BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

NGUYỄN VĂN TRUNG

XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH
ĐỊNH LƢỢNG ĐỒNG THỜI
METHYLISOTHIAZOLINON VÀ
METHYLCHLOROISOTHIAZOLINON TRONG
MỸ PHẨM

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC

HÀ NỘI 2016


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI
NGUYỄN VĂN TRUNG

XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH
ĐỊNH LƢỢNG ĐỒNG THỜI
METHYLISOTHIAZOLINON VÀ
METHYLCHLOROISOTHIAZOLINON TRONG
MỸ PHẨM

ĐỀ CƢƠNG LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC
CHUYÊN NGÀNH KIỂM NGHIỆM – ĐỘC CHẤT
MÃ SỐ 60720410
Người hướng dẫn khoa học: TS. Lê Thị Hƣờng Hoa

HÀ NỘI 2016


LỜI CẢM ƠN
Trong suốt khoảng thời gian nghiên cứu hoàn thành luận văn này, tôi nhận
được sự giúp đỡ nhiệt tình của các thầy cô giáo, các chuyên gia trong nhiều lĩnh
vực, các anh chị kỹ thuật viên, cùng đồng nghiệp, bạn bè, gia đình.
Trước hết, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc đến TS. Lê Thị
Hường Hoa, Trưởng Khoa Kiểm nghiệm Mỹ phẩm, Viện Kiểm nghiệm thuốc
Trung ương, người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong suốt quá
trình học tập, nghiên cứu.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu, phòng sau đại học, các
thầy cô bộ môn Phân tích – Độc chất - Trường Đại học Dược Hà Nội. Các anh,
chị ở Khoa Kiểm nghiệm Mỹ phẩm – Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương đã
giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên
cứu.
Cuối cùng, tôi xin tỏ lòng biết ơn tới gia đình, Ban giám hiệu, các đồng
nghiệp của tôi ở Trường Cao đẳng Y tế Hà Tĩnh, những người đã luôn giúp đỡ,
động viên, tạo điều kiện tốt cho tôi trong suốt thời gian học tập cũng như cuộc
sống.
Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn tất cả những sự giúp đỡ quý báu đó!
Hà Tĩnh, ngày 28 tháng 3 năm 2016
Học viên

Nguyễn Văn Trung



MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ

1

Chƣơng 1. TỔNG QUAN

1

1.1.

3

Chất Bảo quản

1.1.1. Các yêu cầu của chất bảo quản

3

1.1.2. Chất bảo quản trong mỹ phẩm

3

1.2.

Các chất bảo quản nghiên cứu trong đề tài

4


1.2.1. Methylisothiazolinon (MIT):

4

1.2.1.1.Công thức phân tử

4

1.2.1.2.Tính chất vật lý

4

1.2.1.3.Ứng dụng

5

1.2.1.4.Cơ chế tác dụng

5

1.2.1.5.Ảnh hưởng đến người sử dụng

6

1.2.2. Methylcholoisothiazolinon (MCT)

7

1.2.2.1. Công thức hóa học


7

1.2.2.2. Tính chất vật lý

7

1.2.2.3. Ứng dụng và cơ chế tác dụng

8

1.2.2.4.Ảnh hưởng đến người sử dụng

8

1.2.3.Hỗn hợp Methylchloroisothiazolinone : methylisothiazolinone 3:1

8

1.2.3.1. Công thức của hỗn hợp

9

1.2.3.2. Tính chất vật lý của hỗn hợp

9

1.2.3.3. Những ưu điểm của hỗn hợp MCT/MIT 3:1 so với dùng đơn độc MIT
và MCT


9

1.2.3.4. Ảnh hưởng đến người sử dụng

10

1.3.

