ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN




NGUYỄN THÚY HƯƠNG





TUYỂN CHỌN VÀ CẢI THIỆN CÁC CHỦNG
ACETOBACTER XYLINUM TẠO CELLULOSE VI KHUẨN
ĐỂØ SẢN XUẤT VÀ ỨNG DỤNG Ở QUY MÔ PILOT



Chuyên ngành: Vi sinh
Mã số:1.05.12



LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC




Giáo sư hướng dẫn:
PGS.TS. PHẠM THÀNH HỔ

NĂM 2006


MỤC LỤC

Danh mục các ký hiệu các chữ viết tắt
Danh mục các bảng
Danh mục các đồ thò, biểu đồ
Danh mục các hình
Chương 1. MỞ ĐẦU 1
. Mục tiêu của đề tài
. Nội dung của đề tài
. Những điểm mới của luận án
Chương 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4
2.1 Cellulose vi khuẩn
4
2.1.1 Cấu trúc cellulose vi khuẩn 4
2.1.2 Một số tính chất của cellulose vi khuẩn 9
2.2 Vi sinh vật sản sinh cellulose 10
2.2.1 Nhóm vi sinh vật có khả năng sản sinh cellulose 10
2.2.2 Đặc điểm chung Acetobacter – giống vi khuẩn sinh cellulose hiệu quả cao 11
2.2.3 Đặc điểm sinh học của vi khuẩn Acetobacter xylinum 13
2.2.4 Sinh tổng hợp cellulose ở vi khuẩn Acetobacter xylinum 14

2.3 Lên men thu nhận cellulose vi khuẩn
19
2.4 Ứng dụng của cellulose vi khuẩn và triển vọng
25
2.5 Mối quan hệ giữa tính đề kháng Sulfaguanidine và sinh tổng hợp cellulose
gia tăng ở chủng đột biến Acetobacter xylinum

29
2.6 Cố đònh tế bào vi sinh vật 32
Chương 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 36
3.1 Giống 36
3.2 Nguyên liệu và môi trường dinh dưỡng 36
3.3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 39
3.3.1 Các bước thí nghiệm 39
3.3.2 Lập bộ sưu tập giống 39
3.3.3 Sàng lọc giống phù hợp với nguồn nguyên liệu 42
3.3.4 Cải thiện giống: Đột biến bằng tia UV, chọn lọc dòng đột biến kháng
Sulfaguanidine, có khả năng tổng hợp cellulose cao 42
3.3.5 Khảo sát quá trình nhân giống quy mô nhỏ và quy mô pilot 44
3.3.6 Thành phần môi trường phù hợp phương thức lên men bề mặt và lên men chìm45
3.3.7 Một số điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng đến quá trình lên men bề mặt và lên men
chìm BC 46
3.3.8 Nghiên cứu biến động trong quá trình lên men BC ở quy mô phòng thí nghiệm46
3.3.9 Thử nghiệm lên men BC ở quy mô pilot 47
3.3.10 Phương pháp xử lý BC 47
3.3.11 Phương pháp cố đònh vi khuẩn A.xylinum trên BC 49
3.3.12 Tạo 2 chế phẩm A.xylinum BC16 và A.xylinum BC16S
1
. Ứng dụng chế phẩm
Acetobacter xylinum để lên men BC 50

3.3.13 Cố đònh vi khuẩn Lactic và ứng dụng lên men sữa chua 51
3.3.14 Thăm dò sử dụng sinh khối
Acetobacter xylinum
làm tác nhân kết dính để tạo
một số vật liệu có giá trò từ phế thải nông nghiệp 52
3.3.15 Phương pháp xử lý số liệu 52
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 53
4.1 Lập bộ sưu tập giống 53

