HỌC
C VIỆN
VIỆ NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
-------

-------

TRẦN HỒNG LIÊN

TỐI ƯU
U HÓA QUY TRÌNH
TR
NHÂN SINH KHỐII R
RỄ TƠ
CÂY BA KÍCH(Morinda
KÍCH
officinalis How.)

LUẬN
N VĂN
V
THẠC SĨĨ

HÀ NỘI, NĂM 2015


HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
-------

-------

TRẦN HỒNG LIÊN

TỐI ƯU HÓA QUY TRÌNH NHÂN SINH KHỐI RỄ
TƠ CÂY BA KÍCH (Morinda officinalis How.)

Chuyên ngành
Mã số

: Công nghệ sinh học
: 60420201

Người hướng dẫn khoa học:
PGS. TS. Nguyễn Thị Phương Thảo

HÀ NỘI, NĂM 2015


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên
cứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng dùng để bảo
vệ lấy bất kỳ học vị nào.
Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cám ơn,
các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều được chỉ rõ nguồn gốc.
Hà Nội, ngày… tháng… năm…
Tác giả luận văn

Trần Hồng Liên

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp


Page i


LỜI CẢM ƠN
Sau một thời gian thực tập tại Bộ môn Công nghệ sinh học thực vật, được sự quan
tâm, dạy dỗ tận tình của các thầy cô, các cán bộ tại phòng thí nghiệm cùng với sự nỗ lực
của của bản thân em đã hoàn thành khóa luận tốt nghiệp của mình.
Để có được thành quả này đầu tiên tôi xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu nhà
trường, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ sinh học cùng toàn thể các thầy cô đã tạo điều
kiện và dạy dỗ, truyền đạt cho tôi những kiến thức và kĩ năng cần thiết trong suốt quá
trình học tập ở Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS. TS Nguyễn Thị
Phương Thảo,Thạc sỹ Ninh Thị Thảo,giảng viên khoa Công nghệ sinh học, Học viện
Nông nghiệp Việt Nam, những người đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong
suốt thời gian thực tập và hoàn thành báo cáo tốt nghiệp này.
Tôi xin gửi lời biết ơn chân thành và sâu sắc các thầy cô bộ môn Công nghệ sinh
học thực vật, khoa Công nghệ sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã giúp đỡ,
tạo điều kiện giúp tôi có thể hoàn thành luận văn.
Tôi xin cảm ơn ThS. Phạm Thị Thu Hằng cán bộ phòng thí nghiệm nghiên cứu
viên phòng thí nghiệm đã hướng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi hoàn
thành khóa luận này.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè đã giúp đỡ, chia sẻ và động
viên tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page ii


MỤC LỤC


Lời cam đoan

i

Lời cảm ơn

ii

Mục lục

iii

Danh mục chữ viết tắt

v

Danh mục bảng

vi

Danh mục hình

vii

Tóm tắt

viii

Abtract


ix

Phần 1: Mở đầu

1

1.1

Tính cấp thiết của đề tài

1

1.2

Mục tiêu nghiên cứu

2

1.3

Phạm vi nghiên cứu

2

1.4

Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn

2


Phần 2 Tổng quan tài liệu

4

2.1

Giới thiệu chung về cây ba kích

4

2.1.1

Nguồn gốc, phân bố

4

2.1.2

Vị trí phân loại

4

2.1.3

Đặc điểm thực vật học

4

2.1.4


Đặc điểm sinh thái học

5

2.1.5

Công dụng

5

2.1.6

Giá trị dược liệu

6

2.2

Khái niệm chung về Anthraquinone

7

2.2.1

Cấu trúc hóa học

7

2.2.2


Phân loại

9

2.2.3

Tác dụng sinh lý, công dụng Anthraquinone

10

2.2.4

Phân tích định tính và định lượng anthraquinone

11

2.3

Khái niệm chung về rễ tơ và các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cáy rễ tơ

15

2.3.1

Khái niệm về rễ tơ

15

2.3.2


Các yếu tố ảnh hưởng đến sự tăng sinh khối và khả năng tổng hợp hoạt

2.2.4

chất thứ cấp ở rễ tơ

15

Các nghiên cứu liên quan nhân nuôi sinh khối rễ tơ

21

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page iii


Phần 3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu

25

3.1

Đối tượng, vật liệu và thời gian nghiên cứu

25

3.1.1


Đối tượng nghiên cứu

25

3.1.2

Dụng cụ và thiết bị nghiên cứu

25

3.1.3

Hóa chất

25

3.1.4

Địa điểm và thời gian nghiên cứu

25

3.2

Nội dung và phương pháp nghiên cứu

25

3.2.1


Nội dung nghiên cứu

25

3.3.2

Phương pháp nghiên cứu

28

Phần 4 Kết quả và thảo luận

31

4.1

Kết quả

31

4.1.1

Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy trong các điều kiện và điều kiệnn
chiếu sáng khác nhau đến tốc độ tăng trưởng và tích lũy hoạt chất mục
tiêu của rễ tơ cây ba kích

4.1.2

31


Ảnh hưởng của elicitor đến sự tăng trưởng và tích lũy hoạt chất mục tiêu
rễ tơ

39

4.1.3

Xác định công thức tối ưu hóa nuôi cấy rễ tơ ba kích

42

4.2

Thảo luận

44

4.2.1

Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy trong các điều kiện và giai đoạn chiếu
sáng khác nhau đến tốc độ tăng trưởng và tích lũy hoạt chất mục tiêu của
rễ tơ cây ba kích

4.2.2
4.2.3

44

Ảnh hưởng của elicitor đến sự tăng trưởng và tích lũy hoạt chất mục tiêu
rễ tơ


47

Xác định công thức tối ưu hóa nuôi cấy rễ tơ ba kích

48

Phần 5 Kết luận và đề nghị

50

5.1

Kết luận

50

5.2

Đề nghị

50

Tài liệu tham khảo

51

Phụ lục

56


Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page iv


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

B5

: Gamborg’sB5 (Môi trường dinh dưỡng trung bình)

CRD

: Bố trí thí nghiệm hoàn toàn ngẫu nhiên

CV%

: Coefficient of variation (Hệ số biến thiên)

HMGR

: 3 – hydroxyl – 3 – methylglutaryl CoA reductase

LDL

: Low - Density – Lipoprotein

LSD 5%


: Least significant difference (Mức sai khác có ý nghĩa nhỏ nhất 5%)

MJ

: Methyl jasmonate

YE

: Yeast extract (Cao nấm men)

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page v


DANH MỤC BẢNG

Bảng 4.1

Khối lượng rễ khô và hàm lượng anthraquinone của mỗi công thức
khác nhau

Bảng 4.2

31

Khối lượng rễ tươi (gram) của các công thức sau 3, 6, 8, 10 tuần
nuôi cấy.

