ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
&
NGUYỄN THỊ HUYỀN NGỌC

TẠO và TINH SẠCH KHÁNG THỂ THỎ
ĐẶC HIỆU FcγNGƯỜI CỘNG HỢP FITC
Chuyên ngành: Sinh Học Thực Nghiệm (hướng Hóa Sinh)
Mã số: 60 42 30

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học:
PGS.TS.Nguyễn Lê Trang

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – NĂM 2010


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành luận văn này, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ, động
viên của các thầy cô, gia đình, bạn bè.
Đầu tiên, Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến thầy Nguyễn Lê
Trang, thầy đã hết lòng hướng dẫn, chỉ bảo, động viên và tạo mọi điều kiện thuận
lợi cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Thầy là người dạy cho tôi cách
nhìn về cuộc sống, học tập, nghiên cứu; động viên tôi trong lúc khó khăn nhất của
cuộc sống. Tôi cảm thấy mình may mắn và hạnh phúc khi được thầy hướng dẫn,
chỉ dạy.
Tôi xin chân thành cảm ơn GS. Phạm Hoàng Phiệt, thầy đã tạo mọi điều
kiện thuận lợi, để tôi có thể thực hiện và hoàn thành đề tài này tại phòng Y Sinh
Học trường ĐH Y Dược thành phố Hồ Chí Minh.
Tôi xin cảm ơn tới các thầy cô tại phòng Y Sinh Học, khoa Miễn Dịch Sinh Lý

Bệnh, đặc biệt em cảm ơn Cô An, Chị Thanh, Chị Chi Lan, Chị Tuyết luôn là
người động viên em trong quá trình thực hiện đề tài.
Tôi xin chân thành cảm ơn chị ThS. DS. Nguyễn Thị Nguyệt Thu và toàn thể
phòng Miễn dịch học, Viện Pasteur thành phố Hồ Chí Minh. Các chị đã tạo mọi
điều kiện thuận lợi để tôi có thể thực được đề tài này.
Tôi xin cảm ơn các bạn trong lớp cao học K15, cảm ơn Châm, Hải, Quỳnh
Hương, chị Tuyết Hương, Chiêu những người động viên giúp đỡ tôi khi tôi gặp
khó khăn. Cám ơn các bạn Trần Thanh Phong, Mai Quốc Khánh luôn là giúp đỡ,
động viên tôi.
Cuối cùng, xin cảm ơn gia đình tôi đã luôn nguồn động viên lớn nhất đối với
tôi. Con xin cảm ơn Ba, Mẹ, người luôn mong muốn con có những kết quả tốt nhất
trong học tập và trong cuộc sống.


Mục lục

MỤC LỤC
1.

ĐẶT VẤN ĐỀ ......................................................................................................... 1

2.

TỔNG QUAN VỀ SINH HỌC CỦA KHÁNG THỂ .......................................... 2
2.1.

Lịch sử về sự phát hiện ra kháng thể ............................................................. 2

2.1.1. “Viên đạn thần” và miễn nhiễm dịch thể.................................................. 2
2.1.2. Kỹ thuật điện di cho biết kháng thể là protein globulin γ ....................... 4

2.1.3. Xác định cấu trúc phân tử kháng thể........................................................ 7
2.1.3.1. Cấu trúc ba chiều và tổ chức thành vùng của phân tử IgG ............. 10
2.1.3.2. Cấu trúc không gian của biểu vị ........................................................ 15
2.1.3.3. Tính đặc hiệu và ái lực giữa cận vị và biểu vị .................................. 16
2.1.3.4. Các loại KT trong cơ thể..................................................................... 19
2.2.

Sự phát triển của các tế bào bạch huyết B ................................................... 20

2.2.1. Các tế bào bạch huyết B ........................................................................... 21
2.2.2. Các vật liệu di truyền của KT và hoạt động của chúng ........................ 22
2.2.2.1. Các gen chuỗi nặng và chuỗi nhẹ...................................................... 22
2.2.2.2. Cơ chế tổ chức, sắp xếp gen của chuỗi nặng và chuỗi nhẹ .............. 24
2.2.3. KN đặc hiệu hoạt hóa và sự nhân dòng .................................................. 29
2.2.4. Tế bào B có hoạt động thực bào và sự hỗ trợ của tế bào T ................... 34
2.3.

Kháng thể đa dòng ......................................................................................... 38

2.3.1. Ái lực của KT đối với KN và hằng số cân bằng ..................................... 39
2.3.2. Tạo kháng thể đa dòng theo lý thuyết và thực tế ................................... 40
2.3.3. Kháng thể đa dòng trong nghiên cứu sinh học và ứng dụng chẩn
đoán ....................................................................................................................... 47
3.

VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP ........................................................................... 49
3.1.

Vật liệu ........................................................................................................... 49


3.1.1. Động vật thí nghiệm và huyết thanh ....................................................... 49
3.1.2. Hóa chất ..................................................................................................... 49
3.1.3. Trang thiết bị ............................................................................................. 55


Mục lục

3.2.

