ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC Tự NHIÊN

VŨ DIỆU THU

PHAT HIỆN VA XAC ĐỊNH
Klebsiella pneumoniae MANG GEN BLAKPC
KHANG CARBAPENEM

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh - năm 2011


LỜI CÁM ƠN
Tôi xin dành những lời cám ơn chân thành nhất gửi đến tất cả những người đã
luôn bên cạnh tôi, giúp tôi có được thành công ngày hôm nay.
Lời đầu tiên, xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến TS.BS Phạm Hùng Vân, người
thầy đã trực tiếp hướng dẫn khoa học, truyền đạt cho tôi những kiến thức bổ ích và
kinh nghiệm quý báu. Thầy luôn động viên và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi hoàn
thành khóa luận.
Cũng những lời tri ân này, xin gửi tới các thầy cô trường Đại học Khoa Học Tự
Nhiên - những người đã trang bị cho tôi nền tảng kiến thức vững chắc để tôi tự tin
bước vào con đường nghiên cứu.
Tôi có được may mắn vì đề này nằm trong luận án tiến sĩ của Th.S Trần Nhật
Phương nên tôi nhận được rất nhiều sự hỗ trợ từ Anh. Cám ơn Anh đã cung cấp cho tôi
các chủng để tiến hành thí nghiệm cũng như đã theo sát từng bước đi của tôi, cho tôi
những góp ý rất chân thành, giúp đề tài này đuợc hoàn thiện trong thời gian sớm nhất.
Xin gửi lời cảm ơn đến các anh chị, bạn bè ở công ty Nam Khoa đã nhiệt tình
giúp đỡ và tạo một môi trường làm việc thân thiện giúp tôi có động lực làm việc tốt
hơn.

Cảm ơn rất nhiều những người bạn đã luôn sát cánh, dõi theo tôi, những người
đã cùng tôi chia sẻ buồn vui trong những năm tháng đi học, những người mà nếu thiếu
họ chắc tôi khó lòng hoàn thành luận văn này một cách trọn vẹn.
Và cuối cùng, từ tận đáy lòng, con biết ơn bố mẹ đã dành cho con cả cuộc đời
này. Gia đình luôn là điểm tựa vững chắc cho con những lúc khó khăn nhất, giúp con
có thêm động lực, niềm tin vào những gì mình làm, giúp con nên người trưởng thành
như ngày hôm nay.
Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 20 tháng 7 năm 2011
Vũ Diệu Thu


Trang
DANH MUC CHÜ VIET TAT


Trang 4
ASTS

Antibiotics Sensitivity Testing Surveillance

CLSI

Clinical and Laboratory Standards Insitute

dNTP

deoxyribonucleotide triphosphate

ESBL


Expanded Spectrum Beta-lactamase

FDA

Food and Drug Administration

ICARE

Intensive Care Antimicrobial Resisstance Epidemiology

K. pneumoniae

Klebsiella pneumoniae

KIA

Kligler Iron Agar

KPC

Klebsiella pneumonia Carbapenemase

MC agar

Mac Conkey agar

MH

Mueller Hinton


MHA

Mueller Hinton Agar

MIC

Minium Inhibitory Concentration

NCBI

National Center for Borotechnology Information

ONPG

o-nitrophenyl-D-galactopyranoside

PBP

penicillin-binding protein

PCR

Polymerase Chain Reaction

TBE

Tris/Borate/EDTA
DANH MỤC BANG



Trang
DANH MỤC HÌNH

Hình 3.11 Kết quả tra cứu trình tự tương đồng với chủng K. pneumoniae ATCC ®
1705 dùng trong thí nghiệm bằng công cụ BLAST của NCBI.................................75
Hình 3.12 Tìm vị trí cắt giới hạn trong trình tự gen blaKPC bằng phần mềm
Primer premier 5.0 77


Trang

MỤC LỤC

PHỤ LỤC
Phu lục 1: Kết quả định danh bằng IDS 14 ® GNR
Phu lục 2: Kết quả giải trình tự gen 16S rRNA
Phu lục 3: Hình ảnh kháng sinh đồ của 21 chủng thí nghiệm
Phu lục 4: Kết quả giải trình tự gen blaKPC của các chủng thí nghiệm