Những quy định về MIT và MCT khi sử dụng trong mỹ phẩm, công

nghiệp và nông nghiệp

10

1.3.1. Trên thế giới

10

1.3.2. Quy định về mỹ phẩm có chứa MCT và MIT ở Việt Nam

11


1.4. Một số phƣơng pháp định tính, định lƣợng MIT và MCT

11

1.4.1. Phương pháp GCMS

12


1.4.2. Phương pháp HPLC

12

1.4.3. Tổng quan về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

14

1.4.3.1. Nguyên lý chung của sắc ký lỏng

14

1.4.3.2. Một số thông số đặc trưng

17

1.4.3.3. Ứng dụng

21

1.5. Xử lý mẫu trong mỹ phẩm

21

Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

23

2.1. Đối tƣợng nghiên cứu


23

2.2. Hóa chất, dung môi

23

2.3. Phƣơng tiện, thiết bị nghiên cứu

23

2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu

24

2.4.1. Khảo sát, lựa chọn qui trình phân tích:

24

2.4.1.1. Khảo sát, lựa chọn phương pháp xử lý mẫu

24

2.4.1.2. Khảo sát xây dựng điều kiện sắc ký

24

2.4.2. Đánh giá phương pháp phân tích

25


2.4.2.1. Tính thích hợp của hệ thống

25

2.4.2.2. Độ đặc hiệu

25

2.4.2.3. Khoảng nồng độ tuyến tính

26

2.4.2.4. Độ đúng

27

2.4.2.5. Độ chính xác

28

2.4.2.6.Xác định giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng

29

2.4.3. Áp dụng trên một số chế phẩm dạng kem, sữa tắm trên thị trường

30

2.4.4. Phương pháp xử lý số liệu


30

Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

31

3.1. Khảo sát, lựa chọn qui trình phân tích

31

3.1.1. Khảo sát, lựa chọn phương pháp xử lý mẫu

31


3.1.1.1. Lựa chọn dung môi pha mẫu

31

3.1.1.2. Phương pháp xử lý mẫu

32

3.1.2. Khảo sát xây dựng điều kiện sắc ký

35

3.1.2.1. Khảo sát lựa chọn cột sắc ký


35

3.1.2.2. Lựa chọn bước sóng phân tích

35

3.1.2.3. Xác định thành phần pha động

36

3.1.2.4. Xác định tỷ lệ pha động

37

3.1.2.5. Khảo sát thể tích tiêm mẫu

38

3.1.2.6. Khảo sát tốc độ dòng

38

3.2. Thẩm định phƣơng pháp

39

3.2.1. Đánh giá độ thích hợp hệ thống

39


3.2.2. Độ đặc hiệu

40

3.2.3. Khảo sát khoảng tuyến tính

42

3.2.4. Độ chính xác của phương pháp

45

3.2.5. Độ đúng

47

3.2.6. Gới hạn phát hiện, giới hạn định lượng

50

3.3. Áp dụng kiểm tra các mẫu mỹ phẩm

51

Chƣơng 4. BÀN LUẬN

53

4.1. Về chất bảo quản Methylisothiazolinon và Methylcloroisothiazolinon


53

4.2. Về phƣơng pháp nghiên cứu

53

4.2.1. Về phương pháp xử lý mẫu

53

4.2.3. Về xây dựng quy trình phân tích

54

4.2.4. Về thẩm định phương pháp

55

4.3. Về kiểm tra các mẫu mỹ phẩm

56

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

57

PHỤ LỤC


Danh mục từ viết tắt

AOAC: Association of Official Analytical Chemists : Hiệp hội những nhà hóa
học phân tích chính thức
ASEAN: Association of Southeast Asian Nations : Hiệp hội các quốc gia Đông
Nam Á
BP: British Pharmacopoeia : Dược điển Anh
DAD: Detector Diod Array: Detector mảng diod
EI : Electron Ionization :Ion hóa bằng electron
EPA: Environmental Protection Agency: Tổ chức bảo vệ môi sinh
FAK : enzym Focal adhesion kinase
ICH : International Conference on Harmonisation Hội nghị về hòa hợp quốc tế
HPLC : High Performance Liquid Chromatography: Sắc ký lỏng hiệu năng cao
LOD: Giới hạn phát hiện
LOQ: Giới hạn định lượng
MCT: Methylchloroisothiazolinon
MIT: Methylisothiazolinon
Ppm : parts per million: Phần triệu
Ppb : parts per billion :Phần tỷ
USP: United StatesPharmacopeial : Dược điển Mỹ
SCCS : Scientific Committee on Consumer Safety: Hiệp hội khoa học về an toàn
người tiêu dùng
UPLC: Ultra Performance Liquid Chromatography: Sắc ký lỏng hiệu năng siêu
cao
UV: Ultraviolet: Tử ngoại


Danh mục bảng
.

Tên bảng


Trang

Bảng 2.1. Các hóa chất dung môi sử dụng trong quá trình thí nghiệm

25

Bảng 2.2. Giới hạn chấp nhận về độ đúng của phương pháp theo AOAC

29

Bảng 2.3. Giới hạn chấp nhận về độ chính xác của phương pháp theo AOAC

30

Bảng 3.1. Độ ổn định của dung dịch chuẩn MIT và MCT

34

Bảng 3.2. Độ thích hợp của hệ thống sắc ký với nền mẫu dầu gội đầu

41

Bảng 3.3. Độ thích hợp của hệ thống sắc ký khăn ướt, nước giữ ẩm

42

Bảng 3.4. Kết quả xác định khoảng nồng độ tuyến tính của MIT và MCT đối

45


với nền mẫu dầu gội đầu
Bảng 3.5. Kết quả xác định khoảng nồng độ tuyến tính của MIT và MCT đối

46

với nền mẫu nước giữ ẩm, khăn giấy
Bảng 3.6. Độ chính xác của phương pháp trên nền mẫu dầu gội đầu

47

Bảng 3.7. Độ chính xác của phương pháp trên nền mẫu khăn ướt

48

Bảng 3.8. Độ chính xác của phương pháp trên nền mẫu nước giữ ẩm

48

Bảng 3.9. Độ đúng MIT trong nền mẫu dầu gội đầu

49

Bảng 3.10. Độ đúng MCT trong nền mẫu dầu gội đầu

50

Bảng 3.11. Độ đúng MIT trong nền mẫu khăn ướt

50


Bảng 3.12. Độ đúng MCT trong nền mẫu khăn ướt

51

Bảng 3.13. Độ đúng MIT trong nền mẫu nước giữ ẩm

51

Bảng 3.14. Độ đúng MCT trong nền mẫu nước giữ ẩm

52

Bảng 3.15. Kết quả khảo sát MIT, MCT trong một số mẫu mỹ phẩm trên thị

54

trường
Bảng 4.1. Gới hạn phát hiện, giới hạn định lượng

58


Danh mục hình
Tên hình

Trang

Hình 1.1. Sơ đồ cấu tạo hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao

16


Hình 3.1. Sắc ký đồ dung dịch chuẩn pha trong Acetonitril

33

Hình 3.2. Sắc ký đồ dung dịch chuẩn pha trong Methanol

34

Hình 3.3. Sắc ký đồ dung dịch chuẩn với pha động Acetonitril- nước

38

Hình 3. 4. Sắc ký đồ dung dịch chuẩn với pha động methanol- nước

39

Hình 3.5. Sắc ký đồ đánh giá độ đặc hiệu với MIT và MCT trong dầu gội đầu

43

Hình 3.6. Sắc ký đồ đánh giá độ đặc hiệu với MIT và MCT trong khăn ướt

43

Hình 3.7. Sắc ký đồ đánh giá độ đặc hiệu với MIT và MCT trong nước giữ ẩm

44

Hình 3.8. Kết quả xác định khoảng nồng độ tuyến tính của MIT và MCT đối


45

với nền mẫu dầu gội đầu
Hình 3.9. Kết quả xác định khoảng nồng độ tuyến tính của MIT và MCT đối
với nền mẫu nước giữ ẩm, khăn giấy.

