ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

VŨ DIỆU THU

PHÁT HIỆN VÀ XÁC ĐỊNH
Klebsiella pneumoniae MANG GEN BLAKPC
KHÁNG CARBAPENEM

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh - năm 2011


LỜI CÁM ƠN
Tôi xin dành những lời cám ơn chân thành nhất gửi đến tất cả những người đã
luôn bên cạnh tơi, giúp tơi có được thành cơng ngày hơm nay.
Lời đầu tiên, xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến TS.BS Phạm Hùng Vân, người thầy
đã trực tiếp hướng dẫn khoa học, truyền đạt cho tôi những kiến thức bổ ích và kinh
nghiệm q báu. Thầy ln động viên và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tơi hồn thành
khóa luận.
Cũng những lời tri ân này, xin gửi tới các thầy cô trường Đại học Khoa Học Tự
Nhiên – những người đã trang bị cho tôi nền tảng kiến thức vững chắc để tôi tự tin
bước vào con đường nghiên cứu.
Tơi có được may mắn vì đề này nằm trong luận án tiến sĩ của Th.S Trần Nhật
Phương nên tôi nhận được rất nhiều sự hỗ trợ từ Anh. Cám ơn Anh đã cung cấp cho tôi
các chủng để tiến hành thí nghiệm cũng như đã theo sát từng bước đi của tơi, cho tơi
những góp ý rất chân thành, giúp đề tài này đuợc hoàn thiện trong thời gian sớm nhất.
Xin gửi lời cảm ơn đến các anh chị, bạn bè ở công ty Nam Khoa đã nhiệt tình
giúp đỡ và tạo một mơi trường làm việc thân thiện giúp tơi có động lực làm việc tốt
hơn.

Cảm ơn rất nhiều những người bạn đã luôn sát cánh, dõi theo tôi, những người
đã cùng tôi chia sẻ buồn vui trong những năm tháng đi học, những người mà nếu thiếu
họ chắc tơi khó lịng hồn thành luận văn này một cách trọn vẹn.
Và cuối cùng, từ tận đáy lòng, con biết ơn bố mẹ đã dành cho con cả cuộc đời
này. Gia đình ln là điểm tựa vững chắc cho con những lúc khó khăn nhất, giúp con
có thêm động lực, niềm tin vào những gì mình làm, giúp con nên người trưởng thành
như ngày hôm nay.
Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 20 tháng 7 năm 2011
Vũ Diệu Thu


Trang v

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
ASTS

Antibiotics Sensitivity Testing Surveillance

CLSI

Clinical and Laboratory Standards Insitute

dNTP

deoxyribonucleotide triphosphate

ESBL

Expanded Spectrum Beta-lactamase


FDA

Food and Drug Administration

ICARE

Intensive Care Antimicrobial Resisstance Epidemiology

K. pneumoniae

Klebsiella pneumoniae

KIA

Kligler Iron Agar

KPC

Klebsiella pneumonia Carbapenemase

MC agar

Mac Conkey agar

MH

Mueller Hinton

MHA


Mueller Hinton Agar

MIC

Minium Inhibitory Concentration

NCBI

National Center for Borotechnology Information

ONPG

o-nitrophenyl-D-galactopyranoside

PBP

penicillin-binding protein

PCR

Polymerase Chain Reaction

TBE

Tris/Borate/EDTA

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT


Trang viii


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1 Một số thử nghiệm sinh hóa của các lồi chi Klebsiella............................ 5
Bảng 1.2 Nguồn phân lập Klebsiella ...................................................................... 6
Bảng 1.3 Phân lớp các kháng sinh beta-lactam .......................................................10
Bảng 1.4 Các men beta-lactamase chọn lọc ở vi khuẩn gram âm ............................12
Bảng 1.5 Phân bố của gen blaKPC theo thời gian và vùng địa lý ............................21
Bảng 2.1 Hướng dẫn đọc kết quả các phản ứng sinh hóa trong bộ IDS14 GNR® ....35
Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR khuếch đại gen 16S rRNA ............................38
Bảng 2.3 Hướng dẫn biện luận tính kháng của nhóm Enterobacteriacea theo CLSI
2011 .......................................................................................................................44
Bảng 2.4 Trình tự mồi sử dụng khuyếch đại gen blaKPC .......................................47
Bảng 2.5 Chương trình luân nhiệt Tm55 và Tm60 .................................................48
Bảng 2.6 Tên và nồng độ kháng sinh trong kháng sinh đồ

..................................52

Bảng 3.1 Kết quả định danh bằng bộ hóa chất IDS14 GNR® ................................54
Bảng 3.2 Nồng độ, kích thước sản phẩm PCR gen 16S rRNA sau tinh sạch ...........56
Bảng 3.3 Kết quả xác định các chủng tiết ESBL ....................................................58
Bảng 3.4 Kết quả biện luận tính kháng carbapenem dựa vào đường kính vịng vô
khuẩn quanh đĩa carbapenem ..................................................................................60
Bảng 3.5 So sánh kết quả biện luận tính kháng carbapenem dựa vào MIC và dựa
vào đường kính vịng vơ khuẩn ...............................................................................63
Bảng 3.6 Bảng tổng kết kết quả thu được ...............................................................67
Bảng 3.7 Nồng độ và kích thước sản phẩm PCR gen KPC sau tinh sạch ................72
Bảng 3.8 Đánh giá kết quả thử nghiệm Hodge cải biên (MHT) ..............................81