37


Bảng 4.3

Hàm lượng anthraquinone trên 1 g mẫu khô của các công thứckhác nhau

38

Bảng 4.4

Hàm lượng anthraquinone tổng số (µg) thu được ở các điều kiện
nuôi cấy các công thức khác nhau sau 8 tuần nuôi cấy không bổ sung
elicitor

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

42

Page vi


DANH MỤC HÌNH
Số hình

Tên hình

Trang

Hình 2.1

Cấu tạo phân tử của chất 9,10 anthraquinone


7

Hình 2.2

Con đường chuyển hóa chất anthraquinone từ các đơn vị acetat

8

Hình 2.3

Con đường chuyển hóa anthraquinone từ acid shikimic

9

Hình 4.1

Hàm lượng anthraquinone trong mỗi 1gram mẫu khô của các công
thức khác nhau về điều kiện chiếu sáng

Hình 4.2

32

Sự sinhtrưởng rễ tơ nuôi cấy sau 3 tuần ở các điều kiện chiếu sáng
khác nhau

Hình 4.3

32


Sự sinh trưởng rễ tơ nuôi cấy sau 5 tuần ở các điều kiện chiếu sáng
khác nhau

Hình 4.4

32

Sự sinh trưởng rễ tơ nuôi cấy sau 8 tuần ở các điều kiện chiếu sáng
khác nhau

Hình 4.5

33

Sự sinh trưởng rễ tơ nuôi cấy sau 10 tuần ở các điều kiện chiếu sáng
khác nhau

Hình 4.6

33

Sự sinh trưởng của rễ tơ ở các chu kỳ chiếu sáng và thời gian nuôi
cấy khác nhau

Hình 4.7

36

Hàm lượng anthraquinone rễ tơ được nuôi cấy trong 8 tuần ở các

công thức khác nhau về chu kỳ chiếu sáng

Hình 4.8

38

Hàm lượng anthraquinone thu được trong 1 g mẫu khô của các công
thức khác nhau sau 8 tuần nuôi cấy.

Hình 4.9

39

Sự sinh trưởng của rễ tơ của các công thức khác nhau về thời điểm
bổ sung elicitor trước khi dừng nuôi cấy

Hình 4.10

40

Hàm lượng anthraquinone thu được trong 1 g mẫu khô của các công
thức khác nhau sau 8 tuần nuôi cấy không bổ sung elicitor

Hình 4.11

41

Hàm lượng anthraquinone trong 1 g mẫu khô của các công thức khác
nhau về điệu kiện chiếu sáng và bổ sung elicitor


Hình 4.12

43

Hàm lượng anthraquinone của các công thức khác nhau về điệu kiện
chiếu sáng và bổ sung elicitor

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

44

Page vii


TÓM TẮT
Nghiên cứuđược tiến hành nhằm tối ưu qui trình nhân nuôi rễ tơ cây ba kích cho
khả năng tăng sinh khối và tích lũy hàm lượng hoạt chất mục tiêu cao. Trong đề tài này,
tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng khác nhau củađiều kiện chiếu sáng, thời gian chiếu
sáng tối ưu nhất. Nghiên cứu ảnh hưởng yếu tố elicitor và thời điểm bổ sung elicitor
trước khi dừng nuôi cấy.
Kết quả thu được: Nuôi cấy rễ tơ theo hai giai đoạn. Giai đoạn 1, 8 tuần đầu rễ tơ
chủ yếu tăng sinh về khối lượng. Giai đoạn 2: rễ tơ tăng sinh chậm, hóa màu đen hoặc
nâu, tích lũy hoạt chất mục tiêu mạnh.Ánh sáng có vai trò quan trọng trong việc cảm
ứng rễ tăng sinh ở giai đoạn 3 tuần khi bắt đầu nuôi cấy. Giai đoạn tiếp theo, sư phát
triển và tích lũy hợp chất mục tiêu tăng mạnh khi rễ tơ được nuôi cấy trong điều kiện tối
Bổ sung elicitor trướ c ngày dừng nuôi cấy 5 rễ tơ đạt tích lũy hàm lượng hoạt chất mục
tiêu lớn nhất so với thời gian 1, 3, 5, 10 ngày. Bổ sung elicitor 100 mg/l YE + 0,1 mM
MJ có khă năng làm tăng tích lũy hàm lượng hợp chất mục tiêu mạnh nhất ở công thức
nuôi cấy trong điều kiện chiếu sáng 3 tuần 8h sáng 16h tối sau đó 5 tuần tối hoàn toàn,
bổ sung elicitor trước 5 ngày dừng nuôi cấy.Công thức tối ưu hóa thu được là: nuôi cấy

rễ tơ trong điều kiện tuần (16h sáng-8h tối) + 5 tuần tối hoàn toàn, bổ sung elicitor trước
thời điểm dừng nuôi cấy 5 ngày
Các kết quả thí nghiệm góp phần tạo tiền đề cho quá trình xây dựng quy trình sản
xuất các hợp chất thứ cấp từ rễ cây ba kích, phục vụ cho ngành công nghiệp dược liệu
tại Việt Nam.

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page viii


ABTRACT
The research was conducted to optimize the hairy root culture process which
targeted to increase biomass and secondary compound accumulation . In this study,
different factors were studied that including: the effects of lighting conditions, lighting
period and elicitortreatment.
The period culturing hairy root has two stages. Stage 1, the first 8 weeks of
culturing, hairy root proliferate mainly in weight, but not stimulate secondary
compound. Stage 2: hairy root proliferated slowly, turns brown, accumulates strongly
target compound. This result showed the an important role of lighting forroots induction
inthe first 3 weeks from the beginning time of culturing hairy root. In the next stage,
from 8 week to 10 week, the development and accumulation of targeting compounds
got the highestconcentrationwhen hairy rootcultured completely in dark conditions.
Elicitor were supplied 5 days before culture ending time, secondary compounds gotthe
biggest amount, was compared with the time of 1, 3, 5, 10 days. Beside that, supplement
of elicitor 100 mg / l YE + 0.1 mM MJ had the ability to increase the accumulation
ofthe secondary compounds concentration of hairy root cultured in lighting conditions
3 weeks (8h light – 16 h dark)then 5 weeks (dark only). Optimized process is: growing
hairy root in 3 weeks (8h light – 16 h dark) then 5 weeks (dark completely), elicitors
were added 5 days before culture ending time.


Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page ix


PHẦN 1: MỞ ĐẦU

1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
Cây ba kích (Morinda oficinalis How) từ lâu trong dân gian đã được sử
dụng như một vị thuốc quý, có tác dụng bổ thần kinh, bổ gân cốt, giảm xơ cứng
động mạch, tăng cường khả năng sinh lý nam giới, tăng sức dẻo dai, sức đề
kháng, chống viêm, hạ huyết áp, không có tính độc, bổ thận, tráng dương, ích
tinh, cường gân cốt, khứ phong thấp, bổ thận âm, bổ huyết hải, định tâm khí. Rễ
Ba kích có thành phần hóa học là các anthraglucosid, iridoid glucoside, các
sterol, các chất vô cơ như K, Na, Mg, Fe, Cu, Zn…, tinh bột, đường, acid hữu
cơ, vitamin C (Việt Báo, theo SK & ĐS), dịch chiết cồn từ rễ cây ba kích có tác
dụng giảm huyết áp, tác dụng nhanh đối với các tuyến cơ năng, bổ trí não, giúp
ăn ngon và ngủ ngon.
Cây ba kích còn là một cây có giá trị kinh tế cao, giá thành trong nước
khoảng 400.000-500.000 đồng/kg tươi. Tuy nhiên trong tự nhiên, sinh khối của
ác dược liệu quý hiếm ngày bị hạn chế bởi thời gian sinh trưởng kéo dài cùng
những hoạt chất tích lũy chậm. Hiện nay, nguồn cung cấp dược liệu cho ngành
dược vẫn chủ yếu bằng thu hái tự nhiên và nuôi trồng.Cây ba kích trồng trong tự
nhiên phải mất tới 3 -4 năm mới cho thu hoạch. Bên cạnh đó sự nhiễm kim loại
nặng, vi sinh vật, chất phóng xạ, dư lượng thuốc trừ sâu, thay thế các loài thảo
mộc độc hại và giả mại trong dược liệu, đã được thông báo rộng (Drew và
Myers, 1997). Một số nhiễm bẩn khác có thể bị gây ra trong quá trình xử lý và
bảo quản nguyên liệu (Leung và công sự, 2005). Mặt khác, vùng phân bố ba
kích đang bị tàn phá nghiêm trọng khiến loài cây này đang rơi vào tình trạng gần

như tuyệt chủng và được đưa vào sách đỏ Việt Nam cần phải được bảo vệ (Nghị
định số 48/2002/NĐ-CP).
Để sản xuất một loại dược liệu sạch, chất lượng cao, áp dụng công nghệ
sinh học mà cụ thể ở đây là kỹ thuật nhân nuôi sinh khối rễ tơ in vitro các loài
thảo dược – một phương pháp lý tưởng để tăng trưởng bền vững ngành công
nghiệp thảo dược. Nó cho thấy hiệu quả rõ rệt trong sản xuất sinh khối các hợp
chất thứ cấp có giá trị, đặc biệt là từ các loài quý hiếm, sinh trưởng chậm trong tự
nhiên như sâm Triều Tiên (Panax ginseng), sâm Mỹ (Panax quinquefolius),
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 1


Cây tam thất (Panax pseudoginseng), cây thủy tùng (Taxus sp.)… Phương pháp
nuôi cấy rễ tơ với những ưu điểm vượt bậc như rễ phát triển nhanh, không
hướng đất, không phụ thuộc đất, bền vững về mặt di truyển và tổng hợp hoạt
chất thứ cấp với hàm lượng cao hơn hoặc bằng cây mẹ, tạo sinh khôi; giúp giảm
thời gian sản xuất, giảm giá thành sản xuất… hứa hẹn là một hướng đi bền
vững, đầy triển vọng.
Dựa trên cơ sở những ưu điểm vượt trội phương pháp nuôi cấy rễ tơ, rễ tơ
cây ba kích đã được cảm ứng thành công (Lê Thị Thanh Hương, 2014) và đã
bước đầu khảo sát môi trường thích hợp cho việc nuôi cấy rễ tơ (Nguyễn Quỳnh
Chi, 2015), đề tài được tiến hành nhằm tìm ra điều kiện nuôi cấy thích hợp nhằm
năng cao sinh khối và tích lũy hoạt chất mục tiêu rễ tơ cây ba kích.
Chính vì vậy tôi tiến hành đề tài: “Tối ưu hóa quy trình nhân sinh khối
rễ tơ cây Ba kích (Morinda officinalis How.)”.Đề tàigóp phần tạo tiền đề cho
quá trình xây dựng quy trình sản xuất các hợp chất thứ cấp từ rễ cây ba kích,
phục vụ cho ngành công nghiệp dược liệu tại Việt Nam.
1.2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
Mục tiêu

Hoàn thiện quy trình nhân sinh khối rễ tơ cây ba kích
Yêu cầu
Xác định được điều kiện chiếu sáng thích hợp và thời gian nuôi cấy cần cho
sự tăng sinh khối rễ tơ và tích lũy hoạt chất mục tiêu.
Xác định được yếu tố Elicitor thích hợp cho khả năng tích lũy hoạt chất
mục tiêu trong rễ tơ.
Xác định được công thức tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy
1.3. PHẠM VI NGHIÊN CỨU
Nghiên cứu được thực hiệntrên đối tượng rễ tơ ba kích M4 được cảm ứng
thành công (Bộ môn Công nghê sinh học thực vật nghiên cứu) tại bộ môn Công
nghệ sinh học thực vật, khoa Công nghệ sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt
Nam từ tháng 12 năm 2014 đến tháng 8 năm 2015.
1.4. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ Ý NGHĨA THỰC TIỄN
Ý nghĩa khoa học: đề tài giúp xác định ảnh hưởng của ánh sáng, thời gian
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 2


nuôi cấy đến sự sinh trưởng cũng như tích lũy hoạt chất mục tiêu (anthraquinone)
cũng như sự ảnh hưởng của yếu tố elicitor lên rễ tơ.
Ý nghĩa thực tiễn: kết quả của đề tài sẽ có đóng góp quan trọng trong việc
đưa rễ tơ cây ba kích vào trong sản xuất sinh khối lớn phục vụ cho ngành công
nghiệp dược liệu

