VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
------

------

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Đề tài:

Phân lập, tuyển chọn và định tên nấm men Moniliella có
khả năng sinh tổng hợp erythritol cao

Người hướng dẫn

: PGS.TS. VŨ NGUYÊN THÀNH

Sinh viên

: PHÙNG THỊ NGỌC HÂN

Niên khóa

: K18 -Lớp 11.01 - KS.CNSH

Hà Nội - 2015


Viện Đại Học Mở Hà Nội

Khoa Công Nghệ Sinh Học

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan số liệu và kết quả nghiên cứu trong Khóa luận này là trung thực.
Tôi xin cam đoan, mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện Khóa luận này đã được
cám ơn và các thông tin trích dẫn trong Khóa luận này đã được ghi rõ nguồn gốc.
Hà Nội, ngày 25 tháng 05 năm 2015
Sinh viên
Phùng Thị Ngọc Hân

Phùng Thị Ngọc Hân

ii

Lớp: 11.01


Viện Đại Học Mở Hà Nội

Khoa Công Nghệ Sinh Học

LỜI CẢM ƠN
Trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu, em đã nhận được rất nhiều sự
giúp đỡ, chỉ bảo, động viên của thầy cô, gia đình và bạn bè.
Lời đầu tiên em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. TS. Vũ Nguyên
Thành, người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo,tạo mọi điều kiện giúp em thực hiện
khóa luận này.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới tập thể cán bộ Trung tâm Vi sinh vật,
Viện Công nghiệp Thực phẩm đã luôn nhiệt tình giúp đỡ, tạo mọi điều kiện để em
hoàn thành tốt công việc.
Qua đây, em xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô khoa công nghệ sinh học, Viện

Đại Học Mở Hà Nội đã tận tình dạy dỗ chúng em trong suốt 4 năm học qua.
Cuối cùng, em xin dành lời cảm ơn chân thành đến gia đình, người thân, bạn
bè những người luôn động viên, khích lệ em trên con đường học tập, làm quen với
công tác nghiên cứu khoa học.

Hà Nội, Ngày 25 tháng 5 năm 2015
Sinh viên
Phùng Thị Ngọc Hân

Phùng Thị Ngọc Hân

iii

Lớp: 11.01


Viện Đại Học Mở Hà Nội

Khoa Công Nghệ Sinh Học

DANH SÁCH KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
Bp:

Base pair (cặp bazơ)

ITS:

Internal transcribed spacer

PCR:


Polymerase chain reaction (kỹ thuật phản ứng chuỗi polymerase)

dNTPs: Deoxyribonucleotide triphosphat
DNA:

Deoxyribonucleic Acid

rDNA:

Ribosomal Deoxyribonucleic Acid

Phùng Thị Ngọc Hân

iv

Lớp: 11.01


Viện Đại Học Mở Hà Nội

Khoa Công Nghệ Sinh Học

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1. Đặc điểm của một số loại đường .............................................................. 11
Bảng 2. Kết quả phân nhóm bằng hình thái .......................................................... 26
Bảng 3. Ký hiệu các chủng trong phổ fingerprinting ............................................. 28
Bảng 4. Kết quả phân nhóm 30 chủng bằng fingerprinting ................................... 29
Bảng 5. Kết quả tuyển chọn khả năng sinh polyol của các chủng nấm men

Moniliella. ............................................................................................................ 34

Phùng Thị Ngọc Hân

v

Lớp: 11.01


Viện Đại Học Mở Hà Nội

Khoa Công Nghệ Sinh Học

DANH MỤC HÌNH
Hình 1. Cây phả hệ mô tả mối quan hệ giữa các loài thuộc chi Moniliella.
Phylloporia pectinata được sử dụng như nhóm ngoài. Mã số GenBank của trình tự
rDNA được đưa ra sau tên loài. Thanh chèn tương ứng 5% khác biệt trình tự. ...... 3
Hình 2. Hình ảnh tế bào Moniliella suaveolens CBS 120.63 (trái) và Moniliella
acetoabuten CBS 169.66 (phải).(Nguồn www.mycobank.org) ............................... 4
Hình 3. Cấu trúc hóa học của erythritol ................................................................ 8
Hình 4. Hình ảnh đường Erythritol ....................................................................... 9
Hình 5. Độ ngọt của các loại đường lấy sucrose làm chuẩn .................................. 10
Hình 6. Hoa ngũ sắc (Lantana camara) ................................................................ 24
Hình 7. Khuẩn lạc và tế bào chủng TBY 5326.3 trên malt-glucose 2°Bx sau 5 ngày
nuôi cấy (thanh chèn tương ứng 10µm). ............................................................... 25
Hình 8. Khuẩn lạc và tế bào chủng TBY 5101.1 trên malt-glucose 2°Bx sau 5 ngày
nuôi cấy (thanh chèn tương ứng 10µm) ................................................................ 25
Hình 9. Khuẩn lạc và tế bào chủng TBY 5325.1 trên malt-glucose 2°Bx sau 5 ngày
nuôi cấy (thanh chèn tương ứng 10µm) ................................................................ 25
Hình 10. Phổ fingerprinting của 30 chủng nấm men phân lập được ...................... 28

Hình 11. Vị trí các chủng đại diện phân lập được thuộc chi Moniliella. Mã số
GenBank của trình tự rDNA sau tên loài (thanh chèn tương ứng 2% khác biệt trình
tự). Phylloporia pectinata R.Coveny 113 được sử dụng như nhóm ngoài. ............ 30
Hình 12. Sắc kí đồ sản phẩm polyols TBY 5100.1 thuộc loài Moniliella sp1. ...... 32
Hình 13. Sắc kí đồ sản phẩm polyols TBY 5105.1 thuộc loài M. spathulata ......... 33

Phùng Thị Ngọc Hân

vi

Lớp: 11.01


Viện Đại Học Mở Hà Nội

Khoa Công Nghệ Sinh Học

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ................................................................................................ ii
LỜI CẢM ƠN ...................................................................................................... iii
DANH SÁCH KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ................................................. iv
DANH MỤC BẢNG ........................................................................................... v
DANH MỤC HÌNH ............................................................................................ vi
MỤC LỤC ........................................................................................................... vi
MỞ ĐẦU ............................................................................................................. 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN .............................................................................. 2
1.1. TỔNG QUAN VỀ NẤM MEN MONILIELLA ......................................... 2
1.1.1. Giới thiệu chung về nấm men Moniliella ............................................ 2
1.1.2. Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh sản của Moniliella ............................ 3
1.1.3. Phương pháp phân loại nấm men ........................................................ 4

