1

M CL C
Trang
M căl c ........................................................................................................................ 1
Danhăm căhình ............................................................................................................ 6
Danhăm căb ng ........................................................................................................... 9
Danhăm căch ăvi tăt t ............................................................................................... 11
Tómăt t ...................................................................................................................... 12
M ăĎ u ...................................................................................................................... 16
Ch

ngă1ăT ngăquanătàiăli u..................................................................................... 20

1.1ăT ngăquanăv ăcâyăcàăchuaă(Lycopersicon esculentum Mill) ............................... 20
1.1.1ăNgu năg căvàăphânălo i.................... ............................................................... 20
1.1.2 ụăngh aăkinhăt ăc aăcâyăcàăchua ....................................................................... 21
1.1.3ăDinhăd

ngătrongăqu ăcàăchua ......................................................................... 21

1.1.4 Nghiênăc uăv ădiătruy năcâyăcàăchua ............................................................... 23
1.2ăT ngăquanăv ăvirusăviêmăgană(HepatitisăBăvirusă- HBV)ăvàăvaccineă năĎ

căt ă

th căv t ...................................................................................................................... 23
1.2.1ă

iăc

ngăv ăvirusăviêmăganăBă(Hepatitis B virus – HBV) ............................ 24

1.2.2ăC uătrúcăc aăHBVă ........................................................................................... 25
1.2.2.1. Gen S ............................................................................................................ 26
1.2.2.2.ă Khángă nguyênă b ă m tă virusă viêmă gană Bă (HBsAgă – Hepatitis B surface
antigen) ..................................................................................................................... 27
1.2.3ăVaccineă năĎ

căt ăth căv t............................................................................. 30

1.2.3.1ă uăĎi măc aăvaccineă năĎ
1.2.3.2 Ph

căt ăth căv tă .................................................... 30

ngăth căs năxu tăvaccineă năĎ

1.3ă M tă s ă nghiênă c uă ă n

căt ăth căv t ....................................... 32

că ngoàiă vàă trongă n

că v ă bi nă n pă genă HBsAg t oă

khángănguyênăHBsAgătrênăth căv t .......................................................................... 32
1.3.1ăNghiênăc uă ăn

căngoài ................................................................................. 32


1.3.1.1ăTrênăcâyăcàăchuaă(Lycopersicon esculentum Mill.) ..................................... 33


2

1.3.1.2ăTrênăcácăcâyătr ngăkhác ................................................................................ 33
1.3.2ăNghiênăc uătrongăn

c v chuy n gen HBsAg ............................................... 36

1.4ăCácăcôngătrìnhăchuy năgenăkhácătrênăcâyăcàăchuaă ............................................. 36
1.5ăC uătrúcăvectorădùngătrongăbi năn păgenătrênăĎ iăt
1.6ă M tă s ă y uă t ă nhă h

ngăcàăchua ....................... 42

ngă Ď nă hi uă qu ă bi nă n pă genă dùngă Agrobacterium

tumefaciens ăcâyăcàăchua ......................................................................................... 44
1.6.1ăDòngă(strain)ăA. tumefaciens ............................................................................ 44
1.6.2ăTu iăc aăm u .................................................................................................... 44
1.6.3ăLo iăm u........................................................................................................... 45
1.6.4ăMôiătr

ngăti nănuôiăc y .................................................................................. 45

1.6.5ăMôiătr

ngătáiăsinh ........................................................................................... 45


1.6.6ăTh iăgianănhi măkhu nă ................................................................................... 46
1.6.7ăM tăĎ ăvi khu n ............................................................................................... 46
1.6.8ă

ngănuôiăc y .................................................................................................. 46

1.6.9ăPhânăt ătínăhi u ................................................................................................ 47
1.6.10ăGiaiăĎo năti năch năl c .................................................................................. 47
1.6.11ăN ngăĎ ăkhángăsinhăcefotaxime ..................................................................... 47
1.6.12ă nhăh

ngăc aăpromoterălênăs ăbi uăhi năGUS ............................................ 47

1.7 Chuy năgenăgiánăti pănh ăAgrobacterium tumefaciens ...................................... 47
1.7.1ă uăĎi măc aăph

ngăphápăchuy năgenănh ăAgrobacterium tumefaciens ....... 47

1.7.2ăC ăch ăxâmănh păc aăAgrobacterium tumefaciens vàoăt ăbàoăth căv tă ......... 48
1.7.2.1 Hìnhăthànhăm tămobileăT- DNA copy, T- strand. ......................................... 49
1.7.2.2 C ăch ădiăchuy năph căh păT ....................................................................... 50
1.7.2.3 S ăg năT-DNA .............................................................................................. 51
1.8ă M tă s ă ph

ngă phápă t oă th că v tă chuy nă genă ană toànă sinhă h că khôngă cóă genă

ch năl că(marker-free)............................................................................................... 51
Ch

ng 2 V t li u vƠ ph


ng pháp nghiên c u .................................................. 53

2.1ăN iădungănghiênăc u ........................................................................................... 54
2.2ăV tăli uănghiênăc u ............................................................................................. 54


3

2.2.1ăV tăli uăth căv t ............................................................................................... 54
2.2.2ăViăkhu n ........................................................................................................... 54
2.2.3 Plasmid ............................................................................................................. 55
2.2.3.1ăT oădòngăE. coli mang plasmid pITB-HBsAg .............................................. 56
2.2.3.2ăBi năn păplasmidăpITB-HBsAg vàoăAgrobacterium tumefaciens
LBA4404.. ................................................................................................................. 56
2.3ăTh iăgianăvàăĎ aăĎi mănghiênăc u ....................................................................... 56
2.4ăPh

ngăphápănghiênăc u ..................................................................................... 56

2.4.1 Kh oăsátă nhăh
nhăh

ngăc aăBA,ăIAAălênă s táiăsinhăch iăin vitro t ăláăm măvàă

ngăc aăkhángăsinhăkanamycinălênăláăm m,ăcâyăconăin vitro ........................ 56

2.4.1.1 Kh oăsátă nhăh
2.4.1.2ă nhăh


ngăc aăBA,ăIAAălênăs ătáiăsinhăch iăin vitro t ăláăm m ... 56

ngăc aăn ngăĎ ăkhángăsinhăkanamycinălênăláăm m,ăcâyăcon

in vitro ....................................................................................................................... 58
2.4.2 Xâyă d ngă quyă trìnhă bi nă n pă genă vàoă láă m mă câyă càă chuaă TN412 b ngă
ph

ngăphápădùngăviăkhu năAgrobacterium tumefaciens ........................................ 59

2.4.3ăKi mătraăs ăhi nădi năc aăcácăgenăbi năn păvàăs ăbi uăhi năc aăchúngăb ngă
ph

ngăphápăhóaămôăt ăbào,ăsinhăh căĎ nhătínhăvàăhóaăsinh .................................... 61

2.4.3.1ăKi mătraăs ăbi uăhi năĎ nhătínhăc aăgenăkhángăkanamycinănptII ................. 61
2.4.3.2ăKi mătraăs ăhi nădi năc aăcácăgenănptII, HBsAg b ngăk ăthu tăPCR ........... 61
2.4.3.3ăGi iătrìnhăt ăs năph măPCRăgenăHBsAg c aăcâyăcàăchuaăchuy năgen ......... 62
2.4.3.4ă ánhăgiáăcâyăcàăchuaăchuy năgenăHBsAg trongăĎi uăki năv

nă

mă

ăth ăh ăT0 ................................................................................................................. 62
2.4.3.5ăKi mătraăs ăhi nădi năvàăbi uăhi năc aăgenăgusA b ngăk ăthu tăhóaămô ..... 63
2.4.3.6 PhânătíchăSouthernăblotăcácădòngăcàăchuaăchuy năgenăHBsAg ..................... 64
2.4.3.7 Ki mătraănhanhăs ăhi nădi năc aăproteinăHBsAgă ăqu ăcâyăT0 b ngăqueăth ă
Ď căhi u ..................................................................................................................... 67
2.4.3.8ăPhânătíchăproteinăt ngăs ădùngăĎi nădiătrênăgelăpolyacrylamideă(SDS-PAGE)

(Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis) .............................. 68
2.4.3.9ăPhânătíchăWesternăblotăcácădòngăcàăchuaăchuy năgenăHBsAg ...................... 71


4

2.4.3.10ăKi mătraăhàmăl

ngăproteinăHBsAgăb ngăph

ngăphápăELISAă(Enzyme-

Linked ImmunoSorbent Assay) ................................................................................ 73
2.4.4ăKi mătraăs ădiătruy năc aăgenăch năl cănptII vàăgenăchuy năm cătiêuăHBsAg ă
th ăh ăT1 b ngăph

ngăphápăsinhăh c Ď nhătínhăvàăPCR .......................................... 75

2.4.4.1ăKi mătraăkh ăn ngăkhángăkhángăsinhăkanamycinăc aăm tăs ăcâyăconăth ăh ă
T1 b ngăph

ngăphápăsinhăh căĎ nhătính ................................................................. 75

2.4.4.2ăKi mătraăs ăhi nădi năc aăgenănptII, gen HBsAg b ngăk ăthu tăPCR vàăt ăl ă
phânălyăc aăgenănptII vàăgenăHBsAg ăth ăh ăT1 ...................................................... 76
2.5ăPh
Ch

ngăphápăx ălỦăs ăli u ................................................................................... 76


ng 3 K t qu vƠ th o lu n ............................................................................. 77

3.1 Kh oăsátă nhăh
h

ngăc aăBA,ăIAAălênăs táiăsinhăch iăin vitro t ăláăm măvàă nhă

ngăc aăkhángăsinhăkanamycinălênăláăm m,ăcâyăconăin vitro .............................. 77

3.1.1ă nhăh

ngăc aăBA,ăIAAălênăs ătáiăsinhăch iăin vitro t ăláăm m .................... 77

3.1.2 nhăh

ngăc aăn ngăĎ ăkhángăsinhăkanamycinălênăláăm m,ăcâyăconă ........... 80

3.1.2.1 nhăh

ngăc aăn ngăĎ ăkanamycinălênăs ătáiăsinhăc aăm uăláăm mă .......... 80

3.1.2.2ă nh h

ngăc aăn ngăĎ ăkhángăsinhăkanamycinălênăs ăsinhătr

ngăc aăcây

con ............................................................................................................................. 81
3.2 Xâyăd ngăquyătrìnhăbi năn păgenăvàoăláăm măcâyăcàăchuaăTN412 b ngăph


ngă

phápădùngăviăkhu năAgrobacterium tumefaciens ...................................................... 84
3.3ă Ki mă traă s ă hi nă di nă c aă cácă genă bi nă n pă vàă s ă bi uă hi nă c aă chúngă b ngă
ph

ngăphápăhóaămôăt ăbào,ăsinhăh căĎ nhătính,ăhóaăsinh ........................................ 91

3.3.1ăKi mătraăs ăbi uăhi năĎ nhătínhăc aăgenăkhángăkanamycinănptII ................... 91
3.3.2 Ki mătraăs ăhi nădi năc aăcácăgenănptII, HBsAg b ngăk ăthu tăPCR .............. 92
3.3.2.1ăKi mătraăPCRăgenăkhángăkanamycinănptII .................................................. 92
3.3.2.2ăKi mătraăPCRăgenăHBsAg ............................................................................. 92
3.3.3ăGi iătrìnhăt ăs năph măPCRăgenăHBsAg c aăcâyăcàăchuaăchuy năgen ............ 94
3.3.4

ánhăgiáăcâyăcàăchuaăchuy năgenăHBsAg trongăĎi uăki năv

nă

mă ăth ăh ă

T0 .............................................................................................................................. 94
3.3.5ăKi mătraăs ăhi nădi năvàăbi uăhi năc aăgenăgusA b ngăk ăthu tăhóaămô ....... 98


5

3.3.6ăPhânătíchăSouthernăblotăcácădòngăcàăchuaăchuy năgenăHBsAg ........................ 99
3.3.6.1ăT oăm uădòălaiăDNA ..................................................................................... 99
3.3.6.2 Lai DNA ...................................................................................................... 100

3.3.7 Ki mătraănhanhă s ăhi nădi năc aăproteinăHBsAgă ăqu ă câyă T0 b ngăqueăth ă
Ď căhi u ................................................................................................................... 102
3.3.8 Phânătíchăproteinăt ngăs ădùngăĎi nădiătrênăgelăpolyacrylamide (SDS-PAGE) ...
................................................................................................................................. 103
3.3.9 PhânătíchăWesternăblotăcácădòngăcàăchuaăchuy năgenăHBsAg ....................... 106
3.3.10ăKi mătraăhàmăl

ngăproteinăHBsAgăb ngăph

ngăphápăELISA ................. 107

3.4ăKi mătraăs ădiătruy năc aăgenăch năl cănptII vàăgenăchuy năm cătiêuăHBsAg ă
th ăh ăT1 b ngăph

ngăphápăsinhăh căĎ nhătínhăvàăk ăthu tăPCR .......................... 110

3.4.1ă ánhă giáă kh n ngă khángă khángă sinhă kanamycină c a m t s câyă conă th h
sau b ngăph
3.4.2ăPh

ngăphápăĎ nhătính ............................................................................. 110

ngăphápăPCR .......................................................................................... 113

K t lu n vƠ đ ngh ............................................................................................... 115
K tălu n ................................................................................................................... 115
ăngh .................................................................................................................... 116
Danhăm căcôngătrình ............................................................................................... 117
Tàiăli uăthamăkh o ................................................................................................... 118
Ph ăl c ..................................................................................................................... 140



6

DANH M C HỊNH
Hìnhă1.1ăC u trúcăkhôngăgianăc aăvirusăHBV .......................................................... 24
Hìnhă1.2ăC uătrúcăb ăgenăc aăvirusăHBV ................................................................. 26
Hìnhă1.3ăBaăvùngăc aăgenăS (S, pre-S1, pre-S2)ăvàăcácăproteinăĎ

căcácăgenănàyămưă

hóaă ............................................................................................................................ 29
Hìnhă1.4ăC uătrúc gen S vàăkhángănguyênăb ăm t (HBsAg) ................................... 29
Hìnhă1.5ăS ăĎ ăs năxu tăvaccineă năĎ

căt ăth căv tătrênăc ăs ăxâyăd ngăh ăth ngă

bi uă v ă ă virusă gâyă nhi mă th că v tă vàă bi nă n pă diă truy nă nh ă viă khu nă
Agrobacterium/b năgen ............................................................................................. 32
Hìnhă1.6 C uătrúcăgenăPDS ăcàăchuaă ...................................................................... 43
Hìnhă1.7ăC ăch ăxâmănh păc aăT-DNA Agrobacterium tumefaciens vàoăt ăbàoăth că
v tă ............................................................................................................................. 50
Hìnhă1.8 Cácăph

ngăphápăt oăcâyătr ngăbi năĎ iăgenăkhôngăcóăgenăĎánhăd u ...... 52

Hìnhă2.1ăCácăb

căthíănghi măv ăbi năn păt oăcâyăchuy năgenăvàăminhăch ngăv ăs ă


diătruy năc aăgenăchuy n........................................................................................... 53
Hìnhă2.2 C uătrúcăplasmidăpITB-HBsAg.................................................................. 55
Hìnhă2.3ăM uăláăm măcàăchuaăin vitro Ď

căs ăd ngălàmănguyênăli uătáiăsinhăch i ...