Trang

ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong cuộc chiến tranh giữa con người và vi khuẩn, kháng sinh là những trợ thủ đắc lực cho con người. Thuốc kháng
sinh không ngừng được cải biến về chất lượng và phổ tác dụng nhằm tăng cường hiệu quả điều trị. Tuy nhiên, việc sử dụng
kháng sinh rộng rãi đã dẫn tới sự gia tăng các chủng vi khuẩn đa kháng thuốc với nhiều cơ chế khác nhau, đáng chú ý là cơ chế

sản xuất men ESBL (extended spectrum beta-lactamase) có khả năng thủy phân các thế hệ kháng sinh cephalosporin và hầu hết
các loại beta-lactam. Đối với các trường hợp này, kháng sinh carbapenem được xem là phương án cuối cùng. Vũ khí
carbapenem hiện nay đang có nguy cơ trở nên vô hiệu do sự xuất hiện của các vi khuẩn có khả năng tiết men carbapenemase,

đáng lo ngại nhất là men KPC (Klebsiella pneumoniae Carbapenemase) phát hiện chủ yếu ở Klebsiella pneumoniae.
Klebsiella pneumoniae được biết đến là tác nhân phổ biến các trường hợp viêm phổi bệnh viện và nhiều bệnh nhiễm
trùng nguy hiểm khác. Chủng này có khả năng tích lũy và lan truyền tính kháng rất cao. Gần đây, vi khuẩn Klebsiella
pneumoniae mang gen blaKPC kháng carbapenem đã và đang bùng phát trên một số quốc gia trên thế giới và gây ra những đợt
dịch lớn điển hình như ở New York[17, 18, 20, 69], Isarel [46]. Đây thực sự là thách thức đối các nhà điều trị và gánh nặng cho
cộng đồng bởi vì việc trị liệu rất hạn chế, những vi khuẩn mang gen này được xem là “bất trị”. Hơn nữa, gen blaKPC nằm trên
plasmid nên khả năng lan truyền tính kháng rất nhanh và còn có thể cộng hợp với các họ gen kháng khác trên plamid làm cho
những chủng mang gen này có tính kháng mạnh hơn. Tổ chức Y tế thế giới đã lên tiếng cảnh báo về sự lây lan của các vi
khuẩn Klebsiella pneumoniae mang gen blaKPC để các nước có biện pháp kiểm soát sự lây nhiễm và tránh lạm dụng, sử dụng
thuốc kháng sinh sai mục đích. Tuy nhiên, ở Việt Nam, cho đến nay vẫn chưa có nghiên cứu nào về mô hình lan truyền của
siêu vi khuẩn này.
Đề tài “Phát hiện và xác định Klebsiella pneumoniae mang gen blaKPC kháng carbapenem” được thực hiện nhằm phát
hiện được một số chủng Klebsiella pneumoniae mang gen blaKPC ở một số bệnh viện ở Việt Nam. Qua đó giúp cho các nhà
lâm sàng Việt Nam kịp thời có biện pháp cách ly, ngăn chặn sự lây lan cũng như có cái nhìn thận trọng hơn về sự lan truyền
của đối tượng này.
Nội dung thực hiện đề tài bao gồm các phần:
+ Định danh lại các chủng nghi ngờ là Klebsiella pneumoniae có tính đa kháng thu được từ một số bệnh viện tại Việt
Nam.
+ Xác định kiểu hình tiết ESBL và carbapenemase.


Trang
+ Phát hiện gen blaKPC bằng phương pháp PCR.
+ Xác định kiểu gen blaKPC trên các chủng Klebsiella pneumoniae bằng phương pháp giải trình tự.


Trang

1. TỒNG QUAN
1.1 Vi khuẩn Klebsiella pneumoniae

1.1.1

Đặc điêm phân loại
Năm 1884, nhà khoa học người Đan Mạch Hans Christian Gram (18531938)

đã phát triển kĩ thuật nhuộm Gram để phân biệt Klebsiella pneumoniae và
Streptococcus pneumoniae. Klebsiella được đặt theo tên nhà vi khuẩn học người Đức
thế kỉ 19, Edwin Klebs (1834-1913) [24].
Dựa vào độ tương đồng di truyền, chi Klebsiella được chia làm 8 loài:
Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Klebsiella planticola, Klebsiella
terrigena, Klebsiella mobilis (Enterobacter aerogenes), Klebsiella ornithinolytica và
Klebsiella variicola. Klebsiella pneumoniae lại được chia làm 3 loài phụ là Klebsiella
pneumoniae, Klebsiella ozaenae và Klebsiella rhinoscleromatis. Sự phân chia này dựa
theo sự khác nhau trong quá trình phát sinh bệnh chứ không phải dựa vào khoảng cách
di truyền [24]. Trong chi Klebsiella, Klebsiella pneumoniae là thành viên quan trọng
nhất về bệnh học và đã trở thành một trong những tác nhân gây nhiễm khuẩn bệnh
viện nghiêm trọng trong những năm gần đây [52].
Đặc điểm phân loại của Klebsiella pneumoniae:
Giới:
Bacteria
Ngành :

Proteobacteria

Lớp:

Gammaproteobacteri
a

Bộ:


Enterobacteriales

Họ:

Enterobacteriaceae

Chi:

Klebsiella

Klebsiella
pneumoniae
Đặc điểm hình thái, sinh hóa và phân bố
Loài:

1.1.2


Trang
Klebsiella pneumoniae là trực khuẩn Gram âm, không di động, có vỏ
polysacharide đặc trưng. Lớp áo này giúp vi khuẩn tránh được hàng rào phòng vệ của
tế bào chủ [52].