1.1.4. Tình hình nghiên cứu ứng dụng Moniliella tại Việt Nam và thế giới ... 7
1.2. ERYTHRITOL .......................................................................................... 8
1.2.1. Cấu trúc, tính chất hóa học ................................................................. 8
1.2.2. Ứng dụng của erythritol trong công nghiệp ......................................... 11
1.2.3 Tình hình sản xuất erythritol ở Việt Nam và thế giới ........................... 12
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................. 15
2.1. ĐỐI TƯỢNG ............................................................................................ 15
2.2. HÓA CHẤT, DỤNG CỤ, TRANG THIẾT BỊ MÁY MÓC ....................... 15
2.2.1. Hóa chất ............................................................................................. 15
2.2.2. Dụng cụ và trang thiết bị, máy móc .................................................... 15
2.3. THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU ..... 16
2.3.1. Môi trường làm giàu có nồng độ đường cao ....................................... 16
2.3.2. Môi trường malt-glucose 2°Bx có axit lactic 1‰ ................................ 16
2.3.3. Môi trường malt-glucose 2°Bx không có axit lactic ............................ 16
2.3.4. Môi trường GYU ................................................................................ 17
2.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................. 18
Phùng Thị Ngọc Hân

vii

Lớp: 11.01


Viện Đại Học Mở Hà Nội

Khoa Công Nghệ Sinh Học

2.4.1. Phương pháp phân lập ........................................................................ 18
2.4.2. Phương pháp làm sạch và giữ giống ................................................... 18
2.4.3. Quan sát hình thái khuẩn lạc, tế bào ................................................... 18

2.4.4. Phương pháp tách chiết DNA tế bào nấm men ................................... 19
2.4.5. Phương pháp tinh chế DNA ................................................................ 19
2.4.6. Phương pháp tiến hành phản ứng PCR finger printing ........................ 19
2.4.7. Phương pháp điện di ........................................................................... 20
2.4.8. Nhuộm gel và đọc kết quả .................................................................. 20
2.4.9. Phương pháp phân loại nấm men dựa vào đọc trình tự rDNA ............. 20
2.4.10. Tuyển chọn chủng có khả năng chuyển hóa glucose thành erythritol 21
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ........................... 23
3.1. KẾT QUẢ PHÂN LẬP ............................................................................. 23
3.2. QUAN SÁT HÌNH THÁI, KHUẨN LẠC, TẾ BÀO ................................. 24
3.3. PHÂN NHÓM BẰNG KỸ THUẬT FINGERPRINTING .......................... 27
3.4. ĐỊNH TÊN MỘT SỐ CHỦNG NẤM MEN DỰA VÀO GIẢI TRÌNH TỰ
rDNA ................................................................................................................ 29
3.5. TUYỂN CHỌN NHỮNG CHỦNG NẤM MEN MONILIELLA CÓ KHẢ
NĂNG CHUYỂN HÓA GLUCOSE THÀNH ERYTHRITOL .......................... 31
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................................ 36
TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................. 37
PHỤ LỤC

Phùng Thị Ngọc Hân

viii

Lớp: 11.01


Viện Đại Học Mở Hà Nội

Khoa Công Nghệ Sinh Học


MỞ ĐẦU
Trước thập kỷ 1980 khi mà thực phấm chức năng bắt đầu phát triển rộng rãi,
Cerestar đã bắt đầu một nghiên cứu về sản xuất những loại đường mới, ít calo để sử
dụng từ một quy trình lên men liên tục trong đó có Erythritol. Erythritol là một loại
đường chức năng bốn cacbon đã được cho phép sử dụng như một phụ gia thực
phẩm ở Mỹ và nhiều nước trên thế giới. Nó được phát hiện vào năm 1848 bởi nhà
hóa học người Anh John Stenhouse. Những tính chất độc đáo riêng như không chứa
calo và không làm tăng lượng đường trong máu tạo cơ hội cho Erythritol được tiếp
thị một cách nhanh chóng như một chất ngọt có nguồn gốc tự nhiên tại nhiều nước
trên thế gới [1],[19].
Erythritol có thể được sản xuất thông qua con đường Vi sinh vật. Trong tự
nhiên, Một số chủng nấm có khả năng sinh erythritol như nấm men Moniliella,
Pichia, Candida, Trigonopsis, Auriobasidium, Psedozyma, Trichosporon và
Yarrowia [3]. Trong đó Moniliella là nhóm đối tượng được đặc biệt quan tâm vì
hiệu suất chuyển hóa đường để tạo Erythritol tương đối cao. Nấm men Moniliella
được phát hiện vào khoảng đầu thế kỷ 20, là nhóm nấm men có sắc tố đen thuộc
Basidiomycota, có khả năng lên men đường, tổng hợp các polyol đặc biệt là
erythritol và glycerol, đây là nhóm vi sinh vật có nhiều đặc điểm có lợi khi sử dụng
trong quy mô công nghiệp như là khả năng chịu được áp suất thẩm thấu cao, quá
trình lên men đơn giản. Nhằm mục đích tuyển chọn được những chủng Moniliella
phân lập tại Việt Nam có khả năng chuyển hóa glucose thành erythritol, là cơ sở cho
việc ứng dụng trong sản xuất công nghiệp. Chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài
“Phân lập, tuyển chọn và định tên nấm men Moniliella có khả năng sinh tổng
hợp erythritol cao”.