DANH MỤC BẢNG



Trang vi

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1 Hình kính hiển vi qt của khuẩn lạc K. pneumoniae ............................. 4
Hình 1.2 Cấu trúc của penicillin và carbapenem ................................................... 9
Hình 1.3 Vị trí của gen blaKPC ở K. pneumoniae và một số loài khác ................ 16
Hình 1.4 Sự khác biệt giữa KPC-1, KPC-2 và KPC-3 .......................................... 17
Hình 1.5 Phân bố dịch tễ gen blaKPC (năm 2009) ............................................... 23
Hình 2.1 Hướng dẫn định danh vi khuẩn gram âm dễ mọc nhờ bộ IDS14 GNR® 36
Hình 2.2 Thử nghiệm Hodge cải biên trên môi trường MHA ............................... 46
Hình 2.3 Sơ đồ đặt các đĩa kháng sinh ................................................................. 52
Hình 3.1 Kết quả ni cấy và quan sát trên kính hiển vi điện tử ........................... 53
Hình 3.2 Hình ảnh điện di chip gen 16S rRNA .................................................... 56
Hình 3.3 Kết quả kháng sinh đồ chủng 17 ............................................................ 59
Hình 3.4 Kết quả xác định MIC meropenem bằng phương pháp vi pha lỗng trong
mơi trường lỏng của chủng 04, 05, 13, 18, 20. ...................................................... 62
Hình 3.5 Kết quả thử nghiệm Hodge cải biên (MHT)........................................... 65
Hình 3.6 Kết quả điện di sản phẩm PCR khuyếch đại gen KPCu và KPC của chủng
chứng âm và chứng dương.................................................................................... 68
Hình 3.7 Kết quả điện di gen KPC và KPCu của 21 chủng thí nghiệm ................ 70
Hình 3.8 Kết quả điện đi chip sản phẩm PCR gen blaKPC tinh sạch .................... 72
Hình 3.9 Kết quả giải trình tự gen blaKPC của chủng K. pneumoniae ATCC ®
1705 với cặp mồi blaKPC-F ................................................................................. 74
Hình 3.10 Kết quả giải trình tự gen blaKPC của chủng K. pneumoniae ATCC ®
1705 với cặp mồi blaKPC-R ................................................................................. 74

DANH MỤC HÌNH



Trang vii

Hình 3.11 Kết quả tra cứu trình tự tương đồng với chủng K. pneumoniae ATCC ®
1705 dùng trong thí nghiệm bằng cơng cụ BLAST của NCBI .............................. 75
Hình 3.12 Tìm vị trí cắt giới hạn trong trình tự gen blaKPC bằng phần mềm Primer
premier 5.0 .......................................................................................................... 77

DANH MỤC HÌNH


Trang i

MỤC LỤC
MỤC LỤC ............................................................................................................. i
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ............................................................................ v
DANH MỤC HÌNH ............................................................................................. vi
DANH MỤC BẢNG ..........................................................................................viii
ĐẶT VẤN ĐỀ ....................................................................................................... 1
1. TỒNG QUAN ................................................................................................... 3
1.1 Vi khuẩn Klebsiella pneumoniae .................................................................. 3
1.1.1 Đặc điểm phân loại ................................................................................ 3
1.1.2 Đặc điểm hình thái, sinh hóa và phân bố................................................ 4
1.1.3 Các nhân tố gây bệnh............................................................................. 7
1.1.4 Đặc điểm gây bệnh và tình hình đề kháng kháng sinh............................ 8
1.2 Carbapenem và cơ chế kháng carbapenem.................................................... 9
1.2.1 Carbapenem........................................................................................... 9
1.2.2 Cơ chế kháng carbapenem .................................................................. 11
1.2.3 Carbapenemase................................................................................... 12
1.3 Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC) ............................................ 15
1.3.1 Klebsiella pneumonia carbapenemase (KPC)....................................... 15

1.3.2 Phát hiện và điều trị nhiễm khuẩn kháng carbapenem ......................... 17
1.3.3 Tình hình dịch tễ học .......................................................................... 19
1.4 Một số nghiên cứu đã thực hiện .................................................................. 23
1.4.1 Trên thế giới ....................................................................................... 23

MỤC LỤC


Trang ii

1.4.2 Trong nước.......................................................................................... 25
2. VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP......................................................................... 27
2.1 Vật liệu....................................................................................................... 27
2.1.1 Các chủng thí nghiệm .......................................................................... 27
2.1.2 Thiết bị................................................................................................ 27
2.1.3 Hóa chất .............................................................................................. 28
2.2 Phương pháp............................................................................................... 28
2.2.1 Phương pháp nhuộm gram ................................................................... 29
2.2.2 Phương pháp định danh sinh hóa ......................................................... 29
2.2.2.1 Nguyên tắc các phản ứng sinh hóa định danh nhóm trực khuẩn
Gram âm .............................................................................................. 30
2.2.2.2 Cách tiến hành ......................................................................... 33
2.2.3 Phương pháp giải trình tự gen 16S RNA.............................................. 36
2.2.3.1 Tách chiết DNA vi khuẩn ......................................................... 37
2.2.3.2 Phản ứng PCR khuyếch đại đoạn gen 16S rRNA ..................... 37
2.2.3.3 Tinh sạch sản phẩm PCR .......................................................... 38
2.2.3.4 Xác định nồng độ DNA sau tinh sạch ....................................... 40
2.2.3.5 PCR giải trình tự....................................................................... 40
2.2.3.6 Tủa và tinh sạch sản phẩm PCR giải trình tự............................. 41
2.2.3.7 Điện di mao quản DNA ........................................................... 42