Hình 1.1 Hình kính hiển vi quét của khuấn lạc K. pneumoniae [76]
K. pneumoniae sống kị khí tùy ý, có khả năng lên men lactose. K. pneumoniae
có quan hệ gần nhất với Klebsiella oxytoca, chúng phân biệt nhau nhờ phản ứng
indole, K. pneumoniae có indole âm và có khả năng tăng trưởng với cả melezitose và
3-hydroxybutyrate [52]. Một số phản ứng sinh hóa của các loài trong chi Klebsiella
được thống kê trong bảng 1.1.

Vi khuấn này có mặt khắp nơi trong tự nhiên như ở đất, nước, nước thải, các
sản phấm thực vật, những thức ăn có hàm lượng đường và acid cao. Một số
loài trong chi Klebsilla còn được phân lập từ bề mặt rễ của một số loài thực
vật với vai trò cố định nitơ. Klebsiella spp. có phổ kí chủ động vật rộng, bao
gồm cả côn trùng và nhiều nhóm động vật khác. Ở người có thể tìm thấy
chúng ở da, cổ họng, đường ruột, dạ dày, nước tiểu hay vết thương vô trùng
[24, 52]. Nguồn phân lập phổ biến của các loài trong chi Klebsiella được mô tả
trong bảng 1.2.


Bảng 1.1 Một số thử nghiệm sinh hóa của các loài chi Klebsiella [3]
Loài

KIA/TSI

PAD

URE

IND MOB

CIT

V
P

MR

LDC MLO


ONPG

OXI

NO2

K. pneumoniae

-

+

+

+

+

-

-

+

Trang
-

-

+


+

-

+

+

+

K .oxytoca

-

+

+

+

+

-

-

+

+


-

+

+

-

+

+

+

K .omithinolytica

-

+

+

+

+

-

-


+

+

-

+

+
/-

+

+

+

+

K. planticola

-

+

+

+


+

-

-

+

-

-

+

+

+

+

+

+

K. ozanae

-

+


+

+
/-

+
/-

-

-

-

-

-

+
/-

-

+

+
/-

-


+

K. rhinoscleromatis

-

+

+

-

-

-

-

-

-

-

-

-

+


-

+

-

K. terrigena

-

+

+

+

+

-

-

-

-

-

+
/-


+

+
/-

+

+

+

Ghi chú:

GLU

LAC GAS H2S

(-) thử nghiệm âm tính; (+) thử nghiệm dương tính; (+/-) trên 70% là dương tính.
(OXI) thử nghiệm oxidase; (GLU) khả năng lên men glucose; (LAC) khả năng lên men lactose; (GAS) khả năng sinh

hơi; (H2S) khả năng sinh H2S; (PAD) thử nghiệm phenylalanine deaminase, (URE) thử nghiệm urease; (IND) thử nghiệm
indol; (MOB) tính di động; (CIT) khả năng biến dưỡng citrat; (VP) thử nghiệm Voges - Proskauer; (MR) thử nghiệm methyl
red; (LDC) thử nghiệm decarboxylase; (MLO) khả năng biến dưỡng malonate; (ONPG) thử nghiệm ONPG.


TỒNG QUAN

Trang



Bảng 1.2 Nguồn phân lập Klebsiella [3]
Loài

Nguồn phân lập
Phân lập được từ các bệnh phẩm trên người như

Klebsiella pneumoniae

viêm phổi, apxe phổi, viêm phổi, viêm màng não,
nhiễm trùng tiểu, nhiễm trùng huyết.

Klebsiella oxytoca

Phân lập được từ các bệnh phẩm trên người và gây
nhiều nhiễm trùng khác nhau.
Là tác nhân gây viêm mũi teo và nhiễm trùng mủ ở

Klebsiella ozanae

màng nhầy của mũi. Ngoài ra vi khuẩn này còn có
thể phân lập được từ các nhiễm trùng: máu, nước
tiểu, mô mềm.

Klebsiella planticola

Phân lập được từ máu, đàm, nước tiểu, vết thương
Phân lập được từ nước và thực vật. Ở người, vi

Klebsiella ornithinolytica


khuẩn này thường được phân lập ở đường hô hấp
trên, nước tiểu, dịch não tùy và máu.