Phùng Thị Ngọc Hân

1

Lớp: 11.01



Viện Đại Học Mở Hà Nội

Khoa Công Nghệ Sinh Học

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. TỔNG QUAN VỀ NẤM MEN MONILIELLA
1.1.1. Giới thiệu chung về nấm men Moniliella
Con người biết đến nấm men Moniliella vào khoảng đầu thế kỉ 20 là một
nhóm phân loại không đồng nhất, thành tế bào có melanine và sinh sản bằng
phương thức nảy chồi. Tuy nhiên, nấm men Moniliella là một loại nấm rất khó để
nhận dạng, vì vậy những hiểu biết về chúng vẫn chưa được hoàn chỉnh [2].
Trước đây nấm men Moniliella là một chi rất đặc biệt về mặt phân loại, tiến hóa
trong giới nấm. Chi Moniliella lần đầu tiên được miêu tả năm 1966 với hai loài là M.
acetoabutens và M. tomentosa (Stolk & Dakin, 1966). Tiếp theo hai loài M. suaveolens
và M. mellis, được miêu tả bởi von Arx (1972) và Rao & de Hoog (1975). Sau đó tổ hợp
mới Moniliella pollinis được đề nghị cho M. tomentosa var. Pollinis dựa trên sự khác
biệt đáng kể trong thành phần G+C (De Hoog & Gueho, 1984). Năm 2009, Rosa và
cộng sự cho rằng Moniliella và Trichosporonoides (Haskins & Spencer, 1967) có thể xếp
vào cùng một chi và do vậy bốn tổ hợp loài M. megachiliensis, M. nigrescens, M.
oedocephalis, M. spathulata và một loài mới M. fonsecae được đề nghị (Rosa et al,
2009). Gần đây, ba loài mới nữa được công bố là M. carnis, M. dehoogii (Thanh et al,
2012) và M. byzovii (Thanh et al, 2013). Năm 2014, Wang và cộng sự đã phân tích dựa
trên trình tự của sáu gen bao gồm các tiểu đơn vị nhỏ (18S), DNA ribosome (rDNA),
đoạn D1/D2 của rDNA 26S, vùng ITS bao gồm rDNA 5.8S, hai tiểu đơn vị của RNA
polymerase II (RPB1 và RPB2) và các nhân tố dịch mã 1-α (EF1-α). Các nhà phân tích
đã đề nghị rằng Moniliellomycetes và Malasseziomycetes là hai lớp mới trong
Ustilaginomycotina, chúng có mối quan hệ họ hàng với Ustilaginomycetes,
Exobasidiomycetes. Và được sắp xếp theo trật tự: lớp Moniliellomycetes, bộ

Moniliellales, họ Moniliellaceae, chi Moniliella [10]. Như vậy cho tới nay chi
Moniliella gồm 12 loài:
Moniliella acetoabutens Stolk & Dakin (1966)
Moniliella byzovii Thanh, Hien & Thom (2013)
Moniliella carnis Thanh, Hai, Hien, Takashima & Lachance (2012)
Moniliella dehoogii Thanh, Hai, Hien, Takashima & Lachance (2012)
Phùng Thị Ngọc Hân

2

Lớp: 11.01


Viện Đại Học Mở Hà Nội

Khoa Công Nghệ Sinh Học

Moniliella fonsecae Rosa, Nakase, Jindamorakot, Limtong, Lachance,
Fidalgo-Jimenz, Daniel, Pagnocca, Inacio & Morais (2008)
Moniliella megachiliensis (Inglis & Sigler) Rosa & Lachance (2008)
Moniliella mellis Rao & dehoog (1975)
Moniliella nigrescens (Hocking & Pitt) Rosa & Lachance (2008)
Moniliella oedocephalis (Haskins & Spencer) Rosa & Lachance (2008)
Moniliella pollinis De Hoog & Gueho (1984)
Moniliella spathulata (de Hoog) Rosa & Lachance (2008)
Moniliella suaveolens von Arx (1972)

Hình 1. Cây phả hệ mô tả mối quan hệ giữa các loài thuộc chi Moniliella. Phylloporia pectinata
được sử dụng như nhóm ngoài. Mã số GenBank của trình tự rDNA được đưa ra sau tên loài. Thanh
chèn tương ứng 5% khác biệt trình tự.


1.1.2. Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh sản của Moniliella
Đặc điểm hình thái: Khuẩn lạc Moniliella lúc đầu màu kem, sau chuyển sang
màu xám đen hoặc đen oliu hoặc có thể màu xám hay xanh. Các chuỗi hướng ngọn
của các bào tử đính dạng chồi được tạo thành từ các gai nhỏ. Ở một số loài có thể
xuất hiện bào tử áo hình chùy, có vách dày. Có khi xuất hiện sợi giả. Tế bào hình
elip đến hơi trụ, hình que, có lỗ vách. Khuẩn ty phân nhánh, đường kính 2-6 µm
màu xanh lục, đứt gãy nhiều tạo thành các đốt ngắn [2].
Đặc điểm sinh lý: sinh trưởng chậm (sau 4 tuần nuôi cấy đường kính khuẩn lạc
khoảng 3cm). Một số loài có khả năng lên men đường, tổng hợp các polyol đặc biệt
Phùng Thị Ngọc Hân

3

Lớp: 11.01


Viện Đại Học Mở Hà Nội

Khoa Công Nghệ Sinh Học

là erythritol và glycerol. Ngoài ra một số loài cũng đồng hóa được các polyol như
mannitol, erythritol, sorbitol sau 5 ngày nuôi cấy, riêng inositol thì chúng không có
khả năng đồng hóa hay lên men [2].
Đặc tính sinh sản: sinh sản vô tính bằng nảy chồi, không hình thành nang bào
tử, xuất hiện bào tử đốt, cho đến nay chưa phát hiện được hiện được hình thức sinh
sản hữu tính [3].

Hình 2. Hình ảnh tế bào Moniliella suaveolens CBS 120.63 (trái) và Moniliella acetoabuten CBS
169.66 (phải).(Nguồn www.mycobank.org)


1.1.3. Phương pháp phân loại nấm men
Các phương pháp phân loại truyền thống
Phương pháp phân loại truyền thống dựa vào các đặc điểm về hình thái, sinh
lý, sinh hóa để phân loại nấm men [1].
Dựa vào đặc điểm hình thái tế bào nấm men: nấm men là cơ thể đơn bào
nhưng rất đa dạng về hình thái tế bào. Thông thường tế bào nấm men có hình
elip, hình cầu, một số có hình kéo dài dạng que, đôi khi có hình quả chanh.... Vì
vậy, dựa vào sự khác nhau về hình thái ta có thể sơ bộ phân loại các giống nấm
men khác nhau.
Dựa vào đặc điểm nuôi cấy: Quan sát sự thay đổi của môi trường lỏng trong
quá trình nuôi cấy để phân loại như: độ đục, độ tạo váng, bọt khí... Nếu nuôi trên
môi trường thạch thì đánh giá bằng hình thái, kích thước, màu sắc (trắng, kem,
đục,...) và trên bề mặt khuẩn lạc (nhẵn, xù xì, lõm,...)
Phùng Thị Ngọc Hân