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 3



PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÂY BA KÍCH
2.1.1. Nguồn gốc, phân bố
Cây ba kích (Morinda officinalis How.) còn gọi là dây ruột gà, ba kích
thiên, liên châu ba kích, chẩu phóng xì, sáy cáy (Thái), thau tày cáy (Tày), chồi
hoàng kim, chày kiàng đòi (Dao)… là một loại thực vật lâu năm, phân bố tự
nhiên ở Lào, Việt Nam, Trung Quốc. Tên gọi khác là Radix Morindae officinalis,
tên Trung Quốc là Ba Ji Tian.
Ở Việt Nam hoặc Trung Quốc, cây ba kích thường được sử dụng có nguồn
gốc tự nhiên hoặc canh tác. Nó phổ biến ở các tỉnh Quảng Đông, Hà Nam, Quảng
Tây, Phúc Kiến và Hà Nam Trung Quốc, đặc biệt là Quảng Đông. Ba kích ở
nước ta phân bố nhiều ở vùng đồi núi thấp và trung du các tỉnh phía Bắc và có
nhiều ở các tỉnh Quảng Ninh, Thái Nguyên, Tuyên Quang, Yên bái, Vĩnh Phúc,
Phú Thọ, Hòa Bình, Lạng Sơn, Hà Giang (Lê Mộng Chân, 2000).
2.1.2. Vị trí phân loại
Tên khoa học: Morinda officinalis How
Ngành: Ngọc lan (Magnoliophyta)
Lớp: Ngọc lan (Magnoliopsida)
Phân lớp: Hoa môi (Lamiidae)
Bộ: Long đởm (Gentianales)
Họ: Cà phê (Rubiaceae)
Chi: Nhàu (Morinda)
Loài: Morinda officinalis How
Tên thường gọi: Ba kích. Hiện nay có 13.150 loài (Lê Mộng Chân, Lê Thị
Huyên (2000).

2.1.3. Đặc điểm thực vật học
Ba kích là cây thân thảo sống lâu năm, leo bằng thân hoặc quấn vào cành
cây khác hoặc giá đỡ. Thân cây màu tím hoặc xanh, thân non có màu hơi tím,

cành non có 4 lông bao phủ, thân già nhẵn màu nâu. Lá mọc đối, cứng nhọn, hình
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 4


ngọn giáo thuôn dài 6 -14 cm, rộng 2,5 – 6 cm, lúc non màu xanh, có lông dài ở
mặt dưới, sau đó ít lông và có màu trắng mốc; lá kèm hình ống. Lá già ít lông
màu hơi trắng mốc. Lá kèm mỏng dạng ống dính sát thân. Hoa mọc thành cụm
tập trung thành tán tròn ở đầu cành từ 2 - 10 hoa. Hoa mẫu 4 (4 lá dài, 4 cánh
hoa, 4 nhị), hoa dài từ 0,3 - 1,5 cm, cuống từ 3 – 10 mm. Hoa lúc non màu trắng,
sau ngả vàng. Đài hoa hình chén hay hình ống gồm các lá đài nhỏ hình tam giác
đều phát triển không đều nhau, tràng hoa 4 cánh màu trắng liền nhau thành ống
ngắn, nhị ở đáy của sống tràng, bầu hạ chẻ đôi ở đỉnh. Mùa hoa vào khoảng
tháng 5 đến tháng 6. Quả dạng quả hạch, hình cầu, hoặc dính vào nhau, đường
kính 6 – 11 mm. Khi chín quả màu đỏ, bên trong có 4 hạt nhỏ hình bầu dục hay
trứng ngược, màu vàng, vỏ hạt nhám.Quả ra từ tháng 7 đến tháng 10. Rễ dạng rễ
củ có hình trụ tròn, thắt khúc, dài không bằng nhau, vặn vẹo như ruột gà, đường
kính 1,5 – 2 cm. Vỏ ngoài màu nâu nhạt hoặc hồng nhạt, nhám, có vân dọc. Bên
trong là thịt củ dày màu nâu hồng hoặc tím, không mùi, vị ngọt nhưng hơi chát,
trong cùng là lõi củ.Thông thường có hai loại ba kích là ba kích tím và ba kích
trắng.Ba kích tím có lõi củ màu tím, ba kích trắng có lá bầu, lõi củ màu vàng
hoặc hồng vàng (Lê Mộng Chân, 2000).
2.1.4. Đặc điểm sinh thái học
Ba kích ưa sáng, ưa ẩm và chịu bóng, mọc trên đất feralit đỏ vàng, lượng
mùn trung bình, tơi xốp và hơi chua, nhiệt độ trung bình 21 – 23 độ C, thích hợp
ở các vùng trung du, miền núi. Ba kích có thể trồng bằng rễ, cành bánh tẻ hay
gieo ươm bằng hạt. Vào khoảng tháng 3 - 4, khi thời tiết ấm dần, chọn những
cành bánh tẻ ở cây ba kích sống khoẻ, chặt thành từng đoạn 20 - 30 cm, mỗi đoạn
có 2 - 4 mắt. Có thể đem trồng ngay hoặc giâm và vườn ươm cho đến khi nảy

mầm, ra rễ mới đem trồng. Ba kích trồng từ 3 - 7 năm có thể thu hoạch. Năng
suất dược liệu là rễ phụ thuộc vào số năm trồng, càng lâu năm, năng suất càng
cao. Thời điểm thu hoạch vào khoảng tháng 10 – 11 (Lê Mộng Chân, 2000).
2.1.5. Công dụng
Bộ phận dùng là rễ ba kích tươi hay sấy khô. Theo y học hiện đại, ba kích
có tác dụng tăng sức dẻo dai, sức đề kháng. Theo y học cổ truyền, rễ ba kích có
vị ngọt, cay, hơi ấm không độc, có tác dụng bổ thận tráng dương ích tinh, cường
gân cốt, khử phong thấp, bổ thận âm, bổ huyết hải, định tâm khí, chủ trị thận hư,
lãnh cảm, lưng gối mỏi, tê bại, phong thấp, thần kinh suy nhược, trúng phong, ho
suyễn, tiêu chảy.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 5


