ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM CÔNG TY TNHH CNSH KHOA THƯƠNG
SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ






BÁO CÁO NGHIỆM THU



NGHIÊN CỨU TẠO VÀ ỨNG DỤNG KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG
NHẰM PHÁT HIỆN SỚM UNG THƯ CỔ TỬ CUNG



CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI

PGS.TS. HỒ HUỲNH THÙY DƯƠNG

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
THÁNG 12/ 2013

MỤC LỤC

CÁC THÔNG TIN LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI i
TÓM TẮT TIẾNG VIỆT iv
ABSTRACT v
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vii
DANH MỤC BẢNG x
DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ xii
ĐẶT VẤN ĐỀ 1

PHẦN 1. TỔNG QUAN 2
1.1 Các protein virus HPV và protein tế bào liên quan đến ung thư cổ tử cung
(UTCTC) 2
1.1.1 Các protein virus, oncoprotein E7 và protein cấu trúc L1 2
1.1.2 Các protein tế bào 3
1.2. Tổng quan về kháng thể đơn dòng 3
1.2.1 Sản xuất kháng thể đơn dòng bằng kỹ thuật tạo tế bào lai (hybridoma) 3
1.2.2. Kỹ thuật sản xuất KTĐD từ người bằng cách bất tử hóa lympho bào 4
1.2.3. Dung hợp tế bào lympho người với tế bào u tủy chuột 4
1.2.4. Tạo kháng thể khảm và kháng thể “người hóa” 4
1.2.5. Phương pháp trình diện phage 5
1.2.6. Phương pháp tạo chuột chuyển gene biểu hiện Ig người 5
1.2.7. Sản xuất kháng thể đơn dòng 5
1.3 Các phương pháp phát hiện E7 và p16
INK4A
9
PHẦN 2. MỤC TIÊU ĐỀ TÀI 9
PHẦN 3. VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP 10
3.1 VẬT LIỆU 10
3.1.1. Tế bào 10
3.1.2. Chủng vi sinh vật 10
3.1.3. Vector 10
3.1.4. Chuột thí nghiệm 11
3.1.5. Bệnh phẩm 11
3.1.6. Hóa chất-Môi trường 11

3.1.6.1 Hóa chất 11
3.1.6.2 Môi trường 15
3.2. PHƯƠNG PHÁP 15
3.2.1. Phương pháp thiết kế mồi 15

3.2.2. Phương pháp tách chiết DNA, RNA 16
3.2.2.1. Tách chiết DNA bộ gene 16
3.2.2.2. Tách chiết DNA plasmid 16
3.2.2.3. Tách chiết RNA 17
3.2.3. Phương pháp PCR và RT-PCR 17
3.2.4. Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR 17
3.2.5. Phương pháp giải trình tự 17
3.2.6. Phương pháp tạo dòng biểu hiện 18
3.2.6.1. Tạo vector tái tổ hợp mang gene mong muốn 18
3.2.6.2. Biến nạp vector tái tổ hợp vào E. coli DH5α và BL21 (DE3) 19
3.2.6.3. Chọn lọc dòng vi khuẩn tái tổ hợp có mang gene mong muốn 19
3.2.7. Phương pháp thu nhận – tinh sạch protein tái tổ hợp 20
3.2.8. Phương pháp điện di SDS-PAGE 20
3.2.9. Phương pháp Western blot 21
3.2.10. Phương pháp Bradford 21
3.2.11. Phương pháp tạo KTĐD 21
3.2.11.1. Gây đáp ứng miễn dịch trên chuột 18
3.2.11.2. Dung hợp tạo tế bào lai (hybridoma) 22
3.2.11.3. Sản xuất và tinh sạch KTĐD 23
3.2.12. Phương pháp ELISA 24
3.2.12.1. ELISA trực tiếp 24
3.2.12.2. ELISA “sandwich” 25
3.2.12.3. Phương pháp checkerboard 25
3.2.13. Phương pháp chuyển gene vào tế bào động vật 25
3.2.14. Phương pháp hóa tế bào miễn dịch (immunocytochemistry) 26
3.2.14.1.Phương pháp lai hóa miễn dịch tế bào trên lamelle 26
3.2.14.2. Phương pháp lai hóa tế bào miễn dịch trên lame kính 27
3.2.15. Phương pháp immunoPCR 27
3.2.15.1. Biotin hóa kháng thể 27


3.2.15.2. Tạo đoạn DNA chỉ thị đánh dấu biotin (DNA-biotin) 28
3.2.15.3. ImmunoPCR 28
PHẦN 4. KẾT QUẢ 30
4.1. TẠO PROTEIN TÁI TỔ HỢP E7 HPV 6/11/16, L1 HPV 16/18 VÀ p16
INK4A
30
4.1.1. CHUẨN BỊ NGUYÊN LIỆU CHO TẠO DÒNG 30
4.1.1.1 Thiết kế mồi cho phản ứng PCR nhân bản các gene E7 HPV 6/11/16, L1
HPV 16/18 và p16
INK4A
30
4.1.1.2. Thu nhận các gene cần tạo dòng 31
4.1.2. DÒNG HÓA CÁC GENE TƯƠNG ỨNG VÀO VECTOR pET28a(+), pE-SUMO3,
pETM-44, pGATVÀ KIỂM TRA VECTOR TÁI TỔ HỢP BẰNG PCR VÀ GIẢI TRÌNH TỰ 33
4.1.3. BIỂU HIỆN PROTEIN TÁI TỔ HỢP VÀ KIỂM TRA CHÚNG BẰNG SDS -PAGE
VÀ WESTERN BLOT 36
4.1.3.1 Kết quả biểu hiện protein E7 HPV 16 38
4.1.3.2. Kết quả biểu hiện protein p16
INK4A
38
4.1.3.3. Kết quả biểu hiện protein E7 HPV 6 và E7 HPV 11 39
4.1.3.4. Kết quả biểu hiện protein L1 HPV 16 và L1 HPV 18 40
4.1.4. THU NHẬN VÀ TINH SẠCH PROTEIN TÁI TỔ HỢP 40
4.2. KHẢO SÁT MỘT SỐ THÔNG SỐ CHO QUY TRÌNH THU NHẬN PROTEIN TÁI
TỔ HỢP TINH SẠCH 41
4.2.1. BIỂU HIỆN VÀ THU NHẬN PROTEIN TÁI TỔ HỢP 41
4.2.1.1. Hệ vector biểu hiện 41
4.2.1.2. Nhiệt độ cảm ứng 42
4.2.1.3. Nồng độ IPTG cảm ứng 43
4.2.1.4. Thời gian cảm ứng 44

4.2.2. TINH SẠCH PROTEIN TÁI TỔ HỢP 46
4.2.2.1. Nồng độ imidazole dùng trong dung dịch rửa cột 47
4.2.2.2. Dung dịch đệm của phản ứng cắt loại bỏ đuôi SUMO 48
4.2.2.3. Ảnh hưởng của một số chất biến tính lên phản ứng cắt 50
4.2.2.4. Kết quả tinh sạch protein p16
INK4A
từ vector pE-SUMO3 tái tổ hợp 51
4.3. TẠO KTĐD KHÁNG PROTEIN E7 HPV 16 VÀ p16
INK4A
52
4.3.1. GÂY ĐÁP ỨNG MIỂN DỊCH CHUỘT VỚI KHÁNG NGUYÊN MỤC TIÊU 52
4.3.1.1. Gây đáp ứng miễn dịch chuột với kháng nguyên E7 HPV 16 tái tổ
hợp 52