4

Lớp: 11.01


Viện Đại Học Mở Hà Nội

Khoa Công Nghệ Sinh Học

Dựa vào đặc điểm sinh sản:
• Sự nảy chồi: Quan sát số lượng chồi, vị trí nảy chồi, sự sắp xếp chồi trên
tế bào mẹ, chồi có tách ra khỏi tế bào mẹ hay không nhằm phân biệt các chủng
khác nhau.
• Khả năng sinh bào tử: Sử dụng môi trường tạo bào tử, theo dõi thời gian sinh

bào tử, hình dạng, số lượng bào tử trong nang, khả năng phá vỡ nang.
Dựa vào các đặc điểm sinh lý, sinh hóa: Sử dụng các kiểm tra về sinh lý sinh
hóa như: khả năng lên men đường, khả năng đồng hóa đường và các hợp chất nitơ,
khả năng tạo màng, khả năng tạo sắc tố, khả năng tiết một số enzym ngoại bào quan
trọng (amylase, protease, kitinase, xenlulolase, cazeinase), khả năng tiết axit amin,
vitamin ra môi trường nuôi cấy [15].
Các phương pháp hóa phân loại và sinh học phân tử
Ngoài phương pháp phân loại truyền thống các nhà phân loại còn có thêm một
công cụ nữa là phương pháp phân loại bằng sinh học phân tử. Nhờ sự phát triển của
kỹ thuật di truyền và máy móc hiện đại giúp các nhà phân loại học có thêm cơ sở
vững chắc để phân loại, thậm chí định tên đến loài một cách chính xác mà không
cần nghiên cứu đến nhiều khía cạnh cùng một lúc.
Phân tích thành phần thành tế bào: Dựa trên cơ sở thành phần trong chuỗi
polysaccarit cấu tạo nên thành tế bào giữa các loài nấm men khác nhau thì khác
nhau. Việc phân tích thành phần thành tế bào cung cấp một đặc điểm quan trọng để
phân loại nấm men. Các thành phần của thành được sử dụng để phân tích bao gồm
glucan, mannan, kitin, xylose [14].
Thành phần G/C: Tỉ lệ (G+C)/(A+T+G+C) có xu hướng không đổi đối với các
loài nhất định, và khác nhau giữa các loài. Các chủng có thành phần (G+C) khác
nhau 2-2,5% thì thuộc hai loài khác nhau. Tuy nhiên thành phần (G+C) chỉ giúp
phân biệt được hai loài khác nhau mà không xác định được hai chủng có cùng loài
hay không vì nếu tỷ lệ (G+C) giống nhau nhưng trình tự khác nhau thì chúng thuộc
hai loài khác nhau [5],[6].
Loại CoQ: CoQ là chất mang quan trọng trong quá trình vận chuyển điện tử
trong chuỗi hô hấp. Các loài nấm men khác nhau có số lượng và loài CoQ khác

Phùng Thị Ngọc Hân

5


Lớp: 11.01


Viện Đại Học Mở Hà Nội

Khoa Công Nghệ Sinh Học

nhau là cơ sở để phân loại nấm men đến mức độ chi. Các CoQ phát hiện ở nấm
men: CoQ6, CoQ7, CoQ8, CoQ9, CoQ10 và CoQ10(H₂) [6].
Phân loại bằng kỹ thuật fingerprinting: phương pháp fingerprinting là phương
pháp dùng để phân nhóm dưới loài dựa trên sự tương đồng các đoạn DNA vệ tinh.
DNA vệ tinh là các đoạn DNA có trình tự lặp lại lớn, thường không mã hóa cho
gen và ít bị đột biến, thay đổi. Do đó chúng được dùng làm công cụ đắc lực trong
phân loại. Sử dụng các mồi được thiết kế theo trình tự của các DNA vệ tinh trong
phản ứng PCR. Sau đó các đoạn DNA vệ tinh đã khuếch đại sẽ được điện di để so
sánh kích thước. Sự tương đồng của các phổ băng thể hiện dự gần gũi của các
chủng nấm men.
Trình tự rDNA: Do ribosom có ở tất cả các tế bào sinh vật và ít biến đổi nên
nó là cơ sở nghiên cứu tổ tiên chung cho mọi sinh vật. Các rDNA có nhiều bản sao,
dễ phân lập, kích thước nhỏ nên dễ dàng phân tích các đặc điểm liên quan bằng các
kĩ thuật hiện đại như: RFLP, AFLP, hoặc đọc trình tự nucleotit, từ đó phân loại các
vi sinh vật một cách chính xác hơn. Các đoạn rDNA thường được chọn là: rDNA
5S, rDNA 5.8S, rDNA 18S, rDNA 26S, và ITS.
Đoạn gen mã hóa rDNA 5S trước đây được sử dụng nhiều trong phân loại do
nó có kích thước nhỏ (120 Nu) dễ xác định trình tự và có tính bảo thủ cao, là cơ sở
để xác định mối quan hệ phát sinh loài trên phổ rộng. Hiện nay vai trò rDNA 5S
được thay thế bởi rDNA 18S, rDNA 26S do chúng cung cấp nhiều thông tin hơn.
Đoạn gen mã hóa rDNA 18S: Đoạn gen này có kích thước lớn, có chứa các
vùng bảo thủ ở các phần khác nhau. Do vậy phân tích trình tự rDNA 18S cho
phép xác định mối quan hệ sinh vật từ ngành cho đến loài, hiệu quả hơn khi kết

hợp với đặc điểm (G+C), CoQ, thành tế bào để phân loại. Tuy nhiên việc phân
tích trình tự rDNA 18S có nhiều hạn chế do kích thước của chúng quá lớn gây tốn
kém trong đọc trình tự, làm cản trở việc áp dụng kỹ thuật này một cách rộng rãi
trong phân loại.
Đoạn gen mã hóa rDNA 26S: Một trong những thành tựu quan trọng đã đạt
được trong nghiên cứu đa dạng nấm men gần đây là thiết lập được cơ sở dữ liệu về
trình tự D1/D2 của rDNA 26S cho tất cả các nấm men đã biết. Điều đó cho phép so
sánh loài mới phân lập với các loài đã biết đã biết, nhờ đó xác định được tên và vị
Phùng Thị Ngọc Hân

6

Lớp: 11.01


Viện Đại Học Mở Hà Nội

Khoa Công Nghệ Sinh Học

trí của nó trong hệ thống phân loại một cách nhanh chóng và dễ dàng. Đoạn D1/D2
của rDNA 26S được chọn để nghiên cứu vì kích thước nhỏ (600bp), và khác nhau
giữa các loài (tính đặc hiệu loài cao), các chủng khác nhau dưới 1% nucleotit thì
cùng một loài và trên 10% chúng thuộc các chi khác nhau. Tuy nhiên cần phải sử
dụng nhiều gen để phân tích thì hiệu quả phân loại sẽ cao và chính xác hơn.
Vùng ITS: Vùng này nằm giữa rDNA 18S và rDNA 26S, có kích thước
khoảng 500bp. Do có tính bảo thủ cao, kích thước nhỏ nên vùng ITS được sử dụng
trong phân loại khá phổ biến như đoạn D1/D2 của rDNA 26S. So với mức độ
tương đồng của đoạn D1/D2 thì vùng ITS cũng tương tự, các chủng khác nhau
dưới 1% nucleotit thì được coi là cùng loài và trên 10% thì chúng thuộc các chi
khác nhau [5],[6].