Phương pháp .................................................................................................. 56

3.2.1. Tinh sạch IgGngười từ huyết thanh ........................................................... 56
3.2.2. Tạo kháng nguyên Fcγ người ................................................................... 57
3.2.3. Tạo kháng huyết thanh trên thỏ .............................................................. 60
3.2.4. Tạo cột sắc ký ái lực gắn IgG người và Fcγ người ........................................ 64
3.2.5. Tinh chế kháng thể thỏ đặc hiệu Fcγngười ................................................ 65
3.2.6. Cộng hợp kháng thể thỏ với FITC .......................................................... 66
3.2.7. Phương pháp xét nghiệm kháng thể kháng nhân – ANA
(antinuclear antibody) ......................................................................................... 68
4.

KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN .................................................................................... 72
4.1.

Nguyên liệu .................................................................................................... 72

4.1.1. Thu hồi IgGngười từ huyết thanh ............................................................... 72
4.1.2. Tinh sạch Fcγngười ...................................................................................... 74
4.2.


Tạo kháng huyết thanh thỏ ........................................................................... 77

4.2.1. Kiểm tra đáp ứng mẫn cảm ..................................................................... 77
4.2.2. Thu kháng huyết thanh thỏ ...................................................................... 79
4.3.

Sắc ký ái lực để tinh chế IgG thỏ đặc hiệu với Fcγngười ............................... 79

4.3.1. Sắc ký ái lực Sepharose–Fcγngười .............................................................. 79
4.3.2. Sắc ký ái lực Sepharose – IgGngười ........................................................... 80
4.3.3. Điện di kiểm tra độ tinh sạch của KT thỏ sau khi qua hai cột
SKAL 81
4.4.

Cộng hợp IgGthỏ đặc hiệu với Fcγngười với FITC .......................................... 82

4.4.1. Tỉ lệ cộng hợp FITC vào IgGthỏ ............................................................... 82
khángFcg
4.4.2. Kết quả sử dụng FITC– IgGtho
và khả năng chẩn đoán .................... 84

5.

KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ ...................................................................................... 85
5.1.

Kết luận .......................................................................................................... 86

5.2.


Đề nghị ........................................................................................................... 86

PHỤ LỤC ........................................................................................................................ i
PHỤ LỤC 1: THÔNG TIN BỆNH NHÂN .................................................................... i


Mục lục

PHỤ LỤC 2: SẮC KÝ ĐỒ SKAL ................................................................................. ii
PHỤ LỤC 3: CỘNG HỢP FITC ..................................................................................v


Danh mục Bảng biểu – Hình ảnh

DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 3.1: Thành phần gel SDS−PAGE ........................................................................ 52
Bảng 3.2: Tương tác giữa các phân tử Ig người (thỏ) đối với protein A ...................... 58
Bảng 3.3: Quy trình gây miễn nhiễm trên một con thỏ ................................................. 62
Bảng 4.1: Thu hồi IgG từ huyết thanh người lành ........................................................ 72
Bảng 4.2: Kết quả thu hồi protein sau khi qua SKL Sephacryl S200 HR .................... 73
Bảng 4.3: Lượng Fcγ người thu hồi .............................................................................. 75
Bảng 4.4: Hàm lượng protein thu được sau khi cột sắc ký Sepharose – Fcγngười.......... 79
Bảng 4.5: Hàm lượng protein thu được sau khi cột sắc ký Sepharose – IgGngười ......... 80
Bảng 4.6: Sản phẩm cộng hợp FITC ............................................................................. 83
Bảng 4.7: Kết quả xét nghiệm ANA của thuốc thử DAKO .......................................... 84
Bảng 4.8: Kết quả xét nghiệm ANA bằng “KT của công trình nghiên cứu” ................ 85
DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 2.1: Hình Paul Ehrlich & Hata Sahachiro .............................................................. 2
Hình 2.2: Miêu tả thuyết “các nhóm hóa chất” của Erhlich ............................................ 4
Hình 2.3: Hình ảnh điện di huyết thanh của người bình thường và bệnh nhân u. .......... 5

Hình 2.4: “Viên đạn thần” của công nghệ nano ứng dụng trong ngành dược ................ 6
Hình 2.5: Cấu trúc của IgG của thỏ cho thấy sự sắp xếp khá phức tạp của những
liên kết −S−S− ở trong và giữa chuỗi nặng hoặc chuỗi nhẹ .................................. 10
Hình 2.6 : Cấu trúc bậc bốn của phân tử immunoglobulin ........................................... 12
Hình 2.7: Vùng siêu biến động (HRVs) của chuỗi nặng và chuỗi nhẹ ......................... 13
Hình 2.8: Các loại lực liên kết giữa KT – KN ............................................................... 15