Klebsiella rhinoscleromatis

Phân lập được từ màng nhầy đường hô hấp, mũi
hầu, xoang mũi.
Nguồn phân lập chính là đất và nước, có thể phân

Klebsiella terrigena

lập được từ phân người khỏe mạnh, đường hô hấp
nhưng không gây bệnh cho người.

1.1.3

Các nhân tố gây bệnh
Các thành viên trong chi Klebsiella đều biểu hiện 2 loại kháng nguyên bề mặt: kháng


nguyên O có bản chất lipopolysaccharide và kháng nguyên vỏ K có bản chất polysaccharide.
Có khoảng hơn 80 kháng nguyên K và 9 kháng nguyên O. Cả hai kháng nguyên này là cơ sở
cho sự phân nhóm huyết thanh và đều góp phần vào quá trình phát sinh bệnh. Dựa vào tính
biến động trong cấu trúc của những kháng nguyên này, người ta lại phân loại thành nhiều
kiểu huyết thanh khác nhau. Độc tính của tất cả các loại huyết thanh dường như là như nhau
[52].
Cũng như các loài khác trong họ vi khuẩn đường ruột, Klebsiella bám dính lên bề mặt
tế bào chủ nhờ hệ thống lông pili được cấu tạo bởi những đơn vị protein hình cầu có khối
lượng phân tử khoảng 15-26kDa. Những lông pili này có khả năng đông tụ hồng cầu của

nhiều loài động vật khác nhau [52].
Để vượt qua hàng rào phòng vệ của tế bào chủ, ngoài việc thoát khỏi sự thực bào do
hoạt động của các bạch cầu đa nhân, vi khuẩn phải còn phải tìm cách thoát khỏi ảnh hưởng
của các chất diệt khuẩn trong huyết thanh. Hoạt tính diệt khuẩn chủ yếu qua trung gian các
protein bổ thể. Bổ thể được hoạt hóa khi có hay không có kháng thể đặc hiệu nhưng đều dẫn
tới hoạt hóa protein C3, hình thành opsonin C3b và sản phẩm cuối cùng là protein C5b-C9.
Protein này tạo ra các kênh xuyên màng ở màng ngoài tế bào vi khuẩn làm cho Na+ được
bơm vào trong, thay đổi ấp suất thẩm thấu bên trong tế bào vi khuẩn. Cho tới nay, cơ chế giúp
vi khuẩn kháng huyết thanh vẫn chưa rõ. Đối với Klebsiella, giả thuyết được đưa ra là do lớp
vỏ polysaccharide bao bọc và che lớp lipopolysaccharide nằm ở dưới hoặc do chuỗi bên của
kháng nguyên O xuyên qua lớp vỏ tạo thành cấu trúc bề mặt không hoạt hóa bổ thể [52].
Để tăng trưởng được trong mô tế bào chủ, vi khuẩn phải được cung cấp đủ sắt. Đây là
nhân tố thiết yếu cho sự tăng trưởng của vi khuẩn, có chức năng xúc tác các phản ứng oxi hóa
khử trong quá trình truyền điện tử. Tuy nhiên, do nguồn sắt tự do trong tế bào chủ rất thấp
nên nhiều vi khuẩn đảm bảo đủ lượng sắt cho tăng trưởng bằng cách tiết ra những chất kìm
phân tử lượng nhỏ, có ái lực cao với sắt được gọi là các siderophore. Ở Klebsiella người ta
nhận thấy đã có sự sản xuất hai loại siderophore là enterobactin và aerobactin [24, 52].
1.1.4

Đặc điếm gây bệnh và tình hình đề kháng kháng sinh
Klebsiella là tác nhân đứng thứ 2 sau E.coli gây nhiễm khuẩn bệnh viện và cộng


đồng. Chúng có thể gây bệnh viêm phổi, apxe phổi, viêm màng phổi và những nhiễm trùng
ngoài phổi như viêm ruột, viêm màng não, nhiễm khuẩn huyết, nhiễm khuẩn đường tiết niệu.
Yếu tố nguy cơ để nhiễm các chủng này ở bệnh viện là do bệnh nhân thời gian nằm viện kéo
dài, hệ miễn dịch suy yếu, nằm chung giường với người nhiễm bệnh hay thực hiện những thủ
thuật xâm lấn như đặt ống thông tiểu, đặt nội khí quản,...Tuy nhiên, nhiễm khuẩn bệnh viện
do Klebsiella tăng cao chủ yếu do việc sử dụng kháng sinh làm gia tăng những chủng kháng
thuốc [24, 52].