4.2 Các kiểu lên men trên những nguồn nguyên liệu khác nhau 59
4.2.1 Môi trường rỉ đường 59
4.2.1.1 Sàng lọc giống cho nguồn nguyên liệu rỉ đường 59
4.2.1.2 Đột biến bằng tia UV chọn lọc dòng có khả năng sản sinh BC cao trên môi
trường rỉ đường 62
4.2.1.3 Nhân giống
A.xylinum
BC16 và
A.xylinum
BC16S
1
64
4.2.1.4 Thành phần môi trường rỉ đường phù hợp kiểu lên men bề mặt 66
4.2.1.5 Thành phần môi trường rỉ đường phù hợp kiểu lên men chìm 68
4.2.2 Môi trường nước mía 70
4.2.2.1 Sàng lọc giống phù hợp với môi trường nước mía 70
4.2.2.2 Nhân giống A.xylinumBC17 72
4.2.2.3 Thành phần môi trường nước mía phù hợp kiểu lên men bề
mặt và lên men chìm sản xuất BC 73
4.2.3 Một số môi trường khác 75
4.3 Các điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng đến quá trình lên men 78

4.4 Thử nghiệm lên men sản xuất BC ở quy mô pilot 86
4.4.1 Lên men bề mặt quy mô pilot trên diện tích rộng 1,5 m
2
86
4.4.2 Lên men bề mặt quy mô pilot trên khay nhỏ 87
4.4.3 Lên men chìm quy mô 75 lít/mẻ 88
4.5 Xử lý BC và sản phẩm BC 91
4.6 Ứng dụng mới của cellulose vi khuẩn (BC): Dùng BC làm chất nền ( matrix) và
giá đỡ ( supporter) để cố đònh tế bào vi khuẩn 94
4.6.1 BC phù hợp với các yêu cầu cơ bản của chất nền (matrix) trong kỹ thuật cố đònh vi
sinh vật 94
4.6.2 Thăm dò một số phương pháp cố đònh vi khuẩn lên chất nền ( matrix) 95
4.6.3 Cố đònh tế bào vi khuẩn Acetobacter xylinum trên chất nền- giá đỡ BC tạo chế
phẩm để ứng dụng trong lên men cellulose vi khuẩn 97
4.6.4 Cố đònh vi khuẩn Lactic tạo chế phẩm vi khuẩn Lactic 110
4.7 Ứng dụng sinh khối Acetobacter xylinum làm tác nhân kết dính 113
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 117
Các bài báo khoa học được đăng
Tài liệu tham khảo

Phụ lục




















DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

MC: Microbial cellulose (cellulose vi sinh vật)
BC: Bacterial cellulose (cellulose vi khuẩn)
PC: Plant cellulose (cellulose thực vật)
S-BC: Static Bacterial cellulose (cellulose vi khuẩn thu nhận bằng phương pháp
nuôi cấy tónh)
A-BC: Agitated Bacterial cellulose (cellulose vi khuẩn thu nhận bằng phương
pháp nuôi cấy chìm)
pABA: p – aminobenzoic acid
Tia UV: Ultraviolet - Tia tử ngoại



















DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1 Các vi sinh vật sản sinh cellulose
Bảng 2.2 nh hưởng của các nguồn carbon đến sự tổng hợp BC của A.xylinum
Bảng 3.1 Đòa điểm thu thập giống và mẫu phân lập
Bảng 3.2 Thành phần môi trường rỉ đường
Bảng 3.3 Nội dung và các bước thí nghiệm
Bảng 4.1 Quan hệ với nhiệt độ
Bảng 4.2 Kết quả kiểm tra các đặc điểm sinh hoá
Bảng 4.3 Ký hiệu bộ sưu tập giống
Bảng4.4 Tuyển chọn giống qua sự sinh trưởng trên môi trường đặc và
môi trường lỏng
Bảng 4.5 Tuyển chọn giống qua sản lượng BC trong lên men bề mặt và lên men
chìm
Bảng 4.6 nh hưởng của tia tử ngoại đến tế bào vi khuẩn A. xylinum
Bảng 4.7 Khả năng sinh trưởng và tổng hợp cellulose của các dòng đột biến trên
môi trường rỉ đường
Bảng 4.8 Kết quả nhân giống cấp 3 của 2 chủng BC16 và BC 16S1
Bảng 4.9 Tuyển chọn giống phát triển trên môi trường nước mía thông qua sự
phát triển trên môi trường đặc và lỏng
Bảng 4.10 Tuyển chọn giống phát triển nhanh trên môi trường nước mía có khả
năng sản sinh cellulose cao