................................................................................................................................... 57
Hìnhă2.4ăS ăĎ ăĎo năDNAăsauăkhiăx ălỦăb ngăenzymeăgi iăh năNcoI .................... 66
Hìnhă3.1ăCh iătáiăsinhăt ăm uăláăm măcàăchuaătrênăcácămôiătr

ngăkh oăsátăcóăb ă

sungăn ngăĎ ăBAăt ă1,25ămg/LăĎ nă2,5ămg/Lă ă42ăNSCă ........................................ 79
Hìnhă3.2ăM uăláăm măĎ

cănuôiăc yătrênămôiătr

ngătáiăsinhăcóăn ngăĎ ăkhángăsinhă

kanamycinăkhácănhauă ă28ăNSCă .............................................................................. 81
Hìnhă3.3ăM uăcâyănuôiăc yătrênămôiătr

ngăcóăn ngăĎ ăkhángăsinhăkanamycinăkhácă

nhau ă60ăNSC .......................................................................................................... 82
Hìnhă3.4ăM uăláăm mă ăchuăk ăch năl căl năth ă1ătrênămôiătr

ngăcóăkanamycină50ă

mg/L .......................................................................................................................... 84

Hìnhă3.5ăM uăláăm măs ngăsótătrênămôiătr

ngăcóăkhángăsinhăkanamycină50ămg/Lă

hìnhăthànhămôăs o,ătáiăsinhăch iăsauă4ăl năc yăchuy năsangămôiătr

ngăch năl c ... 87


7

Hìnhă3.6 Trìnhăt ăĎo năT-DNAăh pănh tăvàoăb ăgenăcây ........................................ 88
Hìnhă3.7ăTómăt tăquyătrìnhăbi năn păgenăHBsAg vàoăláăm măgi ngăcàăchuaăTN412ă
nh ăviăkhu năAgrobacterium tumefaciens ................................................................ 89
Hìnhă 3.8 S ă Ď ă bi nă n pă genă HBsAg vàoă láă m mă gi ngă càă chuaă TN412ă nh ă viă
khu năAgrobacterium tumefaciens

............................................ 90

Hìnhă 3.9ă M uă láă th tă câyă T0 táiă sinhă trênă môiătr

ngăch aă khángă sinhă kanamycină

100 mg/Lă ă60ăngàyăsauăc yăch năl c ....................................................................... 91
Hìnhă3.10ăK t qu Ďi n di s n ph m PCR c a gen nptII

câyăcàăchuaăchuy n gen

................................................................................................................................... 92
Hìnhă3.11ăK t qu Ďi n di s n ph m PCR c a gen HBsAg


câyăcàăchuaăchuy n gen

................................................................................................................................... 93
Hìnhă3.12ăBaădòngăcâyăcàăchuaăchuy năgenăT0 ăgiaiăĎo năin vitro vàăgiaiăĎo năt ngăă
tr

ngăex vitro ........................................................................................................... 96

Hìnhă3.13ăBaădòngăcâyăcàăchuaăchuy năgenăT0 giaiăĎo năraăhoa,ăk tăqu ăex vitro
................................................................................................................................... 97
Hìnhă3.14ăBi uăhi năGUSă ăm tăs ălo iămôăc a câyăcàăchuaăTN412ăchuy năgen ... 99
Hìnhă3.15ăK tăqu ăĎi nădiăs năph măPCRăgenăHBsAg nh măthuăm uăt oăprobe ... 100
Hìnhă3.16ăK tăqu ăĎi nădiăgelăagaroseăcácăm uăDNAăsauăc tăb ngăenzymeăgi iăh nă
ph căv ăphânătíchăSouthernăblot.............................................................................. 101
Hìnhă3.17ăK tăqu ăphânătíchăSouthernăblotăcácădòngăcàăchuaăchuy năgen ............. 102
Hìnhă3.18ăK tăqu ăphátăhi nănhanhăproteinăHBsAgă ăláăvàăqu ăcàăchuaăcâyăT0 ... 103
Hìnhă3.19ăK tăqu ăĎi nădiăSDS-PAGEăproteinăcácădòngăcàăchuaăchuy năgenăHBsAg
................................................................................................................................. 104
Hìnhă 3.20ă K tă qu ă phână tíchă Westernă blotă d

ngă tínhă Ď iă v iă cácă dòngă càă chuaă

chuy năgen............................................................................................................... 107
Hìnhă 3.21 S
chuy n gen

c ch n y m m c aă khángă sinhă kanamycină trênă h tă càă chuaă khôngă
7 NSC ............................................................................................... 111


Hìnhă3.22ăS n y m m c a h tăcàăchuaăchuy n gen th h T0 trênămôiătr
cóăb sung kanamycin 100 mg/L

ngă½ăMSă

7 NSC ............................................................ 112


8

Hìnhă3.23ăCâyăconăt h tăcàăchuaăchuy n gen HBsAg khángăkanamycină100ămg/Lă
tr ng

v

nă

mă 30 NSC................................................................................... 113

Hìnhă3.24 K tăqu ăki mătraăPCRăgenăkhángăkanamycinănptII vàăgenăHBsAg

m tă

s ăcáăth ăcâyăconăcàăchuaăth ăh ăT1 c aădòngăCC1 ................................................. 113


9

DANH M C B NG
B ngă1.1ăM iăliênăquanăgi aăki uăhuy tăthanhă(serotype)ăvàăki uăgenă(genotype) ......

................................................................................................................................... 25
B ngă1.2ăNh ngăcôngătrìnhăt oăvaccineă năĎ

că ăcàăchuaăgiúpăng năng aăm tăs ă

b nh ........................................................................................................................... 37
B ngă1.3ăNh ngănghiênăc uăchuy năgenă ăcàăchuaăc iăthi năkh ăn ngăkhángăb nhă
vàăch ngăch uăv iămôiătr

ngăb tăl i ........................................................................ 38

B ngă1.4ăNh ngăcôngătrìnhăchuy năgenă ăcàăchuaăgiaăt ngătínhăch uăĎ ngăstressăphiă
sinhăh c ..................................................................................................................... 39
B ngă2.1ăThànhăph năc aăresolvingăgelăvàăstackingăgel ........................................... 70
B ngă3.1

nhăh

ngăc aăn ngăĎ ăBAălênăs táiăsinhăch iăt ăláăm măcà chuaă ă42ă

ngàyăsauăc yă(NSC) ................................................................................................... 78
B ngă3.2

nhăh

ngăc aăn ngăĎ ăkhángăsinhăkanamycinălênăkh ăn ngătáiăsinhăc aă

láăm măcàăchuaăvàăs ăsinh tr

ngăc aăcây conăcàăchua ............................................ 82


B ngă 3.3ă T ngă s ă nhánhă lá,ă s ă hoa,ă s ă qu ă vàă chi uă caoă c aă câyă càă chuaă khôngă
chuy năgenă( C)ăvàăcâyăcàăchuaăchuy năgenăc aăcácădòngăCC1,ăCC2,ăCC3 .......... 95
B ngă3.4 Hàmăl

ngăproteinăt ngăs ăc aăqu ăcácădòngăcàăchuaăchuy năgenăHBsAg

................................................................................................................................. 104
B ngă3.5ăKho ngăcáchădiăchuy năcácăb ngăproteinătrênăb năgelăc a cácăm uăkh oă
sát ............................................................................................................................ 105
B ngă3.6ăTr ngăl

ngăphânăt ăcácăb ngăproteină ăcácăm uăĎ iăch ngăvàăchuy năgenă

HBsAg...................................................................................................................... 106
B ngă3.7ăT

ngăquană gi aăgiáătr ă ODăvàăcácăn ngăĎ ăproteinăHBsAgă(BFă6015ă -

AaltoăBio)ădùngălàmăĎ
B ngă 3.8 Hàmă l

ng chu n .......................................................................... 108

ngă vàă t ă l ă proteină khángă nguyênă HBsAgă trênă proteină t ngă s ă

trongănh ngăm uăkh oăsát ....................................................................................... 108