Theo Trung Dược Học, ba kích có công dụng trong chống viêm: Trên mô
hình gây viêm thực nghiệm ở chuột cống trắng bằng kaolin với liều lượng 5 - 10
g/kg, ba kích có tác dụng chống viêm rõ rệt.Đối với hệ thống nội tiết: thí nghiệm
trên chuột lớn và chuột nhắt cho thấy ba kích không có tác dụng kiểu Androgen
(là kích thích tố đực) nhưng có thể có khả năng tăng cường hiệu lực của
Androgen hoặc tăng cường quá trình chế tiết hoormon Androgen. Tăng sức đề
kháng: dùng phương pháp gây nhiễm độc cấp bằng Ammoni Clorua trên chuột
nhắt trắng, với liều 15 g/kg, ba kích có tác dụng tăng cường sức đề kháng chung
của cơ thể đối với các yếu tố độc hại. Nước sắc ba kích có tác dụng tương tự như
ACTH (adreno cortico trophic hormon) còn được gọi là “corticotropin”.ACTH
được bài tiết từ tuyến yên phía trước để đáp ứng corticotropin- releasing hormone
từ vùng dưới đồi.Nó là một thành phần quan trọng của tuyến yên- thượng thận,
trục dưới đồi và thường được sản xuất để đáp ứng với stress sinh học, ngoài ra
còn có tác dụng hạ huyết áp.
Theo Tài nguyên cây thuốc Việt Nam ba kích có công dụng tráng dương,

cường tráng cân cốt. Đối với cơ thể những người tuổi già, những bệnh nhân có
biểu hiện mệt mỏi, ăn kém, ngủ ít, gầy yếu mà không thấy có những yếu tố bệnh
lý gây nên và một số trường hợp có đau mỏi các khớp sau khi sử dụng ba kích sẽ
có kết quả đỡ mệt mỏi, ăn ngon, ngủ ngon và những dấu hiệu khách quan như
tăng cân nặng, tăng cơ lực. Còn đối với bệnh nhân đau mỏi các khớp thì sau khi
dùng ba kích dài ngày, các triệu chứng đau mỏi giảm rõ rệt.Đối với những bệnh
nhân nam có hoạt động sinh dục không bình thường, ba kích có tác dụng làm
tăng khả năng giao hợp, đặc biệt đối với những trường hợp giao hợp yếu và thưa.
Ba kích có tác dụng tăng cường sức dẻo dai, mặc dù nó không làm tăng đòi hỏi
tình dục, không thấy có tác dụng kiểu Androgen. Tuy không làm thay đổi tinh
dịch đồ nhưng trên thực tế có tác dụng hỗ trợ và cải thiện hoạt động sinh dục
cũng như điều trị vô sinh cho những nam giới có trạng thái vô sinh tương đối và
suy nhược thể lực.
Trong nhân dân, ba kích là vị thuốc có tác dụng bổ trí não và tinh khí, chữa
xuất tinh sớm, di mộng tinh, liệt dương, kinh nguyệt chậm hoặc bế kinh, phong
thấp, huyết áp cao.
2.1.6. Giá trị dược liệu
2.1.6.1. Thành phần hóa học
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 6


Trong ba kích có gentianine, carpaine, choline, trigonelline, yamogenin,
gitogenine, tigogenin, vitexin, orientin, quercetin, luteolin, vitamin B1, rubiadin,
rubiadin-1-methylether. Trong rễ chứa thành phần hóa học chính là các hợp chất
anthranoid: tectoquinon, 1 – hydroxyl – 2, 3- dimethyl – anthraquinon….., ngoài
ra còn antraglycozid, các hợp chất iridoid: asperulosid, morofficialosid….,
đường, nhựa, acid hữu cơ, phytosterol và ít tinh dầu, morindin, rễ tươi có chứa
vitamin C (Đỗ Tất Lợi, 2005).

Để nghiên cứu các thành phần hóa học từ rễ cây ba kích phương pháp sắc
ký cột silica gel và Sephadex LH-20 được sử dụng và các cấu trúc hóa học đã
được làm sáng tỏ trên cơ sở phân tích quang phổ, kết quả có 17 hợp chất được
xác định bao gồm: physcion; 1-hydroxy-2methylanthraquinone; 2-hydroxy-1methoxyanthraquinone; rubiadin; rubiadin 1- methylether; 1,3-dihydroxy-2methoxyanthraquinone; 3-hydroxy-2-methylanthraquinone; digiferruginol;1,2-dimetoxy3-hydroxyanthraquinone;1,3-dihydroxy-2-hydroxymethyl-anthraquinone; lucidin ether
ώ-ethyl; axit-anthraquinone-2 carboxylic; 7-hydroxy-6-methoxy-coumarin; acid
fumaric; stimasterol; daucosterol; β-sitosterol (Zhang Hai-Long và cộng sự, 2010).
Bên cạnh đó Zhongguo và cộng sự (1995) đã phân lập từ rễ của Morinda
officinalis được năm hợp chất có hoạt động chống trầm cảm.Bằng phương pháp
hóa học và quang phổ các hợp chất này được xác định là: axit succinic, nystose,
1F-fructofuranosylnystose
2.2. KHÁI NIỆM CHUNG VỀ ANTHRAQUINONE
2.2.1. Cấu trúc hóa học
Những hợp chất anthranoid nằm trong nhóm lớn hydroxyquinon. Những
hợp chất quinon được tìm thấy chủ yếu trong ngành nấm, địa y, thực vật bậc cao
và cả trong động vật. Căn cứ vào số vòng thơm đính thêm vào nhân quinon mà
người ta sắp xếp thành benzoquinon, naphthoquinon, anthraquinon và
naphthacenequinon hay còn gọi là anthracyclinon (4 vòng).