4.3.1.2. Gây đáp ứng miễn dịch chuột với kháng nguyên p16
INK4A
tái tổ hợp 53
4.3.2. CHỌN LỌC DÒNG HYBRIDOMA SẢN XUẤT KTĐD KHÁNG PROTEIN E7 HPV
16 VÀ p16
INK4A
54
4.3.2.1. KTĐD kháng protein E7 HPV16 54
4.3.2.2 KTĐD kháng protein p16
INK4A
55
4.3.3. THU NHẬN VÀ TINH SẠCH KTĐD KHÁNG E7 HPV 16 VÀ p16
INK4A
55
4.3.3.1. Kết quả xác định isotype KTĐD kháng E7 HPV 16 và p16
INK4A

55
4.3.3.2. Kết quả tinh sạch KTĐD kháng protein E7 HPV 16 và p16
INK4A
57
4.3.4. KIỂM TRA VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA KTĐD 58
4.3.4.1. Kết quả xác định ái lực của KTĐD với kháng nguyên tái tổ hợp 58
4.3.4.2. Kết quả kiểm tra tính đặc hiệu của KTĐD 59
4.4. KHẢO SÁT MỘT SỐ THÔNG SỐ CHO QUY TRÌNH TẠO KTĐD 62
4.4.1. SẢN XUÂT KTĐD QUA NUÔI CẤY TĨNH 62
4.4.1.1. Thu nhận tối đa sinh khối tế bào 4H5 dùng để cấy (seeding) 62
4.4.1.2. Xác định một số điều kiện nuôi tế bào 4H5 để sản xuất KTĐD 63
4.4.2. QUY TRÌNH SẢN XUÂT KTĐD QUA NUÔI CẤY BIOREACTOR 66
4.4.2.1. Mật độ tế bào cấy 66
4.4.2.2. Nồng độ FBS trong môi trường nuôi tế bào 67
4.5. XÂY DỰNG QUY TRÌNH IMMUNOPCR 68
4.5.1. TẠO KTĐD 4H5 ĐÁNH DẤU BIOTIN 69
4.5.2. TẠO ĐOẠN DNA ĐÁNH DẤU BIOTIN 71
4.5.3. KHẢO SÁT NỒNG ĐỘ KHÁNG THỂ 1D5 PHỦ GIẾNG 71
4.5.4. KHẢO SÁT NỒNG ĐỘ KHÁNG THỂ 4H5-BIOTIN VÀ STREPTAVIDIN-
ALKALINE PHOSPHATASE (STV-AP) 71
4.5.5. KHẢO SÁT NỒNG ĐỘ DNA ĐÁNH DẤU BIOTIN 73
4.5.6. KHẢO SÁT NỒNG ĐỘ STREPTAVIDIN (STV) 73
4.5.7. TÁC NHÂN “KHÓA” GIẾNG VÀ SỐ CHU KÌ PCR 74
4.6. XÂY DỰNG QUY TRÌNH HÓA TẾ BÀO MIỄN DỊCH 75
4.6.1. NỒNG ĐỘ KHÁNG THỂ TỐI ƯU CHO QUY TRÌNH LAI TRÊN LAMELLE 75
4.6.2. TÁC NHÂN CỐ ĐỊNH TẾ BÀO TRONG QUY TRÌNH LAI TRÊN LAME KÍNH 79
4.6.3. NỒNG ĐỘ KHÁNG THỂ TRONG QUY TRÌNH LAI TRÊN LAME KÍNH 80
4.6.4. CÁC ĐIỀU KIỆN BỘC LỘ KHÁNG NGUYÊN TRONG QUY TRÌNH LAI TRÊN
LAME KÍNH 81


4.6.5. KHẢO SÁT ĐỘ ĐẶC HIỆU CỦA QUY TRÌNH LAI TRÊN LAME KÍNH 83
4.6.6. KHẢO SÁT CÁC ĐIỀU KIỆN ỔN ĐỊNH KTĐD 1C10 85
4.7. QUY TRÌNH ELISA 87
4.7.1. XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ KHÁNG THỂ “BẮT GIỮ” (PHỦ GIẾNG) TỐT NHẤT 89
4.7.2. XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ KHÁNG THỂ “PHÁT HIỆN” TỐT NHẤT 90
4.7.3. XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ KHÁNG THỂ “CỘNG HỢP HRP” TỐT NHẤT 90
4.7.4. XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ TÁC NHÂN KHÓA GIẾNG TỐT NHẤT 91
4.8. KIT IMMUNOPCR - XÁC ĐỊNH HIỆU QUẢ HOẠT ĐỘNG 95
4.8.1. ĐỘ ĐÚNG 95
4.8.2. ĐỘ CHÍNH XÁC 96
4.8.3. ĐỘ ĐẶC HIỆU PHÂN TÍCH 98
4.8.4. ĐỘ NHẠY PHÂN TÍCH 99
4.8.5. KHẢ NĂNG TRIỂN KHAI ĐẠI TRÀ KIT TẠI CÁC CƠ SỞ Y TẾ 99
4.9. KIT HÓA TẾ BÀO MIỄN DỊCH (HTBMD) - XÁC ĐỊNH HIỆU QUẢ HOẠT
ĐỘNG 101
4.9.1. ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ HOẠT ĐỘNG CỦA KIT KTE7-16ICC 101
4.9.1.1. Độ đúng 101
4.9.1.2. Độ chính xác 103
4.9.1.3. Độ đặc hiệu phân tích 104
4.9.1.4. Khả năng triển khai đại trà kit tại cơ sở y tế 108
4.9.2. ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ HOẠT ĐỘNG CỦA KIT KTE7-18ICC 108
4.9.2.1. Độ đúng 108
4.9.2.2. Độ chính xác 110
4.9.2.3. Độ đặc hiệu phân tích 111
4.9.2.4. Khả năng triển khai đại trà kit tại cơ sở y tế 113
4.9.3. ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ HOẠT ĐỘNG CỦA KIT KTp16ICC 113
4.9.3.1. Độ đúng 113
4.9.3.2. Độ chính xác 115
4.9.3.3. Độ đặc hiệu phân tích 118
4.9.3.4. Độ ổn định 119

4.9.3.5. Khả năng triển khai đại trà kit tại cơ sở y tế 121
4.10. KIT ELISA – XÁC ĐỊNH HIỆU QUẢ HOẠT ĐỘNG 121
4.10.1. XÁC ĐỊNH GIÁ TRỊ “NGƯỠNG” (CUT-OFF) CỦA KIT 121

4.10.2. ĐỘ ĐÚNG 123
4.10.3. ĐỘ CHÍNH XÁC 124
4.10.4. ĐỘ ĐẶC HIỆU PHÂN TÍCH 126
4.10.5. ĐỘ NHẠY PHÂN TÍCH 126
4.10.6. KHẢ NĂNG TRIỂN KHAI ĐẠI TRÀ KIT TẠI CƠ SỞ Y TẾ 127
PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 128
TÀI LIỆU THAM KHẢO 130
i

CÁC THÔNG TIN LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI

1. Tên đề tài : NGHIÊN CỨU TẠO VÀ ỨNG DỤNG KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG
NHẰM PHÁT HIỆN SỚM UNG THƯ CỔ TỬ CUNG
Chủ nhiệm : PGS TS Hồ Huỳnh Thùy Dương
Cơ quan chủ trì : Công ty TNHH CNSH Khoa Thương
Thời gian thực hiện : 36 tháng,
Báo cáo tiến độ : 6/2011
Thời gian được gia hạn : 6 tháng
Kinh phí được duyệt : 3.050.000.000 đồng
Kinh phí đã cấp :
2. Mục tiêu : Mục tiêu dài hạn của đề tài là phát triển một công nghệ mới ở Việt Nam,
công nghệ kháng thể đơn dòng (KTĐD) phục vụ cho chẩn đoán và điều trị. Đối tượng
nghiên cứu của đề tài là HPV (Human Papillomavirus), một loại virus có liên quan chặt
chẽ với ung thư cổ tử cung. Mục tiêu cụ thể bao gồm : (1) Hoàn chỉnh quy trình tạo
KTĐD ở quy mô nhỏ và vừa, áp dụng để tạo KTĐD kháng một số protein liên quan đến
ung thư cổ tử cung như E7 HPV16/18, p16