2.2.3.8 Xử lý kết quả giải trình tự ......................................................... 42
2.2.4 Phương pháp phát hiện vi khuẩn có kiểu hình tiết ESBL...................... 42
2.2.4.1 Phương pháp đĩa đôi ................................................................. 42
MỤC LỤC


Trang iii

2.2.4.2 Phương pháp đĩa kết hợp .......................................................... 43
2.2.5 Phương pháp phát hiện vi khuẩn có khả năng sinh carbapenmase ........ 44
2.2.5.1 Phương pháp khuyếch tán kháng sinh ....................................... 45
2.2.5.2 Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC................ 45
2.2.5.3 Thử nghiệm Hodge cải biên ...................................................... 45
2.2.5 Phương pháp xác định vi khuẩn mang gen blaKPC ............................... 47
2.2.5.1 Phương pháp PCR .................................................................... 47
2.2.5.2 Điện di gel agarose ................................................................... 48
2.2.5.3 Phương pháp giải trình tự gen ................................................... 49
2.2.5.4 Xác định kiểu gen blaKPC........................................................ 50
2.3 Qui trình thí nghiệm ................................................................................... 51
3. KẾT QUẢ BIỆN LUẬN ................................................................................ 53
3.1 Kết quả định danh vi khuẩn ........................................................................ 53
3.1.1 Kết quả định danh sinh hóa ................................................................. 53
3.1.2 Kết quả giải trình tự 16S rRNA ........................................................... 56
3.2 Kiểm tra kiểu hình tiết ESBL...................................................................... 57
3.3. Kiểm tra kiểu hình kháng carbapenem ...................................................... 59
3.3.1 Biện luận tính kháng dựa vào đường kính vịng vơ khuẩn................... 59
3.3.2 Biện luận tính kháng dựa vào MIC ..................................................... 61
3.3.3 Kết quả thử nghiệm Hodge cải biên .................................................... 64
3.4. Xác định gen blaKPC ............................................................................... 68
3.4.1. Kết quả PCR ...................................................................................... 68


MỤC LỤC


Trang iv

3.4.2 Kết quả giải trình tự............................................................................. 71
3.4.3 Xác định kiểu gen blaKPC................................................................... 76
3.5 Tổng kết kết quả thu được .......................................................................... 79
3.5.1 Đánh giá tính kháng của các chủng thí nghiệm .................................... 79
3.5.2 Đánh giá thử nghiệm Hodge cải biên ................................................... 81
4. KẾT LUẬN ĐỀ NGHỊ ................................................................................... 83
4.1 Kết luận ...................................................................................................... 83
4.2 Đề nghị....................................................................................................... 84
TÀI LIỆU THAM KHẢO.................................................................................. 85
Tài liệu tiếng Việt............................................................................................. 85
Tài liệu tiếng Anh............................................................................................. 86
Tài liệu Internet ................................................................................................ 93
PHỤ LỤC
Phu lục 1: Kết quả định danh bằng IDS 14 ® GNR
Phu lục 2: Kết quả giải trình tự gen 16S rRNA
Phu lục 3: Hình ảnh kháng sinh đồ của 21 chủng thí nghiệm
Phu lục 4: Kết quả giải trình tự gen blaKPC của các chủng thí nghiệm

MỤC LỤC


Trang 1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong cuộc chiến tranh giữa con người và vi khuẩn, kháng sinh là những
trợ thủ đắc lực cho con người. Thuốc kháng sinh không ngừng được cải biến về
chất lượng và phổ tác dụng nhằm tăng cường hiệu quả điều trị. Tuy nhiên, việc
sử dụng kháng sinh rộng rãi đã dẫn tới sự gia tăng các chủng vi khuẩn đa kháng
thuốc với nhiều cơ chế khác nhau, đáng chú ý là cơ chế sản xuất men ESBL
(extended spectrum beta-lactamase) có khả năng thủy phân các thế hệ kháng sinh
cephalosporin và hầu hết các loại beta-lactam. Đối với các trường hợp này, kháng
sinh carbapenem được xem là phương án cuối cùng. Vũ khí carbapenem hiện nay
đang có nguy cơ trở nên vô hiệu do sự xuất hiện của các vi khuẩn có khả năng
tiết men carbapenemase, đáng lo ngại nhất là men KPC (Klebsiella pneumoniae
Carbapenemase) phát hiện chủ yếu ở Klebsiella pneumoniae.
Klebsiella pneumoniae được biết đến là tác nhân phổ biến các trường hợp
viêm phổi bệnh viện và nhiều bệnh nhiễm trùng nguy hiểm khác. Chủng này có
khả năng tích lũy và lan truyền tính kháng rất cao. Gần đây, vi khuẩn Klebsiella
pneumoniae mang gen blaKPC kháng carbapenem đã và đang bùng phát trên một
số quốc gia trên thế giới và gây ra những đợt dịch lớn điển hình như ở New
York[17, 18, 20, 69], Isarel [46]. Đây thực sự là thách thức đối các nhà điều trị
và gánh nặng cho cộng đồng bởi vì việc trị liệu rất hạn chế, những vi khuẩn mang
gen này được xem là “bất trị”. Hơn nữa, gen blaKPC nằm trên plasmid nên khả
năng lan truyền tính kháng rất nhanh và cịn có thể cộng hợp với các họ gen
kháng khác trên plamid làm cho những chủng mang gen này có tính kháng mạnh
hơn. Tổ chức Y tế thế giới đã lên tiếng cảnh báo về sự lây lan của các vi khuẩn
Klebsiella pneumoniae mang gen blaKPC để các nước có biện pháp kiểm soát sự
lây nhiễm và tránh lạm dụng, sử dụng thuốc kháng sinh sai mục đích. Tuy nhiên,
ở Việt Nam, cho đến nay vẫn chưa có nghiên cứu nào về mơ hình lan truyền của
siêu vi khuẩn này.

