambert- Beer.
1.4.2.2. Kỹ thuật so sánh với dung dịch chuẩn
Xác định mật độ quang của dung dịch thử có nồng độ C
x
(chưa biết) được tiến
hành đồng thời với việc xác định mật độ quang của dung dịch chuẩn có nồng độ C
c

đã biết chính xác, trong điều kiện thỏa mãn định luật Lambert- Beer thì C
x
được
tính theo công thức

Trong phương pháp so sánh kết quả càng chính xác khi nồng độ C
x
càng gần
với nồng độ dung dịch chuẩn C
c
.
1.4.2.3. Kỹ thuật đường chuẩn

Để xây dựng đường chuẩn người ta chuẩn bị một số dung dịch chuẩn có nồng
độ C
s
khác nhau, thường dùng 5 - 8 dung dịch chuẩn. Đo độ hấp thụ A
s
của dãy
chuẩn và lập đồ thị A theo C. Đo độ hấp thụ A
x

của dung dịch mẫu thử và dựa vào
đường chuẩn xác định được nồng độ chất thử C
x
.



12

1.4.2.4. Kỹ thuật thêm chuẩn
Để hạn chế ảnh hưởng của tạp chất người ta đưa thêm vào dung dịch một
lượng chính xác chất chuẩn làm cho nồng độ dung dịch tăng thêm một lượng C
0
. Đo
mật độ quang của dung dịch thử (A) và dung dịch thử thêm chuẩn (A’), nồng độ của
dung dịch thử được tính theo công thức:

1.4.2.5. Kỹ thuật thêm đường chuẩn:
Tiến hành bằng cách thêm chính xác những thể tích giống nhau của dung dịch
thử vào dãy chuẩn chứa những lượng khác nhau và chính xác của chất chuẩn. Đo độ
hấp thụ của dãy rồi vẽ đường chuẩn quan hệ giữa mật độ quang với lượng chất

chuẩn thêm vào. Giao điểm của đương chuẩn với trục hoành (nồng độ) cho ta nồng
độ của chất cần định lượng.




13
1.5. Thẩm định phương pháp phân tích [6], [7]
1.5.1. Độ đặc hiệu
- Định nghĩa: Là khả năng xác định được chất phân tích khi có mặt các thành
phần khác như tạp chất, sản phẩm phân hủy, tá dược… Với phép thử định lượng
phải đưa ra kết quả chính xác về hàm lượng hay hoạt lực của chất phân tích có trong
mẫu.
- Cách xác định: Thêm vào sản phẩm một lượng thích hợp tạp chất hoặc tá dược
rồi phân tích để chứng minh rằng kết quả định lượng không bị ảnh hưởng bởi tạp
chất hoặc tá dược.
1.5.2. Độ tuyến tính
- Định nghĩa: Độ tuyến tính của một phương pháp phân tích là sự phụ thuộc tuyến
tính giữa đại lượng đo được (y) và nồng độ chất cần phân tích (x) trong khoảng xác
định. Nó được biểu thị bằng phương trình hồi quy y=ax+b và hệ số tương quan
tuyến tính r.
- Cách xác định: Chuẩn bị 1 dãy gồm 5-10 dung dịch chuẩn có nồng độ x
i
tăng
dần x
1
, x
2
, … x
n

. Ta có đáp ứng y
i
: y
1
, y
2
, … y
n
. Tiến hành phân tích mẫu bằng
phương pháp cần khảo sát, xây dựng phương trình hồi quy y
i
= ax
i
+b và xác định
hệ số tương quan r.
1.5.3. Độ lặp lại
- Định nghĩa: Độ lặp lại của một phương pháp phân tích là mức độ thống nhất
giữa các kết quả thử riêng biệt theo quy trình thử nghiệm được áp dụng lặp đi lặp lại
nhiều lần trên cùng một mẫu, độ lặp lại được biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối
(RSD) hoặc sai số tương đối (ε
r
%).
- Cách xác định: Tiến hành thí nghiệm lặp đi lặp lại n lần, thu được các kết quả x
i
là x
1
, x
2
, … x
n