INK4A
; (2) Ứng dụng các KTĐD đã tạo được
để phát triển các phương pháp chẩn đoán dựa trên kỹ thuật immuno PCR và miễn dịch
mô/ tế bào ; (3) Xây dựng một số kit nhằm phát hiện sớm ung thư cổ tử cung dựa trên kỹ
thuật immuno-PCR và hóa miễn dịch mô, tế bào.
3. Nội dung
STT

Nội dung đăng ký Nội dung thực hiện
1 Báo cáo tổng kết với đầy đủ nội
dung và đúng quy định của Sở
Khoa học và công nghệ
1 báo cáo tổng kết trình bày đầy đủ nội dung
nghiên cứu của đề tài.
2 Protein tái tổ hợp E7 HPV
6/11/16, L1 HPV 16/18 và
p16
INK4A
– trình tự chính xác, độ
tinh sạch 95 %, 10 mg cho mỗi
loại protein
Protein tái tổ hợp E7 HPV 6 /11/16, và
p16
INK4A
– trình tự chính xác, độ tinh sạch lần
lượt là 95,4 %, 93 %, 95,4 % và 92,3 %, 10
mg cho mỗi loại protein
Gene L1 HPV 16 và L1 HPV 18 tạo dòng biểu
hiện không thành công.
3 Quy trình tạo protein tái tổ hợp. Quy trình tạo protein tái tổ hợp vời các vector

ii

Bộ vector cùng với quy trình tạo
dòng tương ứng có thể sử dụng để
tạo dòng nhiều loại protein
pET28(a+), pETM-44, pGAT và pSUMO3 có
thể dùng để tạo dòng các protein có tính tan
khác nhau
4 Quy trình tạo KTĐD – thực hiện
được tại Việt Nam, xác định được
các thông số về loại môi trường,
tốc độ lắc, thời gian nuôi cấy
trước khi thu kháng thể
Quy trình tạo KTĐD – thực hiện được tại Việt
Nam.
Quy trình thu nhận KTĐD 4H5 gồm các thông
số cụ thể : (1) thu sinh khối làm nguyên liệu
cấy : môi trường RPMI 1640 chứa FBS 10 %,
mật độ 2.10
6
tế bào/ml môi trường, nuôi 48 giờ
; (2) thu nhận KTĐD bằng nuôi cấy bình Roux:
môi trường RPMI 1640 chứa FBS 5 %, mật độ
2.10
6
tế bào/ml môi trường, thu mẫu sau 96 giờ
; thu nhận KTĐD với bioreactor : môi trường
RPMI 1640 chứa FBS 10 %, mật độ 5.10
5
tế

bào/ml môi trường, thu mẫu sau 168 giờ
5 Kháng thể đơn dòng – 2 loại
KTĐD kháng E7 HPV 16 và
p16
INK4A
, độ tinh sạch  90 %,
hàm lượng 10 mg/l môi trường
nuôi cấy hybridoma
2 loại KTĐD : 2C1 kháng E7 HPV 16, hàm
lượng 7,6 mg/ml. độ tinh sạch 95 %, và 1C10
kháng p16
INK4A
, hàm lượng 7,3 mg/ml, độ tinh
sạch 92 %.
2 KTĐD 4H5 và 1D5 kháng E7 HPV 18 tạo từ
đề tài trước được sản xuất với hàm lượng lần
lượt là 8,8 mg/ml và 6,7 mg/ml và độ tinh sạch
lần lượt là 90 % và 98 %.
6 Quy trình immunoPCR – 3 quy
trình phát hiện protein E7 HPV
16/18 và p16
INK4A

1 quy trình immunoPCR phát hiện protein E7
HPV 18
7 Kit immunoPCR phát hiện protein
E7 HPV 16/18 và p16
INK4A
– 3 kit
phát hiện các protein E7 HPV 16,

E7 HPV 189 và p16
INK4A
trong
mẫu bệnh với độ đặc hiệu là 95 %
so với kit OncoTect (Invirion
01 kit immunoPCR phát hiện protein E7 HPV
18 trong mẫu bệnh, độ nhạy phân tích 1 ng/ml,
không có so sánh với kit đối chứng ; 50 phản
ứng/kit x 6 kit
iii

Diagnostics), độ nhạy cao hơn 10-
100 lần ; 50 phản ứng /kit x 3 loại
kit x 6 kit/loại
8 Quy trình hóa miễn dịch tế
bào/mô – 2 quy trình hóa miễn
dịch tế bào hoặc hóa miễn dịch
mô để phát hiện p16
INK4A
và E7
HPV 16
Quy trình hóa miễn dịch tế bào – 3 quy trình
phát hiện p16
INK4A
, E7 HPV 16, và E7 HPV 18
được xậy dựng dựa trên các dòng tế bào chứng
dương và âm phù hợp
9 Kit hóa miễn dịch tế bào/mô – 02
kit phát hiện p16
INK4A

và E7 HPV
16 với độ đặc hiệu và độ nhạy
tương đương (90-100%) với các
kit thương mại tương ứng ; 50
phản ứng /kit x 2 loại kit x 6
kit/loại
Kit hóa miễn dịch tế bào – 03 kit phát hiện
p16
INK4A
, E7 HPV 16 và E7 HPV 18. Kit E7
HPV 16 phù hợp 80 % với kit chứng ; kit E7
HPV 18 phù hợp 53 % với kit chứng ; kit
p16
INK4A
phù hợp 85 – 85,7 % với kit chứng ;
50 phản ứng /kit x 2 loại kit x 6 kit/loại
10 Bài báo quốc tế và trong nước –
02 bài đăng tại tạp chí khoa học
và công nghệ chuyên ngành
03 bài báo đăng tại tạp chí chuyên ngành trong
nước
11 Báo cáo khoa học tại hội thảo
quốc tế và trong nước chuyên
ngành – 2 bài
01 báo cáo poster tại hội nghị quốc tế
12 Quy trình ELISA phát hiện p16
INK4A
được xậy
dựng dựa trên các dòng tế bào chứng dương và
âm phù hợp

13 Kit ELISA phát hiện được p16
INK4A
trong dịch
tế bào cổ tử cung, độ nhạy và độ đặc hiệu lâm
sàng lần lượt là 91,6 % và 88,89 % tại gía trị
“ngưỡng” là 0,250.
14 Luận văn Thạc sĩ 03 luận văn thạc sĩ chuyên ngành Di truyền



iv




TÓM TẮT TIẾNG VIỆT

Mục tiêu dài hạn của đề tài là phát triển công nghệ kháng thể đơn dòng (KTĐD)
phục vụ chẩn đoán và điều trị bệnh. Mục tiêu cụ thể là hoàn chỉnh quy trình tạo KTĐD
kháng một số protein liên quan chặt chẽ đến ung thư cổ tử cung như E7 HPV 16, 18,
p16
INK4A
; ứng dụng các KTĐD tạo được để phát triển các quy trình immunoPCR và hóa
tế bào miễn dịch ; và dựa trên các quy trình này để xây dựng các kit chẩn đoán nhằm phát
hiện sớm ung thư cổ tử cung.