10


B ng 3.9 K t qu th nghi m kh n ngă khángă khángă sinhă c a h t t qu càă chuaă
chínă chuy n gen HBsAg th h T0 trênă môiă tr
kanamycin 100 mg/L

ng n y m mă ½ă MSă cóă b sung

7 NSC ............................................................................... 111


11

DANH M C CÁC Kụ T

VI T T T

APS

Ammonium persulfate

BA

Benzyl Adenine

bp

Base pairs

BSA


Bovine Serum Albumin

DNA

Deoxyribonucleic acid

dNTPs

Deoxyribonucleotide triphosphates

EDTA

Ethylenediaminetetraacetic acid

ELISA

Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay

FAO

Food and Agriculture Organization of the United Nations

HBV

Hepatitis B virus

HBsAg

Hepatitis B surface antigen


HRP

Horseradish peroxidase

IAA

Indole-3-acetic acid

kDa

Kilo Dalton

MS

Murashige and Skoog

PBS

Phosphate Buffer Saline

PBST

Phosphate Buffer Saline Tween 20

PCR

Polymerase Chain Reaction

PDS


Phytoene desaturase

pNPP

p-Nitrophenyl Phosphate

SDS-PAGE

Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis

TBS

Tris Buffered Saline

TBST

Tris Buffered Saline Tween 20


12

TịM T T
T O CÂY CẨ CHUA MANG GEN HBsAg B NG PH

NG PHÁP

BI N N P GEN DỐNG VI KHU N Agrobacterium tumefaciens

Nghiênăc uăĎ


c th căhi năt iăPhòngăCôngăngh ăGen,ăVi năSinh h căNhi tă

Ď iă– Vi năHànălâmăKhoaăh căvàăCôngăngh ăVi tăNamăvàăt iăTr

ngă

iăh căNôngă

LâmăThànhăph ăH ăChíăMinh.ă M cătiêuăc a lu năánălàăt oăcâyăcàăchuaămangăgenă
HBsAg mưă hóaă proteină khángă nguyênă HBsAgă ph că v ă h

ngă nghiênă c uă t oă

vaccineă năĎ

ngălai.ăM tăh ăth ngă

căphòngăng aăb nhăviêmăganăsiêuăviăBătrongăt

cácăn iădungănghiênăc uăvàăph

ngăphápănghiênăc uăphùăh pă(nuôiăc yămô,ăchuy nă

gen,ăsinhăhóa,ăsinhăh căphânăt )ăĎưăĎ
trên.ăK tăqu ăĎ

cătómăt tăd

cătri năkhaiăth căhi nănh măĎ tăm cătiêuănóiă


iăĎây:

ưăxâyă d ngăhoànăthi năh ăth ngătáiăsinhăch iăt ăláă m m 7ăngàyă tu i nuôiă
c yăin vitro choăgi ngăcàăchuaăTN412ălàmăti năĎ ăchoănghiênăc uăbi năn păgen.ăT ă
l ătáiăsinhăch iăcaoănh t,ăs ăl
tr

ngăch iătrênăm uănhi uănh tăĎ

căghiănh nătrênămôiă

ngăkhoángăMS (vitaminăB5)ăcóăb ăsungăBAă2,0ămg/LăvàăIAAă0,5ămg/L.ă ưăxácă

Ď nhăĎ

căn ngăĎ ăt iăthi uăc aăkhángăsinhăkanamycină nhăh

gâyăch tăláăm măvàăs ăsinhătr

ngăĎ nătáiăsinhăch i/ă

ng/ăgâyăch tăcâyăconănuôiăc yăin vitro làă50ămg/L.

ưăxâyăd ngăhoànăch nhăquyătrìnhăbi năn păgenăHBsAg vàoăláăm mănh ăviă
khu nă Agrobacterium tumefaciens ch aă plasmidă pITB-HBsAg [gen HBsAg Ď

că

Ďi uăkhi năb iăpromoterăPDS (phytoene desaturase) t oăbi uăhi năĎ cătr ngă ăqu ă
vàăpromoterăT7] v iăk tăqu ăt oăĎ


că03ădòngăcâyăchuy năgen.ăCácăb

quyătrìnhăbaoăg măgiaiăĎo năti nănuôiăc yăláăm mătrênămôiătr

căc ăb năc aă

ngătáiăsinhătrongă2ă

ngày;ăgâyănhi măláăm măv iăviăkhu năAgrobacterium tumefaciens LBA 4404 trong
20ă phút;ă nuôiă chungă láă m mă v iă viă khu nă trongă 2ă ngày;ă ch nă l c,ă táiă sinhă ch iă
chuy năgenăt ăláăm mănuôiăc yătrênămôiătr

ngăcóăb ăsungă50ămg/Lăkanamycin.

ưăki mătraăs ăhi nădi n,ăbi uăhi năc aăgenăchuy nă ăth ăchuy năgenăT0 b ngă
k ă thu tă PCR,ă gi iă trìnhă t ă Ďo nă gen,ă Southernă blot,ă ph

ngă phápă hóaă môă t ă bàoă


13

(GUSăassay),ăsinhăh căĎ nhătính,ăhóaăsinhă(ELISA)ăvàăWesternăblot. Protein HBsAg
chi mă0,11%ătrênăt ngăs ăproteinăhòaătanăc aăqu .
B ngă ph

ngă phápă sinhă h că Ď nhă tínhă quaă ki mă traă kh ă n ngă khángă khángă

sinh kanamycin 50 – 100ămg/Lăvàăb ngăk ăthu tăPCR ĎưăxácăĎ nhăĎ


căs ădiătruy nă

c aăgenăch năl cănptII vàăgenăchuy nă m că tiêuăHBsAg ăth ăh ă T1.ăK tăqu ăc ngă
choăth yăs ăphânălyădiătruy năhaiăgenănóiătrênăc ăb năphùăh păquyălu tăMendelăv iă
t ăl ă3:1.ă
âyă làă nghiênă c uă Ď uă tiênă Ď ă c pă t oă câyă càă chuaă mangă genă HBsAg Ď

că

Ďi uăkhi năb iăhai promoter PDS (phytoene desaturase) vàăpromoterăT7.ăQuyătrìnhă
chuy nă genă ă gi ngă càă chuaă TN412ă cóă th ă Ď
khác.

că ápă d ngă trênă cácă gi ngă càă chuaă


14

ABSTRACT
PRODUCTION OF TRANSGENIC TOMATO PLANTS CONTAINING
HBsAg GENE BY Agrobacterium tumefaciens
The study was carried out at the Plant Genetic Engineering Laboratory,
Institute of Tropical Biology – Vietnam Academy of Science and Technology and
the Nong Lam University - Ho Chi Minh City. The objective of this study is to
produce transgenic tomato plants containing the HBsAg target gene encoding
HBsAg antigen with the hope that edible vaccine could be applied for preventing
the Hepatitis B virus in the future. A system of research contents and the
appropriate methods (tissue culture, genetic transformation, biochemistry,
molecular biology) were established in order to get this objective. The results were

as follows:
The improved protocol of in vitro plant regeneration from 7-day old
cotyledons of the TN412 tomato cultivar through culturing them on the MS medium
(with B5 vitamins) containing BA and IAA was carried out. The MS medium
supplemented with BA (2 mg/L) and IAA (0.5 mg/L) was the most suitable medium
for plant regeneration. The kanamycin at the minimal lethal/ inhibitory dose of
cotyledon and in vitro young plant was also identified (50 mg/L). These protocols
were used as basis for the genetic transformation study.
The protocol for genetic transformation via LBA 4404 Agrobacterium
tumefaciens was established. This strain contains the plasmid pITB-HBsAg
harbouring HBsAg gene [driven by the PDS (phytoene desaturase) fruit–specific
promoter and the T7 promoter], nptII kanamycin resistance gene (CaMV35S
promoter) and gusA reporter gene (also driven by the PDS and the T7 promoters).
The protocol was composed of the pre-culture of cotyledons on the regeneration
medium for 2 days, infection of cotyledons with the Agrobacterium tumefaciens for
20 minutes, co-cultivation for 2 days, regeneration of the putative transgenic shoots


15

on the above regeneration medium with kanamycin (50 mg/L). Through this stepby-step transformation protocol, three transgenic plant lines were obtained.
The presence and the expression of the transgenes in individuals of T0
generation were confirmed by PCR analyses, sequencing part of the expected
HBsAg gene, Southern blot, GUS assay, qualitative biology method, ELISA and
Western blot. HBsAg antigen level was 0.11% of the total fruit soluble protein.
The kanamycin assay (50 – 100 mg/L) and the PCR technique were used for
the inheritance analysis of the nptII and the HBsAg genes in T1 generation. The
results showed that the inheritance of these genes conform to the expected
Mendelian segregation ratio 3:1.
This is the first report on the production of transgenic tomato plants

containing the HBsAg gene driven both by the PDS (phytoene desaturase) promoter
and the T7 promoter. The transformation protocol on TN412 tomato cultivar could
be used in the genetic transformation of the other tomato cultivars.