46


ĐẶT VẤN ĐỀ
Nhu cầu làm đẹp của con người đã có từ rất lâu. Ngày nay, khi xã hội phát triển,
kinh tế phát triển, nhu cầu làm đẹp ngày càng tăng cao. Ở Việt Nam, trong những năm
gần đây, các sản phẩm làm đẹp ngày càng phong phú. Các sản phẩm làm đẹp này gọi
chung là mỹ phẩm. Chất lượng mỹ phẩm là một vấn đề cần phải được quan tâm bởi vì
mỹ phẩm tiếp xúc trực tiếp với cơ thể, không có qui định về thời gian và liều lượng sử
dụng vì vậy có thể ảnh hưởng đến sức khỏe và vẻ đẹp của cơ thể. Trong phân loại sản
phẩm, hàng hóa theo tính an toàn, mỹ phẩm thuộc nhóm 2 - cần có sự quản lý của nhà
nước về tính an toàn của sản phẩm. Mặt khác, nền kinh tế Việt Nam đã và đang nằm
trong tiến trình hội nhập và toàn cầu hóa. Năm 2003, Chính phủ Việt Nam đã ký kết
“Hiệp định hệ thống hòa hợp ASEAN trong quản lý mỹ phẩm”[3][9].Ngày 07/11/2006,
Việt Nam đã chính thức trở thành thành viên thứ 150 của tổ chức thương mại thế giới.
Chúng ta phải tuân thủ những qui định, ràng buộc... để có một sự hòa hợp, công nhận
lẫn nhau và phát triển. Quản lý chất lượng hàng hóa nói chung và chất lượng mỹ phẩm
nói riêng sao cho phù hợp là một nhu cầu tất yếu và cấp bách.
Trong mỹ phẩm ngoài thành phần có tác dụng còn có rất nhiều thành phần khác
như chất màu, chất bảo quản dùng để tránh nấm mốc, nhiễm khuẩn….
Methylisothiazolinon (MIT) và Methylcholoroisothiazolinon(MCT) là hai chất được sử
dụng rất nhiều làm chất bảo quản trong công nghiệp nông nghiệp và đặc biệt trong mỹ
phẩm vì tan tốt trong nước, có khả năng diệtkhuẩn. Tuy nhiên, trong quá trình sử dụng

đã có nhiều lo ngại về tác dụng có hại của MIT và MCT đến sức khỏe người sử dụng
đặc biệt là phản ứng dị ứng. Trước những vấn đề đó, rất nhiều những nghiên cứu về
ảnh hưởng của MIT và MCT trong mỹ phẩm đến sức khỏe người tiêu dùng đã được
tiến hành. Dựa trên những nghiên cứu này, để đảm bảo an toàn cho người sử dụng, các
nướcMỹ, liên minh Châu Âu, Asean và một số nước khác đã đưa ra giới hạn sử dụng
cho MIT và MCT trong mỹ phẩm : không quá 100ppm (0,01%) cho MIT và không quá
15ppm (0,0015%) cho hỗn hợp MCT/MIT tỷ lệ 3:1, đã sử dụng hỗn hợp MCT/MIT thì
không được có thêm MIT [14][16][20][24][25][27]. Ở Việt Nam, ngày 13/04/2015 cục

1


Quản lý dược cũng đã có công văn số 6577/QLD-MP nêu rõ quy định về các chất bảo
quản sử dụng trong mỹ phẩm trong đó quy định giới hạn hàm lượng của MIT và MCT
phù hợp như quy định của Asean[4].
Tuy nhiên, để kiểm tra sự có mặt và định lượng các chất này trong Mỹ phẩm và
một số sản phẩm khác, theo các tài liệu tham khảo được, trên thế giới chỉ có bảy quy
trình, các nước ASEAN và Việt Nam thì chưa có nghiên cứu nào về định tính, định
lượng MIT và MCT trong mỹ phẩm. Để phục vụ cho công tác kiểm tra, giám sát chất
lượng mỹ phảm, đảm bảo an toàn cho người sử dụng, cần thiết phải xây dựng được
một quy trình định lượng MIT và MCT một cách thuận tiện, đảm bảo độ chính xác và
khoa học.
Trước những vấn đề nêu trên chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Xây dựng
phương

pháp

định

tính


định

lượng

đồng

thời

Methylisothiazolinonvà

Methylcholoroisothiazolinon trong mỹ phẩm” với các mục tiêu sau:
1.

Xây dựng phương pháp định tính định lượng đồng thời Methylisothiazolinon và

Methylcholoroisothiazolinontrong một số dạng mỹ phẩm (dầu gội, khăn ướt, nước giữ
ẩm).
2.

Áp dụng phương pháp đã xây dựng để định lượng Methylisothiazolinon và

Methylcholoroisothiazolinontrong một số mỹ phẩm đang lưu hành trên thị trường.

2


Chƣơng 1. TỔNG QUAN
1.1.


Chất bảo quản
Chất bảo quản là một chất tự nhiên hoặc tổng hợp được thêm vào các sản phẩm

như thực phẩm, dược phẩm và các sản phẩm chăm sóc cá nhân để ngăn chặn sự phân
hủy do sự tăng trưởng của vi sinh vật hay thay đổi hóa học không mong muốn [34]
[40].
1.1.1. Các yêu cầu của chất bảo quản:
-

Không độc không gây kích thích ở nồng độ sử dụng

-

Bền với nhiệt và chứa được lâu dài

-

Có khả năng tương hợp với các cấu tử khác trong công thức và vật liệu bao gói

-

Có hoạt tính ở nồng độ thấp

-

Giữ được hiệu quả trong phạm vi pH rộng

-

Có hiệu quả với nhiều vi sinh vật


-

Dễ tan ở nồng độ hiệu quả

-

Không mùi và không màu

-

Không bay hơi, giữ được hoạt tính khi có cả muối kim loại tự nhiên như nhôm
và sắt [34][40].