Các nội dung chủ yếu của đề tài bao gồm :
1. Tạo protein tái tổ hợp và xây dựng quy trình tạo protein tái tổ hợp. Chúng tôi đã tạo
được các protein E7 HPV 6, 11, 16, p16
INK4A

. Các protein này

được kiểm tra bằng kỹ
thuật Western blot và có độ tinh sạch 92-95 %. Các protein này được sử dụng để gây đáp
ứng miễn dịch trên chuột cho nội dung tạo KTĐD. Quy trình tạo protein tái tổ hợp với
vector pET28a(+) và pSUMO-3 có thể áp dụng để tạo dòng biểu hiện nhiều loại protein.
2. Tạo KTĐD và xây dựng quy trình tạo KTĐD. Chúng tôi đã tạo được các hybridoma
sản xuất KTĐD kháng protein E7 HPV 16 và p16
INK4A
. Các KTĐD này và KTĐD kháng
E7 HPV 18 được thu nhận theo hai cách : nuôi cấy tĩnh và nuôi trong bioreactor. Các
KTĐD tạo được có ái lực mạnh với kháng nguyên mục tiêu, độ tinh sạch  90 %. Quy
trình thu nhận KTĐD, gồm các thông số về môi trường, mật độ tế bào cấy, thời gian nuôi
trước khi thu kháng thể, có thể thực hiện được trong điều kiện phòng thí nghiệm trong
nước.
Từ các KTĐD đã tạo được, chúng tôi xây dựng các quy trình và các kit
immunoPCR, hóa tế bào miễn dịch và ELISA.
3. Quy trình và kit immunoPCR. Chúng tôi xây dựng quy trình immunoPCR phát hiện
protein E7 HPV 18 ; và dựa trên quy trình để xây dựng kit immunoPCR nhằm phát hiện
kháng nguyên mục tiêu trong dịch ly giải tế bào cổ tử cung. Kit immunoPCR được so
sánh với kit Amplisense HPV Typing. Độ đúng và độ đặc hiệu phân tích cũng như khả
năng triển khai rộng rãicủa kit immunoPCR không cao.
v

4. Quy trình và kit hóa tế bào miễn dịch. Chúng tôi đã xây dựng được 03 quy trình phát
hiện các protein E7 HPV 16, E7 HPV 18 và p16
INK4A
. Từ các quy trình, chúng tôi tạo 03
kit tương ứng. Các kit E7 HPV 16 và E7 HPV 18 được so sánh với kit Amplisense HPV
Typing, kit p16

INK4A
được so sánh với kit CINtec. Kit E7 HPV 18 có độ đúng và độ đặc
hiệu phân tích thấp. Kit E7 HPV 16 phù hợp 80 % với kit định týp HPV và độ đặc hiệu
phân tích tốt. Kit p16
INK4A
phù hợp 85-85.7 % với kit CINtec, độ đặc hiệu phân tích tốt và
khả năng triển khai thực tế cao.
5. Quy trình và kit ELISA. Chúng tôi xây dựng quytrình ELISA phát hiện p16
INK4A
tái tổ
hợp và áp dụng quy trình để xây dựng kit ELISA phát hiện p16
INK4A
trong dịch ly giả tế
bào cổ tử cung. Với giá trị “ngưỡng” là OD
450
= 0,250, độ nhạycủa kit ELISA là 91,6 %
và độ đặc hiệu là 88,89 %, giá trị AUC đạt 93 %. Kit ELISA phát hiện p16
INK4A
trong
dịch ly giải tế bào cổ tử cung có khả năng triển khai thực tế cao nếu tiếp tục được nghiên
cứu ở quy mô lớn hơn.
6. Các sản phẩm khác của đề tài gồm : 2 bài báo đăng trong tạp chí chuyên ngành trong
nước, 01 báo cáo tại hội nghị quốc tế, 03 luận văn Thạc sĩ.

ABSTRACT

Long-term purpose of our study is the development of monoclonal antibody
technology for diagnostic and therapeutic applications. Short-term purposes include :
optimization of production protocols for monoclonal antibodies (Mabs) directed against
some viral and cellular proteins closely related to cervical cancer such as E7 HPV 16/18,

p16INK4A ; use of the Mabs generated to develop protocols and diagnostic kits for early
detection of cervical cancer, based on immunoPCR and immunocytochemistry methods.

The main contents include :
1. Generation of some recombinant proteins and setting up protocol for recombinant
protein obtention. We generated E7 HPV 6/11/16 and p16INK4A recombinant proteins
with purity in the range of 92 to 95 % and whose specificity was confirmed by Western
blotting. These proteins were used to induce immune responses in mice for Mab
generation. Protocol for recombinant proteins generation based on pET28a(+) and
pSUMO-3 vectors can be used to generate recombinant proteins.
vi

2. Generation of Mabs and setting up protocol for Mab generation. We generated
hybridomas producing Mabs directed against E7 HPV 16 and p16INK4A. Those Mabs,
along with the Mab against E7 HPV 18, were obtained by flask- and bioreactor-cultures.
These Mabs exhibited high affinity with their target antigens, and a purity superior to 90
%. The protocols for Mab generation and production, including parameters on medium
composition, seeding density, time before collection, are applicable in local conditions.
Using the Mabs generated, we established immunoPCR, immunocytochemistry and
ELISA-based protocols and diagnostic kits
3. ImmunoPCR-based protocol and kit. We established immunoPCR-based protocol to
detecting E7 HPV 18 and furtherly developed kit (named KTimmunoPCR E7/18) for
antigen detection in cervical cell lysates. Results obtained with our immunoPCR kit was
compared to those obtained with the Amplisense HPV Typing kit. Accuracy and
analytical specificity as well as applicability of the kit are low.
4. Immunocytochemistry-based protocols and kits. We established three protocols to
detecting E7 HPV 16/18 and p16INK4A. Based on these protocols, we fabricated three
kits (KTE7-16ICC, KTE7-18ICC, KTp16ICC). KTE7-16ICC and KTE7-18ICC kits were
compared, in term of accuracy, to the Amplisense HPC Typing kit, whereas KTp16ICC
was compared to the CINtec cytology kit. KTE7-18ICC kit has low accuracy and low

analytical specificity. Results obtained with KTE7-16ICC kit was of 80 % in
concordance with those obtained with Amplisense HPV Typing kit. In the same way,
KTp16ICC kit was of 85-85.7 % in agreement with CINtec cytology kit. The two latter
kits have good analytical specificity and KTp16ICC has good perspective for application
as a complementary test to cytology methods.
5. ELISA protocol and kit. We established ELISA protocol and developed kit
(KTp16ELISA) to detecting p16INK4A in cervical cell lysates. With a cut-off value of
0.250 at OD450, kit sensitivity and specificity were 91.6 % and 88.89 %, respectively.
AUC value reached 93 %. KTp16ELISA kit would have good applicability with larger
sample size for more accurate cut-off value determination.
6. Other achievements include : 02 publications in local scientific journals, 01 poster
presentation at international conference and 03 Master theses.


vii




DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
KÝ HIỆU VÀ
CHỮ VIẾT TẮT

THUẬT NGỮ

6xHis Hexa-histidine
ASC-US Atypical Squamous Cells of Undetermined Significance
ATCC American Type Culture Collection
CV Coefficient Of Variation
GST Glutathione S-transferase