ĐẶT VẤN ĐỀ



Trang 2

Đề tài “Phát hiện và xác định Klebsiella pneumoniae mang gen blaKPC
kháng carbapenem” được thực hiện nhằm phát hiện được một số chủng
Klebsiella pneumoniae mang gen blaKPC ở một số bệnh viện ở Việt Nam. Qua
đó giúp cho các nhà lâm sàng Việt Nam kịp thời có biện pháp cách ly, ngăn chặn
sự lây lan cũng như có cái nhìn thận trọng hơn về sự lan truyền của đối tượng
này.
Nội dung thực hiện đề tài bao gồm các phần:
+ Định danh lại các chủng nghi ngờ là Klebsiella pneumoniae có tính đa
kháng thu được từ một số bệnh viện tại Việt Nam.
+ Xác định kiểu hình tiết ESBL và carbapenemase.
+ Phát hiện gen blaKPC bằng phương pháp PCR.
+ Xác định kiểu gen blaKPC trên các chủng Klebsiella pneumoniae bằng
phương pháp giải trình tự.

ĐẶT VẤN ĐỀ


Trang 3

1. TỒNG QUAN
1.1 Vi khuẩn Klebsiella pneumoniae
1.1.1 Đặc điểm phân loại
Năm 1884, nhà khoa học người Đan Mạch Hans Christian Gram (18531938) đã phát triển kĩ thuật nhuộm Gram để phân biệt Klebsiella pneumoniae và
Streptococcus pneumoniae. Klebsiella được đặt theo tên nhà vi khuẩn học người
Đức thế kỉ 19, Edwin Klebs (1834-1913) [24].
Dựa vào độ tương đồng di truyền, chi Klebsiella được chia làm 8 loài:
Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Klebsiella planticola, Klebsiella
terrigena, Klebsiella mobilis (Enterobacter aerogenes), Klebsiella ornithinolytica

và Klebsiella variicola. Klebsiella pneumoniae lại được chia làm 3 loài phụ là
Klebsiella pneumoniae, Klebsiella ozaenae và Klebsiella rhinoscleromatis. Sự phân
chia này dựa theo sự khác nhau trong quá trình phát sinh bệnh chứ không phải dựa
vào khoảng cách di truyền [24]. Trong chi Klebsiella, Klebsiella pneumoniae là
thành viên quan trọng nhất về bệnh học và đã trở thành một trong những tác nhân
gây nhiễm khuẩn bệnh viện nghiêm trọng trong những năm gần đây [52].
Đặc điểm phân loại của Klebsiella pneumoniae:
Giới:

Bacteria

Ngành :

Proteobacteria

Lớp:

Gammaproteobacteria

Bộ:

Enterobacteriales

Họ:

Enterobacteriaceae

Chi:

Klebsiella


Loài:

Klebsiella pneumoniae

TỔNG QUAN


Trang 4

1.1.2 Đặc điểm hình thái, sinh hóa và phân bố
Klebsiella pneumoniae là trực khuẩn Gram âm, không di động, có vỏ
polysacharide đặc trưng. Lớp áo này giúp vi khuẩn tránh được hàng rào phịng vệ
của tế bào chủ [52].

Hình 1.1 Hình kính hiển vi qt của khuẩn lạc K. pneumoniae [76]
K. pneumoniae sống kị khí tùy ý, có khả năng lên men lactose. K.
pneumoniae có quan hệ gần nhất với Klebsiella oxytoca, chúng phân biệt nhau nhờ
phản ứng indole, K. pneumoniae có indole âm và có khả năng tăng trưởng với cả
melezitose và 3-hydroxybutyrate [52]. Một số phản ứng sinh hóa của các lồi trong
chi Klebsiella được thống kê trong bảng 1.1.
Vi khuẩn này có mặt khắp nơi trong tự nhiên như ở đất, nước, nước thải, các
sản phẩm thực vật, những thức ăn có hàm lượng đường và acid cao. Một số lồi
trong chi Klebsilla cịn được phân lập từ bề mặt rễ của một số loài thực vật với vai
trị cố định nitơ. Klebsiella spp. có phổ kí chủ động vật rộng, bao gồm cả cơn trùng
và nhiều nhóm động vật khác. Ở người có thể tìm thấy chúng ở da, cổ họng, đường
ruột, dạ dày, nước tiểu hay vết thương vô trùng [24, 52]. Nguồn phân lập phổ biến
của các lồi trong chi Klebsiella được mơ tả trong bảng 1.2.