1.1.4. Tình hình nghiên cứu ứng dụng Moniliella tại Việt Nam và thế giới
Từ khía cạnh công nghệ, nấm men Moniliella có nhiều ưu điểm như khả năng
sinh sản nhanh trong điều kiện hiếu khí, vi hiếu khí, phát triển dạng đơn bào trong
môi trường lỏng, phù hợp với công nghệ lên men chìm phổ biến hiện nay.
Moniliella còn có khả năng phát triển trong điều kiện áp suất thẩm thấu cao tương
đương với nồng độ glucose 60% (de Hoog et al., 2011). Điều này có ý nghĩa đặc
biệt quan trọng trong sản xuất thương mại khi cần nâng cao nồng độ cơ chất và sản
phẩm. Tính ưa áp suất thẩm thấu cũng giúp góp phần giảm tạp nhiễm trong quá
trình lên men. So với các nấm men khác cũng như vi khuẩn, tế bào nấm men
Moniliella có kích thước khá lớn (de Hoog et al., 2011) thuận lợi cho công nghệ
thu hồi sản phẩm (lọc, ly tâm). Ngoài ra, trên môi trường cơ chất rắn, Moniliella có
thể phát triển ở dạng sợi (de Hoog et al., 2011) và thích hợp với công nghệ sản
xuất lên men bề mặt [2].
Một số nghiên cứu về Moniliella phân lập tại Việt Nam được tiến hành tại
Viện Công nghiệp Thực phẩm đã cho thấy tiềm năng ứng dụng trong công nghệ
như khả năng chuyển hóa dầu thầu dầu thành tinh dầu đào, khả năng sinh một loại
kháng sinh mới (zymocin), khả năng sinh lipase, phosphatase và khả năng chuyển
hóa glucose tạo erythritol.
Trên thế giới Monilliella được nghiên cứu rất nhiều trong sản xuất erythritol
sử dụng nhiều loài nấm men như Moniliella magachiliensis, Moniliella ponillis,
Phùng Thị Ngọc Hân

7

Lớp: 11.01


Viện Đại Học Mở Hà Nội

Khoa Công Nghệ Sinh Học


Moniliella acetoabuten. Năm 1971, Antonie van Leeuwenhoek mô tả một phương
pháp lên men bằng vi sinh vật để sản xuất erythritol từ glucose bằng việc sử dụng
Moniliella (Torula) sp với tỷ lệ chuyển đổi của glucose thành erythritol tương đối
cao [12]. Các nghiên cứu về sàng lọc và đột biến được sử dụng để xác định các chủng
cải tiến của Moniliella có thể sản xuất erythritol từ glucose với một tỷ lệ chuyển đổi
ít nhất là khoảng 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65% hoặc cao hơn trong điều
kiện tối ưu. Tối ưu hóa Erythritol sản xuất bởi Moniliella acetoabutens sử dụng
phương pháp lên men bề mặt được thực hiện bởi Liu Peng Wang Ze-nan ZHANG
Shi-fa LI Ying (Công nghệ Sinh học và Kỹ thuật Thực phẩm, Đại học Công nghệ
Hợp Phì, Trung Quốc) tối ưu cho sản xuất erythritol trong môi trường gồm có
glucose 26%, chiết xuất nấm men 0,4%, KH2PO4 0,2g/L, MnSO4.4H2O 0,05g/L,
CuSO4.5H2O 0,04g/L, giá trị pH ban đầu 4,2, nhiệt độ 31°C, tốc độ lắc 150R/ phút.
Kết quả thu được nồng độ của erythritol đạt 75,63g/ L [9],[13].
1.2. ERYTHRITOL
1.2.1. Cấu trúc, tính chất hóa học
Cấu trúc
Erythritol thuộc nhóm monosaccharide, nhóm này cũng bao gồm: Sorbitol,
Mannitol, Xylitol và Glycerol. Erythritol có màu trắng, dạng rắn, không hút ẩm, có
dạng bột mịn hay tinh thể với vị ngọt nhẹ và có hình dạng giống Sucrose.
Erythritol là một đường đa chức với 4 cacbon. Kích thước phân tử nhỏ và có nhiều
tính chất độc đáo [20].
CTPT: C4H10O4
Tên hóa học: 1,2,3,4-butanetetrol, meso-erythritol
KLPT: 122,2

Hình 3. Cấu trúc hóa học của erythritol

Phùng Thị Ngọc Hân


8

Lớp: 11.01


Viện Đại Học Mở Hà Nội

Khoa Công Nghệ Sinh Học

Hình 4. Hình ảnh đường Erythritol

Tính chất vật lý, hóa học
Điểm nóng chảy và đặc điểm về nhiệt độ
Với khối lượng phân tử thấp so với đường Sucrose và các polysaccharide
khác, Erythritol có nhiệt độ sôi là 121°C và điểm đông đặc thấp, có độ hòa tan thấp
hơn so với các polysaccharide khác [1].
Độ tan trong nước
Erythritol tan trong nước tạo dung dịch không nhớt, không màu. Điểm khác
biệt của đường này là có độ hòa tan thấp và khi tan sinh ít nhiệt [2].
Tính chất chống oxy hóa
Erythritol có khả năng phản ứng cao với các gốc hydroxyl tự do (OH ) có sự
xúc tác bởi các kim loại như sắt và đồng. Các gốc tự do hydroxyl phản ứng ở một
tỷ lệ rất cao với hầu hết các phân tử sinh học, thủy phân hydrogen, hoặc quá trình
oxy hóa. Điều này dẫn đến protein, màng tế bào và DNA bị hư hỏng, cuối cùng
gây ra rối loạn chức năng tế bào hoặc phá hủy tế bào. Phân tử sinh học hay các tế
bào trong cơ thể có thể được bảo vệ để chống lại các gốc tự do bằng việc sử dụng
các chất chống oxy hóa để phá hủy các gốc tự do. Chất chống oxy hóa là các hợp
chất phản ứng với các gốc tự do trước khi chúng phản ứng với các phân tử sinh học
(tế bào). Điều này ngăn cản những thiệt hại của các protein, màng tế bào và DNA,
và do đó bảo vệ tế bào chống lại các tác hại của các gốc tự do. Erythritol có khả

năng tiêu hóa đến 90% và được chuyển hóa hoàn toàn, có tiềm năng lớn nhờ khả
năng chống oxy hóa trong cơ thể người. Polysaccharide cũng có tác dụng như
Phùng Thị Ngọc Hân