Tính đề kháng kháng sinh của các thành viên trong gia đình Klebsiella rất cao. Tất cả
đã đề kháng với ampicillin do sự có mặt của gen mã hóa sản xuất beta- lactamase đặc hiệu
cho penicillin. Thông thường, các enzyme beta-lactamase vốn có này còn nhạy cảm với các
chất ức chế beta-lactamase như acid clavulanic, tuy nhiên từ năm 1982 tại Đức đã xuất hiện
K. pneumoniae có tính đa kháng do tiết được men beta-lactamase phổ rộng hay còn gọi là
ESBL (extended spectrum betalactamase). Các enzyme này được truyền qua trung gian
plasmid nên có tính chất lây lan trên diện rộng, tính nhạy cảm giảm hẳn với các thuốc ức chế
beta- lactamase, và nguy hiểm hơn lại có tính đa kháng thông qua trung gian plasmid với các
họ kháng sinh khác như với aminoglycoside. Đối với các chủng tiết ESBL, việc lựa chọn
kháng sinh điều trị rất khó khăn do chúng kháng được với nhiều loại kháng sinh. Carbapenem
(imipenem, ertapenem, meropenem) được coi là kháng sinh có tác dụng nhất. Tuy nhiên,
“siêu vi khuẩn” K. pneumoniae có khả năng kháng carbapenem với một số cơ chế khác nhau
đang bùng phát và trở thành mối nguy cho sức khỏe cộng đồng [52].


Trang
1.2 Carbapenem và cơ chế kháng carbapenem
1.2.1 Carbapenem
Carbapenem là một phân lớp của kháng sinh beta-lactam, có phổ kháng khuẩn rộng
nhất so với các phân lớp khác của beta-lactam như penicillin, các thế hệ cephalosporin.
Carbapenem có nguồn gốc là một dẫn xuất của thienamycin, một hợp chất tự nhiên do
Streptomyces cattlaya tiết ra [15, 60].
Carbapenem với cấu trúc hơi giống penicillin, gồm 1 vòng beta-lactam hình vuông
nối kết với 1 vòng 5 cạnh, nhưng khác với penicillin ở chỗ nguyên tố lưu huỳnh thay bằng
gốc methylen và có thêm 1 dấu nối đôi . Cấu trúc đặc biệt của carbapenem tạo ra 3 đặc tính
giúp carbapenem có phổ tác dụng rộng: (1) những phân tử này rất nhỏ và có khả năng sử
dụng những lỗ hổng rất nhỏ của màng ngoài vi khuẩn Gram âm để tiếp xúc với PBP
(penicillin-binding protein); (2) cấu trúc của carbapenem làm cho kháng sinh này khó bị betalactamase của nhiều loại vi khuẩn cắt đứt vòng beta-lactam; (3) carbapenem có ái lực với
nhiều PBP khác nhau của nhiều loại vi khuẩn.
Hình 1.2 Cấu trúc của penicillin và carbapenem

Carbapenem [74]
Penicilline [75]


Trang
Bảng 1.3 Phân lớp các kháng sinh beta-lactam [2]
Lớp kháng
Lớp phụ
sinh

Penicilin

Tên kháng sinh

Penicillin

Penicillin

Aminopenicillin

Amoxillin, ampicillin

Ureidopenicillin

Azlocillin, mezlocillin, piperacillin.

Carboxylpenicilli
n
Penicillinase- bền
penicillin


Carbenicillin, ticarcillin

Amidinopenicilli
n

Cloxacillin, dicloxacillin, methincillin,
nafcillin, oxacillin
Mecillinam
Ampicillin/sulbactam

P-lactam/hợp
chất ức chế
P-lactam

Amoxicillin/clavulanate
Ticarcillin/clavulanate
Cephalosporin I
Cephalosporin II

Cephem
(chích)

Cefem
(uống)

Cephalosporin III

Cefoperazone, cefotaxime, ceftazidime,
ceftizoxime, ceftiaxone


Cephalosporin IV

Cefepime

Cephamycin

Cefmetazole, cefotetan, cefoxitin

Cephalosporin

Cefator, cefadroxil, cefdinir, cefditoren,
cefetamet, cefixime, cefpodoxime (axetil),
cefprozil, ceftibuten, cefuroxime, cephalexin,
cepharadine

Carbacephem

Locacarbef

Monobacta
m
Penems

Piperacillin/Tazobactam
Cefazolin, cephalothin, cephapirin,
cephradine
Cefamandole, cefocicid, ceftaroline,
cefuroxime (sodium)