HAT Hypoxanthine-aminopterin-thymidine Medium
HPV Human papillomavirus
HRP Horseradish peroxidase
HTBMD Hóa tế bào miễn dịch
KTĐD Kháng thể đơn dòng
LB Môi trường Luria-Bertan
LR-HPV Low-Risk HPV
MBP Maltose binding protein
NCBI National Center for Biotechnology Information
ROC Receiver operating characteristics
SDS Sodium dodecyl sulfat
SDS-PAGE
Sodium dodecyl sulfate – polyacrylamide gel
electrophoresis
SUMO Small Ubiquitin-Modifier
SV Streptavidin
UTCTC Ung thư cổ tử cung
VLPs Virus Like Particle
WHO World Health Organization













viii

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1. Các plasmid sử dụng và enzyme cắt giới hạn tương ứng 18
Bảng 2. Kích thước sản phẩm PCR dự đoán trên các vector tái tổ hợp 19
Bảng 3 . Quy trình gây đáp ứng miễn dịch chuột 22
Bảng 4. Các cặp mồi sử dụng để nhân bản các gene mục tiêu 30
Bảng 5. Ký hiệu các vector tái tổ hợp 33
Bảng 6. Đặc điểm của các hệ vector sử dụng dòng hóa gene E7 HPV16 và p16
INK4A
34
Bảng 7. Phân tử lượng dự đoán của protein E7 HPV16 dung hợp với các đuôi khác
nhau 36
Bảng 8. Kích thước dự đoán của protein p16
INK4A
ở dạng dung hợp với các đuôi khác
nhau 36
Bảng 9. Mức độ biểu hiện protein ở pha tan của các hệ vector 39
Bảng 10. Kết quả phân tích bằng phần mềm Total Lab Quant mức độ biểu hiện protein
pha tan với các protein khác của tế bào trong các hệ vector ở các nhiệt độ cảm ứng khác
nhau 42
Bảng 11. Kết quả phân tích bằng phần mềm Total Lab Quant mức độ biểu hiện protein
pha tan với protein khác của tế bào trong các hệ vector ở các nồng độ IPTG khác
nhau. 43
Bảng 12. Kết quả phân tích bằng phần mềm Total Lab Quant mức độ biểu hiện protein
pha tan với protein khác của tế bào trong các hệ vector ở các thời gian cảm ứng khác
nhau 44
Bảng 13. Các điều kiện cảm ứng biểu hiện protein p16

INK4A
tối ưu cho từng hệ
vector 45
Bảng 14. Kết quả phân tích bằng phần mềm Total Lab Quant ảnh hưởng của nồng độ
imidazole lên sự dung ly của protein mục tiêu 46
Bảng 15. Kết quả phân tích bằng phần mềm Total Lab Quant ảnh hưởng của dung dịch
đệm, thời gian và nhiệt độ cắt lên phần trăm protein mục tiêu thu được 46
Bảng 16. Kết quả phân tích bằng phần mềm Total Lab Quant hiệu suất của phản ứng
cắt 49
Bảng 17. Tổng kết kết quả immunoPCR E7/HPV 18 dựa trên kết quả định týp HPV 51
ix

Bảng 18. Độ lặp lại nội phản ứng của kit immunoPCR E7/18 trên dich tế bào HeLa và
protein E7 HPV 18 tái tổ hợp 96
Bảng 19. Độ lặp lại liên phản ứng của kit KTE7-18 immunoPCR trên dich tế bào HeLa
và protein E7 HPV 18 tái tổ hợp 97
Bảng 20. Kết quả ImmunoPCR E7/18 trên dịch tế bào HeLa và MCF-7 98
Bảng 21. Giá trị Ct của các nồng độ protein tái tổ hợp E7 HPV 18 98
Bảng 22. Kết quả hóa miễn dịch tế bào E7 HPV 16 so với kết quả định týp HPV 99
Bảng 23. Kết quả hóa miễn dịch tế bào E7 HPV 18 so với kết quả định týp HPV 102
Bảng 24. Kết quả nhuộm miễn dịch với kit KTp16ICC và CINtec đợt I 109
Bảng 25. Kết quả nhuộm miễn dịch với kit KTp16ICC và kit CINtec đợt II 114
Bảng 26. Kết quả ELISA trên mẫu dịch tế bào cổ tử cung với kit KTp16ELISA và
JC8 115
Bảng 27. Độ lặp lại nội phản ứng của kit ELISA p16
INK4A
trên dich tế bào HeLa và
protein p16
INK4A
tái tổ hợp 124

Bảng 28. Độ lặp lại liên phản ứng của kit KTp16ELISA trên dich tế bào HeLa và protein
p16
INK4A
tái tổ hợp 124
Bảng 29. Độ lặp lại liên phản ứng của kit KTp16ELISA trên dich tế bào HeLa và protein
p16INK4Atái tổ hợp 125
Bảng 30. Kết quả ELISA p16
INK4A
trên dịch tế bào HeLa và MCF-7 126













x



DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1. ELISA và immuno PCR 9
Hình 2. Các kiểu ELISA 25

Hình 3. Sơ đồ phương pháp checkerboard 26
Hình 4. Sơ đồ phương pháp immunoPCR 28
Hình 5. Sản phẩm PCR từ các gene E7/HPV 1, E7/HPV 6 32
Hình 6. Sản phẩm PCR từ gene E7 HPV16 với các cặp mồi E7-Nde/E7-Sal;
E7-Bsa/E7-Sal, E7-Nco/E7-Sal 32
Hình 7. Sản phẩm PCR từ gene p16
INK4A
với cặp mồi p16-Nde/p16-Sal; cặp mồi
p16-Bsa/p16-Sal; p16-Nco/p16-Sal 32
Hình 8. Sản phẩm PCR từ gene L1 HPV 16 và L1 HPV 18 với cặp mồi
L1/16f-Nhe/ L1/16r-Hind và L1/18f-Eco/ L1/18r-Xho 33
Hình 9. Sản phẩm PCR từ các plasmid tái tổ hợp mang gene E7 HPV11 và
E7 HPV6 35
Hình 10. Sản phẩm PCR từ các plasmid tái tổ hợp mang gene E7 HPV16. 34
Hình 11. Sản phẩm PCR từ các plasmid tái tổ hợp mang gene p16
INK4A
35
Hình 12.Sản phẩm PCR từ các plasmid tái tổ hợp mang gene L1 HPV16 và L1
HPV18 35
Hình 13. Kết quả SDS-PAGE và Western blot từ các vector pET-E7,
pETM-E7, pSUMO-E7, pGAT-E7 37
Hình 14. Kết quả SDS-PAGE và Western blot từ các vector pET-p16,
pETM-p16, pSUMO-p16, pGAT-p16 38
Hình 15. Kết quả SDS-PAGE và Western blot từ các vector pET-E7/6,
pET-E7/11 39
Hình 16. Kết quả SDS-PAGE và Western blot từ các vector pET-L1/16 và
pET-L1/18 40
Hình 17. Kết quả SDS-PAGE với protein p16
INK4A
, E7 HPV 16, E7 HPV 6, E7 HPV 11

trước và sau tinh sạch 41
xi

Hình 18. Kết quả SDS-PAGE với các vector pET-p16, pETM-p16, pSUMO-p16,
pGAT-p16 ở các nhiệt độ cảm ứng khác nhau 43
Hình 19. Kết quả SDS-PAGE từ dịch protein thu nhận với các vector pET-p16,
pETM-p16, pSUMO-p16, pGAT-p16 ở các nồng độ IPTG khác nhau 44
Hình 20. Kết quả SDS-PAGE từ dịch protein thu nhận với các vector pET-p16,
pETM-p16, pSUMO-p16, pGAT-p16 ở các thời gian cảm ứng khác nhau 45
Hình 21. Kết quả khảo sát nồng độ imidazole cho vector pE-SUMO, pET-28a 48
Hình 22. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của 3 dung dịch 1, dung dịch 2, dung
dịch 3 49
Hình 23. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của 2 chất biến tính protein 50
Hình 24. Kết quả tinh sạch protein p16
INK4A
từ vector pE-SUMO3 tái tổ hợp 51
Hình 25. Kết quả ELISA trên huyết thanh của 2 chuột trước và sau khi gây đáp ứng miễn
dịch với protein E7 HPV16 53
Hình 26. Kết quả ELISA trên huyết thanh của 4 chuột trước và sau khi gây đáp ứng miễn
dịch với protein p16
INK4A
53
Hình 27. Biểu đồ thể hiện kết quả sàng lọc các dòng hydridoma có khả năng tạo kháng
thể kháng E7 HPV 16 trên 102 giếng tế bào lai ở10 đĩa 96 giếng 54
Hình 28 . Biểu đồ thể hiện kết quả sàng lọc các dòng hydridoma có khả năng tạo kháng
thể kháng p16
INK4A
trên 49 giếng tế bào lai ở 10 đĩa 96 giếng. 55
Hình 29. Kết quả xác định isotype của các KTĐD kháng protein E7 HPV 16 sản xuất bởi
dòng tế bào lai 2C1 và 6B10 bằng bộ Isotyping ELISA Kit (BD) 56