Hình 2.1: Cấu tạo phân tử của chất 9,10 anthraquinone
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 7


(Bài giảng dược liệu” tập I, Trường Đại học Dược Hà Nội, Ngô Văn Thu,2011)

Anthranoid hay anthraquinon khi tồn tại dưới dạng glycosid thì được gọi là
anthraglycosid hay anthracenosid. Cũng như các loại glycosid khác
Anthraglycosid là những glycosid khi bị thuỷ phân sẽ cho phần đường và phần
aglycon (genin) là dẫn chất 9,10 anthraquinon*, (9,10-anthracendion*) (9,10

dixeton của anthraxen).
Đa số các anthraglycosid là các polyoxy anthraquinon. Gắn vào nhân
thường có các nhóm chức -OH, -OCH3, -CH3, -COOH... Tuỳ theo vị trí các nhóm
chức đính vào nhân mà có các dẫn chất khác nhau:
Vì trong tự nhiên hầu như chưa gặp các dẫn chất 1,2 hoặc 1,4anthracendion nên khi nói đến các dẫn chất anthraquinon trong tự nhiên thì người
ta hiểu rằng đó là những dẫn chất 9,10-anthracendion. Sự tạo thành các dẫn chất
anthraquinon xuất phát từ 2 con đường:
Ðối vơi những dẫn chất 1,8-dihydroxyanthraquinon hay gặp trong các họ
thực vật Polygonaceae, Caesalpiniaceae, Rhamnaceae cũng như trong một số
nấm và địa y, con đường sinh nguyên xuất phát từ các đơn vị acetat. Người ta
đưa acetat có đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ vào môi trường nuôi cấy nấm
Penicillium islandicum là nấm tạo ra dẫn chất anthranoid thì thấy các đơn vị
acetat được ngưng tụ nối với nhau theo đầu đuôi. Chất poly-b-cetomethylen acid
được tạo thành đầu tiên rồi tiếp theo các dẫn chất anthranoid.

Hình 2.2: Con đường chuyển hóa chất anthraquinone từ các đơn vị acetat
(Bài giảng dược liệu” tập I, Trường Đại học Dược Hà Nội, Ngô Văn Thu,2011)

Con đường thứ hai tạo thành các dẫn chất anthraquinon trong một số họ
thực vật khác chủ yếu là họ Rubiaceae thì chất tiền sinh là acid shikimic. Sau khi
acid này ngưng tụ với một acid a-cetoglutaric thì tạo thành một dẫn chất
naphtalen rồi chất này lại gắn thêm một gốc isoprenyl để rồi đóng vòng tạo ra các
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 8


dẫn chất anthraquinon.

Hình 2.3: Con đường chuyển hóa anthraquinone từ acid shikimic

(Bài giảng dược liệu” tập I, Trường Đại học Dược Hà Nội, Ngô Văn Thu, 2011)

2.2.2. Phân loại
Thành phần chính của cánh kiến đỏ là nhựa dùng để chế shellac dùng để
đánh bóng vecni đồ gỗ, mây tre; sản phẩm phụ là chất màu đỏ sẫm gọi là acid
laccaic . Đây là một hỗn hợp nhiều chất, trong đó Acid laccaic A,B,Ccó màu
đỏ. Acid laccaic D không có 2 nhóm OH ở nên có màu vàng.Nhóm này có trong
một số chi thuộc họ: Rubiaceae (Rubia tinctoria)....
Nhóm nhuận tẩy (các dẫn chất 1,8 dihydroxy anthraquinon).
Dẫn chất 1,8 dihydroxy anthraquinon (oxymethylanthraquinon) thường có
nhóm CH3, CH2OH, CHO hoặc COOH ở vị trí 3. Dẫn chất 1,8
dihydroxyantraquinon có thể ở dạng tự do hoặc kết hợp với phần đường ở dạng
glycosid. Một số chất thường gặp thuộc nhóm này: Cryzophanol (Acid
Cryzophanic), Aloe emodin, Rein, Reum emodin (Emodin), (Phyxion)
Tuỳ thuộc mức độ oxyhoá của các dẫn chất anthraxen người ta chia thành:
anthraquinon (dạng oxy hoá), anthron và anthranol (dạng khử). Nếu khử một
trong hai nhóm chức ceton của anthraquinon sẽ cho dẫn chất anthron hoặc đồng
phân hỗ biến của chất này là anthranol (dạng enol). Nếu khử tiếp th_ì dẫn đến dẫn
xuất chất dihydroanthranol. Dạng khử có tác dụng xổ mạnh nhưng hay gây đau
bụng vì vậy một số dược liệu chứa anthranoid phải để 1 năm sau khi thu hái mới
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 9


dùng để dạng khử chuyển thành dạng oxyhoá.
Nhóm dimer
Một số dẫn chất anthranoid dimer do 2 phân tử ở dạng anthron bị oxy hoá
rồi trùng hợp với nhau tạo thành dianthron hoặc tiếp đến các dẫn chất
dehydrodianthron ví dụ sự tạo thành hypericin là chất có trong cây Hypericum

perforatum, có tác dụng kháng khuẩn dùng chữa viêm dạ dày, ruột, răng, miệng.
Một số ví dụ khác là các chất: ararobinol (có trong cốt khí muồng và trong
các loài Rumex spp.), sennosid A,B,C (có trong Phan tả diệp) hoặc rheidin A,B,C
(có trong Đại hoàng).
Khi tạo thành dimer nếu 2 nửa phân tử giống nhau th_ gọi là homodianthron
ví dụ ararobinol, sennosid A,B; nếu 2 nửa phân tử không giống nhau gọi là
heterodianthron ví dụ sennosid C, rheidin A.Trong chi Cassia người ta còn gặp
một số dimer dạng dianthraquinon như cassianin, cassiamin.Loại dianthraquinon
gặp trong một số loài nấm Penicillium.
Trong thực vật ngoài những dẫn chất anthranoid xếp vào 3 nhóm trên còn
có những dẫn chất khác có một số nhóm thế đặc biệt, ví dụ chất fragilin có trong
địa y Sphaerophorus globosus hoặc nalgiolaxin có trong nấm Penicillium
Các dẫn chất anthranoid được phân bố trong khoảng 30 họ thực vật khác
nhau, chủ yếu là những cây 2 lá mầm. Các họ hay gặp: Caesalpiniaceae,
Rhamnaceae, Rubiaceae, Polygonaceae.
Trong cây một lá mầm rất hiếm. Cho đến nay có 2 cây được biết: Lô hội Aloe spp. và Hemerocallis aurantiaca. Trong nấm, địa y cũng có. Trong động vật
thì gặp trong các loài sâu như Coccus cacti, Kermococcus ilicus, Lacifer lacca.
2.2.3. Tác dụng sinh lý, công dụng Anthraquinone
Các dẫn chất anthraglycosid, chủ yếu là các β-glucosid dễ hoà tan trong
nước, không bị hấp thu cũng như bị thủy phân ở ruột non. Khi đến ruột già, dưới
tác dụng của β-glucosidase của hệ vi khuẩn ở ruột th_ các glycosid bị thủy phân và
các dẫn chất anthraquinon bị khử tạo thành dạng anthron và anthranol là dạng có
tác dụng tẩy xổ, do đó có thể giải thích lư do tác dụng đến chậm sau khi uống
thuốc. Dạng genin th_ì bị hấp thu ở ruột non nên không có tác dụng.
Do tác dụng làm tăng nhu động ruột nên với liều nhỏ các dẫn chất 1,8dihydroxyanthraquinon dưới dạng heterosid giúp cho sự tiêu hoá được dễ dàng,
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 10