Bảng 4.11 Kết quả nhân giống cấp 3 vi khuẩn A.xylinum BC 17
Bảng 4.12 Sản lượng BC tươi thu được từ các môi trường phụ phẩm trái cây
Bảng 4.13 Sản lượng BC khô thu được từ các môi trường phụ phẩm trái cây
Bảng 4.14 Sản lượng BC thu từ môi trường tinh bột
Bảng 4.15 Diễn biến sản lượng cellulose (S-BC) trên môi trường rỉ đường lên
men bề mặt theo tỷ lệ giống và thời gian lên men
Bảng 4.16 Diễn biến sản lượng cellulose (A-BC ) trên môi trường rỉ đường lên
men chìm theo tỷ lệ giống và thời gian lên men
Bảng 4.17 Các phương án điều chỉnh để cải thiện sản lượng A-BC ở quy mô
pilot
Bảng 4.18 Một số phương pháp tinh sạch màng BC
Bảng 4.19 Đặc tính sản phẩm BC
Bảng 4.20 Mật độ vi khuẩn
Acetobacter xylinum BC16
theo thời gian ủ trên chất
nền S-BC và A-BC
Bảng 4.21 Mật độ vi khuẩn trên S-BC theo thời gian bảo quản
Bảng 4.22 Mật độ vi khuẩn trên A-BC theo thời gian bảo quản
Bảng 4.23 Nồng độ chế phẩm A.xylinum BC16 trong lên men bề mặt
Bảng 4.24 Sản lượng S-BC theo chu kỳ lên men tái sử dụng
Bảng 4.25 Nồng độ chế phẩm
A.xylinum
BC16S
1
trong lên men chìm
Bảng 4.26 Sản lượng A-BC theo chu kỳ lên men tái sử dụng
Bảng 4.27 Trò số pH và acid tổng của sữa chua trong 10 lần lên men tái sử dụng
chế phẩm

Bảng 4.28 Độ chòu lực của sản phẩm kết dính bằng phương pháp lên men

Bảng 4.29 Độ chòu lực của một số sản phẩm kết dính bằng bột BC








DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ, BIỂU ĐỒ
Đồ thò 4.1 Xác đònh các điều kiện nhân giống cấp 2 của
A. xylinum
BC16 và
BC16S
1
Đồ thò 4.2 Thành phần môi trường rỉ đường phù hợp kiểu lên men bề mặt
Đồ thò 4.3 Thành phần môi trường rỉ đường phù hợp kiểu lên men chìm
Đồ thò 4.4 Xác đònh điều kiện nhân giống cấp 2 của A. xylinum BC 17
Đồ thò 4.5 Thành phần môi trường nước mía phù hợp kiểu lên men bề
mặt và lên men chìm
Đồ thò 4.6 nh hưởng của pH ban đầu đến sản lượng BC trong lên men
bề mặt và lên men chìm trên môi trường rỉ đường
Đồ thò 4.7 nh hưởng của nhiệt độ trong quá trình lên men BC
Đồ thò 4.8 Diễn biến sản lượng A-BC theo tốc độ quay của máy lắc
Đồ thò 4.9 Diễn biến sản lượng A-BC theo phương thức khuấy đảo trong
quá trình lên men
Đồ thò 4.10 Biến động trong quá trình lên men bề mặt cellulose vi khuẩn
trên môi trường rỉ đường ởâ phòng thí nghiệm
Đồ thò 4.11 Biến động trong quá trình lên men chìm cellulose vi khuẩn
trên môi trường rỉ đường ởâ phòng thí nghiệm