. Trung bình các kết quả là



n
i
i
x
n
X
1
1

Ta tính độ lặp lại theo công thức sau:
+ Độ lệch chuẩn:
1
)(
1
2





n
Xx
SD
n
i
i





14
+ Độ lệch chuẩn tương đối:
(%)100
X
SD
RSD

+ Sai số tương đối:
(%)100
X
t
n
SD
r




t
là trị số giới hạn phụ thuộc vào xác suất (p) và số bậc tự do (n-1) được
tra trong bảng phân bố t (student); α = 1- p
1.5.4. Độ đúng
- Độ đúng của một phương pháp phân tích là mức độ sát gần của các giá trị tìm
thấy trong phân tích so với giá trị thực.
- Cách xác định: thường được xác định bằng 2 cách:
+ Cách xác định trên mẫu tự tạo: Tự tạo mẫu với các thành phần hoạt chất và tá

dược có trong chế phẩm với hàm lượng hoạt chất khoảng 90%, 100%, 110% hàm
lượng ghi trên nhãn. Tiến hành định lượng hoạt chất theo phương pháp phân tích
cần đánh giá. Độ đúng là tỉ lệ phần trăm giữa kết quả định lượng so với hoạt chất
cho vào.
+ Cách xác định trên mẫu thử được thêm chuẩn: thêm vào mẫu thử một lượng
chất chuẩn ( khoảng 10%, 20%, 30% so với lượng hoạt chất có sẵn sao cho tổng
lượng hoạt chất có trong mẫu nằm trong khoảng tuyến tính) rồi tiến hành định
lượng theo phương pháp phân tích đề ra. Độ đúng sẽ được tính bằng tỉ lệ phần trăm
giữa lượng chất chuẩn tìm được so với lượng chất chuẩn thêm vào.
1.5.5. Giới hạn phát hiện (LOD)
- Định nghĩa: Giới hạn phát hiện là lượng chất thấp nhất cần phân tích có thể phát
hiện được về mặt định tính.
- Cách xác định:
+ Cách 1: Đo tín hiệu liên tục từ mẫu trắng (B) và mẫu thử (S). Thiết lập tỉ số
S/B. Nếu S/B = 3/1 là chấp nhận được.
+ Cách 2: Đo độ lớn của đường nền bằng cách phân tích một số mẫu trắng.
Giới hạn phát hiện được tính theo công thức.
a
SD
LOD


3




15
Trong đó:
SD là độ lệch chuẩn của đáp ứng

a là độ dốc của đường chuẩn ( hệ số a của phương trình đường chuẩn
y=ax+b)
+ Cách 3: Phân tích các mẫu có nồng độ đã biết sau đó pha loãng cho tới khi
tìm được nồng độ tối thiểu nào đó còn phát hiện được bằng phương pháp đã đề
xuất.
1.5.6. Giới hạn định lượng (LOQ)
- Định nghĩa: là lượng thấp nhất của chất cần thử có trong mẫu thử có thể phát
hiện được về mặt định lượng với độ đúng và độ chính xác thích hợp.
- Cách xác định:
+ Cách 1: Đo độ lớn của đường nền bằng cách phân tích một số mẫu trắng.
Giới hạn định lượng được tính theo công thức.

a
SD
LOQ


10
= 3,3 × LOD
Trong đó:
SD là độ lệch chuẩn của đáp ứng
a là độ dốc của đường chuẩn(hệ số a của phương trình đường chuẩn
y=ax+b)
+ Cách 2: Phân tích các mẫu có nồng độ đã biết sau đó pha loãng cho tới khi
tìm được nồng độ tối thiểu nào đó còn có thể xác định được chất thử với độ chính
xác và độ đúng chấp nhận được.








16
CHƯƠNG 2.
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị
2.1.1. Nguyên vật liệu
2.1.1.1. Dược liệu
Dược liệu: cây Ô đầu (Aconitum carmichaeli ) trồng ở tỉnh Hà Giang.
- Phụ tử lấy khi cây đã ra quả và lụi, rửa sạch, phơi sấy khô, nghiền thành bột kích
thước khoảng 1mm.
- Lá tươi cây ô đầu, lấy khi cây đã ra quả phơi sấy khô, xay nhỏ kích thước 2-5
mm.
2.1.1.2. Hóa chất, dung môi
- Chất đối chiếu :
+ Chất chuẩn PTN quercetin hàm lượng 99,0%
+ Chất chuẩn PTN glucose hàm lượng 98,6%.
- Dung môi, hóa chất:
+ EtOH 96
0
, đạt tiêu chuẩn PA.
+ H
2
SO
4
đặc, đạt tiêu chuẩn PA.
+ Phenol , đạt tiêu chuẩn PA.
+ AlCl

3
, đạt tiêu chuẩn PA.
+ NaOH, đạt tiêu chuẩn PA.
+ Nước cất 1 lần, đạt tiêu chuẩn PA.
2.1.2. Dụng cụ thiết bị
- Máy quang phổ UV- VIS Cary 60.
- Máy siêu âm Utrasonic cleaner-MRC.
- Máy đo pH AL 20 pH- Aqualitic.
- Máy ly tâm HSCEN- 204- MRC.
- Máy lắc xoay điện Velp- Zx
3
.
- Cân phân tích AUW 220.