liều vừa nhuận, liều cao xổ. Hỗn hợp các dẫn chất anthraquinon có trong rễ cây
Rubra tinctoria L. có tác dụng thông tiểu và có khả năng tống sỏi thận. .
Chrysophanol có tác dụng kháng nấm dùng để trị nấm, hắc lào, lang ben.
Một số nghiên cứu cho thấy các dẫn chất quinon đặc biệt là các dẫn chất
anthraquinon có tác dụng kích thích miễn dịch chống ung thư. Xuất phát từ acid
chrysophanic và các dẫn chất anthraquinon khác, người ta bán tổng hợp một số
dẫn chất có N-, S- và gốc halogen có hoạt tính chống ung thư.
Các hợp chất anthraquinone có thể thúc đẩy sản xuất tiểu cầu, tăng đáng kể
fibrinogen, thời gian đông máu được rút ngắn, làm giảm tính thấm mao mạch, cải
thiện mạch máu mỏng manh, do đó sự gia tăng trong hoạt động co bóp của các
mạch máu, vì vậy họ có thể thúc đẩy máu đông máu.
Mặt khác, anthraquinone có tác dụng kháng khuẩn: Các hợp chất
anthraquinone chống lại vi khuẩn khác nhau có mức độ khác nhau của sự ức chế,
mà tụ cầu, liên cầu nhạy cảm nhất, Shigella, nhạy cảm hơn với bệnh bạch hầu, và
trực khuẩn subtilis thương hàn. Cơ chế ức chế ức chế quá trình oxy hóa của vi
khuẩn và khử đường và trung gian trao đổi chất, và ức chế sự tổng hợp protein và
axit nucleic, như vậy tránh nhiễm độc và kháng thuốc kháng sinh nhất định về
mặt lâm sàng.
Anthraquinone còn có tác dụng tẩy: ràng buộc để bảo vệ glycosides
anthraquinone nguyên nhân glycosyl hóa, hầu hết không có sự hấp thụ trực tiếp
vào ruột già, men vi khuẩn bị phá vỡ trong ruột vào aglycone và đường.
Aglycone kích thích niêm mạc, ruột và ức chế sự hấp thu ion natri từ độ ẩm ruột
quá lớn làm tăng nhu động ruột gây tiêu chảy cường giáp.
Các hợp chất anthraquinone có thể làm tăng lượng nước tiểu và thúc đẩy
nhu động niệu quản, niệu natri và kali cũng tăng đáng kể, trong khi hiệu quả hạ
áp lợi tiểu. Vai trò của nó là làm giảm sự tái hấp thu đường ruột của các amino
acid ức chế sự tổng hợp urê trong mô gan và thận, làm tăng nồng độ máu của các
axit amin thiết yếu miễn phí, sử dụng trong cơ thể tổng hợp protein và phân urê
để ngăn chặn sự phân hủy của protein cơ bắp, và tăng bài tiết urê và creatinin để
hoàn thành.

2.2.4. Phân tích định tính và định lượng anthraquinone
- Phương pháp cân: phương pháp của Daels và Kroeber.
Nguyên tắc của phương pháp này như sau: Dược liệu được đun với acid
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 11


sulfuric 25% để thủy phân các glycosid, các aglycon được chiết ra bằng
chloroform. Dung dịch chloroform đem rửa với dung dịch natri bisulfit rồi tiếp
theo với dung dịch HCl loãng. Sau đó bốc hơi dung môi, cắn được đem sấy và
cân. Dược điển Liên Xô IX ứng dụng phương pháp này để định lượng các
oxymethylanthraquinon trong vỏ câyRhamnus frangula L. và trong đại hoàng.
Cách tiến hành: cân chính xác 2 g bột dược liệu, đun cách thủy trong bình
có ống sinh hàn hồi lưu trong 2 giờ rưỡi với 200 ml CHCl3 và 50 ml H2SO4 25%.
Sau đó lắc các dịch chiết CHCl3 với 50 ml dung dịch natri bisulfit 10% trong 5
phút. Sau khi để yên tách lớp CHCl3, lọc và lắc với dung dịch acid hydrochloric
1% trong 5 phút. Sau khi 2 lớp phân cách rõ ràng, người ta tách lớp dưới, lọc và
bốc hơi CHCl3, sấy, lúc đầu 600 rồi sau đó 800C đến khi khối lượng không đổi.
- Phương pháp so màu:
Phương pháp này dựa trên phản ứng màu Borntraeger. Tschirch là người
đầu tiên đưa ra phương pháp để định lượng anthranoid trong đại hoàng. Theo tác
giả, bột đại hoàng được đun sôi với dung dịch H2SO4 loãng, sau đó chiết bằng
ether. Từ dịch ether lại chiết bằng kiềm rồi đo màu. Nhiều tác giả khác có thay
đổi một số điều kiện về dung môi hữu cơ, acid, thời gian thủy phân, loại dung
dịch kiềm để làm phản ứng màu. Sau đây chỉ trình bày phương pháp của
Auterhoff là phương pháp được nhiều người chấp nhận. Nguyên tắc của phương
pháp là đun dược liệu với acid acetic để thủy phân các glycosid, sau đó thêm
ether để chiết aglycon. Từ dịch acid acetic - ether (chú ý acid acetic hoà tan
trong ether) các aglycon được lắc nhanh với dung dịch xút cộng với ammoniac.