Aztreonam
Carbapenem

Imipenem, meropenem, doripenem, ertapenem,
cefmetazole

Penem

Faropenem

Kháng sinh thuộc nhóm carbapenem gồm có: imipenem, meropenem, ertapenem,


Trang
doripenem, panipenem/ betamipron, biapenem. Trong đó imipenem, meropenem, ertapenem
là các loại thông dụng, doripenem cũng đã được FDA chấp nhận sử dụng để chữa trị các
trường hợp nhiễm trùng ổ bụng và nhiễm trùng tiểu nặng [28]. Carbapenem thường được sử
dụng để chữa trị các trường hợp nhiễm khuẩn gây ra bởi vi khuẩn Gram âm sản xuất betalactamase phổ rộng (ESBL) [20, 22, 39, 60, 71], điển hình trong một số trường hợp như viêm
màng não mủ, viêm xoang do nhiễm khuẩn bệnh viện, viêm phổi do nhiễm khuẩn bệnh viện,
nhiễm trùng không rõ nguồn gốc.
1.2.2

Cơ chế kháng carbapenem
Tính kháng với carbapenem chủ yếu do 3 cơ chế:

-

Sản xuất vượt mức một loại beta-lactamase không phải carbapenemase như AmpC
cephalosporinase hay ESBL kết hợp với giảm tính thấm màng ngoài do mất hoặc thay thế
kênh porin làm chặn cổng vào của kháng sinh. Cơ chế này được nhận thấy ở Enterobacter

cloacae, Enterobacter aerogens, Proteus rettgeri, Citrobacter freundii, Escherichia coli, K.
pneumoniae [71, 72]. Ở K. pneumoniae, kênh porin màng OmpK35và OmpK36 giữ vai trò
quan trọng, sự thiếu hay thay thế một trong hai protein này đều đóng góp vào tính kháng
carbapenem [36].

-

Sản xuất carbapenemase có khả năng thủy giải carbapenem nhờ hoạt tính thủy phân cầu
amide của vòng beta-lactam. Đây là cơ chế chủ yếu được thấy ở K. pneumoniae [71, 72]. Với
vũ khí Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC), K. pneumoniae đã gây ra nhiều đợt
dịch trên thế giới với những hậu quả nghiêm trọng.

-

Sự thay đổi ái lực của các protein gắn penicillin (PBP) đối với carbapenem làm cho kháng
sinh này không tiếp cận được với chuỗi peptidoglycan đang được tổng hợp của vi khuẩn [71,
72]. Cơ chế kháng carbapenem này trên K. pneumoniae ít được nghiên cứu.
Ở K. pneumoniae, vấn đề hệ thống bơm đấy kháng sinh ra ngoài AcrAB có
liên quan tính kháng carbapenem hay không vẫn chưa được làm rõ [36], tuy nhiên đã
có nghiên cứu chứng minh rằng sự biểu hiện vượt mức hệ thống này có làm cho vật
chủ mở rộng phổ kháng kháng sinh, chúng có khả năng kháng chéo với
chloramphenicol, quinolone [14].


Trang
1.2.3

Carbapenemase
Carbapenemase là enzyme thuộc họ P-lactamase bất hoạt được tất cả các loại


P-lactam như penicillin, cephalosporin phổ rộng và kể cả kháng sinh mạnh nhất hiện
nay là carbapenem [53].


Trang
Bảng 1.4 Các men beta-lactamase chọnTEM
lọc ởvà
vi SHV
khuấn Gram
[32].
Cácâm
hoạt
chất nhóm broad
Ức chế
spectrum trên cộng
vớibởi
Hoạt chấtoxyimino-cephalosporins
clavulanic

Betalactamas
e

Ví dụ

acid
(cefotaxime, cefpodoxime,

++++
Lớp
phâ


A

n

ceftazidime,
Benzylpenicillin (penicillin
G), và ceftriaxone) và tử
monobactam (aztreonam)
amino-penicillins (amoxicillin
Giống như TEM và SHV
and
ampicillin),
Khác (BES-1,
carboxypenicillins
GES/IBC,
PER-1, 2,
TEM-1, 2, SHV-1

(carbenicillin
SFO-1, TLA-1, và ticarcillin),
ureidopenicillin
(piperacillin),
VEB-1, 2)
CTX-M
cephalosporins

Broad-

(cefazolin,


spectrum

++++
A

+++

A

phổ
hẹpnhóm ESBL cộng với
Hoạt chất
cephalothin,
cefepime

cefamandole,
cefuroxime,
vàCTX-M
OXA
Giống như

OXA

A
+

các thuốc khác)
ACC-1, ACT-1,
Hoạt chất nhóm expandedCác hoạt chất nhóm broadCFE-1, CMY,

spectrum
cộng
thêm
spectrum trên cộng thêm
DHA-1, 2, FOX,
cephamycins
+ (cefotetan,D
cloxacillin, methicillin, và
LAT, MIR-1, MOX- cefoxitin, và thuốc khác)
oxacillin
1, 2