9

Lớp: 11.01


Viện Đại Học Mở Hà Nội

Khoa Công Nghệ Sinh Học

Erythritol là Mannitol. Giống như những polysaccharide khác, Erthritol cũng có
khả năng khử những gốc oxy tự do. Nó được tiêu hóa tốt nhưng không chuyển hóa,
chỉ tuần hoàn trong cơ thể do đó có tác dụng chống oxy hóa [1, 2].
Tính ổn định
Erythritol có tính ổn định cao. Nó có đặc tính tương tự như các polyol khác,
không có đầu khử nên bền với nhiệt và axit. Nó không bị phân hủy trong cả hai
môi trường axit và kiềm. Không hòa tan trong một số dung môi phân cực khác. Nó
thường được sử dụng kết hợp với Malnitol trong các công thức Erthritol đóng vai
trò là hệ số hòa tan giới hạn của các yếu tố như xiro trong bánh ngọt. [7]
Độ ngọt
Giống những loại đường đa chức khác, Erythritol có độ ngọt lớn, nhưng
không gay gắt, có sự ổn định về mặt vi sinh học vì có cấu trúc tương tự như
Sucrose, nếu lấy Sucrose làm chuẩn thì Erythritol có độ ngọt từ 60-70% so với
Sucrose và tùy vào từng loại thực phẩm [7].

Hình 5. Độ ngọt của các loại đường lấy sucrose làm chuẩn


Phùng Thị Ngọc Hân

10

Lớp: 11.01


Viện Đại Học Mở Hà Nội

Khoa Công Nghệ Sinh Học

Bảng 1. Đặc điểm của một số loại đường

Mạch
cacbon

Erythritol

Xylitol

Mannitol

Sorbitol

Maltitol

Isomalt

Lactitol


Sucrose

4

5

6

6

12

12

12

12

122

152

182

182

344

344


344

342

121

94

165

97

150

145-50

122

190

-23.3

-36.5

-28.5

-26

-18.9


-9.4

-13.9

-4.3

>160

>160

>160

>160

>160

>160

>160

160

2-12

2-10

2-10

2


10

2

>3

37

64

20

70

60

25

57

Trung

Trung

bình

bình

Trung


Trung

bình

bình

Trọng
lượng phân
tử
Nhiệt độtan
chảy(oC)
Nhiệt sinh
ra khi tan
kJ/mol
Độbềnnhiệt
(oC)
Độbền
axit/kiềm
(pH)

Thủy
phân

Khả năng
hòa
tan[%w/w ở

67

25oC]

Độ nhớt

Rất thấp

Hút ẩm

Rất thấp

Rất
thấp
Cao

Thấp
Thấp

cao
Thấp

Rất
thấp

Thấp

Trung

Trung

bình

bình


1.2.2. Ứng dụng của erythritol trong công nghiệp
Từ năm 1990, erythritol được thương mại hóa, được bổ sung vào thực phẩm
và đồ uống để tạo độ ngọt cũng như điều hòa vị và giúp ổn định cấu trúc sản phẩm
(Mitsubishi and Nikken 1996). Erythritol được sử dụng từ năm 1990 ở Nhật Bản
như một thành phần của kẹo, chất thay thế đường, sô cô la, đồ uống không cồn, kẹo
cao su, thạch, mứt và sữa chua (Mitsubishi and Nikken, 1996). Erythritol được sử
dụng với hàm lượng 46mg/ngày/người (Mitsubishi and Nikken, 1996) hoặc 0,7
mg/kg cân nặng/ngày. Ở Mỹ, erythritol được sử dụng như một chất kích thích
hương vị, định dạng hình sản phẩm, chất giữ ẩm, chất tạo ngọt, chất ổn định, chất
tạo tạo đông, chất kìm hãm hoặc chất tạo kết cấu được sử dụng để thay thế đường
Phùng Thị Ngọc Hân

11

Lớp: 11.01


Viện Đại Học Mở Hà Nội

Khoa Công Nghệ Sinh Học

100% và có hàm lượng chiếm tới 50% trong kẹo cứng; 40% ở kẹo mềm (kẹo bạc
hà và sô cô la); 1,5% ở đồ uống thấp năng lượng; 60% ở kem béo; 7% bánh quy và
bánh xốp; 60% ở kẹo cao su.
Thế giới đang có xu hướng sử dụng erythritol và sử dụng với hàm lượng lớn
trong sản xuất bánh kẹo, kẹo cao su, đồ uống, bánh ngọt bởi vì nó không có ảnh
hưởng đến hàm lượng glucose và insulin, nó rất an toàn với người mắc bệnh tiểu
đường. Đặc tính của trúc của erythritol lại giống với mannitol – một chất chống
oxy hóa thông dụng. Vì vậy trong khảo sát trên cơ thể sống và trong ống nghiệm