Dung dịch kiềm có màu đỏ, được đem đo mật độ quang. Đường cong chuẩn được
xây dựng với chất mẫu istizin (= 1,8-dihydroxyanthraquinon) hoặc acid
chrysophanic được pha cũng trong dung dịch xút + ammoniac hoặc dựa vào dung
dịch cobalt chlorid; dung dịch này có màu hồng như màu của phản ứng. Mật độ
quang của 0,36mg istizin trong 100ml dung dịch xút + ammoniac (5g NaOH
trong 50ml nước thêm 2ml ammoniac đậm đặc và thêm đủ 100ml với nước cất)
bằng mật độ quang của dung dịch cobalt chlorid 1%.
Phương pháp này hạn chế tới mức thấp nhất sự oxy hoá các chất ở dạng khử
anthron. Các chất này có màu vàng trong môi trường kiềm nên không cản trở sự
định lượng. Nếu muốn định lượng anthranoid toàn phần cần oxy hoá các dẫn chất
anthron bằng cách đặt các dung dịch đã phản ứng với kiềm lên nồi cách thủy
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 12


trong 20 phút. Ở môi trường kiềm cộng với nhiệt độ và không khí, các dẫn chất
anthron sẽ bị oxy hoá thành anthraquinon. Hiệu giữa 2 lần đo trước và sau khi
oxy hoá cho phép ta tính được hàm lượng của các dẫn chất anthron.
Nếu muốn định lượng các aglycon ở dạng tự do trong dược liệu thì không
qua giai đoạn thủy phân mà chỉ cần chiết các aglycon tự do bằng ether rồi thêm
dung dịch kiềm để làm phản ứng màu.
Phương pháp Auterhoff đã được đưa vào Dược điển Việt Nam để định
lượng những dẫn chất anthranoid trong dược liệu.
- Phương pháp thể tích của Tschirch và Schmitz:
Nguyên tắc của phương pháp là dùng dung dịch KOH 0,1 N để tác dụng lên
các dẫn chất anthraquinon rồi chuẩn độ kiềm thừa bằng HCl 0,1 N; sự chuyển
màu từ đỏ sang vàng của phản ứng thay cho chỉ thị màu. Phương pháp này thiếu
chính xác.
-


Phương pháp sắc ký lỏng cao áp HPLC
HPLC được thực hiện dựa trên việc bơm để đẩy một lượng chất lỏng dưới
áp suất cao và hỗn hợp mẫu cần phân tích đi qua một cột được nhồi đầy một loại
chất hấp phụ và từ đó dẫn tới việc tách các thành phần của mẫu. Chất hấp phụ –
được nhồi trong cột, là các hạt rắn (như silica, polymers) với kích thước từ 2 – 50
µm. Các thành phần trong hỗn hợp mẫu được tách ra khỏi nhau nhờ vào mức độ
tương tác khác nhau với các hạt chất hấp phụ. Dòng chất lỏng dưới áp suất cao
thường là hỗn hợp của các dung môi (nước, acetonitrile và/hoặc methanol), được
gọi là “pha động”. Thành phần và nhiệt độ dung môi đóng vai trò chính trong quá
trình tách chất do tương tác xảy ra giữa các thành phần của mẫu và chất hấp phụ.
Về bản chất, các tương tác này là tương tác vật lý như tương tác kị nước (phân
tán), tương tác lưỡng cực và tương tác ion, thông thường nhất là tổng hợp của tất
cả các tương tác trên.
HPLC ưu việt hơn so với phương pháp sắc ký lỏng cổ điển (áp suất thấp)
bởi vì áp suất hoạt động cao hơn nhiều (từ 50-400 bar) trong khi kỹ thuật sắc ký
cổ điển chỉ dựa trên lực hấp dẫn để đẩy pha động ra khỏi cột. Do chỉ có một
lượng nhỏ mẫu được tách trong phân tích HPLC, vì vậy cột thông thường có
đường kính khoảng 2.1 – 4.6 mm và độ dài khoảng 30-250 mm . Ngoài ra, cột
sắc ký được nhồi các hạt hấp phụ có kích thước nhỏ hơn (kích thước trung bình

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 13


từ 2-50 µm). Điều này cho phép HPLC khả tách các hỗn hợp một cách hữu hiệu
và trở hành một kỹ thuật sắc ký phổ biến.
- Phương pháp quang phổ UV-Vis
Trong quang phổ học, ánh sáng nhìn thấy (ánh sáng khả kiến), tia hồng

ngoại, tia tử ngoại, tia Rơnghen, sóng radio... đều được gọi chung một thuật ngữ
là bức xạ. Theo thuyết sóng, các dạng bức xạ này là dao động sóng của cường độ
điện trường và cường độ từ trường, nên bức xạ còn được gọi là bức xạ điện từ.
Sau thuyết sóng, thuyết hạt cho thấy bức xạ gồm các “hạt năng lượng” gọi là
photon chuyển động với tốc độ ánh sáng (c = 3.108 m/s). Các dạng bức xạ khác
nhau thì khác nhau về năng lượng của các photon. Ở đây, năng lượng của bức xạ
đã được lượng tử hóa, nghĩa là năng lượng của bức xạ không phải liên tục mà các
lượng tử năng lượng tỉ lệ với tần số của dao động điện từ.
Phương pháp đường chuẩn
Ưu điểm là chính xác, thực hiện được nhiều lần.
+ Chuẩn bị từ 6 dung dịch chuẩn (trong khoảng tuân theo định luật Beer).
+ Đo độ hấp thụ quang A của dung dịch ở λmax so với các dung dịch so
sánh được chuẩn bị giống như dung dịch tiêu chuẩn nhưng không chứa ion cần
xác định.
+ Biểu diễn sự phụ thuộc A theo C trên đồ thị hoặc tính theo phương
trình hồi qui A= aC + b (a và b là hệ số cần tìm của phương trình hồi quy –
tương quan)
Sau khi đo được giá trị độ hấp thụ quang của các dung dịch chuẩn, chúng
ta có thể tiến hành xây dựng đường chuẩn và tìm ra phương trình hồi quy tương
quan. Sau khi thiết lập đường chuẩn, ta được dạng phương trình y = ax + b với y
là độ hấp thụ quang, x là nồng độ. Đối với dung dịch xác định, ta tiến hành phản
ứng và đo được hệ số hấp thu của mẫu (A mẫu = y), ta có thể tính được nồng độ
của mẫu cần xác định theo phương trình:
x = (y – b)/a
Chiết xuất

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 14