Hình 30. Kết quả xác định isotype của các KTĐD kháng protein p16
INK4A
sản xuất bởi
dòng tế bào lai 1C10 và 5A1 bằng bộ Isotyping ELISA Kit (BD) 56
Hình 31. Kết quả điện di SDS-PAGE KTĐD 2C1 57
Hình 32. Kết quả điện di SDS-PAGE KTĐD 1C10 57
Hình 33. Đồ thị xác định hằng số ái lực của KTĐD 2C1 với kháng nguyên E7
HPV16 58
Hình 34. Đồ thị xá định hằng số ái lực của KTĐD 1C10 với kháng nguyên
p16
INK4A
58
Hình 35. Kết quả SDS-PAGE và Western blot trên KTĐD kháng E7 HPV 6, E7 HPV 11,
E7 HPV 16, E7 HPV 18 với các protein tái tổ hợp tương ứng 59
xii

Hình 36. Kết quả Western blot giữa KTĐD 2C1 với dịch ly giải tế bào CaSki, C-33 A và
protein E7 HPV-16 tái tổ hợp 60
Hình 37. Kết quả SDS-PAGE và Western blot trên KTĐD 1C10 với protein p16
INK4A
tái
tổ hợp 61
Hình 38. Kết quả Western blot của các KTĐD 1C10 và thương mại với dịch ly giải tế
bào HeLa, MCF7 và protein p16
INK4A
tái tổ hợp 58
Hình 39. Đồ thị xác định điều kiện nuôi cấy tế bào 4H5 để đạt mật độ tối đa 63
Hình 40 . Tăng trưởng tế bào và nồng độ KTĐD thu được với mật độ cấy thấp và cao 64
Hình 41. Sự thay đổi mật độ tế bào, tỉ lệ tế bào sống, nồng độ kháng thể 64
Hình 42. Sự thay đổi mật độ tế bào và nồng độ kháng thể theo thời gian trong các môi

trường có nồng độ huyết thanh khác nhau và môi trường SFM, với mật độ cấy thấp (2 x
10
5
tế bào/ml) và cao (2 x 10
6
tế bào/ml) 65
Hình 43. Sự thay đổi mật độ tế bào, nồng độ kháng thể trong môi trường bổ sung 5 %
FBS khi nuôi bằng bioreactor với mật độ cấy 5 x 10
5
tế bào/ml và 1 x 10
6
tế bào/ml 64
Hình 44. Sự thay đổi mật độ tế bào, nồng độ kháng thể trong môi trường có bổ sung 5 %
FBS và 10 % FBS khi nuôi bằng bioreactor với mật độ cấy 5 x 10
5
tếbào/ml 67
Hình 45. Các dạng immunoPCR và ELISA 68
Hình 46. Đồ thị hằng số ái lực của KTĐD 4H5-biotin với E7 HPV 18 tái tổ hợp 70
Hình 47. PCR tạo DNA đánh dấu biotin. 70
Hình 48. Kết quả kiểm tra sự biotin hóa DNA bằng streptavidin cộng hợp alkaline
phosphatase 70
Hình 49. Đồ thị khảo sát nồng độ kháng thể 1D5 phủ giếng 71
Hình 50. Đồ thị khảo sát nồng độ kháng thể 4H5-biotin 72
Hình 51. Đồ thị khảo sát nồng độ STV-AP 72
Hình 52. Kết quả khảo sát nồng độ DNA đánh dấu biotin 73
Hình 53. Sản phẩm PCR với các nồng độ streptavidin 73
Hình 54. Sản phẩm PCR với các tác nhân khóa giếng và số chu kì PCR khác nhau 74
Hình 55. Nhuộm hóa tế bào miễn dịch sử dụng KTĐD kháng E7 HPV 18 – 1D5 trên
dòng tế bào HeLa và C-33 A với các nồng độ kháng thể 10µg/ml, 5 µg/ml và
2,5 µg/ml 76

xiii

Hình 56. Nhuộm hóa tế bào miễn dịch sử dụng KTĐD kháng E7 HPV 16 – 2C1 trên
dòng tế bào CaSki và C-33 A với các nồng độ kháng thể 20µg/ml, 10 µg/ml, 5 µg/ml và
2,5µg/ml 76
Hình 57. Nhuộm hóa tế bào miễn dịch sử dụng KTĐD kháng p16
INK4A
– 1C10 trên dòng
tế bào HeLa và MCF-7 với các nồng độ kháng thể 20 µg/ml, 10 µg/ml, 5 µg/ml và
2,5µg/ml 77
Hình 58. Nhuộm hóa tế bào miễn dịch với KTĐD 1D5 (10 µg/ml) trên tế bào HeLa, C-
33 A, CHO-K1 chuyển vector pEGFP-E7 HPV 18, CHO-K1 chuyển vector pEGFP-C2,
CaSki 77
Hình 59. Nhuộm hóa tế bào miễn dịch sử dụng kháng thể 2C1 (5 µg/ml) trên các dòng tế
bào HeLa, CaSki, C-33 A, MCF-7 78
Hình 60. Nhuộm hóa tế bào miễn dịch sử dụng kháng thể 1C10 (10 µg/ml) trên các dòng
tế bào HeLa, CaSki, C-33 A, MCF-7 78
Hình 61. Các tác nhân sử dụng trong cố định và bảo quản tế bào : PFA 1%, ethanol 30%,
methanol 30% và acetone 10% 79
Hình 62. Nhuộm hóa tế bào miễn dịch trên lame kính sử dụng KTĐD 1D5 trên dòng tế
bào HeLa và C-33 A với các nồng độ kháng thể 20 µg/ml, 10 µg/ml, 5 µg/ml và 2,5µg/ml
80
Hình 63. Nhuộm hóa tế bào miễn dịch trên lame kính sử dụng KTĐD 2C1 trên dòng tế
bào CaSki và C-33 A với các nồng độ kháng thể 80 µg/ml, 40 µg/ml, 20 µg/ml và
10µg/ml 80
Hình 64. Nhuộm hóa tế bào miễn dịch trên lame kính sử dụng KTĐD 1C10 trên dòng tế
bào HeLa và MCF-7 với các nồng độ kháng thể 80 µg/ml, 40 µg/ml, 20 µg/ml và
10µg/ml 81
Hình 65. Nhuộm hóa tế bào miễn dịch trên dòng HeLa và C-33 A với kháng thể 1D5 (10
µg/ml), tác nhân bộc lộ kháng nguyên là citrate 10mM/EDTA 1mM pH 6, Tris