Danh mục Bảng biểu – Hình ảnh

Hình 2.9: Những công trình dùng tia X để xác định cấu trúc chi tiết tinh thể phức
hợp cận vị - biểu vị của KT kháng lysozyme......................................................... 17
Hình 2.10: Tổ chức các gen lambda và kappa người .................................................... 23
Hình 2.11: Tái sắp xếp, phiên mã, chế biến lại RNA, dịch mã của gen kappa ............. 25
Hình 2.12: Minh họa tổ chức gen của chuỗi nặng ......................................................... 25
Hình 2.13: Mô hình miêu tả quá trình tái sắp xếp DNA, quá trình phiên mã chuỗi
H ............................................................................................................................. 28
Hình 2.14: Phiên mã chuỗi nặng H ............................................................................... 29
Hình 2.15: Hình thái tế bào B ........................................................................................ 30
Hình 2.16: Siêu biến đổi thể của tế bào B tại hạch ngoại vi ......................................... 33
Hình 2.17: Tế bào T hỗ trợ hoạt hóa tế bào B ............................................................... 35
Hình 2.18: Tế bào APC trình diện KN cho tế bào T giúp phát triển sự miễn nhiễm
để thích nghi ........................................................................................................... 37
Hình 2.19: APC (tế bào trình diện kháng nguyên) nhận biết MTB (vi khuẩn lao) ....... 41
Hình 2.20: Các TLR và phối tử của chúng .................................................................... 43
Hình 2.21: Dụng cụ tạo huyền dịch ............................................................................... 46
Hình 3.1: Phản ứng hóa học giữa protein và thạch CNBr hoạt hóa .............................. 64
Hình 3.2: Cấu trúc phân tử FITC................................................................................... 67
Hình 3.3: Nguyên lý miễn dịch huỳnh quang ............................................................... 69
Hình 3.4: Tấm kính sử dụng cho hóa mô miễn dịch ..................................................... 70

Hình 4.1: Sắc ký đồ Sephacryl S200 HR ...................................................................... 73
Hình 4.2: Kết quả điện di SDS-PAGE 12% IgGngười..................................................... 74
Hình 4.3: Kết quả điện di tinh chế Fcγ người trên gel SDS – PAGE 12% ...................... 76


Danh mục Bảng biểu – Hình ảnh

Hình 4.4 : Đáp ứng với KN Fcγ người của HT thỏ sau mẫn cảm .................................... 78
Hình 4.5: Kiểm tra hiệu giá của huyết thanh thỏ đối với Fcγ người sau đáp ứng mẫn
cảm ......................................................................................................................... 78
Hình 4.6: Điện di KTthỏ (qua SKAL)............................................................................. 82


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
ANA

:Kháng thể kháng nhân (Antinuclear antibody)

APC

:Tế bào trình diện KN (Antigen Presenting Cell)

APS

:Ammonium persulfate

CDR

:Đoạn bổ sung quyết định
(Complementarity-determining regions)


Chuỗi H

:Chuỗi nặng (heavy chain)

Chuỗi L

:Chuỗi nhẹ (light chain)

Da

:Dalton

Dd

:Dung dịch

ddH2O

:Nước cất hai lần (double distilled water)

DNA

:Deoxyribonucleic acid

Đoạn J

:Đoạn nối (Join)

Đoạn L


:Đoạn dẫn đầu (Leader)

DTT

:Dithiothreitol

EDTA

:Ethylene Diamine TetraAcetic Acid

Fab

:Fragment antigen binding (phân mảnh gắn KN)

Fc

:Fragment crystallisable (phân mảnh kết tinh)

FITC

:Fluorescein isothiocyante

HVR

:Vùng siêu biến động (Hypervariable regions)

Ig

:Immunoglobin (globulin miễn)


KDa

:Kilo Dalton

KN

:Kháng nguyên

KT

:Kháng thể

MDHQGT

:Miễn dịch huỳnh quang gián tiếp

MN

:MN

NST

:Nhiễm sắc thể


RNA

:Ribonucleic acid


S A.S

:Dung dịch ammonium sulfate bão hòa (Saturated
Ammonium Sulfate – Ammonium sulfate 100%S)

SDS

:Sodium Dodecyl Sulfate

SDS – PAGE

:Sodium

Dodecyl

Sulfate

–

Polyacrylamide

Electrophoresis
-SH

:Sulfhydryl

TEMED

:N, N, N’, N’– tetramethylenediamine


Tris

:Tris (hydroxymethyl) aminomethane

Vùng C

:Vùng ổn định (Constant)

Vùng V

:Vùng biến động (Variable)