TỔNG QUAN



Trang 5

Bảng 1.1 Một số thử nghiệm sinh hóa của các loài chi Klebsiella [3]
KIA/TSI
Loài

OXI NO2

PAD URE IND MOB CIT

VP

MR LDC MLO ONPG

GLU LAC GAS H 2S
K. pneumoniae

-

+

+

+

+

-


-

+

-

-

+

+

-

+

+

+

K .oxytoca

-

+

+

+


+

-

-

+

+

-

+

+

-

+

+

+

K .ornithinolytica

-

+


+

+

+

-

-

+

+

-

+

+/-

+

+

+

+

K. planticola


-

+

+

+

+

-

-

+

-

-

+

+

+

+

+


+

K. ozanae

-

+

+

+/-

+/-

-

-

-

-

-

+/-

-

+


+/-

-

+

K. rhinoscleromatis

-

+

+

-

-

-

-

-

-

-

-


-

+

-

+

-

K. terrigena

-

+

+

+

+

-

-

-

-


-

+/-

+

+/-

+

+

+

Ghi chú: (-) thử nghiệm âm tính; (+) thử nghiệm dương tính; (+/-) trên 70% là dương tính.
(OXI) thử nghiệm oxidase; (GLU) khả năng lên men glucose; (LAC) khả năng lên men lactose; (GAS) khả năng sinh
hơi; (H2S) khả năng sinh H2S; (PAD) thử nghiệm phenylalanine deaminase, (URE) thử nghiệm urease; (IND) thử nghiệm
indol; (MOB) tính di động; (CIT) khả năng biến dưỡng citrat; (VP) thử nghiệm Voges – Proskauer; (MR) thử nghiệm
methyl red; (LDC) thử nghiệm decarboxylase; (MLO) khả năng biến dưỡng malonate; (ONPG) thử nghiệm ONPG.

TỔNG QUAN


Trang 6

Bảng 1.2 Nguồn phân lập Klebsiella [3] [4]

Nguồn phân lập


Loài

Phân lập được từ các bệnh phẩm trên người như
Klebsiella pneumoniae

viêm phổi, apxe phổi, viêm phổi, viêm màng não,
nhiễm trùng tiểu, nhiễm trùng huyết.

Klebsiella oxytoca

Phân lập được từ các bệnh phẩm trên người và
gây nhiều nhiễm trùng khác nhau.
Là tác nhân gây viêm mũi teo và nhiễm trùng mủ

Klebsiella ozanae

ở màng nhầy của mũi. Ngồi ra vi khuẩn này cịn
có thể phân lập được từ các nhiễm trùng: máu,
nước tiểu, mô mềm.

Klebsiella planticola

Phân lập được từ máu, đàm, nước tiểu, vết thương
Phân lập được từ nước và thực vật. Ở người, vi

Klebsiella ornithinolytica

khuẩn này thường được phân lập ở đường hô hấp
trên, nước tiểu, dịch não tùy và máu.
Phân lập được từ màng nhầy đường hô hấp, mũi


Klebsiella rhinoscleromatis

hầu, xoang mũi.
Nguồn phân lập chính là đất và nước, có thể phân

Klebsiella terrigena

lập được từ phân người khỏe mạnh, đường hô hấp
nhưng không gây bệnh cho người.

TỔNG QUAN


Trang 7

1.1.3 Các nhân tố gây bệnh
Các thành viên trong chi Klebsiella đều biểu hiện 2 loại kháng nguyên bề
mặt: kháng nguyên O có bản chất lipopolysaccharide và kháng nguyên vỏ K có bản
chất polysaccharide. Có khoảng hơn 80 kháng nguyên K và 9 kháng nguyên O. Cả
hai kháng nguyên này là cơ sở cho sự phân nhóm huyết thanh và đều góp phần vào
q trình phát sinh bệnh. Dựa vào tính biến động trong cấu trúc của những kháng
nguyên này, người ta lại phân loại thành nhiều kiểu huyết thanh khác nhau. Độc
tính của tất cả các loại huyết thanh dường như là như nhau [52].
Cũng như các loài khác trong họ vi khuẩn đường ruột, Klebsiella bám dính
lên bề mặt tế bào chủ nhờ hệ thống lông pili được cấu tạo bởi những đơn vị protein
hình cầu có khối lượng phân tử khoảng 15-26kDa. Những lông pili này có khả năng
đơng tụ hồng cầu của nhiều lồi động vật khác nhau [52].
Để vượt qua hàng rào phòng vệ của tế bào chủ, ngồi việc thốt khỏi sự thực
bào do hoạt động của các bạch cầu đa nhân, vi khuẩn phải cịn phải tìm cách thốt

khỏi ảnh hưởng của các chất diệt khuẩn trong huyết thanh. Hoạt tính diệt khuẩn chủ
yếu qua trung gian các protein bổ thể. Bổ thể được hoạt hóa khi có hay khơng có
kháng thể đặc hiệu nhưng đều dẫn tới hoạt hóa protein C3, hình thành opsonin C3b
và sản phẩm cuối cùng là protein C5b-C9. Protein này tạo ra các kênh xuyên màng
ở màng ngoài tế bào vi khuẩn làm cho Na+ được bơm vào trong, thay đổi ấp suất
thẩm thấu bên trong tế bào vi khuẩn. Cho tới nay, cơ chế giúp vi khuẩn kháng huyết
thanh vẫn chưa rõ. Đối với Klebsiella, giả thuyết được đưa ra là do lớp vỏ
polysaccharide bao bọc và che lớp lipopolysaccharide nằm ở dưới hoặc do chuỗi
bên của kháng nguyên O xuyên qua lớp vỏ tạo thành cấu trúc bề mặt khơng hoạt
hóa bổ thể [52].
Để tăng trưởng được trong mô tế bào chủ, vi khuẩn phải được cung cấp đủ
sắt. Đây là nhân tố thiết yếu cho sự tăng trưởng của vi khuẩn, có chức năng xúc tác
các phản ứng oxi hóa khử trong q trình truyền điện tử. Tuy nhiên, do nguồn sắt tự
TỔNG QUAN