10mM/EDTA 1mM pH 9 và citrate 10mM pH 6 81
Hình 66. Nhuộm hóa tế bào miễn dịch trên dòng CaSki và C-33 A với kháng thể 2C1 (20
µg/ml), sử dụng tác nhân bộc lộ kháng nguyên là citrate 10mM/EDTA 1mM pH 6, Tris
10mM/EDTA 1mM pH 9 và citrate 10mM pH 6 82
xiv

Hình 67. Nhuộm hóa tế bào miễn dịch trên dòng HeLa và MCF-7 với kháng thể 1C10
(80 µg/ml), sử dụng tác nhân bộc lộ kháng nguyên là citrate 10mM/EDTA 1mM pH 6,
Tris 10mM/EDTA 1mM pH 9 và citrate 10mM pH 6 82
Hình 68. Nhuộm hóa tế bào miễn dịch trên dòng HeLa với kháng thể 1C10 (80 µg/ml),
sử dụng tác nhân bộc lộ kháng nguyên là Tris 10mM/EDTA 1mM pH 9 theo 2 phương
pháp là đun trong bể ổn nhiệt và microwave, ở 2 thời gian xử lý là 10 phút và 20 phút . 83
Hình 69. Nhuộm hóa tế bào miễn dịch trên dòng tế bào HeLa, CaSki, C-33 A và MCF-7
với KTĐD 1D5 (10 µg/ml) 83
Hình 70. Nhuộm hóa tế bào miễn dịch trên dòng tế bào HeLa, CaSki, C-33 A và MCF-7
với KTĐD 2C1 (20 µg/ml) 84
Hình 71. Nhuộm hóa tế bào miễn dịch trên dòng tế bào HeLa, CaSki, C-33 A và MCF-7
với KTĐD 1C10 (80 µg/ml) 84
Hình 72. Kết quả nhuộm miễn dịch với KTĐD 1C10 tế bào HeLa và tế bào MCF-7
(chứng âm) trong các dung dịch bảo quản (1-11) và ở các mốc thời gian từ 0 đến 150
ngày 87
Hình 73. Sơ đồ phương pháp ELISA “sandwich” gián tiếp 88
Hình 74. Giá trị OD450 ở các nồng độ kháng thể phủ giếng của 1C10 và JC8 89
Hình 75. Giá trị OD450 ở các nồng độ kháng thể “phát hiện” với kháng thể bắt giữ là
1C10 và JC8 90
Hình 76. Giá trị OD450 ở các nồng độ kháng thể “cộng hợp HRP” với kháng thể “bắt
giữ” là 1C10 và JC8 91
Hình 77.Giá trị OD450 ở các nồng độ tác nhân khoá giếng BSA và FBS khác nhau 92
Hình 78. Tế bào CaSki và C-33A nhuộm miễn dịch ở các lần thử nghiệm khác nhau tại
PTN Công ty Khoa Thương 103

Hình 79. Tế bào CaSki và C-33A nhuộm miễn dịch ở hai đơn vị: Khoa Thương và BV
Hùng Vương 104
Hình 80. Kết quả miễn dịch huỳnh quang trên tế bào CHO-K1/EGFP-E7-16, CHO-
K1/EGFP-C2 với KTĐD 2C1 quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang (20X) ở bước sóng
541 nm và 488 nm. 106
Hình 81. Kết quả miễn dịch huỳnh quang trên tế bào CaSki, C-33 A với KTĐD 2C1
quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang (20X) ở bước sóng 541 nm và 488 nm 107
xv

Hình 82. Tế bào HeLa và MCF-7 nhuộm miễn dịch ở các lần thử nghiệm khác tại Công
ty Khoa Thương. 110
Hình 83. Tế bào HeLa và MCF-7 nhuộm miễn dịch ở hai đơn vị: Khoa Thương và BV
Hùng Vương 111
Hình 84. Tế bào CHO-K1/EGFP và CHO-K1/EGFP-E7 nhuộm miễn dịch huỳnh quang
với KTĐD 1D5 quan sát ở bước sóng 488 và 541 nm (100X) 113
Hình 85. Tế bào HeLa và Beas-2B nhuộm miễn dịch huỳnh quang với 1D5 (40 X). 112
Hình 86. Tế bào cổ tử cung nhuộm miễn dịch với kit KTp16ICC và kit CINtec 115
Hình 87. Tế bào HeLa và MCF-7 nhuộm miễn dịch với kit KTp16ICC với các lần lặp
lại 116
Hình 88. Tế bào HeLa và MCF-7 nhuộm miễn dịch với kit KTp16ICC ở các đơn vị: BV
Bình Dương, BV Thủ Đức, Khoa Thương, BV Hùng Vương 117
Hình 89. Kết quả miễn dịch huỳnh quang trên tế bào CHO-K1 EGFP-p16
INK4A
và CHO-
K1 pEGFP-C2 bằng KTĐD 1C10 (20X) 118
Hình 90. Kết quả lai miễn dịch huỳnh quang trên tế bào HeLa và MCF7 với KTĐD 1C10
(20X). 116
Hình 91. Tế bào HeLa và MCF-7 nhuộm miễn dịch với kit KTp16ICC bảo quản ở các
thời gian khác nhau 120
Hình 92. Kết quả nhuộm miễn dịch tế bào HeLa (A) và tế bào MCF-7 (B) với kit

KTp16ICC ở các lô sản xuất khác nhau. 120
Hình 93. Biểu đồ phân bố giá trị mật độ quang của các mẫu từ người có kết quả Pap bình
thường (control) và người có kết quả Pap bất thường (patient) với hệ thống ELISA trên
kháng thể 1C10 (A), JC8 (B) 122
Hình 94. Đồ thị đường cong R.O.C của kit KTp16ELISA với KTĐD 1C10 (A) và JC8
(B) 123
Hình 95. Kết quả xác định độ nhạy của kit KTp16ELISA 126

1

ĐẶT VẤN ĐỀ


Ở Việt Nam theo công bố của WHO (2010) thì UTCTC được xếp thứ 5 trong số
các dạng ung thư ở phụ nữ và xếp thứ nhất trong nhóm tuổi từ 15 đến 44 với tỷ lệ mắc là
11.7/100.000 người/năm. Tỷ lệ tử vong do UTCTC là 5.6/100.000 người và xếp thứ tư
trong số các dạng ung thư ở phụ nữ mọi lứa tuổi. Dự đoán đến 2025, số ca mắc mới tăng
40 % cho lứa tuổi dưới 65 và 80 % cho lứa tuổi trên 65 ; trong khi tỷ lệ tử vong tăng lần
lượt là 62 % và 75 % cho lứa tuổi dưới và trên 65.
UTCTC có liên quan chặt chẽ với sự nhiễm HPV (Human Papillomavirus). Virus
này gồm nhiều týp trong đó nhóm các týp “nguy cơ cao” là nguyên nhân gậy UTCTC và
một số dạng ung thư khác như ung thư hậu môn, âm đạo, đầu và cổ. Do UTCTC diễn tiến
rất chậm, có thể đến vài chục năm nên việc phát hiện sớm các tổn thương tiền ung thư có
ý nghĩa lớn cho việc phòng và điều trị bệnh.
Xét nghiệm tế bào học, Pap test, là công cụ tầm soát UTCTC được sử dụng rộng
rãi trên toàn thế giới. Tuy nhiên, Pap test vẫn có một số hạn chế, với tỷ lệ âm tính giả có
thể lên đến 20-30 % và phụ thuộc nhiều vào chủ quan của người đọc. Xét nghiệm HPV
DNA týp “nguy cơ cao” cũng được khuyến cáo cho tầm soát lại có nhược điểm khác do
tỷ lệ người nhiễm HPV týp “nguy cơ cao” diễn tiến thành UTCTC chỉ vào khoảng 1 %.
Như vậy việc phát hiện chính xác những trường hợp sẽ thật sự diễn tiến thành ung thư sẽ

giúp can thiệp kịp thời nhưng hạn chế những can thiệp quá mức cần thiết.
Đó là lý do ngày càng nhiều “chỉ thị sinh học” (biomarker) được đề xuất trong tầm
soát, tiên lượng và chẩn đoán UTCTC. Có hai nhóm “chỉ thị sinh học”, nhóm từ virus như
DNA HPV, E6/E7 HPV “nguy cơ cao”, …, và nhóm từ tế bào như protein p16
INK4A
, ki-
67, TERC, MCM, … Trong đó, protein E6/E7 các týp HPV “nguy cơ cao” và p16
INK4A

thu hút nhiểu sự chú ý do sự tăng hàm lượng của chúng phản ánh được quá trình diễn tiến
từ tế bào bình thường đến tình trạng ung thư .
Đề tài này tạo các kháng thể đơn dòng (KTĐD) kháng E7 HPV 16 và 18, và
p16
INK4A
và sử dụng các KTĐD này để phát triển các quy trình và kit nhằm phát hiện sớm
các trường hợp có khả năng diễn tiến thành UTCTC.