β-MeSH

:β-mercaptoethanol

Gel


Đặt vấn đề

Luận văn Thạc sĩ Sinh học

1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Phương pháp tạo nên kháng thể (KT) đặc hiệu với một cấu trúc mong muốn
ngày càng trở nên phổ biến để có thuốc cho các xét nghiệm hoặc điều trị.
Tại phòng xét nghiệm tại Bệnh viện Đại học Y Dược tp. HCM, đòi hỏi phải có
KT súc vật đặc hiệu với KT người (IgGngười) để xác định sự có mặt của KT kháng
nhân (antinuclear antibody - ANA) ở huyết thanh bệnh nhân tự miễn. KT súc vật
thường sử dụng là thương phẩm mua từ nước ngoài với giá thành cao, hơn nữa

không chủ động về nguồn cung cấp. Ngoài ra, nhu cầu KT súc vật đặc hiệu với
IgGngười thực tế rất lớn vì để xét nghiệm các bệnh nhiễm khuẩn khác.
Trong lúc đó, huyết thanh người đã được xét nghiệm là âm tính đối với các
bệnh truyền nhiễm nguy hiểm (HIV, HBV, HCV) hằng ngày thường được loại bỏ.
Trên thực tế thuận lợi về mặt nguyên vật liệu này, chúng tôi muốn từ nguyên liệu
sẵn có để chế tạo Fcγngười sử dụng như là KN, dùng để gây miễn dịch cho thỏ để có
kháng huyết thanh đặc hiệu với IgGngười làm thuốc thử để thay thế hàng ngoại
nhập.
Khi có kháng huyết thanh thỏ, IgG thỏ được tinh chế và tạo cộng hợp IgG –
FITC (flourecein isothicyanate) làm thuốc thử huỳnh quang đặc hiệu với KT
người.

1


Tổng quan tài liệu

Luận văn Thạc sĩ Sinh học

2. TỔNG QUAN VỀ SINH HỌC CỦA KHÁNG THỂ
2.1.

Lịch sử về sự phát hiện ra kháng thể

2.1.1. “Viên đạn thần” và miễn nhiễm dịch thể
♦ Tác nhân: Từ năm 1870, Louis Pasteur (1822 – 1895) đã chứng minh sự có
mặt của vi sinh và truyền bá các phương pháp vệ sinh và tiệt trùng. Tiếp theo
thuyết về các mầm bệnh (“La théorie des germes”, 1878) mà Pasteur đã nêu lên,
các nghiên cứu tập trung chủ yếu vào việc phát hiện các tác nhân gây bệnh; Robert
Koch (1843 – 1910) đã xác minh tác nhân gây bệnh lao phổi. Nhưng cái gì tiêu

diệt tác nhân gây bệnh để bệnh nhân được hồi phục vẫn còn là điều bí ẩn. Chưa ai
có khái niệm gì về khả năng chống khuẩn của các thành phần trong cơ thể, trong
huyết thanh.
♦ Hóa trị liệu: nhưng ở huyết thanh của bệnh nhân đã hồi phục được nhận thấy
có thành phần nào đó có khả năng kết tủa với khuẩn đã gây bệnh và điều đó
riêng biệt cho từng loại khuẩn. Cũng vào thời gian đó, Bs P. Erhlich cùng học trò
Sahachiro nghiên cứu thành công chế ra một thuốc gọi là Salvarsan, rất hiệu quả
để điều trị bệnh giang mai, từ đó P. Erhlich đã được coi là cha đẻ của hóa trị liệu
(chemotherapy).

Dr Paul Ehrlich & Dr HataSahachiro
Trích từ Wikipedia

Hình 2.1: Hình Paul Ehrlich & Hata Sahachiro

2


Tổng quan tài liệu

Luận văn Thạc sĩ Sinh học

♦ Từ hóa trị liệu đến huyết thanh trị liệu (miễn nhiễm thụ động): Vốn là một
thầy thuốc, nhưng Erhlich có sở trường dùng các hóa chất có màu làm thuốc
nhuộm để nghiên cứu cấu trúc, tổ chức các mô, sự hiện diện của các vi sinh.
Erhlich biết rõ sự cần thiết phải dùng mỗi thuốc nhuộm riêng cho một loại tổ chức,
cho một loại vi sinh. Bản thân Erhlich cũng đã mắc bệnh lao (khi ở Ai Cập), có
hợp tác với R. Koch. Erhlich cũng có tham gia nghiên cứu cùng với Emil Adolf
von Behring (1854 – 1915) trong việc chế tạo kháng huyết thanh khác loài (trên
ngựa) để điều trị bệnh bạch hầu (diphtheria) ở trẻ em. Vào thời điểm đó Behring

và Shibasaburo Kitasato (1853 – 1931) cũng nghiên cứu về tác nhân của bệnh uốn
ván (Clostidium tetani) và từ các triệu chứng của bệnh, hiểu được nguyên nhân
gây bệnh là do một độc tố (toxin); do đó huyết thanh các nhà khoa học này tạo nên
đã được gọi là chất “kháng độc tố” (antitoxin). Erhlich đã nhận thấy các huyết
thanh tạo nên ở động vật chỉ trung hòa riêng biệt tác nhân đã sử dụng để tạo được
tính miễn nhiễm, đặc tính mà sau này được gọi là tính đặc hiệu của huyết thanh;
đặc tính phản ứng đó của huyết thanh được Erhlich quan niệm là tương đương với
đặc tính thấy ở các phản ứng của các hóa chất và các màu nhuộm ông đã sử dụng
để kết hợp với những nhóm hóa học có trên vi khuẩn tác nhân, hoặc trên các độc
tố.
Từ suy nghĩ đó, tuy chưa biết được bản chất của “antitoxin„ là gì, nhưng
Erhlich đã đưa ra một góc nhìn lý thuyết mà giá trị thực tiễn của nó vẫn còn
nguyên đến ngày nay, trong cơ chế liên kết giữa KT và KN.
Thuyết các nhóm hóa chất (side-chain theory) và các “viên đạn thần„:
Erhlich cho rằng nếu có một thành phần nào đó trong huyết thanh (đã mang tính
miễn nhiễm) chỉ liên kết với vi sinh cần tiêu diệt mà không làm hại gì đến các tế
bào hay thành phần khác của thể chủ, đó phải là “những viên đạn thần„(“magic
bullets”).