1.1.2. Chất bảo quản trong mỹ phẩm:
Mỹ phẩm và các sản phẩm chăm sóc cá nhân đặc biệt là các mỹ phẩm dạng
kem, lotion … là những sản phẩm dễ bị phân hủy bởi các tác nhân hóa lý, đây cũng là
môi trường thuận lợi cho sự phát triển của vi sinh vật. Do vậy hầu như tất cả các mỹ
phẩm đều có chứa các chất bảo quản để đảm bảo chất lượng mỹ phẩm trong quá trình
sử dụng. Tuy nhiên hầu hết các chất bảo quản đều có tác dụng không mong muốn vì
vậy chúng có thể ảnh hưởng trực tiếp đến sức khỏe của người sử dụng mỹ phẩm hoặc
có thể ảnh hưởng đến môi trường, hệ sinh thái, một số chất bảo quản còn có khả năng
làm tăng khả năng kháng của các loại vi sinh vật…Chính vì vậy, nhiều chất bảo quản
bị cấm sử dụng trong mỹ phẩm, những chất khác cũng chỉ được sử dụng với hàm lượng
nằm trong giới hạn cho phép không ảnh hưởng đến môi trường và người sử dụng. Các

3


chất bảo quản thông thường nhất được xác định là methylparaben, phenoxyethanol,

sodium benzoate, Propylparaben với tỷ lệ sử dụng trong các sản phẩm lần lượt là 41%,
39%,

34%,

25%,

vớimethylchloroisothiazolinonehoặc

hỗn

hợp

methylchloroisothiazolinone/methylisothiazolinone (MCT / MIT) thì có tỷ lệ sử dụng
trong các sản phẩm là 22% [34]. Những lý do trên cho thấy tính cấp thiết về việc kiểm
tra, kiểm soát các chất bảo quản sử dụng trong các sản phẩm khác nói chung và trong
mỹ phẩm nói riêng.
1.2.

Các chất bảo quản nghiên cứu trong đề tài

1.2.1. Methylisothiazolinon (MIT):
1.2.1.1.Công thức phân tử:

CTPT: C4H5NOS

Khối lượng phân tử: 115.1536 g/mol

Danh pháp quốc tế: 2-Methylisothiazol-3(2H)-one.(Theo IUPAC)
Tên khác: 2-Methyl-4-isothiazolin-3-one[24][25].

1.2.1.2.Tính chất vật lý:
Là tinh thể hình lăng trụ không màu, tan tốt trong nước, acetonitril, methanol ít
tan trong xylen. Độ tan cụ thể trong một số dung môi:
- Trong nước:>100g/100ml (200C), 5367 g/l (250C)
- Trong đệm : >574.6 g/l (pH 5), >489.0 g/l (pH 9)
- Acetonitril:> 78,76g/100ml (200C)
- Methanol:>79,1g/100ml (200C)
- Ethyl acetate : 562 g/l (100C), 688 g/l (300C)
- Hexane : 0.93 g/l (100C), 2.4 g/l (300C)

4


Nhiệt độ nóng chảy: 47,480C, nhiệt độ sôi: 2370C. Độ hấp thụ: UV max ( trong diethyl
ether): 281 nm ; ( trong ethanol 95%): 275 nm [24][25][33].
1.2.1.3.Ứng dụng:
Methylisothiazolinonlà một chất thuộc nhóm isothiazoline đã được đăng ký đầu
tiên tại Mỹ vào năm 1977 như là một kháng sinh với nhiều mục đích sử dụng khác
nhau. MIT có tác dụng diệt khuẩn, tan tốt trong nước nên được ứng dụng nhiều làm
chất bảo quản trong mỹ phẩm, sản phẩm chăm sóc cá nhân trong công nghiệp và nông
nghiệp[26].
Trong mỹ phẩm: MIT được phép sử dụng trong mỹ phẩm, những sản phẩm
chăm sóc cá nhân từ năm 2015. Có tác dụng diệt khuẩn tốt và tan tốt trong nước nên
thường sử dụng trong các mỹ phẩm như kem dưỡng ẩm, chống nắng, sữa rửa mặt, kem
dưỡng da, dầu gội đầu, sữa tắm, ngoài ra MIT còn sử dụng trong một số sản phẩm
chăm sóc cá nhân như nước súc miệng, kem đánh răng, giấy ướt cho trẻ em…[26].
Trong công nghiệp: Methylisothiazolinone được sử dụng để kiểm soát chất
nhờn hình thành do vi khuẩn, nấm và tảo trong sản xuất bột giấy và giấy, trong hệ
thống làm mát nước, sử dung các hoạt động khai thác dầu, trong hệ thống máy giặt,
điều hòa không khí. Được đưa vào một số sản phẩm công nghiệp như keo dán, sơn,

nhiên liệu, màu vẽ …với vai trò là chất bảo quản. MIT cũng được sử dụng để kiểm soát
sự phát triển của nấm mốc, mối mọt trên các sản phẩm gỗ. Nghiên cứu cho thấy có
16,5 % các sản phẩm công nghiệp có chứa MIT[26].
Trong nông nghiệp: Được sử dụng trong thuốc trừ sâu[26].
1.2.1.4.Cơ chế tác dụng:
Focal adhesion kinase (FAK) là một enzym có chức năng phosphoryl hóa, nó
điều hòa một loạt các chức năng sinh lý bình thường của tế bào. Enzym này ức chế sự
hoạt động của một số chất oxy hóa gây độc tế bào ( ROS). Methylisothiazolinon là một
trong những chất ức chế sự hoạt động của FAK do ngăn cản quá trình phosphoryl hóa
tyrosin của FAK vì vậy tăng cường hoạt động của ROS gây độc và tiêu diệt các tế bào.
Đây cũng là cơ chế diệt khuẩn chủ yếu của Methylisothiazolinon [19].

5


1.2.1.5.Ảnh hưởng đến người sử dụng:
Độc tính: LD50 đường uống cấp tính cho các con chuột đực được xác định là
235 mg / kg (95% giới hạn tin cậy của 216-336 mg / kg) và cho chuột cái 183 mg / kg
(95% giới hạn tin cậy của 154-214mg / kg) [21].
Dựa vào cơ chế tác dụng của MIT là ngăn cản hoạt động của FAK làm tăng
nồng độ của các chất oxy hóa gây độc tế bào ROS, người ta nhận thấy MIT có tiềm
năng là một chất độc thần kinh phá hủy các tế bào thần kinh. Các thí nghiệm trong
invitro cho thấy sự tiếp sức với MIT gây độc làm chết các tê bào thần kinh được nuôi
cấy. Nghiên cứu trên tế bào vỏ não chuột cho thấy có sự ức chế các tế bào thần kinh
khi tiếp xúc với MIT, kết luận cho thấy rằng tiếp xúc lâu dài với MIT có ảnh hưởng
xấu đến các tế bào thần kinh đang phát triển.Tuy nhiên trong các thí nghiệm invivo, thí
nghiệm trên động vật không cho thấy tác dụng độc thần kinh với MIT được sử dụng
trong mỹ phẩm[21].
Một tác dụng có hại quan trọng nữa của MIT đó là tác dụng gây dị ứng. Tỷ lệ bị
dị ứng khi tiếp xúc với MIT là từ 1-5 %. Các báo cáo đầu tiên về dị ứng khi tiếp xúc