Trang 8

do trong tế bào chủ rất thấp nên nhiều vi khuẩn đảm bảo đủ lượng sắt cho tăng
trưởng bằng cách tiết ra những chất kìm phân tử lượng nhỏ, có ái lực cao với sắt
được gọi là các siderophore. Ở Klebsiella người ta nhận thấy đã có sự sản xuất hai
loại siderophore là enterobactin và aerobactin [24, 52].
1.1.4 Đặc điểm gây bệnh và tình hình đề kháng kháng sinh
Klebsiella là tác nhân đứng thứ 2 sau E.coli gây nhiễm khuẩn bệnh viện và
cộng đồng. Chúng có thể gây bệnh viêm phổi, apxe phổi, viêm màng phổi và những
nhiễm trùng ngoài phổi như viêm ruột, viêm màng não, nhiễm khuẩn huyết, nhiễm
khuẩn đường tiết niệu. Yếu tố nguy cơ để nhiễm các chủng này ở bệnh viện là do
bệnh nhân thời gian nằm viện kéo dài, hệ miễn dịch suy yếu, nằm chung giường với
người nhiễm bệnh hay thực hiện những thủ thuật xâm lấn như đặt ống thông tiểu,
đặt nội khí quản,…Tuy nhiên, nhiễm khuẩn bệnh viện do Klebsiella tăng cao chủ

yếu do việc sử dụng kháng sinh làm gia tăng những chủng kháng thuốc [24, 52].
Tính đề kháng kháng sinh của các thành viên trong gia đình Klebsiella rất
cao. Tất cả đã đề kháng với ampicillin do sự có mặt của gen mã hóa sản xuất betalactamase đặc hiệu cho penicillin. Thơng thường, các enzyme beta-lactamase vốn
có này còn nhạy cảm với các chất ức chế beta-lactamase như acid clavulanic, tuy
nhiên từ năm 1982 tại Đức đã xuất hiện K. pneumoniae có tính đa kháng do tiết
được men beta-lactamase phổ rộng hay còn gọi là ESBL (extended spectrum
betalactamase). Các enzyme này được truyền qua trung gian plasmid nên có tính
chất lây lan trên diện rộng, tính nhạy cảm giảm hẳn với các thuốc ức chế betalactamase, và nguy hiểm hơn lại có tính đa kháng thơng qua trung gian plasmid với
các họ kháng sinh khác như với aminoglycoside. Đối với các chủng tiết ESBL, việc
lựa chọn kháng sinh điều trị rất khó khăn do chúng kháng được với nhiều loại
kháng sinh. Carbapenem (imipenem, ertapenem, meropenem) được coi là kháng
sinh có tác dụng nhất. Tuy nhiên, “siêu vi khuẩn” K. pneumoniae có khả năng
kháng carbapenem với một số cơ chế khác nhau đang bùng phát và trở thành mối
nguy cho sức khỏe cộng đồng [52].
TỔNG QUAN


Trang 9

1.2 Carbapenem và cơ chế kháng carbapenem
1.2.1 Carbapenem
Carbapenem là một phân lớp của kháng sinh beta-lactam, có phổ kháng
khuẩn rộng nhất so với các phân lớp khác của beta-lactam như penicillin, các thế hệ
cephalosporin. Carbapenem có nguồn gốc là một dẫn xuất của thienamycin, một
hợp chất tự nhiên do Streptomyces cattlaya tiết ra [15, 60].
Carbapenem với cấu trúc hơi giống penicillin, gồm 1 vịng beta-lactam hình
vng nối kết với 1 vòng 5 cạnh, nhưng khác với penicillin ở chỗ nguyên tố lưu
huỳnh thay bằng gốc methylen và có thêm 1 dấu nối đôi . Cấu trúc đặc biệt của
carbapenem tạo ra 3 đặc tính giúp carbapenem có phổ tác dụng rộng: (1) những
phân tử này rất nhỏ và có khả năng sử dụng những lỗ hổng rất nhỏ của màng ngoài

vi khuẩn Gram âm để tiếp xúc với PBP (penicillin-binding protein); (2) cấu trúc của
carbapenem làm cho kháng sinh này khó bị beta-lactamase của nhiều loại vi khuẩn
cắt đứt vịng beta-lactam; (3) carbapenem có ái lực với nhiều PBP khác nhau của
nhiều loại vi khuẩn.

Penicilline [75]

Carbapenem [74]

Hình 1.2 Cấu trúc của penicillin và carbapenem

TỔNG QUAN


Trang 10

Bảng 1.3 Phân lớp các kháng sinh beta-lactam [2]
Lớp kháng
sinh

Tên kháng sinh

Penicillin

Penicillin

Aminopenicillin

Amoxillin, ampicillin


Ureidopenicillin

Azlocillin, mezlocillin, piperacillin.