16

M

U

Lu năánă“T o câyăcàăchuaămangăgenăHBsAg b ngăph
dùngă viă khu n Agrobacterium tumefaciens”ă Ď

ngăphápăbi n n p gen

c th c hi n t iă phòngă Côngă ngh

Gen,ă Phòngă Thíă nghi m Tr ngă Ďi mă phíaă Namă v Côngă ngh T bàoă Th c v t Vi n Sinh h c Nhi tăĎ i.
Tính c p thi t c a lu n án
TheoăWHOă(n mă2010),ăviêmăganăsiêuăviăBălàăb nh v ganăth
trong danh m căm

i b nh d chăgâyăt vong cao nh tătrênăth gi i, s ng

nhi măvirusăviêmăganăBă(Hepatitis B virus) cao, kho ng 2 t ng
ng

ng g p, n m


i.

n

i t ng

c ta, t l

i mang m m b nhăviêmăganăsiêuăviăBăkháăcao,ăchi m kho ng 15 - 20%ădânăs

(h nă12ătri uăng

i).ăTìnhătr ng nhi mănàyăĎưăgâyăraănhi u h u qu nghiêmătr ng.

B nhănàyălâyălanătheoănhi uăconăĎ

ng,ătr

ng h p b nhămưnătínhăcóăth d năĎ n

x ăganăvàăungăth ăgan,ăth i gian ch a tr kéoădài,ăh năn aăchiăphíăĎi u tr cònăr t
caoă [5,ă 6].ă Cáchă t t nh tă làă phòngă ng aă vàă m tă trongă cácă bi nă phápă phòngă ng a
quan tr ngă làă ch ng ng a.ă Tuyă nhiên,ă chiă phíă choă ch ng ng a b nhă kháă caoă n u
tuânăth theoăphácăĎ Ďi u tr tiêuăchu n.
t oăĎi u ki n thu n l i cho ph c v tiêmăch ng vaccine m r ngăĎ i v i
ng

iădână cácăn

n


c (M ,ă Cuba,ă

cănghèoăvàăcácăn

căĎangăphátătri n,ăcácănhàăkhoaăh c nhi u

c,ă Hànă Qu c, Trung Qu c,ă Tâyă Bană Nha)ă Ďưă s n xu t th

nghi mă vaccineă táiă t h p t câyă tr ng chuy nă gen.ă H
vaccineănàyăĎ

căxemălàăh

ngă nghiênă c u s n xu t

ngăcóăti măn ngăvôăcùngăl n.ăGiáăthànhăs n ph m s

th păh năr t nhi u so v iăgiáăthànhăcácăs n ph m hi nădùng.ăVìăcóăth s n xu t
quyămôăl n,ăĎ năgi nătrongăkhâuăt ch c s n xu t, v n chuy n vàăb o qu n ngu n
vaccine, s n ph măkhôngăch aăcácăvirusăgâyăb nhăchoăng

i [77, 97, 105, 137, 157,

164, 167].
Proteinăkhángănguyênăb ăm tăHBsAg,ăt ăgenăS c aăvirusăviêmăganăBă(HBV)ă
làăthànhăph năr tăquanătr ngăgiúpăchoăHBVă bámădínhăvàoă màngăt ăbào,ăsauăĎó Ďiă
vàoăt ăbàoăvàăhuy tăt

ngăcáăth ăb nh.ăHuy tăt


ngăcóăch aăHBsAgălàăngu năv tă


17

li uăquanătr ngăĎ ăs năxu tăthu căch ngăng aă(ngoàiăhuy tăt
Ď

ng,ăvaccineănàyăcònă

căs năxu tăt ăn mămen,ăt ăbàoăĎ ngăv tăh uănh ă[36]).ă
Trênă th ă gi iă Ďưă cóă m tă s ă côngă b ă khoaă h că liênă quană Ď nă nghiênă c uă

chuy năn păgenăHBsAg (gen S)ăvàoăm tăs ăcâyătr ngă(thu călá,ăkhoaiătây,ăcàăchua,ă
chu i),ăs năxu tăsinhăkh iămôăt ăbàoăcâyăchuy năgen,ăchi tătáchăproteinătinhăkhi tăvàă
nghiênăc uăkh ăn ngăĎápă ngămi năd chă ăc ăth ăĎ ngăv t quaătiêmăchíchăprotein
tinhă khi tă ho c/vàă nă tr că ti pă s nă ph mă câyă chuy nă gen.ă M tă s ă nghiênă c uă nêuă
trênă choă th yă proteină khángă nguyênă HBsAgă s ă d ngă quaă Ď

ngă tiêuă hoáă cóă kh ă

n ngăt oăĎápă ngămi năd chăt tă- m ăraătri năv ngănghiênăc uăchuy năn păgenănày
vàoăcácăcâyătr ngăcóăb ăph nă năt
iăt

ngăcâyătr ngăĎ

iăĎ


cănh ăqu ,ălá,ăthân,ăc .

căs ăd ngătrongănghiênăc uănàyălàăcàăchua.ăCàăchuaă

làăm tătrongănh ngăcâyărauăquanătr ng,ăĎ

cătiêuăth ănhi uă[153],ăcóăkh ăn ngăphátă

tri năr ngăkh păth ăgi i,ăh nă60 tri uăt năcàăchuaăĎ

căs năxu tăm iăn m.ăCàăchuaă

cungăc pănhi uăvitaminăvàăkhoángăch tăcóăl iăchoăs căkh eăc aăconăng

iănh ăs că

t ă lycopene vàă -carotene. Nh ngă ch tă ch ngă oxiă hóaă m nhă nàyă làmă ch mă s ă lưoă
hóa,ă ng nă ch nă t ă bàoă ungă th ,ă ch ngă s ă hìnhă thànhă c că máuă Ďôngă trongă thànhă
m ch,ăng nătíchăl yăcholesterol, phòngăng aăcácătaiăbi năc aăb nhătimăm ch,ăb nhă
béoă phì. Càă chuaă Ďưă Ďóngă gópă nhi uă choă nh ngă ti nă b ă trongă côngă ngh ă sinhă h că
th căv tăvìăcóăchuăk ăs ngăt

ngăĎ iăng n,ăcóăth ătr ngătrongănhàăkính [120],ăcóăkh ă

n ngăbi năn pă caoă[15]ăvàăcóă nh ngăĎ căĎi măphùă h păĎ ăs năxu tăcácăch ăph mă
d

căsinhăh c,ăs năxu tăvaccineă năĎ

c.


Vìăv y,ălu năánănàyăh

ngăt iăt oăcâyăcàăchuaămangăvàăbi uăhi năgenăHBsAg,

làăk tăqu ăti năĎ ăph căv ăh

ngănghiênăc uătrên th ăgi iăhi nănayăv ăt oăproteinătáiă

t ăh păHBsAgă ăqu ăcàăchuaăchuy năgenănh ălàă“vaccineă năĎ

c”ăĎ ăphòngăng aă

b nhăviêmăganăsiêuăviăB.
M c tiêu c a lu n án
T oă Ď

căcâyă càă chuaă biă TN412ă mangă genă HBsAg b ngă ph

n p gen dùng viăkhu năAgrobacterium tumefaciens.

ngăphápă bi nă


18

Yêu c u c a lu n án
- Hoànăthi năh ăth ngătáiăsinhăch iăin vitro t ăláăm măvàăxácăĎ nhăĎ

căn ngă


Ď ă t iă thi uă c aă khángă sinhă kanamycină gâyă ch tă láă m m,ă câyă conă càă chuaă gi ngă
TN412ălàmăti năĎ ăchoănghiênăc uăbi năn păgen.ă
- XácăĎ nhăĎ

căs ăhi nădi n,ăbi uăhi năc aăcácăgenăchuy nă ăcâyăth ăh ăT0

b ngăk ăthu tăPCR,ăgi iătrìnhăt ăĎo năgenăvàăSouthernăblot,ăph

ngăphápăhóaămôăt ă

bào,ăsinhăh căĎ nhătính,ăhóaăsinhăvàăWesternăblot.
- XácăĎ nhăĎ

căs ădiătruy năc aăgenăch năl cănptII vàăgenăchuy năm cătiêuă

HBsAg ăth ăh ăT1 b ngăph

ngăphápăsinhăh căĎ nhătínhăvàăk ăthu tăPCR.