3


Tổng quan tài liệu

Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Ehrlich's side chain theory of immunity
Paul Ehrlich: a hundred years of chemotherapy - 1891-1991
Anthony S Travis, in The Biochemist 13(5).


Hình 2.2: Miêu tả thuyết “các nhóm hóa chất” của Erhlich
Vấn đề đối với sinh học ngày nay là biết được làm sao cơ thể động vật có thể
làm ra các “viên đạn” thần đó? Từ kháng thể (antibody) sử dụng ngày nay có nội
dung kháng là chống lại (anti) và thể có nghĩa là do chính cơ thể (body) sinh ra,
tương tự như từ “antitoxin” nêu trên. Từ kháng nguyên (antigen) trong đó kháng
có nghĩa là KT, nguyên có nghĩa là nguyên nhân làm sinh ra (genere) KT.
2.1.2. Kỹ thuật điện di cho biết kháng thể là protein globulin γ
[7][7][16][17][22]
Gần 40 năm sau khi hóa trị liệu và ý tưởng “viên đạn thần” ra đời, Arne
Tiselius và Elvin A. Kabat (1939) phát minh kỹ thuật điện di và chứng minh các
KT thuộc thành phần globulin − g của huyết thanh. Hình 2.2 trên đây cho thấy
Erhlich đã minh họa ý tưởng lý thuyết về các nhóm hóa của KT đặc hiệu, liên kết
với các nhóm hóa đích.

4


Tổng quan tài liệu

Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Trich từ: Kimball's Biology Pages

Hình 2.3: Hình ảnh điện di huyết thanh của người bình thường và bệnh nhân u.
Hình 2.3 cho thấy điện di đồ của các huyết thanh bình thường (normal), của ba
bệnh nhân u bạch huyết bào hay còn gọi là u tủy; huyết thanh bệnh nhân có một
dòng tế bào bạch huyết tương u (plasmacytoma) “đơn độc” nhân lên cách không
bình thường và tiết ra nhiều IgG (immunoglobulin – G). Tiếp theo là của một bệnh
mang dòng tế bào tiết ra nhiều IgM (immunoglobulin – M), của một bệnh nhân
khác mang dòng tế bào tiết ra nhiều IgA (immunoglobulin – A). Các protein đó

thường được gọi là các “paraproteins” (“cận” protein), gần như (do tổng hợp từ tế
bào cũng là dòng bạch huyết B) nhưng không phải là Ig hay KT bình thường (tạo
nên qua đáp ứng miễn). Đối với huyết thanh người lành, tỷ lệ các globulins − g
nhận thấy là ít; tỷ lệ đó sẽ cao hơn đối với người khi bị nhiễm khuẩn, với vết ở
vùng các globulin − g nhòe, rộng hơn, chứ không rõ nét như thấy ở các bệnh nhân
u tủy. Hình 2.4 bên dưới cho thấy ảnh hưởng của tư tưởng “viên đạn thần” đến
dược học ngày nay.

5


Tổng quan tài liệu

Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Hình 2.4: “Viên đạn thần” của công nghệ nano ứng dụng trong ngành dược
(Viên đạn thần trong kỹ thuật nano: phác họa cách phân phối dược chất đề nghị. (a) Bề mặt của
nang nhộng “nano” cần được chức năng hóa để hoạt động với thụ quan hóa học, và các viên
nhộng chứa dược chất muốn dùng. (b) Đầu cho dược chất vào được đóng lại. (c) Thuốc uống vào
được các viên nhộng “nano” đưa tới đúng vị trí đích nhờ nhóm chức trên mề mặt. (d) Tế bào nội
bào hóa các viên nhộng nano ví dụ qua các thụ quan trung gian của hoạt động nội bào hóa (ẩm /
thực). (e) Nắp đóng được mở ra hoặc nang bị tiêu hóa ở nội bào. (f) Các phần tử dược thoát ra.)