Carboxylpenicillin

Carbenicillin, ticarcillin

Penicillinase- bền
penicillin

Cloxacillin, dicloxacillin, methincillin,
nafcillin, oxacillin

Amidinopenicillin

Penicilin

Lớp phụ

Mecillinam
Ampicillin/sulbactam

β-lactam/hợp
chất ức chế
β-lactam

Amoxicillin/clavulanate
Ticarcillin/clavulanate
Piperacillin/Tazobactam

Cephalosporin I

Cefazolin, cephalothin, cephapirin, cephradine

Cephalosporin II

Cefamandole, cefocicid, ceftaroline,
cefuroxime (sodium)

Cephalosporin III

Cefoperazone, cefotaxime, ceftazidime,
ceftizoxime, ceftiaxone

Cephalosporin IV

Cefepime

Cephamycin

Cefmetazole, cefotetan, cefoxitin

Cephalosporin

Cefator, cefadroxil, cefdinir, cefditoren,
cefetamet, cefixime, cefpodoxime (axetil),
cefprozil, ceftibuten, cefuroxime, cephalexin,
cepharadine

Carbacephem


Locacarbef

Cephem
(chích)

Cefem
(uống)

Monobactam
Penems

Aztreonam
Carbapenem

Imipenem, meropenem, doripenem,
ertapenem, cefmetazole

Penem

Faropenem

TỔNG QUAN


Trang 11

Kháng sinh thuộc nhóm carbapenem gồm có: imipenem, meropenem,
ertapenem, doripenem, panipenem/ betamipron, biapenem. Trong đó imipenem,
meropenem, ertapenem là các loại thông dụng, doripenem cũng đã được FDA chấp

nhận sử dụng để chữa trị các trường hợp nhiễm trùng ổ bụng và nhiễm trùng tiểu
nặng [28]. Carbapenem thường được sử dụng để chữa trị các trường hợp nhiễm
khuẩn gây ra bởi vi khuẩn Gram âm sản xuất beta-lactamase phổ rộng (ESBL) [20,
22, 39, 60, 71], điển hình trong một số trường hợp như viêm màng não mủ, viêm
xoang do nhiễm khuẩn bệnh viện, viêm phổi do nhiễm khuẩn bệnh viện, nhiễm
trùng khơng rõ nguồn gốc.
1.2.2 Cơ chế kháng carbapenem
Tính kháng với carbapenem chủ yếu do 3 cơ chế:
-

Sản xuất vượt mức một loại beta-lactamase không phải carbapenemase

như AmpC cephalosporinase hay ESBL kết hợp với giảm tính thấm màng ngồi do
mất hoặc thay thế kênh porin làm chặn cổng vào của kháng sinh. Cơ chế này được
nhận thấy ở Enterobacter cloacae, Enterobacter aerogens, Proteus rettgeri,
Citrobacter freundii, Escherichia coli, K. pneumoniae [71, 72]. Ở K. pneumoniae,
kênh porin màng OmpK35và OmpK36 giữ vai trò quan trọng, sự thiếu hay thay thế
một trong hai protein này đều đóng góp vào tính kháng carbapenem [36].
-

Sản xuất carbapenemase có khả năng thủy giải carbapenem nhờ hoạt

tính thủy phân cầu amide của vòng beta-lactam. Đây là cơ chế chủ yếu được thấy ở
K. pneumoniae [71, 72]. Với vũ khí Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC),
K. pneumoniae đã gây ra nhiều đợt dịch trên thế giới với những hậu quả nghiêm
trọng.
-

Sự thay đổi ái lực của các protein gắn penicillin (PBP) đối với


carbapenem làm cho kháng sinh này không tiếp cận được với chuỗi peptidoglycan
đang được tổng hợp của vi khuẩn [71, 72]. Cơ chế kháng carbapenem này trên K.
pneumoniae ít được nghiên cứu. [72, 71]
TỔNG QUAN


Trang 12

Ở K. pneumoniae, vấn đề hệ thống bơm đẩy kháng sinh ra ngồi AcrAB có
liên quan tính kháng carbapenem hay không vẫn chưa được làm rõ [36], tuy nhiên
đã có nghiên cứu chứng minh rằng sự biểu hiện vượt mức hệ thống này có làm cho
vật chủ mở rộng phổ kháng kháng sinh, chúng có khả năng kháng chéo với
chloramphenicol, quinolone [14].
1.2.3 Carbapenemase
Carbapenemase là enzyme thuộc họ β-lactamase bất hoạt được tất cả các loại
β-lactam như penicillin, cephalosporin phổ rộng và kể cả kháng sinh mạnh nhất
hiện nay là carbapenem [53].
Bảng 1.4 Các men beta-lactamase chọn lọc ở vi khuẩn Gram âm [32].
Ức chế bởi
Betalactamase

clavulanic

Hoạt chất

phân

acid

Ví dụ


Lớp

tử

+++

A

+

D

Benzylpenicillin (penicillin G),
amino-penicillins (amoxicillin
and

ampicillin),

carboxypenicillins
TEM-1, 2, SHV-1

(carbenicillin

và ticarcillin),

ureidopenicillin (piperacillin),
cephalosporins

spectrum


phổ

(cefazolin,

Broad-

hẹp

cephalothin,

cefamandole, cefuroxime, và
các thuốc khác)
Các hoạt chất nhóm broadOXA

spectrum
cloxacillin,

trên

cộng

methicillin,

thêm
và

oxacillin

TỔNG QUAN



Trang 13

Các hoạt chất nhóm broad
spectrum
TEM và SHV

trên

cộng

với

oxyimino-cephalosporins
(cefotaxime,

++++

A

++++

A

++++

A

+


cefpodoxime,

D

0

C

0

B

+++

A

+

D

ceftazidime, và ceftriaxone) và
Expandedspectrum
(ESBL)