trên động vật sống (Van Acker et al.,1996 và Yokozawa et al.,2002), erythritol có
tác dụng giảm thiểu hàm lượng glucose trong huyết thanh (15% ở hàm lượng sử
dụng cao nhất), ở gan và ở các mô thận.
Erythritol đóng vai trò là một chất chống oxy hóa trong cơ thể sống chống lại
sự tăng đường huyết và sự phá vỡ mạch máu (Den Hartog et al. 2009).
Trong khi tất cả các đường chức năng polyol các đều có thể gây phản ứng
nguy hiểm cho hệ tiêu hóa thì erythritol thì lại rất an toàn. Các nghiên cứu khoa
học đã chứng minh rằng, ở mức độ hấp thụ nhất định thì erythritol hoàn toàn vô hại
tới ruột hay hệ tiêu hóa. Cơ sở giải thích cho sự an toàn này là do erythritol có kích
thước phân tử rất bé. Điều này cho phép erythritol được hấp thụ nhanh chóng ở bộ
máy tiêu hóa phía trên và ở mức độ cao hơn khác với các đường chức năng khác
(Livesay 2001).
1.2.3 Tình hình sản xuất erythritol ở Việt Nam và thế giới
Cerestar bắt đầu sản xuất sản phẩm Erythritol trên quy mô thương mại cho thị
trường Nhật Bản vào năm 1993 với tốc độ phát triển nhanh chóng [1]. Đến nay trên
thế giới thì erythritol đang được sản xuất thương mại ở quy mô công nghiệp sử
dụng các chủng Moniliella. Công nghệ sản xuất Erythritol sử dụng nấm men Moniliella
ở các khía cạnh khác nhau được bảo vệ bằng một loạt các sáng chế bởi các công ty hóa
chất và viện nghiên cứu như USP (United States Patent 2012) của công ty hóa chất
Jungbunzlauer Austria AG (Áo) bảo hộ cho việc sử dụng môi trường chứa nitrate cho
lên men erythritol sử dụng Moniliella tomentosa (Moniliella pollinis). Tương tự, công ty
Nikken Chemicals Co, Ltd. (Nhật); Mitsubishi Chemical Corporation (Nhật Bản). Các
nấm men Moniliella có khả năng lên men các loại đường đơn giản để sản xuất
Phùng Thị Ngọc Hân

12

Lớp: 11.01



Viện Đại Học Mở Hà Nội

Khoa Công Nghệ Sinh Học

Erythritol. Sàng lọc và đột biến được sử dụng để xác định chủng cải tiến của Moniliella
có khả năng sản lượng sản xuất Erythritol hiệu quả. Hiện nay trên thế giới có rất nhiều
nước đã nghiên cứu và phát triển cải tiến công nghệ sản xuất Erythritol. Nổi bật
trong chi Moniliella là loài Moniliella pollinis, đã được sử dụng ở rất nhiều nước
trên thế giới như Mỹ, Đức, Nga để sản xuất Erythritol trên quy mô công nghiệp.
Công nghệ sản xuất có sử dụng các phương pháp hóa học, vật lý thì công
nghệ lên men sử dụng các chủng vi sinh vật có khả năng chuyển hóa tinh bột,
đường thành các polyols trong đó có Erythritol đang là một trong những hướng đi
nghiêm túc và có nhiều triển vọng. Vì vậy, Vi sinh vật đóng vai trò hết sức quan
trọng trọng và quyết đinh hiệu suất của quá trình lên men. Một số chủng nấm có
khả năng sinh erythritol đã được công bố như nấm men Moniliella, Pichia,
Candida, Trigonopsis, Auriobasidium, Psedozyma , Trichosporon và Yarrowia [3].
Các vi sinh vật này có khả năng biến đổi glucose thành erythritol là nhờ enzym
erythrose reductase, đây là enzyme hoạt động phụ thuộc NAD(P)H. Điều này đã
được tìm thấy ở một số nấm men và vi khuẩn với 3 isozyme trong một chủng nấm
men [8].
Trên quy mô công nghiệp, erythritol được sản xuất bởi hai phương pháp khác
nhau: Phương pháp Misubishi/Nikken (phương pháp M/N) và phương pháp
Cerestar (phương pháp C) [6]. Đây thực chất là quá trình lên men nhờ vi sinh vật,
trong đó, phương pháp M/N sử dụng chủng nấm men Moniliella megachiliensis
còn phương pháp C lại sử dụng chủng Moniliella pollilis. Năm 2015, Kobayashi và
cộng sự đã tiến hành nghiên cứu sử dụng nấm men M. megachiliensis để lên men
chuyển hóa glycerol từ nguyên liệu diesel sinh học như một nguồn cacbon để
chuyển hóa thành erythritol . Erythritol là một polyol 4 cacbon hiếm hoi có thể
chuyển đổi thành hydrocacbon 4 cacbon. Đề xuất này hứa hẹn sẽ cung cấp
được nguồn hydrocacbon 4 cacbon thay thế phục vụ cho việc cung cấp nguồn

nguyên liệu hóa học đồng thời xử lý một lượng lớn chất thải glycerol ra khỏi
môi trường [16].
Trong thời gian gần đây Viện Công nghiệp Thực Phẩm đã có một số nghiên
cứu bước đầu về tuyển chọn những chủng Moniliella phân lập tại Việt Nam có khả
năng chuyển hóa glucose thành erythritol. Kết quả cho thấy, hầu hết các chủng đều
Phùng Thị Ngọc Hân

13

Lớp: 11.01


Viện Đại Học Mở Hà Nội

Khoa Công Nghệ Sinh Học

có khả năng sinh erythritol, chỉ một vài chủng không có. Hai chủng sinh erythritol
cao nhất là TBY 348 thuộc loài M. carnis với tỷ lệ phần trăm erythritol chiếm
21,9% và chủng TBY 202.2 thuộc loài M. dehoogii với tỷ lệ phần trăm erythritol
chiếm 17,2% thành phần dịch canh trường. So với những kết quả nghiên cứu đã
công bố như chủng Trichosporonoides sp của M. A. Y. Aoki et al. (1993) lượng
erythritol tạo ra là 43 (gL-1 ), chủng Ustalagino mycetes 618A-01 của Y. Hitara et
al. (1999) lượng erythritol tạo ra là 100 (gL-1 ), chủng Pseudozyma tsukubaenis của
M.jeya et al (2009) lượng erythritol tạo ra là 149 (gL-1 ) thì lượng erythritol tạo ra
trong nghiên cứu trên vẫn còn là kết quả khiêm tốn. Tuy nhiên do phổ phân loại
của các chủng là khá rộng, nghiên cứu cũng chỉ mới tiến hành sàng lọc được một
số ít các chủng nấm men Moniliella trong bộ sưu tập giống. Trên thực tế hệ Vi sinh
vật tại Việt Nam rất đa dạng, dó đó nghiên cứu này nhằm tiếp tục sàng lọc những
chủng Moniliella có khả năng sinh erythritol cao tạo cơ sở cho ứng dụng công nghệ
sau này.