Những điều vừa nêu muốn nói lên hai điểm cần ghi nhận:
Œ Trong máu của mỗi người, có nhiều dòng (đa dòng) tế bào bạch huyết B
tiết ra nhiều phân tử KT khác nhau.
• Các “kháng thể” tiết ra từ một dòng tế bào bạch huyết u được coi là đơn
dòng do có tính đồng nhất, chúng đã được biết trước khi có kỹ thuật tạo tế bào lai
(hybridoma) để sản xuất “vĩnh viễn” KT đơn dòng / đơn clôn. [22]


6


Tổng quan tài liệu

Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Các tế bào u (myeloma) là những tế bào bệnh lý; với câu hỏi sau đây vào thời
trước vẫn chưa có câu trả lời dứt khoát: mỗi tế bào bạch huyết B có thể tiết ra
nhiều loại phân tử KT có tính đặc hiệu khác nhau hay chỉ một loại KT nhận biết
một cấu trúc phân tử nhất định? Tế bào lai vừa nêu trên, giữa một tế bào u [đã
chọn là không tiết ra KT] với một tế bào bạch huyết B bình thường tiết KT, đã cho
biết cách thuyết phục rằng mỗi tế bào bạch huyết B chỉ cho một loại KT đồng
nhất.
Các tế bào lai tạo nên thường cho KT chuột, với lượng giới hạn hơn lượng các
KT đơn dòng người có được từ các bệnh nhân u tủy. Lượng vật liệu từ người đủ để
cho phép thực hiện những công trình xác định cấu trúc của phân tử KT, dù chưa có
kỹ thuật nhạy cảm cao như ngày nay. Ngoài các mẫu “cận” globulin miễn đồng
nhất thu từ bệnh nhân, các globulin miễn có tính đặc hiệu với một KN từ ngựa hay
thỏ cũng đã được sử dụng trong nghiên cứu cấu trúc của các “viên đạn thần”.
2.1.3. Xác định cấu trúc phân tử kháng thể [7][17] [26][27]
Để nhận thức được mối liên quan giữa chức năng của KT [như đã cảm nhận
qua hoạt động của các “kháng độc tố” (antitoxin)] và cấu trúc của protein động vật
này, đã tốn rất nhiều công lao qua nhiều công trình kéo dài từ những năm 1950
đến 1990 và tiếp tục đến ngày nay để hiểu rõ hơn về cơ chế sinh học tạo ra tính
đặc hiệu cho KT. Những công trình trong lĩnh vực này khởi sự với vật liệu là các
“cận” KT người như vừa trình bày.
Vào những năm đầu của thập niên 1950, cũng đang khởi công cách rất sinh
động những nghiên cứu hóa sinh di truyền, tìm hiểu về phiên mã, dịch mã các men
(enzyme) ở vi sinh, vi nấm. Phía này đã tung ra thuyết “một gen - một protein” và

sau đó được điều chỉnh lại là “một gen - một polypeptide”, khi phát hiện các
“intron”, “exon” và cơ chế “splicing” (cắt nối). Nêu lên những điều đó để thấy tính
hấp dẫn vào những ngày khai sinh của “sinh học phân tử” (molecular biology),
cũng như khi hiểu được cơ chế sinh tính “đa dạng sinh học” ở trình tự của vùng
biến động trên phân tử KT, sẽ đề cập sau.
7


Tổng quan tài liệu

Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Để xác minh cấu trúc phân tử của KT, lúc khởi điểm có hai cách đề cập vấn đề
đã được thực hiện:
- Cách 1: sử dụng một men khá đặc hiệu với liên kết peptide để thủy phân
cách giới hạn phân tử Ig. Vào năm 1950 R.R. Porter (1917–1985) đã sử dụng
papain[27][28]; tiếp đó vào năm 1960 Nisonoff (1923–2001) dùng pepsin[26].
- Cách 2: một cách đề cập khác lại không động đến các liên kết peptide,
nhưng lại sử dụng b-mercaptoethanol để khử các liên kết (-S-S-) disulfide trong
phân tử (G. Edelman).
- Cùng lúc đó, các kỹ thuật siêu ly tâm, điện di và các loại sắc ký đã được sử
dụng để xác định các đặc tính của các mảnh phân tử so với phân tử nguyên.
Kết quả đã cho biết papain cắt phân tử globulin-g thành ba mảnh, hai mảnh
như nhau:
- Mỗi mảnh có trọng lượng lúc ban đầu xác định là 40kDa và sau được chỉnh
lại là 50–55kDa, có khả năng liên kết với KN đích; hai phần đó của phân tử ngày
nay được quen gọi là Fab (fragment, antigen-binding).
- Mảnh còn lại với trọng lượng phân tử “80kDa”, có tính rất dễ kết tinh
(critallise) nên đã được gọi là phần Fc (fragment, critallise) của KT, trọng lượng
phân tử nguyên được cho là “188kDa”.