monobactam (aztreonam)
Khác (BES-1,
GES/IBC, PER-1,
2, SFO-1, TLA-1,


Giống như TEM và SHV

VEB-1, 2)
CTX-M
OXA
ACC-1, ACT-1,
CFE-1, CMY,
AmpC

DHA-1, 2, FOX,
LAT, MIR-1,
MOX-1, 2

Hoạt chất nhóm ESBL cộng
với cefepime
Giống như CTX-M
Hoạt chất nhóm expandedspectrum
cephamycins

cộng

thêm
(cefotetan,

cefoxitin, và thuốc khác)
Hoạt chất nhóm expanded-

IMP, VIM, GIM-1,
và SPM-1
Carbape-


spectrum

cộng

với

cephamycins và carbapenems
(ertapenem,

imipenem,

và

meropenem)

nemase
KPC-1, 2, 3
OXA-23, 24, 25,
26, 27, 40, 48

Giống như IMP, VIM, GIM-1,
và SPM-1
Giống như IMP, VIM, GIM-1,
và SPM-1

TỔNG QUAN


Trang 14


Dựa vào cơ chế thủy giải tại vị trí hoạt hóa, carbapenemase được phân làm 2
nhóm:
-

Non-metallo-carbapenemase: có serin tại trung tâm hoạt động của

enzyme, hoạt tính bị ức chế bởi clavulanic.
-

Metallo-carbapenemase: có nhân sắt tại trung tâm hoạt động, bị ức chế

bởi EDTA, không bị ảnh hưởng bởi clavulanic.
Dựa vào chức năng thủy giải, beta-lactamase được phân làm 4 nhóm từ
nhóm 1 đến 4. Trong đó, nhóm 2 được chia làm nhiều nhóm phụ dựa trên sự chuyên
biệt cơ chất và các chất ức chế. Carbapenemase chủ yếu thuộc nhóm 3 và nhóm phụ
2f [53].
Dựa vào đặc tính phân tử, carbapenemase được chia làm 3 lớp
-

Lớp A: thuộc nhóm non-metallo-beta-lactamase, gồm các loại sau:

+ Nguồn gốc NST: Serratia marcescens enzyme (SME)
 Not metalloenzyme carbapenemases (NMC)
 Imipenem-hydrolyzing -lactamases (IMI)
+ Nguồn gốc plasmid:
 Klebsiella pneumoniae carabapenemases (KPC)
 Guiana Extended-Spectrum (GES)
-


Lớp B: thuộc nhóm metallo-beta-lactamases, bao gồm IMP, GIM,

SIM, SPM, và VIM carbapenemases, được ghi nhận ở Pseudomonas aeruginosa,
Acinetobacter baumanii và một số vi khuẩn đường ruột. Mới đây là NDM-1, một
carbapenemase nằm trên plasmid, phát hiện ở K. pneumoniae và E. coli, phân lập từ
mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân người Thụy Điển nhập viện tại New Delhi, Ấn Độ.
-

Lớp D: bao gồm oxacilinase, chủ yếu tìm thấy ở Acinetobacter

baumanii.

TỔNG QUAN


Trang 15

1.3 Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC)
1.3.1 Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC)
Trước đây các men carbapenemase được cho là chuyên biệt cho lồi, do gen
mã hóa nằm trên nhiễm sắc thể với các đặc tính rõ ràng. Tuy nhiên, với việc phát
hiện các carbapenemase do gen mã hóa nằm trên plasmid, điển hình là KPC
(Klebsiella pneumoniae Carbapenemase), đã làm thay đổi cách nhìn nhận về mơ
hình lan truyền của tác nhân kháng thuốc này. Sự gia tăng nhanh chóng các chủng
mang gen blaKPC trong thời gian gần đây càng cho thấy tầm quan trọng của việc
tìm hiểu đặc tính của các men này trong nghiên cứu lâm sàng học.
KPC là một carbapenemase đầu tiên được tìm thấy ở K. pneumoniae, thuộc
lớp A, nhóm 2f, bị ức chế bởi clavulanic. Kết quả của việc sản xuất enzyme này là
vi khuẩn có khả năng đề kháng với tất cả penicillin, cephalosporin (cefepime,
ceftriaxone), carbapenems (meropenem, ertapenem), và aztreonam. Vi khuẩn đường

ruột tiết men KPC hầu hết còn kháng được các lớp kháng sinh khác như
fluoroquinolone, aminoglycoside [16, 34, 38, 46, 62].
KPC do gen mã hóa nằm trên plasmid, plasmid có thể ở dạng dung hợp hay
khơng dung hợp. Trình tự gen blaKPC nằm giữa trình tự transposon Tn44001, vị trí
của gen blaKPC ở K. pneumoniae và một số lồi khác được mơ tả trong hình 1.3.
Việc kết hợp gen blaKPC với các họ gen kháng khác nằm trên plasmid như
fluoroquinolone, aminoglycosides làm tăng cường tính kháng cho vi khuẩn. Hơn
nữa, plasmid là yếu tố di truyền di động, có thể dễ dàng di truyền ngang giữa các
lồi lân cận nên khả năng truyền tính kháng là rất cao [22, 53, 58].

TỔNG QUAN