ụ ngh a khoa h c vƠ th c ti n c a lu n án
ụ ngh a khoa h c: XácăĎ nh s ăh pănh tăvàăbi uăhi năc aăgenăHBsAg, qua
Ďi uăkhi năb iăpromoterăT7 - cóăngu năg căt ăth căkhu năth ăk tăh păv iăpromoteră
PDS (Phytoene desaturase), ă cây/qu ă càă chuaă chuy nă genă nh nă Ď
bi năn păgenăb ngăph

că thôngă quaă

ngăphápădùngăviăkhu năAgrobacterium tumefaciens.


ụ ngh a th c ti n: Câyă càă chuaă mangă genă mưă hóaă proteină khángă nguyênă
HBsAgă t oă ti nă Ď ă choă nhână gi ngă quyă môă l nă ph că v ă h
“vaccineă năĎ

ngă nghiênă c uă t oă

c”ăphòngăng aăb nhăviêmăganăB.ă

Tính m i c a lu n án
D aătrênăcácănghiênăc uătr
qu ănghiênăc uănh năĎ

căĎây v ăt oăcâyăcàăchuaămangăgenăHBsAg,ăk tă

c ăĎ ătàiănàyăcóătínhăm i là: L năĎ uătiênăt oăĎ

dòngăcâyăcàăchuaăTN412ă(gi ngăth

căm tăs ă

ngăm i)ămangăvàăbi uăhi năgenăHBsAg,ăĎ

că

Ďi uăkhi năb iăhaiăpromoterăT7 vàăpromoterăPDS,ăv iăk tăqu ălàmăt ngăs ăbi uăhi nă
chuyênăbi tăproteinăkhángănguyênăHBsAgă ăqu ăcàăchua.ă
Gi i h n c a lu n án
Doăgenăch ăth ăgusA Ď

căthi tăk ăkhôngăt oăbi uăhi năs mă(dùngănh ăm tă


ch ăth ănhanh),ăch ăt oăbi uăhi nă ăgiaiăĎo năqu ănênă ălu năánăkhôngăti năhànhăkh oă
sátă chiă ti tă nhă h

ngă c aă m tă s ă y uă t ă Ď nă t nă s ă bi nă n pă genă nh ă h pă ch tă

phenol acetosyringone,ăth iăgianănuôiăchungămôăláăm măv iăviăkhu n.ă


19

Vìăgi iăh năv ăth iăgianănênănghiênăc uăd ngăl iă ăgiaiăĎo năki mătraăs ădiă
truy năc a gen m cătiêuă(HBsAg)ă ăcácăcáăth ăth ăh ăT1 b ngăph
Ď nhă tínhă vàă k ă thu tă PCR. Ch a kh oă sátă nhă h
n ngăt oăĎápă ngămi năd ch.

ngăphápăsinhăh că

ngă c aă proteină HBsAgă lênă kh ă


20

CH

NG 1

T NG QUAN TẨI LI U
1.1 T ng quan v cơy cƠ chua (Lycopersicon esculentum Mill.)
1.1.1 Ngu n g c vƠ phơn lo i

Càă chuaă thu că h ă càă Solanaceae,ă chiă Lycopersicon (h uă h tă cácă thànhă viênă
trongăh ăcóăcùngăs ănhi măs căth ălàă12) [53], càăchuaăcùngăh ăv iănhi uălo iăcây cóă
giáătr ăkinhăt ăkhác nh :ăkhoaiătây,ăthu călá,ă t.ăTrongăĎó,ăcàăchuaăcóăb ăgenăĎ năb iă
cóăkíchăth

cănh ănh tălàă950 Mb [53].

Chi Lycopersicon g mă12ăloài, cóă2ăchiăph :ăchiăph Eriopericon (qu ăluônă
cóămàuăxanh,ăcóăs cătía,ăcóălông,ăh tănh )ăvàăchiăph Eulycopersicon (qu ăchínăĎ ă
ho căvàng,ăhoaăto).ăChiăph ăth ăhaiăcóă2ăloài:ăL. esculentum - làăloàiăcàăchuaătr ngă
ph ă bi nă vàă L. pimpinellifolium - làă loàiă càă chuaă bánă hoangă d i.ă Loàiă càă chuaă
Lycopersicon esculentum Mill.ă làă loàiă l nă nh t,ă cácă bi nă ch ngă vàă gi ngă c aă loàiă
nàyăcóăkh ăn ngăthíchănghiăr ngănênăchúngăĎ

cătr ngăr ngărưiă ănhi uăn iătrênăth ă

gi iă[129].
Câyăcàăchuaăcóăngu năg că ăvùngătrungăvàănamăChâuăM .ăMêxicôălàăn
Ď uătiênătr ngăloàiăcâyănày.ăT ăChâuăM ,ăcàăchuaăĎ

căcácăth

că

ngăgiaăB ă àoăNhaă

vàăTâyăBană Nhaăchuy năsangătr ngă ăChâuă ÂuăvàăChâuăÁă[129, 130].ăSauăĎó,ăt ă
ChâuăÂu,ăcàăchua Ď

căchuy năsangăChâuăPhiănh ănh ngăng


iăth cădânăĎiăkhaiă

pháăl căĎ a này.ăTr

căkia,ăcàăchuaăĎ

h ăv iăcâyăcàăĎ căd

c,ăvì cóămàuăs căqu ăĎ pănênăcàăchua ĎưăĎ

c nh.ăMưiăĎ năn mă1750,ăcàăchuaăm iăĎ
th ăXVIII,ăcàăchua m iăb tăĎ uăĎ
chuaăĎ

căchoăr ngălàăcâyăcóăĎ căt ădo chúng cùngă
cătr ngănh ăcâyă

cădùngălàmăth căph mă ăAnh.ăCu iăth ăk ă

cătr ngă ăcácăn

căthu căLiênăXôăc .ă ăM ,ăcàă

cănh păvàoăt ănh ngăn mă1860ăvàăcùngăth iăgianănàyăcàăchuaăc ngăĎ

phátătri nă ăPháp.ăM tăs ănhàănghiênăc uăchoăr ngăcàăchuaăĎ
Namăt ăth iăgianăth cădânăPhápăchi măĎóngă[130].

că


căduănh păvàoăVi tă


21

1.1.2 ụ ngh a kinh t c a cơy cƠ chua
Càăchuaălàălo iăcâyătr ngăcóăgiáătr ăkinhăt ăcaoăĎ

cătr ngăr ngărưiătrênăth ă

gi i.ăTheoăs ăli uăth ngăkêăc aăFAOăn mă2014ăthìădi nătíchăvàăs năl

ngăcàăchuaă

trênăth ăgi iălàă4,83ătri uăhaăvàă162ătri uăt n [32].ăChâuăÁălàăkhuăv căĎ ngăĎ uăv ă
s năxu tăcàăchua,ăth ăĎ nălàăchâuăÂu.ăM ălàăn
tích gieoă tr ng.ă Trênă th ă gi i,ăcàă chuaă Ď

căĎ ngăĎ u c ăv ăn ngăsu tăvàădi nă

că s nă xu tă Ď ngă th ă hai, sauă khoaiă tây.ă

Trungă Qu că cóă di nă tíchă tr ngă càă chuaă l nă nh tă th ă gi iă (trênă 753ă ngànă ha),ă ti pă
theoălàă nă