2

PHẦN 1. TỔNG QUAN
1.1. Các protein virus HPV và protein tế bào liên quan đến ung thư cổ tử cung
(UTCTC)
Bình thường, khi xâm nhiễm cổ tử cung, HPV sẽ biểu hiện và nhân bản chủ yếu
trong các tế bào biểu mô nền và cận nền (basal - parabasal) đã biệt hóa, là những tế bào
vốn không tồn tại lâu trong cơ thể. Tuy nhiên, nếu cơ chế điều hòa biểu hiện gene ở virus
và sự biệt hóa của tế bào chủ bị phá vỡ thì HPV sẽ nhân bản được trong các tế bào biểu
mô mầm chưa biệt hóa cao và sẽ tương tác với quá trình phân chia bình thường của tế bào
biểu mô dẫn đến sự xuất hiện khối u. Diễn tiến UTCTC do các týp HPV "nguy cơ cao"

khởi đầu chủ yếu với tác động của hai oncoprotein của virus, E6 và E7. Protein E7 gây
mất ổn định pRb vốn là một protein quan trọng trong sự điều hòa phân bào, làm rối loạn
quá trình phân bào và dẫn đến những bất thường về số lượng và cấu trúc nhiễm sắc thể ở
tế bào chủ, là những tiền đề cho sự phát triển khối u (zur Hausen, 2002).
Như vậy, hai thành phần chủ chốt trong diễn tiến UTCTC là các oncoprotein virus
và các protein điều hòa ở tế bào chủ.
1.1.1. Các protein virus, oncoprotein E7 và protein cấu trúc L1
 E7 là protein nhỏgồm 100 amino acid, có tính acid. E7 là một protein có khả năng
tương tác với rất nhiều protein đóng vai trò quan trọng trong điều hòa sự phân chia tế bào
như pRb, p107, p130, các cyclin như cyclin A hay cyclin E, hay các phân tử ức chế các
CDK (Cyclin Dependent Kinase - cyclin phụ thuộc kinase) như p27
Kip1
…. E7 gây bất
hoạt chức năng của chúng trong tế bào, khiến các tế bào bị HPV xâm nhiễm vốn ở trạng
thái không phân bào chuyển sang trạng thái phân bào liên tục không kiểm soát và hình
thành khối u(zur Hausen, 2002).
 L1 là protein vỏ capsid chính của HPV, có cấu trúc pentamervà có khối lượng phân tử
khoảng 55.000 dalton. Protein này cùng với protein vỏ capsid phụ là L2 chỉ được tạo ra
trong các tế bào đã biệt hóa nằm ở lớp ngoài cùng của biểu mô. Sau khi được tổng hợp ở
tế bào chất, L1 và L2 được chuyển vào nhân để đóng gói thành các phần tử virus mới. L1
có tính bảo tồn rất cao giữa các týp HPV đồng thời có khả năng gây đáp ứng miễn dịch
mạnh. Ngoài ra, L1 còn có khả năng tự lắp ghép thành các phần tử giống virus (virus like
particle - VLP) có cấu trúc và khả năng gây miễn dịch tương tự như virus thật. Khả năng
này thuận lợi cho việc tạo ra các VLP in vitro dùng trong chẩn đoán và tạo vaccine. Một
số công bố phát hiện HPV thông qua kháng thể kháng L1 như công trình của Sehr và
3

cộng sự (2002). Đặc biệt, hai loại vaccine được FDA công nhận là Gardasil (HPV 16, 18,
6,11) và Cervarix (HPV 16, 18) được hình thành dựa trên protein L1 này.
1.1.2. Các protein tế bào

Các công trình nghiên cứu biomarker (dấu ấn sinh học) để phát hiện sớm UTCTC
đã đề xuất nhiều ứng viên như các protein MCM5 (minichromosome maintenance),
CDC6 (cell division cycle), p16
INK4A
, Ki-67, topoisomerase 2A (Wentzensen & von
Knebel Doeberitz, 2007). Trong số đó, hầu hết các công trình đều thống nhất xem
p16
INK4A
, do gene CDKN2Amã hóa, như một dấu ấn sinh học nhạy và đặc hiệu cho các tế
bào loạn sản cổ tử cung, dạng vảy và dạng tuyến. Đây là một protein ức chế khối u (tumor
suppressor protein) mà nếu mất đi hay giảm biểu hiện có thể dẫn đến nhiều dạng ung thư
ở người (tụy, thực quản, dạ dày, …). Protein này lại có biểu hiện vượt mức trong tế bào
UTCTC. Cơ chế này liên quan đến sự bất hoạt pRb bởi oncoprotein E7 của các týpHPV
“nguy cơ cao”. Protein pRb bất hoạt sẽ giải phóng E2F, nhân tố phiên mã hoạt hóa biểu
hiện của gene CDKN2A, dẫn đến sự tăng hàm lượng p16
INK4A
trong tế bào loạn sản. Biểu
hiện của p16
INK4A
liên kết chặt chẽ với sự nhiễm các týp HPV “nguy cơ cao” (Klaes & cs,
2001 ; Murphy & cs, 2005).
1.2. Tổng quan về kháng thể đơn dòng (KTĐD)
1.2.1. Sản xuất kháng thể đơn dòng bằng kỹ thuật tạo tế bào lai (hybridoma)
Kỹ thuật sản xuất KTĐD được đề xuất bởi hai nhà khoa học Cesar Milstein và
Georges Köhler năm 1975. Kỹ thuật này dựa trên nguyên tắc lai tế bào u tủy (myeloma)
với tế bào lympho B đã hoạt hóa. Tế bào u tủy là tế bào có khả năng phân chia vô hạn
trong điều kiện nuôi cấy in vitro nhưng không tạo được kháng thể. Ngược lại, tế bào
lympho B có khả năng tổng hợp kháng thể nhưng sẽ chết sau một thời gian nuôi cấy vì là
những tế bào tận cùng của quá trình biệt hóa. Do đó, tế bào lai (hybridoma) sẽ kết hợp
được ưu điểm phân chia vô hạn của tế bào u tủy và sản xuất kháng thể của tế bào B.

KTDĐ là kháng thể thu nhận được từ một dòng tế bào lai đã được phân lập và tạo dòng
(Ausubel, 2001).
KTĐD sản xuất từ kỹ thuật tạo tế bào lai đã được ứng dụng rộng rãi cho nghiên
cứu và trở thành những công cụ chẩn đoán hiệu quả. Ngày nay, nhiều kỹ thuật mới đã ra
đời nhằm tạo ra các KTĐD có khả năng dùng trong điều trị bệnh ở người.