MI xuất hiện vào năm 1987. Đầu tiên là viêm da tiếp xúc dị ứng nghề nghiệp từ MIT
có trong sơn. Dị ứng viêm da và viêm da tiếp xúc toàn thân cũng được báo cáo do tiếp
xúc trực tiếp với không khí có MIT từ sơn vữa trên tường vẽ hoặc từ chất tẩy rửa nhà
vệ sinh.
Các báo cáo dị ứng đầu tiên từ mỹ phẩm bắt đầu từ năm 2010 chủ yếu là do
khăn ướt lau vệ sinh (khăn lau em bé, giấy vệ sinh ẩm),dầu gội, mỹ phẩm trên khuôn
mặt như sữa rửa mặt, tẩy trang…, chất khử mùi và kem chống nắng.
Tỷ lệ dị ứng có liên quan tới MIT là tương đối cao và tỷ lệ này tăng theo hàng
năm song song với việc sử dụng rộng rãi của MIT. Nghiên cứu tỷ lệ gây dị ứng của
MIT khi không sử dụng chung với MCT đã được thực hiện ở một loạt các nước châu
Âu. Theo báo cáo từ 2006-2010, tỷ lệ bệnh nhân bị dị ứng tiếp xúc với mỹ phẩm có
chứa MIT là 1,5% ở Đan Mạch (37 trong 2536 bệnh nhân được thử nghiệm da liễu).
Tuy nhiên, trong giai đoạn 2010-2013, tỷ lệ bệnh nhân Đan Mạch dị ứng với MIT tăng

6


lên đáng kể 2,0% trong năm 2010, 3,0% năm 2011, 3,7% trong năm 2012 (2766 bệnh
nhân da liễu thử nghiệm tại Đan Mạch) và đến năm 2013 là 5,7%. Ở Đức, trong cùng
thời gian, tỷ lệ tăng từ 1,9% năm 2009 lên 4,4% trong năm 2011 (dựa trên 21.274 bệnh
nhân da liễu). Tỷ lệ ở Phần Lan là 1,4% và 0,6% trong số 10.821 da liễu bệnh nhân thử
nghiệm với 1000ppm và 300ppm MI trong giai đoạn 2006-2008. Trong thời gian
2011/2012, các cuộc điều tra tương ứng ở một số quốc gia châu Âu khác (Anh, Bỉ, Bồ
Đào Nha) cho thấy tỷ lệ đị ứng khi tiếp xúc với MIT tăng tương tự như các nước trên.
Năm 2013, Urwin và Wilkinson báo cáo một tỷ lệ 1,8-4,6% ở Leeds (Anh) (2619 bệnh
nhân được thử nghiệm), và Gonçalo và Goossens báo cáo tỷ lệ là 6,0% ở London, 5,8%
ở Leuven và 4,5% ở Coimbra[20][24][27].
Một nghiên cứu khác cũng cho thấy tỷ lệ dị ứng với MIT có sự tăng đặc biệt ở
những bệnh nhân nữ với viêm da mặt. Điều này cho thấy sự gia tăng này có liên quan
đến tiếp xúc với mỹ phẩm[28]. Tại Hoa Kỳ cũng xảy ra tình huống tương tự như các

nước châu và MIT được đưa vào danh sách các chất gây dị ứng vào năm 2013[27].
Một số ảnh hưởng của MIT đến môi trường hệ sinh thái cũng đc được nghiên
cứu và chứng minh[32][38].
1.2.2. Methylcholoisothiazolinon (MCT):
1.2.2.1. Công thức hóa học:

Công thức phân tử: C4H4ClNOS

Khối lượng phân tử: 149.45

Danh pháp quốc tế: 5-chloro-2-methylisothiazol-3(2H)-one. (Theo IUPAC).
Tên khác: 5-Chloro-2-methyl-4-isothiazolin-3-one [25][33].
1.2.2.2. Tính chất vật lý:

7


Là tinh thể có màu vàng nhạt, mùi cay, nhiệt độ nóng chảy 69ºC, nhiệt độ sôi
262ºC.Tan tốt trong nước, methanol, acetonitril. Có độ tan trong một số dung môi như
sau:
- Độ hòa tan trong nước

:706-751 g / L, 200C

- Độ tan trong Ethyl acetate : 38,06 g / L, 100C
52,55 g / L, 300C
- Độ tan trong Hexane

: 1.39 g / L, 100C


2.91 g / L, 300C [25][33].
1.2.2.3. Ứng dụng và cơ chế tác dụng:
MCTlà một chất thuộc nhóm isothiazolinon tương tự như MIT nó có tác dụng
diệt khuẩn, cơ chế tác dụng giống với MIT. MCT có nồng độ sử dụng cao hơn so với
MIT và MCT lại có khả năng gây dị ứng cao hơn vì vậy MCT không được dùng đơn
độc trong mỹ phẩm và các sản phẩm chăm sóc sức khỏe cá nhân mà thường kết hợp
với MIT với tỷ lệMCT:MIT (3:1). Hỗn hợp này được sử dụng rộng rãi trong mỹ phẩm,
các sản phẩm chăm sóc cá nhân và cả trong trong công nghiệp để thay thế cho MIT và
MCT dùng đơn độc. MCT dùng đơn độc chủ yếu trong công nghiệp không được dùng
trong mỹ phẩm[22][25][29].
1.2.2.4.Ảnh hưởng đến người sử dụng:
Liều độc LD50 ở chuột: 481mg/kg.
Độc tính của MCT cũng tương tự như với MIT nhưng được chú ý nhiều nhất là
khả năng gây dị ứng rất mạnh, mạnh hơn so với MIT. Mặt khác MCT rất ít khi được
dùng đơn độc mà chủ yếu được sử dụng dưới dạng phối hợp với MIT với tỷ
lệMCT/MIT 3:1 nên những nghiên cứu tập trung vào những tác dụng của hỗn hợp
MCT/MIT 3:1 nhiều hơn so với nghiên cứu đơn độc một mình MCT.
MCT cũng được xem như một chất có khả năng gây ung thư tuy nhiên hiện
chưa có bằng chứng chứng minh cụ thể [25][28].
1.2.3.Hỗn hợp Methylchloroisothiazolinon:methylisothiazolinon tỷ lệ 3:1