ă(365ăngànăha),ăAnhă(300ăngànăha),ăAiăC pă(180ăngànăha),ăM ă(170ă

ngànăha)ăvàăAnhă(140ăngànăha).ă
V ăn ngăsu tă(t n/ha)ăĎ tăcaoănh tăph iăk ăĎ năM ă(66,5),ăti pătheoălàăHàăLană

(42,85),ăAnhă(37,76),ăAiăC pă(35,5),ăB ă(33,33),ăTrungăQu c (25,62) [4, 9]. ChâuăÁă
cóădi nătíchătr ngăl nănh ngăn ngăsu tăcònăth pă(23,8ăt /ha). N ngăsu tăcàăchuaătoànă
th ăgi iăkho ngă27,51ă t n/ha.ă ăVi tăNam,ăcàăchuaăĎ

cătr ngătrênă100ăn mănay,ă

di nătíchătr ngătr tăhàngăn m t ă15ă– 17ăngànăha, s năl

ngăĎ tă280ăngànăt n,ăbìnhă

quânăĎ uăng

iă3ăkg/n m,ăm cătiêuăth ăcàăchuaăc aăng

b ngă 1/5ă c aă ng

iă Trungă Qu că (16 kg/ng

iăVi tăNamăhi nănayăch ă

i/n m) [4, 9].ă Càă chuaă Ď

că tiêuă th ă

l nănh tă ăchâuăÂu,ăr iăĎ năchâuăÁ,ăB căM ăvàăNamăM .
Càăchuaăcóăth ădùngălàmăqu ăt

i,ăxào,ăn u,ăn

căgi iăkhát.ăCàăchuaăcònălàă


nguyênăli uăch ăbi năthànhănhi uăs năph mănh ăcàăchuaăcôăĎ c,ăn
t

ngăcàăchua,ăt

1.1.3 Dinh d

căqu ,ăn

căs t,ă

ngă t,ăcàăchuaăĎóngăh p.

ng trong qu cƠ chua

Càăchuaălàăcâyărauă năqu ăgiàuăvitamin,ăcarotene,ăaminoăacid,ăĎ
khoángă[133, 153].ăTheoăs ăli uăc aăVi năDinhăD

ngăvàămu iă

ngăn mă2007ă(b ngăphânătíchă

thànhăph năhóaăh căc aăVi năv ăsinhăd chăt ăB ăYăt ),ătrongă100ăgăcàăchuaăcóă94ăgă
n

c,ă 0,6ă gă protein,ă 4,2ă gă Ď

ng,ă 0,8ă gă ch tă x ,ă 0,4ă g tro, 12 mg canxi, 26 mg


photpho,ă1,4ămgăs t,ăcácălo iăvitamină -carotene (393ăµg/ă100ăg),ăvitaminăB1,ăB2,ă
PP,ă Că (40ă mg/ă 100ă g),ă vitamină Kă (7,9ă µg/ă 100ă gă )ă cungă c pă Ď
vitamin,ăch tăkhoángăd ăh păthuăgiúpăc ăth ăt ngăc
ch ngănhi mătrùng.

că 20ă kcal.ă Cácă

ngăkh ăn ngămi năd ch,ăphòngă


22

Cácăvitaminătrongăqu ăcàăchuaăkhôngăb ăm tăĎiătrongăquáătrìnhăch ăbi n,ăn uă
n

ngă[119].ăTrungăbìnhăkhiătiêuăth ă230ăgăcàăchuaăs ăĎápă ngăĎ

h ngăngàyăv ăvitamină CăĎ iăv iăng
khiătiêuăth ă100ămlăn

iătr

ngăthànhăvàă85%ăĎ iăv iătr ăem.ă Ho că

căépăcàăchuaăs ăĎápă ngăĎ

vitamin A. Càăchuaăcóătácăd ngăkíchăthíchăti tăraăn
tiêuăhóaăc aăc ăth ăĎ

că60%ănhuăc uă


că20%ănhuăc uăh ngăngàyăv ă
căb t,ăĎ ătr ăgiúpăchoăquáătrìnhă

căd dàng.ăTiêuăth ăcàăchuaăvàănh ngăs năph măcàăchuaăcóă

th ăgi m Ďángăk ănguyăc ăphátătri năungăth ăru t,ătr cătràngăvàăd ădàyă[136].
M tăs ăcôngătrìnhănghiênăc uăĎưăchoăth y,ăcàăchuaăcóătácăd ngăgi mănguyăc ă
m c m tăs b nhăungăth [54],ăgi mănguyăc ăungăth ăvú,ăungăth ăĎ iătràng,ăungăth ă
vòmăh ng, Ď căbi tălàăungăth ăti năli tătuy nă ănamăgi i [84]. Vì càăchuaăcóăch aă
lycopeneă(3.025ăµg/ă100g)ăvàă -carotene - Ďâyălàăch tăcóătácăd ngăch ngăôxyăhóaăr tă
quanătr ng [92],ăng năch năt ăbàoăungăth ,ăch ngăs ăhìnhăthànhăc cămáuăĎôngătrongă
thànhăm ch.ăM tăcu căkh o sátăc aăcácănhàăkhoaăh că anăM chătrênă220ăng
ôngă cóă ti nă s ă v ă b nhă timă m chă vàă nh ngă ng
nh ngăng

iăcóăhàmăl

iăĎànă

iă Ďànă ôngă kh eă m nhă choă th y,ă

ngălycopeneătrongăc ăth ăcaoăs ăítăcóănguyăc ăm căcácăb nhă

v ătimăm ch [86].
Cácăch tăôxiăhóaăm nhăĎ

căsinhăraăquaăho tăĎ ngătraoăĎ iăch t,ăch ăĎ ăsinhă

ho tăvàăch ăĎ ă nău ngăs ăph nă ngăv iăcácăthànhăph năc aăt ăbàoănh ălipit,ăprotein,ă

DNAăvàăgâyăh ăh ngănó.ăNh ngăh ăh ngănàyăth ăhi năvaiătròăquanătr ngătrongăvi că
gâyă raă cácă b nhă mưnă tínhă [62, 116].ă Vìă v y,ă ch ă Ď ă nă giàuă tráiă cây,ă rauă (g mă càă
chua)ă ch aă cácă ch tă ch ngă ôxiă hóaă nh ă vitamină E,ă vitamină C,ă carotenoidă vàă
polyphenolă giúpă ch ngă ungă th ,ă ch ngă v aă Ď ngă m ch,ă gi mă nguyă c ă m că b nhă
mưnătínhă[48, 54, 63, 131, 155].
M tăs ănghiênăc uăkhoaăh căc ngăĎưăch ngăminh,ăcàăchuaăcóătácăd ngăgi mă
huy tăáp,ăgi măl

ngăcholesterolătrongămáu,ăt ăĎóăs ăng năch năĎ

cătìnhătr ngăx ă

v aăĎ ngăm chăvàăcácănguyăc ăd năt iăĎ tăqu .ă
Theoăyăh căc ătruy n,ă năcàăchuaăcònăcóătácăd ngămátămáu,ă năĎ nhăgan,ăgi iă
nhi t,ăgi iăĎ c,ăr tăthíchăh păchoănh ngăng
huy tă áp,ă ng

iăb ăch yămáuăchânăr ng,ăng

iăb ăcaoă

iă cóă c ă th ă nóngă nhi t.ă Càă chuaă cóă tácă d ngă nângă caoă s că kh e,ă


23

phòngăng aăb nhăt tăcóăl iăchoăs căkh eăc aăm iăl aătu i.ăVìăv y,ătrongăch ăĎ ă nă
u ngăhàngăngàyăb nănênăs ăd ngăĎ uăĎ năcà chuaăĎ ăch ăbi nănhi uăd ngămónă n.ă
1.1.4 Nghiên c u v di truy n cơy cƠ chua
Daniell vàăcs.ă(2006)ăĎưăc ăb năhoànăthànhănghiênăc uăgi iămưătoànăb ăb ăgenă