Phùng Thị Ngọc Hân

14

Lớp: 11.01


Viện đại học mở Hà Nội

Khoa Công nghệ sinh học

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. ĐỐI TƯỢNG
Chúng tôi tiến hành phân loại 161 chủng nấm men Moniliella được phân lập
từ 274 mẫu khác nhau từ các địa điểm khác nhau tại Hà Nội và Nghệ An. Đồng
thời chúng tôi chọn ra 12 chủng đại diện cho việc sàng lọc, tuyển chọn những
chủng sinh erythritol cao.
2.2. HÓA CHẤT, DỤNG CỤ, TRANG THIẾT BỊ MÁY MÓC
2.2.1. Hóa chất
Hóa chất dùng trong nuôi cấy
-Agar (Việt Nam)

-Pepton (Ấn Độ)

-Glucose (Trung Quốc)

-Acid lactic (Trung Quốc)

-Yeast extract (Tây Ban Nha)


-Malt extract (Trung Quốc)

-Urea (Trung Quốc)
Hóa chất dùng cho PCR
Enzym Taq DNAPolymease

Thermo scientific (Mỹ)

dNTPs

Invitrogen (Mỹ)

Thang DNA mẫu dùng trong điện di

Thermo scientific (Mỹ)

Agarose dùng trong điện di

Thermo scientific (Mỹ)

Ethidium Bromide để nhuộm gel

Pharmacia-Biotech (Mỹ)

2.2.2. Dụng cụ và trang thiết bị, máy móc
Máy móc, thiết bị: box cấy (BioblockScientific-Pháp), cân điện tử (Precisa,
Thụy Điển), kính hiển vi quang học (Leica), lò vi sóng (LG, Hàn Quốc), máy chụp
ảnh gel (Syngene), máy đo pH (Toledo, Anh), máy lắc ổn nhiệt (Hàn Quốc), máy
ly tâm cao tốc (Heraeus, Sepatech), nồi hấp thanh trùng (Himayatoko, Nhật), máy

phá tế bào (MiniBeadbeater, BiospecProducts), sắc ký lỏng cao áp (Agilient
Technologies 1260 infinity)
Dụng cụ: Đĩa petri, pipette tự động các loại, ống Fancol, ống nghiệm, ống
Eppendorf, ống đong, đèn cồn, bình tam giác (loại từ 20-1000), nút cao su, bình
Schott, que cấy…

Phùng Thị Ngọc Hân

15

Lớp: 11.01


Viện đại học mở Hà Nội

Khoa Công nghệ sinh học

2.3. THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU
2.3.1. Môi trường làm giàu có nồng độ đường cao
Thành phần (môi trường Glucose 50°Bx) 1000 ml:
+ Glucose (50%)
+ Yeast extract (0,5%)
+ Nước cất
Chuẩn bị: Cân các thành phần với tỷ lệ như trên, cho hỗn hợp vào bình
schoot sau đó hấp khử trùng ở 115°C, 15 phút để môi trường nguội xuống khoảng
70°C- 80°C, bổ sung axit lactic 90‰, với tỷ lệ 1ml axit lactic/1000 ml môi trường,
lắc đều. Bảo quản môi trường trong tủ mát.
Tác dụng: làm giàu nấm men Moniliella trong mẫu thu thập được.
2.3.2. Môi trường malt-glucose 2°Bx có axit lactic 1‰
Thành phần (1000 ml):

+ Malt (1%)
+ Glucose (1%)
+ Agar (1,5%)
+ Nước cất
Chuẩn bị: Cân các thành phần với tỷ lệ như trên. Cho hỗn hợp vào bình
schoot sau đó đem hấp khử trùng ở 121°C trong 15 phút để môi trường nguội xuống
70-80°C, bổ sung axit lactic 90‰ với tỷ lệ l ml axid lactic/1000 ml môi trường, lắc
đều và đổ ra đĩa petri trong điều kiện vô trùng.
Tác dụng: Dùng làm môi trường phân lập với mẫu đã làm giàu bằng môi
trường có nồng độ đường cao.
2.3.3. Môi trường malt-glucose 2°Bx không có axit lactic
Thành phần (1000 ml):
+ Malt (1%)
+ Glucose (1%)
+ Agar (1,5%)
+ Nước cất
Chuẩn bị:

Phùng Thị Ngọc Hân

16

Lớp: 11.01


Viện đại học mở Hà Nội

Khoa Công nghệ sinh học

-Cân các thành phần, cho hỗn hợp vào bình schoot rồi hấp khử trùng ở 121°C

trong 15 phút sau đó để nguội môi trường xuống 70-80°C đổ ra đĩa petri trong
điều kiện vô trùng.
-Cân các thành phần, hòa tan agar sau đó dùng pipet hút 3ml cho vào ống
nghiệm nút xoáy rồi hấp khử trùng ở 121°C trong 15 phút, sấy nhẹ môi trường
cho khô và bảo quản vào tủ mát.
Tác dụng : dùng làm môi trường tinh sạch và bảo quản.
2.3.4. Môi trường GYU
Thành phần (1000 ml):
+ Glucose (30%)
+ Yeast extract (1%)
+ Ure (1%)
+ Nước cất
Chuẩn bị:
Chuẩn bị dung dịch Urea 10%: cân 10 g urea hòa tan trong nước cất và chỉnh
thể tích về 100 ml bằng bình định mức. Lắc đều và lọc thanh trùng bằng màng 0,2
µl vào ống fancol vô trùng. Bảo quản trong ngăn đá và mỗi lần dùng 1 ống, không
sử dụng lại (Urea không được hấp).
Chuẩn bị dung dịch glucose 30% : Cân 300 g glucose. Bổ sung nước cất và
làm tan (có thể gia nhiệt ). Đưa thể tích bằng 900 ml bằng ống đong.
Chuẩn bị dung dịch Yeast extract 1% : cân 10 g yeast extract. Hòa tan trong
nước cất. Đưa tổng thể tích về 90 ml nước bằng ống đong.
Hấp dung dịch đường và cao nấm men trong các bình schoot riêng ở 121°C
trong 15 phút. Để nguội (< 60°C) và hòa trộn dung dịch glucose, yeast extract, 10
ml urea 1% (cho 1000 ml) trong box cấy. Lắc đều và phân phối vào các bình tam
giác 100 ml bằng pipet có bông/ màng lọc. Môi trường cần chuẩn bị cho mỗi lần
dùng, không bảo quản để tránh nhiễm.
Tác dụng : Dùng làm môi trường kiểm tra khả năng sinh erythritol của nấm
men Moniliella

Phùng Thị Ngọc Hân


17

Lớp: 11.01