8


Một số tên gọi khác: Methylchloroisothiazolinone và methylisothiazolinone với
magnesium chloride và magnesium nitrate, 5-chloro-2-methylisothiazol-3(2H)-one và
2-methylisothiazol-3(2H)-one tỷ lệ 3:1.
Tên thương mại: Kathon™ CG (MCT/MIT 3:1, Mg salts) Acticide LG, Acticide
14 L, Acticide 14P[25].
1.2.3.1. Công thức của hỗn hợp :

Hỗn hợp MCT/MIT 3:1 với muối, nồng độ tổng của MCT và MIT 1,5% -15%.
Các muối ví dụ như muối Magnesium nitrate và magnesium chloride trong Kathon™
CG có tác dụng làm chất ổn định, những muối này được đánh giá là an toàn, tuy nhiên
không bao gồm những hướng dẫn đối với mỹ phẩm.
Công thức của Kathon™ 886F (14% nominal) :
-

Chloromethylisothiazolinone: 10.6 – 10.8 %

-

Methylisothiazolinone

: 3.43 – 3.47 %

-

Magnesium nitrate

: 16.5 – 17.1 %

-

Magnesium chloride

: 9.30 – 9.43 %

Nước vừa đủ [25].
1.2.3.2. Tính chất vật lý của hỗn hợp:
Tùy thuộc vào công thức và nhà sản xuất các chế phẩm thương mại sẽ có tính

chất khác nhau. Tính chất vật lý chung là chất lỏng tan tốt trong nước, methanol,
acetonitril[25].
1.2.3.3. Những ưu điểm của hỗn hợp MCT/MIT 3:1 so với dùng đơn độc MIT và MCT
Tác dụng gây dị ứng của MIT thấp hơn so với MCT, tuy nhiên nồng độ sử dụng
lại cao, còn MCT lại có tác dụng gây dị ứng mạnh và nồng độ sử dụng cũng cao. Các
nghiên cứu cho thấy rằng khi phối hợp MCT với MIT với tỷ lệ 3:1 sẽ tăng khả năng
tiêu diệt vi khuẩn do đó sẽ giảm nồng độ sử dụng, hạn chế tác dụng gây dị ứng cũng
như tác hại với môi trường so với khi dùng đơn độc MIT[28].
Tỷ lệ cho phép của MIT và MCT trong cả mỹ phẩm lẫn công nghiệp đều rất
thấp vì vậy rất khó có thể duy trì hàm lượng cho phép nếu sử dụng MIT và MCT đơn

9


độc. Hỗn hợp MIT và MCT trên thị trường có nồng độ 1,5% - 14%có tác dụng như một
dung dịch mẹ có thể dễ dàng đảm bảo hàm lượng khi đưa vào các sản phẩm [25].
1.2.3.4. Ảnh hưởng đến người sử dụng:
Cũng tương tự như độc tính của MCT và MIT, tác dụng có hại của hỗn hợp
cũng chủ yếu là phản ứng dị ứng, đã có rất nhiều nghiên cứu trên cả invitro, invivo và
cả nghiên cứu thống kê dịch tễ học đã chứng minh rõ tác dụng có hại này của hỗn hợp
dù nồng độ cho phép sử dụng của nó thấp hơn rất nhiều so với dùng đơn độc MIT [28].
Trong những năm 1980, một số trường hợp người lao động dị ứng tiếp xúc với
các chất bảo quản MCT/MIT đã được báo cáo. Tiếp theo là các báo cáo về sự gia tăng
tỷ lệ dị ứng tiếp xúc với MCT/MIT trong số bệnh nhân ở một số nước. Cùng với sự
phổ biến sử dụng MCT/MIT các nghiên cứu cho thấy có tỷ lệ dị ứng có liên quan
MCT/MIT cũng tăng lên. Ví dụ :Tại Bỉ năm 2012,tỷ lệ nhạy cảm với MCT/MIT là
4,5% ,tỷ lệ này tăng lên đến 7,2% trong năm 2013. Tỷ lệ nhạy cảm MCT/MIT ở Gran
Canaria Tây Ban Nha tăng từ 3,6% năm 2007 lên 17,3% vào năm 2012[25][27].
1.3.


Những quy định về sử dụng MIT và MCT

1.3.1. Trên thế giới:
Mỹ quy định đối với MCT:
- Microbiocide cho thu hồi dầu bùn khoan và các chất lỏng đóng gói giới hạn từ 0,34
đến 34 ppm.
- Thuốc diệt nấm (nấm mốc) cho các sản phẩm gỗ giới hạn từ 1,7-37 ppm thành phần
hoạt chất.
- Thủy sản không dùng cho thực phẩm giới hạn từ 0,11-36 ppm[26].
Mỹ quy định đối với MIT:
- Microbiocide cho thu hồi dầu bùn khoan và các chất lỏng đóng gói giới hạn từ 0,1
đến 10 ppm.
- Thuốc diệt nấm (nấm mốc) cho các sản phẩm gỗgiới hạn từ 0,52-11ppm thành phần
hoạt chất.
- Thủy sản không dùng trong thực phẩm giới hạn từ 034-11 ppm.