l căl păcácăloàiăSolanum bulbocastanum, Solanum lycopersicum (càăchua)ătrongăĎóă
cóăphânătích,ăsoăsánhătrìnhăt ăgenăhaiăloàiănóiătrênăv iăm tăs ăloàiăkhácăcùngătrongă
h ăCàă(Solanaceae).ăK tăqu ănàyălàăc ăs ăgiúpăcácănhàănghiênăc uăcóăth ăthi tăk ă
trìnhăt ăDNAăvùngăgiápăranhă(flankingăregion)ăt

ngăĎ ngăv iăgenăl căl pă ăhaiăĎ uă

c aăgenăchuy n Ď ăchuy năgenăvàoăl căl păcàăchua.
G năĎây,ătrìnhăt ăb ăgenăcàăchuaălaiă“Heinză1706”ăĎ
t ănàyăĎ

căgi iămư,ănh ngătrìnhă

căt păh păl iăthànhă91ăkhungăĎ căm ,ăbaoăg mă760ămegabasesă(Mb)ăc aă

g nă900ăMbăb ăgen,ăĎ

căx pă ă12ănhi măs căth ăcàăchuaăv iăkho ngă34.727ăgenă

mưăhóaăprotein.ăH uăh tăcácăkho ngătr ngăĎ

căgi iăh nă ăvùngăg măcácătrìnhăt ă

l păl iăg nătâmăĎ ng.ăKhiăsoăsánhănh ngătrìnhăt ăb ăm t ho c s păx păl iăv iăcàăchuaă
hoangă d iă Solanum pimpinellifolium,ă choă th yă r ngă haiă b ă genă cóă s ă gi ngă nhauă
cao,ăch ăkhácăbi tă0,6%ănucleotide.ăGi aăcàăchuaălaiăvàăcàăchuaăhoangăd iăcóă60%ă
genăcóăs ăthayăĎ iăĎ ngăngh a,ăch ăkho ngă40%ăcóăs ăthayăĎ iăsaiăngh aăbaoăg măs ă
thayăĎ iă“stopăcodon”ăcóăvaiătròăquanătr ngăchoăch căn ngăgenă[125].ăNghiênăc uă
gi iă mưă nh ngă b ă genă nàyă giúpă Ď yă m nhă nh ngă nghiênă c uă v ă diă truy nă ch nă
gi ngăth căv t.ă

1.2 T ng quan v virus viêm gan (Hepatitis B virus - HBV) vƠ vaccine n đ

c

t th c v t
Virusă gâyă viêmă gană thu că chiă Orthohepadnavirus, h ă Hepadnaviridae,ă làă
nh ngă virusă cóă áiă l căv iăt ă bàoă gan.ă T ă bàoă Ďíchă màă virusă h
nhânălên và gâyăt năth

ngă t i, xâmă nh p,

ngăch ăy uălàăt ăbàoăgan.ăCácăvirusăviêmăganăĎ uăcóăt ăbàoă

Ďíchăchungălàăt ăbàoăgan,ănh ngăchúngăcóăc uătrúc,ăĎ

ngăxâmănh p và c ăch lây

truy n khácănhau.ăDoăv y,ăchoăĎ nănay,ăcácăvirusăviêmăganăchínhăĎ
lo iălàăA,ăB,ăC,ăD,ăEă[3, 5, 6, 7].

căchiaăraăn m


24

HBVăcóăkh n ngăt n t iăcaoătrongăĎi u ki n nhi tăĎ kh c nghi tăvàă mă

t.

Chúng cóăth t n t iă15ăn mă -20°C,ă24ăthángă -80°C,ă6ăthángă nhi tăĎ trong

phòng,ăvàă7ăngàyă 44°C.
1.2.1

ic

ng v virus viêm gan B (Hepatitis B virus ậ HBV)

N mă1970,ăBaruchăvàăc ngăs ăĎưăphátăhi năkhángănguyênăAustralia.ăSauăĎó,ă
khángă nguyênă Australiaă Ď
n mă1976ăĎ

că xácă Ď nhă làă khángă nguyênă b ă m tă c aă h tă virusă vàă

căg iălàăHBsAgă(Hepatitis B surface antigen) [3, 5, 6, 7].

Cóă haiă cáchă phână lo i HBV: ki u huy tă thanhă (Serotype)ă vàă ki u gen
(Genotype).

Hình 1.1 C uătrúcăkhôngăgianăc aăvirusăHBV [5, 6]
- Ki u huy t thanh: Cóăb n y u t mangătínhăkhángănguyênăchínhăĎ
bi t v iă khángă th nh s nh n di nă cácă epitopeă khácă nhauă Ď

căphână

că Ď nh d ng b i

khángănguyênăb m t - HBsAg. T t c cácăsubtypeănàyăĎ u ch a y u t quy tăĎ nh
„a‟,ăĎ

cămưăhóaăb iăcácăaminoăacidăt 124ăĎ n 147. S khácăbi t gi aăcácăsubtypeă


làădoăy u t quy tăĎ nhăd/yăvàăw/rădoăs thayăĎ i t KăthànhăRăt iăaminoăacidă122ăvàă
160. Y u t ph Ď

că thêmă vàoă Ď phână bi t 4 ki u serotype lo iă aywă vàă 2ă ki u

adw.ă Nh ă v y, hi nă cóă 8ă ki u huy t thanh: adr, ayr, ayw1, ayw2, ayw3, ayw4,
adw2,ăadw4.ăCònăn uăthêmăy u t quy tăĎ nh q+/q- Ď
thanhăadrăthìăHBVăcóă9ăki u huy t thanh [141].

cătìmăth y trong ki u huy t


25

- Ki uăgen:ăVirusăcóă8ăki u gene (A-H) d aăvàoăs khácănhauătrênă8%ăc aătoànă
b b gen c a HBV ho că4%ătrìnhăt c a SHBs. Ki u gen c aăHBVăphânăb

cácă

châuăl căvàăvùngălưnhăth khácănhauăthìăkhácănhau.ăS khácă bi t gi aăcácăgenăcóă
nhă h

ngă Ď nă tìnhă tr ng b nh,ă cácă bi n ch ngă vàă kh n ngă Ďápă ng v iă ph

ngă

phápăĎi u tr vàăvaccine.
B ng 1.1 M iă liênă quană gi aă ki uă huy tă thanhă (serotype)ă vàă ki uă genă (genotype)ă
[93]

Ki uăgen

Huy tăthanhăHBV

HBV
A

ayw1, adw2

B

ayw1, adw2

C

ayr, adrq+, adrq-, adw2

D

ayw2, ayw3

E

ayw4

F

adw4

1.2.2 C u trúc c a HBV

HBVălàăvirusămangăDNAăhaiăs iăkhôngăkhépăkín,ăcóătr ngăl
x 106 Dalton,ăĎ
th

ngăphânăt làă2

căc uăt oăb iă3200ănucleotid. V ăcapsidăcóăhìnhăkh i Ď iăx ng,ăkíchă

căkho ngă27ănm,ăv ngoàiădàyăkho ngă7ănmăĎ

căc uăt oăb iă3ăproteinăc uătrúc:ă

proteinăl n,ăproteinătrungăbìnhăvàăproteinănh ;ăv ăbaoăt oăchoăvirusăcóăhìnhăc uăĎ

ngă

kínhă42ănmă(Ďóălàăh tăDane).
Haiă s iă DNAă b ă genă cóă chi uă dàiă khácă nhau: Chu iă dàiă n mă ngoàiă cóă tínhă
c căâmă(-),ăt oănênăm tăvòngăliênăt căcóăchi uădàiăc ăĎ nhă3200ănucleotideăvàăg nă
nh ăkhépăkín,ămưăhóaăchoăcácăthôngătinădiătruy năc a virus; chu iăng n n mătrongă
cóătínhăc căd

ngă(+),ăchi uădàiăthayăĎ iăt ă50-100%ăchi uădàiăb gen. DNAăc aă

HBVăkhôngăph iăxo nă2ăvòngănh ăcácăDNAăc aăcácăvirusăkhácă màăch ăxo nă m tă