Đồ thò 4.12 So sánh các biến động trong quá trình lên men bề mặt cellulose vi
khuẩn trên môi trường rỉ đường ởâ phòng thí nghiệm và quy mô pilot
Đồ thò 4.13 So sánh các biến động trong quá trình lên men chìm cellulose vi
khuẩn trên môi trường rỉ đường ởâ phòng thí nghiệm và quy mô pilot
Đồ thò 4.14 Các phương án cải thiện sản lượng A-BC ở quy mô pilot
Đồ thò 4.15 So sánh mật độ tế bào theo thời gian ủ trên chất nền dạng S-BC và
A-BC
Đồ thò
4.16 M
ật độ vi khuẩn phát triển trên chất nền qua cải tiến phương pháp
hấp thụ
Đồ thò 4.17 Mật độ vi khuẩn trên S-BC theo thời gian bảo quản ở nhiệt độ
phòng và nhiệt độ mát

Đồ thò 4.18 Mật độ vi khuẩn trên A-BC theo thời gian bảo quản ở nhiệt độ
phòng và nhiệt độ mát

Đồ thò 4.19 Sản lượng S-BC theo chu kỳ tái sử dụng và so với đối chứng
Đồ thò 4.20 Sản lượng A-BC theo chu kỳ tái sử dụng và so với đối chứng
























DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH
Hình 2.1 Cellulose vi khuẩn và cellulose thực vật
Hình 2.2 So sánh đường kính của sợi cellulose vi khuẩn với các sợi tự nhiên và
sợi nhân tạo
Hình 2.3 Cấu trúc Bacterial Cellulose
Hình 2.4 Cấu trúc A-BC và S-BC
Hình 2.5 Cấu trúc Cellulose I và Cellulose II
Hình 2.6 Cấu tạo một lỗ tiết cellulose
Hình 2.7 Sơ đồ các con đường tổng hợp cellulose bởi A.xylinum
Hình 2.8 Con đường tổng hợp cellulose từ cơ chất glucose
Hình 2.9 Sơ đồ con đường tổng hợp cellulose bởi chủng đột biến kháng
Sulfaguanidine

A.xylinum
BPR3001E
Hình 3.1. Môt số phương thức trong quá trình nhân giống, lên men BC
Hình 4.1 Sơ tuyển nhanh một số chủng vi khuẩn có khả năng sản sinh cellulose
Hình 4.2 Hình ảnh vi thể của một số chủng đại diện

Hình 4.3 Hình ảnh đại thể khuẩn lạc một số chủng đại diện
Hình 4.4 Quan hệ với oxy của một số chủng vi khuẩn
Hình 4.5 Khả năng sinh trưởng phát triển và tạo màng BC của A.xylinum BC16
phù hợp với môi trường rỉ đường
Hình 4.6 Hình ảnh sản phẩm BC
Hình 4.7 Tế bào vi khuẩn A.xylinum trong mạng lưới cellulose
Hình 4.8 Mạng lưới cellulose của hai dạng BC
Hình 4.9 BC thô sau lên men
Hình 4.10 Cố đònh vi khuẩn trên máy lắc
Hình 4.11 Chế phẩm BC
Hình 4.12 Lên men kết dính bằng phương pháp nhúng
Hình 4.13 Sản phẩm kết dính xơ dừa bằng phương pháp nhúng
Hình 4.14 Bã mía
Hình 4.15 Bã mía kết dính bằng bột BC
Hình 4.16 Bụi xơ dừa
Hình 4.17 Bụi xơ dừa kết dính bằng bột BC