10


- Trong nông nghiệp: Được sử dụng trong thuốc trừ sâu với vai trò là chất bảo quản
với nồng độ quy định không quá 2,25ppm[26].
Đối với các sản phẩm mỹ phẩm: Sau khi xem xét lợi ích và nguy cơ cũng như
các nghiên cứu về nồng độ diệt khuẩn tối thiểu, nồng độ gây tác dụng dị ứng. Liên
minh châu Âu, ASEAN, Mỹ và một số nước khác đã quy định nồng độ của hỗn hợp
MCT/MIT tỷ lệ 3:1 không được vượt quá 15 ppm, MIT sử dụng đơn độc không được
vượt quá 100 ppm trong mỹ phẩm[14][16][20][24][25][27].
Mỹ cũng quy định những sản phẩm có MIT và MCT phải có dòng chữ “Sản
phẩm này có thể gây ra các phản ứng mẫn cảm da ở một số người”[26].
1.3.2. Quy định về mỹ phẩm có chứa MCT và MIT ở Việt Nam:
Trước những nguy cơ của mỹ phẩm có chứa MCT và MIT đối với sức khỏe

người tiêu dùng. Ngày13/4/2015, cục Quản lý Dược đã có quy định cụ thể trong công
văn 6577/QLD-MP: Các chất bảo quản Methylisothiazolinone (MIT) và hỗn
hợp Methylchloroisothiazolinone với Methylisothiazolinone (MCT + MIT) (tham
chiếu 39, 57 Annex V) theo tỷ lệ 3:1 chỉ được sử dụng trong các sản phẩm rửa sạch
(rinse-off products) với nồng độ không quá 0,01% (100ppm) và 0,0015% (15ppm).
Hỗn hợp MCT + MIT theo tỷ lệ 3:1 và có thêm MIT thì không được sử dụng trong
sảnphẩm mỹ phẩm.
Thời hạn áp dụng quy định đối với Methylisothiazolinone (MIT) và hỗn
hợpMethylchloroisothiazolinone với Methylisothiazolinone (MCT + MIT) (tham
chiếu 39, 57 Annex V) nêu trên: Thời hạn công bố đối với các sản phẩm mới sản
xuất trong nước, nhập khẩu đến hết ngày 01/7/2015. Các sản phẩm sản xuất trong
nước, nhập khẩu chỉ được phép lưu thông trên thị trường đến hết ngày 30/4/2016[4].
1.4.

Một số phƣơng pháp định tính, định lƣợng MIT và MCT:
Nồng độ cho phép sử dụng của MIT và MCT rất thấp nên cần có một phương

pháp có độ nhạy cao để định lượng. Hai phương pháp thường được lựa chọn là: GCMS và HPLC. Tuy nhiên nhiệt độ sôi của MIT và MCT tương đối cao nên phương
pháp GC-MS mặc dù có độ nhạy cao hơn nhưng ít được sử dụng, chủ yếu là phương

11


pháp HPLC có độ nhạy thấp hơn nhưng đơn giản, dễ tách MIT và MCT (độ tan trong
nước, methanol, acetonitril của MIT và MCT khác nhau khá nhiều) thích hợp cho định
lượng đồng thời. [24] [25].
1.4.1. Phương pháp GCMS:
Định lượng MIT trong mỹ phẩm[39]
Điều kiện GC / MS:
-


Cột: Agilent J & W DB-5, 30 mx 0,25 mm

-

Khí mang: Helium 1,2 ml / phút (dòng chảy liên tục)

-

Inlet: Split, 40: 1 tỷ lệ

-

Nhiệt độ: 250°C

-

Thể tích tiêm: 1 ml
-

Điều kiện lò: ban đầu là 60°C, tăng 10°C/phút cho đến 110°C, tiếp theo tăng

100°C/phút đến 325°C, giữtrong 2 phút
-

Nhiệt độ nguồn: 230°C

-

Detector: Khối phổ với ion hóa được thực hiện bởi EI.


1.4.2. Phương pháp HPLC: Các phương pháp HPLC thường nghiên cứu để định
lượng đồng thời MIT và MCT vì đa số các sản phẩm chứa đồng thời hai chất này
Phƣơng pháp 1: Định lượng MIT và MCT trong nước keo dán[44]. Điều kiện sắc ký:
-

Cột: cột C18 (5 μm, 250mmX4.6mm, Agilent Inc.);

-

Detector: DAD

-

Pha độngMethanol: nước = 50: 50

-

Tốc độ dòng chảy: 0.8mL/phút

-

Nhiệt độ cột 300C;

-

Thể tích tiêm: 10μL.

Phƣơng pháp 2: Định lượng 22 chất bảo quản trong mỹ phẩm trong đó có MIT và
MCT[43].Điều kiện sắc ký:

-

Cột sắc ký sử dụng là Acquity UPLC- BEH C18 (2.1 mm × 50 mm,1.7 µm )

Detected: UPLC-PDA

12


-

Pha động: Chạy theo gadien giai đoạn phân tích MCT và MIT là nước-methanol

65:35,
-

Nhiệt độ cột: 300C

-

Tốc độ pha động: 0.6 ml/phút

-

Thể tích mẫu 15μL.

Phƣơng pháp 3: Định lượng chất bảo quản trong các sản phẩm chăm sóc da trong đó
có MIT và MCT[36].Điều kiện sắc ký
-


Cột sắc ký: Symmetry C18, 75x4,6 mm, 3,5 µm và Zorbax SB-C18,12.5x4.6

mm, 5µmbảo vệ cột.
-

Pha động: Dung môi A là axid o-phosphoric 0,1% trong nước; dung môi B là

methanol. Chạy theo Gradient sau đây: 1% B , 99% A liên tục trong 10 phút, A giảm
tới 49% trong 30 phút tiếp theo, sau đó giảm đến 10% trong 1 phút, duy trì trong 9
phút. Cân bằng trước khi tiêm tiếp theo là 16 phút.
-

Tốc độ pha động: 1 ml/phút,

-

Thể tích tiêm 20 µl,

-

Nhiệt độ cột: nhiệt độ môi trường.

Phƣơng pháp 4: Định lương MIT và MCT trong dầu gội[22].Điều kiện sắc ký:
-

Cột sắc ký: LiChrosorb © RP-18 (5 IZM) 250 x 4,6 mm, cột bảo vệ Perisorb ©

RP-18, 30-40 IZM, 40 X 4,6 mm.
-


Pha động: Acid acetic 0,2%-methanol (45:55)

-

Tốc độ pha động: 0,5 ml/phút,

-

Nhiệt độ cột: 250C

-

Detector : DAD.

-

Bước sóng UV: 275 nm.