AmpC

++++

D

0

C

Hoạt chất nhóm expandedIMP, VIM, GIM-1,
Carbape
nemase

và SPM-1

spectrum


cộng

với

cephamycins và carbapenems
(ertapenem,

imipenem,

0

B

+++

A

+

D

và

meropenem)
KPC-1, 2, 3

Giống như IMP, VIM, GIM-1,
và SPM-1

OXA-23, 24, 25, 26, Giống như IMP, VIM, GIM-1,

27, 40, 48

và SPM-1

Dựa vào cơ chế thủy giải tại vị trí hoạt hóa, carbapenemase được phân làm 2
nhóm:


Trang
-

Non-metallo-carbapenemase: có serin tại trung tâm hoạt động của enzyme, hoạt tính
bị ức chế bởi clavulanic.

-

Metallo-carbapenemase: có nhân sắt tại trung tâm hoạt động, bị ức chế bởi EDTA,
không bị ảnh hưởng bởi clavulanic.
Dựa vào chức năng thủy giải, beta-lactamase được phân làm 4 nhóm từ nhóm
1 đến 4. Trong đó, nhóm 2 được chia làm nhiều nhóm phụ dựa trên sự chuyên biệt cơ
chất và các chất ức chế. Carbapenemase chủ yếu thuộc nhóm 3 và nhóm phụ 2f [53].
Dựa vào đặc tính phân tử, carbapenemase được chia làm 3 lớp

-

Lớp A: thuộc nhóm non-metallo-beta-lactamase, gồm các loại sau:
+ Nguồn gốc NST: Serratia marcescens enzyme (SME)
■ Not metalloenzyme carbapenemases (NMC)
■ Imipenem-hydrolyzing ß-lactamases (IMI)
+ Nguồn gốc plasmid:

■ Klebsiella pneumoniae carabapenemases (KPC)
■ Guiana Extended-Spectrum (GES)

-

Lớp B: thuộc nhóm metallo-beta-lactamases, bao gồm IMP, GIM, SIM, SPM, và
VIM carbapenemases, được ghi nhận ở Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter
baumanii và một số vi khuẩn đường ruột. Mới đây là NDM-1, một carbapenemase
nằm trên plasmid, phát hiện ở K. pneumoniae và E. coli, phân lập từ mẫu bệnh phẩm
của bệnh nhân người Thụy Điển nhập viện tại New Delhi, Ân Độ.

-

Lớp D: bao gồm oxacilinase, chủ yếu tìm thấy ở Acinetobacter baumanii.
1.3 Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC)
1.3.1 Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC)
Trước đây các men carbapenemase được cho là chuyên biệt cho loài, do gen
mã hóa nằm trên nhiễm sắc thể với các đặc tính rõ ràng. Tuy nhiên, với việc phát hiện
các carbapenemase do gen mã hóa nằm trên plasmid, điển hình là KPC (Klebsiella
pneumoniae Carbapenemase), đã làm thay đối cách nhìn nhận về mô hình lan truyền
của tác nhân kháng thuốc này. Sự gia tăng nhanh chóng các chủng mang gen blaKPC


Trang
trong thời gian gần đây càng cho thấy tầm quan trọng của việc tìm hiểu đặc tính của
các men này trong nghiên cứu lâm sàng học.
KPC là một carbapenemase đầu tiên được tìm thấy ở K. pneumoniae, thuộc
lớp A, nhóm 2f, bị ức chế bởi clavulanic. Kết quả của việc sản xuất enzyme này là vi
khuẩn có khả năng đề kháng với tất cả penicillin, cephalosporin (cefepime,
ceftriaxone), carbapenems (meropenem, ertapenem), và aztreonam. Vi khuẩn đường

ruột tiết men KPC hầu hết còn kháng được các lớp kháng sinh khác như
fluoroquinolone, aminoglycoside [16, 34, 38, 46, 62].
KPC do gen mã hóa nằm trên plasmid, plasmid có thể ở dạng dung hợp hay
không dung hợp. Trình tự gen blaKPC nằm giữa trình tự transposon Tn44001, vị trí
của gen blaKPC ở K. pneumoniae và một số loài khác được mô tả trong hình 1.3.
Việc kết hợp gen blaKPC với các họ gen kháng khác nằm trên plasmid như
fluoroquinolone, aminoglycosides làm tăng cường tính kháng cho vi khuẩn. Hơn nữa,
plasmid là yếu tố di truyền di động, có thể dễ dàng di truyền ngang giữa các loài lân
cận nên khả năng truyền tính kháng là rất cao [22, 53, 58].