Cả ba phần đã được cho là có tổ chức sợi polypeptide cuộn lại một cách chặt
chẽ, do đó khó cho papain phân hủy ở những vị trí khác. Sau lại trọng lượng phân
tử IgG được xác định là 150 – 160kDa.
Pepsin lại cắt IgG thành hai mảnh:
- Một mảnh Fc nhỏ.
- Mảnh lớn có đặc điểm là còn có khả năng kết tủa với KN của nó, do mảnh
này còn đủ hai vùng tổ chức (paratope, cận vị) để liên kết vào biểu vị (epitope) của
KN, ngày nay phần này được gọi là F(ab’)2.
8


Tổng quan tài liệu

Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Còn b-mercaptoethanol chỉ khử các liên kết disufide; sự xử lý IgG với hóa
chất này đã cho biết thành phần của phân tử gồm hai loại chuỗi polypeptide, một
dài được gọi là chuỗi nặng (H-heavy, 50kDa) và chuỗi kia ngắn hơn gọi là chuỗi
nhẹ (L-ligth, 25kDa).
Những kết quả thử nghiệm trên cùng với những nghiên cứu về trình tự của
những vùng “ổn định” của phân tử IgG đã cho thấy một hình ảnh khá rõ về cấu
trúc phân tử mà vào năm 1972, Porter đã trình bày như thấy ở Hình 2.5 bên dưới.
Phần “ổn định” mang những chức năng để KT hoạt động phối hợp cùng với
các thành phần khác, đặc biệt là các tế bào của hệ thống miễn nhiễm, kể cả với tế
bào B sản xuất KT, để điều tiết, khi hết nhiễm thì tế bào B không cần tiếp tục sản
xuất, hay khi tái nhiễm cần sản xuất trở lại (cơ chế hoạt hóa và cơ chế dung nạp).

9



Tổng quan tài liệu

Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Trích từ:

Hình 2.5: Cấu trúc của IgG của thỏ cho thấy sự sắp xếp khá phức tạp của những
liên kết −S−S− ở trong và giữa chuỗi nặng hoặc chuỗi nhẹ
2.1.3.1. Cấu trúc ba chiều và tổ chức thành vùng của phân tử IgG
[8][17][19][32]
Để biết rõ hơn cấu trúc của KT, các công trình xác định trình tự axít amin (a.a)
và vị trí của một số nhóm đường liên kết trên phân tử IgG của thỏ và của người
vẫn tiếp tục kiên trì. Nhưng để nhận thức hoạt động của loại sinh phân tử này,
cách chi tiết hơn và đặc biệt ở dạng nguyên, phải cần đến các phương pháp hóa lý.
Vào những năm sau 1970, những kỹ thuật dùng tia X để xác định cấu trúc tinh
thể trong thế liên kết giữa KT với những đoạn peptide giới hạn đã được thực hiện;
tiếp theo đó và còn tiếp tục hiện nay hai kỹ thuật khác cũng đã tham gia là kỹ thuật
cộng hưởng từ hạt nhân (NMR, nuclear magnetic resonance) và cộng hưởng spin
điện tử (ESP, electron spin resonance).

10


Tổng quan tài liệu

Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Vào năm 1977, hình ảnh ba chiều xác minh được của phân tử IgG là như nêu
ở Hình 2.6 [13]. Cấu trúc bậc bốn của glycoprotein này được xác minh, tổ chức
thành 12 vùng (12 domains).

Phần Fc cũng như hai phần Fab mỗi phần gồm bốn vùng. Phần Fc gồm hai
vùng CH2 và hai vùng CH3; xen kẽ giữa hai vùng CH2, có những nhóm đường liên
kết.
Mỗi phần Fab gồm hai vùng ổn định của chuỗi nặng (CH1) và của chuỗi nhẹ
(CL1), hai vùng biến động của hai chuỗi nặng (VH) và nhẹ (VL).
Cấu trúc các vùng CH2 mang chức năng phối hợp hoạt động với một protein
dịch thể khác của hệ miễn nhiễm gọi là bổ thể (complement), từ có nghĩa là bổ trợ
hoạt động của KT. Các vùng CH3 có cấu trúc để bảo đảm sự liên kết vào các thụ
quan (FcR, Fc receptor) có mặt trên các thực bào, để các tế bào này tiêu hủy
khuẩn đã bị KT đánh dấu. Vùng CH3 này còn có chức năng liên kết với các thụ
quan trên tế bào nhau (placental) của thai phụ để được truyền qua cho thai, để
thai có thể được bảo vệ (cách thụ động) trong sáu tháng đầu sau sinh.
Hai chức năng vừa đề cập trên của CH2 và CH3 còn đảm nhiệm vai trò trung
gian của KT trong hoạt động của các bạch cầu có hạt (granulocytes) trong đáp ứng
bẩm sinh chống khuẩn của bạch cầu trung tính (neutrophil), trong các hoạt động
gây dị ứng của bạch cầu ái kiềm (basophil), trong hoạt động chống lại ký sinh
trùng của bạch cầu ái toan (eosinophil).
Phần Fab gồm hai vùng CL và CH1 (gắn liền với vùng CH2 của phần Fc), ở phía
đầu cùng phân tử IgG, tiếp theo vùng CL là vùng VL, tiếp theo vùng CH1 là vùng
VH . Phần Fab là phần có chức năng liên kết với KN, điều Porter và Nisonoff đã
cho thấy trước đây.