Phƣơng pháp 5: Định lượng một số chất bảo quản trong mỹ phẩm trong đó có MIT và
MCT [31]. Điều kiện sắc ký:
-

Cột develosil Aqoeus AR-RP-5RP-30 (250x4,6mm, 5µm), bảo vệ bằng

Develosil RP-RP Aqueous AR-30 (10x40mm, 5µm)

13


-


Pha động chạy theo gadien trong đó giai đoạn MIT và MCT là Acetonitril-acid

formic 0,1 % tỷ lệ 15 : 85
-

Tốc độ pha động: 1,0ml/phút

-

Thể tích tiêm mẫu: 20µl

-

Detector: DAD

-

Bước sóng phát hiện: 274nm.

Phƣơng pháp 6: Định lượng đồng thời MIT và MCT do nhà sản xuất máy HPLC đề
xuất[41]. Điều kiện sắc ký
-

Cột: Pathfinder® MR( 4.6 mm x 150 mm, 3,5 μm)

-

Pha động: Acid formic 0,1 %-Acetonitril 85:15


-

Tốc độ pha động: 1ml/phút

-

Thể tích tiêm: 1µl

-

Detector: UV

-

Bước sóng : 240nm

-

Nhiệt độ cột: 400C.
Nhìn chung các phương pháp đều sử dụng cột sắc ký pha đảo C18, một số chương

trình chạy gradient. Chúng tôi mong muốn xây dựng, đóng góp thêmmột quy trình
phân tích đơn giản, sử dụng các dung môi thông thường để định tính định lượng MIT
cà MCT trong mỹ phẩm với hy vọng dễ dàng áp dụngtại các phòng thí nghiệm ở Việt
Nam.
1.4.3. Tổng quan về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao:
1.4.3.1. Nguyên lý chung của sắc ký lỏng:
Sắc ký lỏng là quá trình tách xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chất rắn và pha
động là chất lỏng (sắc ký lỏng - rắn). Mẫu phân tích được chuyển lên cột tách dưới
dạng dung dịch. Cơ chế của quá trình sắc ký lỏng là hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay

loại trừ theo kích cỡ.
Trong sắc ký lỏng hiệu năng cao, mẫu phân tích được tiêm qua buồng tiêm và
được đi vào cột nhờ pha động, các thành phần trong mẫu phân tích được tách ra trên

14


pha tĩnh chứa trong cột rồi đi qua detector để phát hiện và cho các tín hiệu được ghi
trên sắc đồ.
a. Pha tĩnh trong sắc ký lỏng :
Pha tĩnh hay dùng nhất trong sắc ký lỏng hiệu năng cao là pha tĩnh mà trong đó
các nhóm silanol trên bề mặt hạt silicagel (chất mang) đã được liên kết với các nhóm
hóa học khác nhau tạo nên các hợp chất siloxan có độ phân cực khác nhau tùy theo
nhóm liên kết:
- Si-O-Si -R


Khi

R là các nhóm ít phân cực như octyl (C8), octadecyl (C18), phenyl và pha động phân
cực, ta có sắc ký pha đảo (RP-HPLC).
Khi R là nhóm khá phân cực như alkylamin hay alkylnitril pha động là dung
môi ít phân cực, ta có sắc ký pha thuận (NP-HPLC). Hiện nay, kỹ thuật RP-HPLC
được sử dụng rộng rãi vì tách tốt được nhiều hợp chất khác nhau, thành phần chính của
pha động là nước nên rất kinh tế. Cột thông dụng là cột ODS (RP18), C8 với cỡ hạt 5
hay 10m. Để cải thiện khả năng tách, tiết kiệm dung môi và thời gian, gần đây người
ta đã đưa sắc ký lỏng nhanh (UPLC) vào ứng dụng rộng rãi. Trong UPLC, kích thước
hạt chất mang nhỏ (thường từ 1,7 – 2,2 m) và có thể sử dụng cột ngắn hơn (5-10cm).
b. Pha động trong sắc ký lỏng:
Pha động đóng góp một phần rất quan trọng trong việc tách các chất phân tích

trong quá trình sắc ký nhất định. Mỗi loại sắc ký đều có pha động rửa giải riêng cho nó
để có được hiệu quả tách tốt. Pha động có hai loại phân cực và ít phân cực thường dùng
cho sắc ký pha đảo và sắc ký pha thuận. Tuy nhiên pha động một thành phần đôi khi
không đáp ứng được khả năng rửa giải, người ta thường phối hợp 2 hay 3 dung môi để
có được dung môi có độ phân cực từ thấp đến cao phù hợp với phép phân tích. Sự thay
đổi thành phần pha động theo thời gian gọi là rửa giải gradient nồng độ.
c. Detector trong sắc ký:

15


Có nhiều loại detector khác nhau, tùy thuộc bản chất lý hóa của chất phân tích
mà lựa chọn detector cho phù hợp:
- Detector quang phổ hấp thụ phân tử UV-VIS: áp dụng cho các chất có khả năng hấp
thụ ánh sáng trong vùng tử ngoại hoặc khả kiến.
- Detector huỳnh quang: sử dụng để phát hiện các chất có khả năng phát huỳnh quang.
Đối với các chất không phát huỳnh quang cần phải dẫn xuất hóa chất phân tích để tạo
sản phẩm có khả năng phát huỳnh quang.
- Detector khúc xạ: thường dùng định lượng hợp chất đường.
- Detector độ dẫn: phù hợp các chất có hoạt tính điện hóa.
Ngoài ra còn tán xạ ánh sáng bay hơi (ELSD), khúc xạ (RI), điện hóa, phổ khối
(MS)... trong đó detector chuỗi diode (DAD) cho phép thay đổi bước sóng theo chương
trình đã đặt trong một quá trình sắc ký.
d. Cấu tạo của hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao
Thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao gồm 3 phần chính:
- Phần đầu vào gồm pha động, bơm, hệ thống tiêm mẫu.
- Phần tách: gồm cột tách, lò cột, có thể có cột phụ trợ.
- Phần phát hiện và xử lý số liệu: gồm detector, bộ phận ghi tín hiệu (máy tính) [3].

Hình 1.1. Sơ đồ cấu tạo hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao.


16