Trang

Có 3 loại isoenzyme của KPC đã được xác định rõ ràng. Trình tự gen blaKPC2 sai biệt 1 nu so với blaKPC-1 dẫn đến sự biến đổi serine thành glycine ở vị trí 175.
Trình tự gen blaKPC-3 khác biệt một nu so với blaKPC-2 dẫn đến sự thay thế
tyrosine thành histidine tại vị trí 272 [31]. Sự khác nhau này giúp ta phân biệt 3 biến
thể gen blaKPC này dựa trên sản phẩm gen sau khi cắt bởi 2 loại enzyme cắt giới hạn
BstNI và RsaI như hình 1.4. Tuy là men KPC-3 có hiệu quả thủy giải cao hơn KPC-1
và KPC-2 nhưng tầm quan trọng lâm sàng vẫn chưa rõ ràng. KPC-3 được nhận thấy
có ở K. pneumoniae [37, 56, 69], Enterobacter cloacae [19], Hiện nay đã phát hiện
các biến thể khác của KPC ( từ 2-11) [21].


Trang

Hình 1.4 Sự khác biệt giữa KPC-1, KPC-2 và KPC-3 [30].
]

c ai


San phàm POR ban đâu
11 I San phàm PCR đã đươc cãt bơi Bst'N i vá Rsal

1.3.2 Phát hiện và điều trị nhiễm khuẩn kháng carbapenem
Một số phương pháp phát hiện vi khuẩn mang gen blaKPC thông qua việc phát
hiện carbarpenemase đã được sử dụng bao gồm:
- Sử dụng môi trường chọn lọc CHROMagar KPC có bổ sung tác nhân ức chế vi
khuẩn Gram âm và dương nhạy carbapenem [57].
-

Phương pháp đĩa khuyếch tán kháng sinh dựa trên sự xác định đường kính vòng vô
khuẩn quanh đĩa carbapenem [67].


Trang
-

Phương pháp vi pha loãng dựa trên sự xác định giá trị nồng độ ức chế tối thiểu MIC
của các kháng sinh carbapenem. Cùng với phương pháp đĩa khuyếch tán kháng sinh,
đây được coi là phương pháp đánh giá tiêu chuẩn trong các phòng thí nghiệm, được
biện luận theo tiêu chuẩn của CLSI [67].

-

Sử dụng que thử E-test được cấu tạo bằng nitrocellulose tẩm kháng sinh carbapenem
theo dãy nồng độ để xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC. Khi đặt que E-test trên
môi trường đã trải vi khuẩn, kháng sinh từ que khuyếch tán ra môi trường theo
gradient nồng độ và ức chế sự phát triển của vi khuẩn tạo thành vùng vô khuẩn có
hình elip. Một số hệ thống tự động như MicroScan WalkAway (Dade MicroScan,
Inc), BD Phoenix (BDDS), Sensititre AutoReader (Westlake, Mỹ), VITEK Legacy

(bioMérieux) và VITEK 2 (bioMérieux) giúp xác định MIC carbapenem cũng đã
được nghiên cứu sử dụng [63, 64].

-

Thử nghiệm Hodge cải biên: là thử nghiệm có độ nhạy cao giúp khẳng định kiểu hình
tiết carbapenemase. Thử nghiệm này dựa trên nguyên tắc những chủng có khả năng
tiết carbapenemase có khả năng tăng cường sự tăng trưởng của chủng E.coli ATCC ®
25922 nhạy carbapenem ở trong vùng vô khuẩn đĩa carbapenem [67].

-

Phương pháp dựa trên APB (3-aminophenylboronic acid): APB là một dẫn xuất của
boronic có khả năng ức chế enzyme carbapenemase lớp A. Phương pháp này dựa sự
mở rộng đường kính vòng vô khuẩn từ đĩa carbapenem tới vùng giao tiếp với đĩa
chứa chất ức chế carbapenemase APB đối với những chủng tiết carbapenemase lớp A
[49].

-

Phương pháp PCR hay realtime-PCR dựa trên sự khuếch đại vùng gen blaKPC bằng
cặp mồi chuyên biệt [30, 59]. Phương pháp này có độ nhạy và độ chuyên biệt cao
nhưng cũng có trường hợp kết quả dương tính giả do sự ngoại
nhiễm hay âm tính giả do trình tự mồi không đặc hiệu, các thành phần phản ứng không
tối ưu.
- Phương pháp giải trình tự: phương pháp này bổ sung cho phương pháp
khuếch đại PCR nhằm xác định chính xác kiểu gen blaKPC [25].