11


Tổng quan tài liệu

Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Trích từ:

Kuby Immunology 4th
J. Kindt, B.A.Osborne, R.A.Goldsby
Trang 83, chương 4

Hình 2.6 : Cấu trúc bậc bốn của phân tử Ig
(Mỗi bi nhỏ là một đơn vị a.a. Bi lớn màu vàng là một bán đơn vị CHO (đường). Bi màu đỏ
thuộc chuỗi nhẹ (L) và màu xanh là thuộc chuỗi nặng (H). Hình b) cho thấy tổ chức phân tử
thành những quả cầu kết cấu bền vững, được gọi là các “vùng” (domain) của phân tử. Vùng
trình tự a.a không biến động gọi là vùng ổn định (C, constant) và vùng có trình tự biến động gọi
là vùng biến động (V, variable).)

Nhưng vì sao mỗi phân tử KT lại chỉ bắt một KN? Cơ sở của tính đặc hiệu cần
được xác minh. Và vì sao cơ thể lại có khả năng tạo nên nhiều tính đặc hiệu đến
thế?

12


Tổng quan tài liệu

Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Để tìm hiểu những điều đó, Wu và Kabat [32] đã xác định trình tự vùng biến
động trên chuỗi nhẹ của khoảng mười hai KT “đơn dòng” người với tính đặc hiệu
khác nhau và đã phát hiện, cách tương đối đơn giản sự có mặt của những đoạn gọi
là siêu biến động (hypervariable regions, HVRs), Hình 2.7.

Hình 2.7: Vùng siêu biến động (HRVs) của chuỗi nặng và chuỗi nhẹ
Hình 2.7 cho thấy tỉ lệ thay đổi (variability) đơn vị a.a ở các điểm trên vùng
biến động của hai chuỗi V và H. Các kết quả đó cho hiểu là những liên kết với

những biểu vị khác nhau của KN được bảo đảm bởi những a.a khác nhau của KT,
các axít amin liên kết với biểu vị nằm trong những đoạn siêu biến động (HV1,
HV2 và HV3 trên hai chuỗi nặng và nhẹ). Phần gồm hai vùng VH và VL không
bao gồm hai vùng CL và CH1, còn được gọi là phần Fv (fragment variable), mang
hai đoạn có a.a N cuối cùng của hai chuỗi H và L, với cấu trúc bậc bốn như đã
thấy trên Hình 2.6.

13


Tổng quan tài liệu

Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Do các liên kết tạo phức hợp KT≈KN là những liên kết không hóa trị, phức
hợp có thể phân ly một cách thuận ngược, bản chất của các liên kết tham gia cần
được xác định.
Sự gắn liền trực tiếp giữa các axít amin của các đoạn siêu biến động của cận vị
với các thành phần trong tổ chức cấu trúc trên biểu vị của KN (có thể là peptide,
glucide hay lipide), được bảo đảm bởi những loại liên kết hóa lý với bản chất gốc
của các loại lực liên kết được trình bày trên Hình 2.8.

Trích từ: Immunobiology, 5th ed., C.A. Janeway et al. Garland Pub. p.104

14


Tổng quan tài liệu

Luận văn Thạc sĩ Sinh học


Hình 2.8: Các loại lực liên kết giữa KT – KN
(Lực liên kết giữa KN – KT gồm có những liên kết sau. Lực liên kết tĩnh điện: tương tác giữa
nhóm trái dấu. Liên kết hydrogen: hydro được chia sẻ của những nguyên tử mang điện âm. Liên
kết Van der Waall: tương tác giữa những đám mây điện tử của hai phân tử khác dấu gần nhau.
Liên kết kị nước: những phân tử kỵ nước có khuynh hướng tập trung cùng nhauà để loại phân tử
nước.)

2.1.3.2. Cấu trúc không gian của biểu vị [7][17]
Như đã thấy trên Hình 2.7, ba đoạn HV không liên tục nối tiếp nhau nhưng
cách biệt bởi những đoạn peptide ngắn.
Tổ chức cấu trúc trong không gian của các đoạn HVRs để tạo những liên kết
giữa cận vị trên KT với biểu vị trên KN, còn được gọi là các đoạn bổ sung quyết
định (complementarity-determining regions, CDRs) của KT; các axít amin của
cận vị trực tiếp gắn liền với các thành phần tổ chức cấu trúc trên biểu vị cũng còn
được gọi là quyết định KN (antigenic determinant).
Biểu vị là một cấu trúc có tổ chức trong không gian, có thể là nhỏ nhưng cũng
có thể lớn và phức tạp. Chúng ta có thể gặp cấu trúc của một hapten như
dinitrophenyl, một steroid hay một độc tố vi nấm như aflatoxin B1 là những biểu
vị nhỏ. Biểu vị lớn thường là những tổ chức của các đoạn polypeptide có mặt trên
các protein bề mặt của vi-rút hay vi khuẩn; các đoạn polypeptide này có thể có tổ
chức cuộn lại trong không gian và các thành phần a.a được liền nhau cách liên tục
là những biểu vị gọi là biểu vị liên tục (continuous epitope) hay biểu vị thẳng
(linear epitope). Trong đó, nhiều biểu vị tổ chức tập hợp hai đoạn polypeptide

15