1
Chương 1. MỞ ĐẦU




Thạch dừa ( Nata- de Coco) là một loại thực phẩm truyền thống của
Philippines, được du nhập và phổ biến ở Việt Nam từ hơn 15 năm nay. Thạch
dừa thực chất là sinh khối của vi khuẩn Acetobacter xylinum ( nuôi trên môi
trường nước dừa già), mà thành phần chủ yếu là cellulose nên được gọi là
cellulose vi khuẩn ( Bacterial cellulose – BC ). Trên thế giới, Acetobacter

xylinum đã được nghiên cứu rất nhiều theo hướng sử dụng BC làm vật liệu mới
trong nhiều lónh vực sản xuất và đời sống ngoài giá trò làm thực phẩm như thạch
dừa. Các kết quả đạt được cho thấy tiềm năng ứng dụng độc đáo trong các lónh
vực khác nhau như : thực phẩm, y học, mỹ phẩm, khoa học vật liệu, xử lý môi
trường … [25, 35, 46, 47, 73 -76, 80 -83, 98, 106, 108, 109 ].
Từ năm 1997, khi bắt đầu làm đề tài Thạc só trên đối tượng
Acetobacter
xylinum
, nhận thấy tiềm năng to lớn của BC, nhóm chúng tôi tập trung nghiên
cứu BC (Biopolymer) theo hướng sử dụng BC làm vật liệu mới để tìm các ứng
dụng trong nhiều liõnh vực khác nhau.
Đề tài “Tuyển chọn và cải thiện các chủng Acetobacter xylinum tạo
cellulose vi khuẩn để sản xuất và ứng dụng ở quy mô pilot“ nhằm :
* Mục tiêu
:
- Sản xuất cellulose vi khuẩn ở quy mô pilot, để từng bước hướng tới sản
xuất BC quy mô công nghiệp.
- Góp phần khai thác và mở rộng ứng dụng của cellulose vi khuẩn.
Để đạt được 02 mục tiêu này, nội dung nghiên cứu của đề tài bao gồm:
* Nội dung:
Đề tài tiến hành có hệ thống như sau:

1. Giống
- Xây dựng bộ sưu tập các chủng giống
Acetobacter xylinum
- Tuyển chọn các chủng thích hợp với các loại nguyên liệu lên men khác nhau
- Cải thiện giống cho sản lượng BC cao

2
2. Nguyên liệu

- Mở rộng việc sử dụng các nguồn nguyên liệu khác nguồn nước dừa già truyền
thống ( có số lượng rất hạn chế và mang tính chất đòa phương) như: mật rỉ
đường, nước mía, tinh bột, dòch trái cây phế thải,…
3. Xác đònh các kiểu lên men và điều kiện lên men cellulose vi khuẩn ở
phòng thí nghiệm
- Đa dạng các kiểu lên men cellulose vi khuẩn : lên men bề mặt, lên men chìm.
4. Thử nghiệm lên men cellulose vi khuẩn quy mô pilot
- Lên men bề mặt quy mô pilot trên diện tích rộng 1,5m
2

- Lên men bề mặt quy mô pilot trên khay nhỏ
- Lên men chìm quy mô pilot
5. Tìm các ứng dụng mới của cellulose vi khuẩn (BC):
- Sử dụng BC làm chất nền ( matrix) để cố đònh tế bào vi khuẩn
- Sử dụng BC làm giá đỡ (supporter) để lên men bán rắn thu sinh khối vi sinh
vật.
- Sử dụng tế bào vi khuẩn Acetobacter xylinum làm tác nhân kết dính.


* Những điểm mới của luận án:

Các điểm mới ở Việt nam:

- Luận án là công trình đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu có hệ thống và đồng bộ
quá trình lên men sản xuất cellulose vi khuẩn từ quy mô phòng thí nghiệm đến
quy mô pilot qua các khâu: thu thập giống, tuyển chọn giống, cải tạo giống,
nhân giống, khảo sát các biến động trong quá trình lên men.
- Bộ sưu tập giống phong phú có kết hợp tuyển chọn giống thích hợp cho từng
loại cơ chất như mật rỉ đường, nước mía,…
- Đa dạng nguồn nguyên liệu lên men vừa phù hợp quy mô sản xuất lớn, vừa

phù hợp với điều kiện ở Việt nam : ngoài nguồn nguyên liệu nước dừa già, có

3
thể sản xuất BC từ nguồn rỉ đường, nước mía, tinh bột, dòch trái cây phế thải. Đã
xác đònh các điều kiện nuôi và hiệu quả trên từng loại nguyên liệu.
- Xác đònh kiểu lên men phù hợp quy mô lớn: ngoài kiểu truyền thống lên men
bề mặt, có thể sản xuất BC theo phương thức lên men chìm. Kiểu lên men chìm
còn để phục vụ trong nhân giống cho quy mô lớn.
Các điểm mới chưa đề cập trên thế giới:

Dựa trên tính chất và cấu trúc của cellulose vi khuẩn, luận án còn khai thác
một số ứng dụng mới của BC :
- Sử dụng BC làm chất nền ( matrix) để cố đònh tế bào vi khuẩn.
- Dùng BC làm giá đỡ (supporter) để thu sinh khối vi sinh vật.
Nhờ 2 ứng dụng này đã tạo ra chế phẩm vi khuẩn Acetobacter xylinum , giúp
thuận lợi hơn trong sản xuất BC ở quy mô lớn.
- Sử dụng tế bào vi khuẩn Acetobacter xylinum làm tác nhân kết dính.



4
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Cellulose vi khuẩn
Năm 1886, A.J. Brown đã trình bày báo cáo đầu tiên về sự tổng hợp
cellulose của vi khuẩn Acetobacter xylinum. Tuy nhiên mãi đến nửa sau thế kỷ
XX, cellulose vi khuẩn mới thực sự được chú ý.
2.1.1 Cấu trúc cellulose vi khuẩn

Các kỹ thuật hiện đại đã xác đònh được cấu trúc của cellulose vi khuẩn. Kỹ
thuật nhiễu xạ tia X phân biệt các dạng cấu trúc và kích thước của cellulose vi

khuẩn . Các kỹ thuật phổ Rama, phân tích phổ hồng ngoại và phổ cộng hưởng từ
hạt nhân giúp xác đònh các dạng kết tinh của cellulose vi khuẩn.
Cellulose vi khuẩn có đường kính bằng 1/100 đường kính của cellulose thực
vật ( hình 2.1). Cellulose vi khuẩn có cấu trúc siêu mòn và độ chòu lực của
cellulose vi khuẩn gần bằng với độ chòu lực của nhôm. Khi đem so sánh đường
kính của cellulose vi khuẩn và đường kính của các sợi nhân tạo cho thấy: kích
thước của cellulose vi khuẩn còn nhỏ hơn cả kích thước của sợi tổng hợp hoá
học có đường kính nhỏ nhất (hình 2.2)[108,112-120].



Cellulose thực vật (x200) Bacterial cellulose (x20,000)
Hình 2.1 Cellulose vi khuẩn và cellulose thực vật[82].

5
100µm Tóc

Bông vải
10µm Gỗ thông
Sợi tổng hợp

1µm Sợi tổng hợp kỹ thuật cao

0,1 µm Sợi collagen

0,01
µ
m Cellulose vi khuẩn



Hình 2.2 So sánh đường kính của sợi cellulose vi khuẩn với các sợi tự nhiên và
sợi nhân tạo [24,108].

BC là một chuỗi polymer do các glucopyranose nối với nhau bằng liên kết
β-1,4 glucan ( hinh2.3). BC gồm các sợi có cấu trúc dạng dải. Khi quan sát dưới
kính hiển vi điện tử, người ta thấy được cấu trúc xoắn của dải sợi [14,15,19,35].

Hình 2.3 Cấu trúc Bacterial Cellulose[24,26]

6
Các sợi mới sinh ra của BC kết hợp lại với nhau để hình thành nên các sợi
sơ cấp (subfibril) có chiều rộng khoảng 1,5nm, là những sợi mảnh nhất có nguồn
gốc tự nhiên. Các sợi sơ cấp kết hợp lại thành các vi sợi (microfibril). Các vi sợi
nằm trong các bó (bundle) và cuối cùng thành các dải (ribbon). Các dải có chiều
dài 3-4 nm và chiều rộng 70-80 nm [98], hoặc 3,2 x 133 nm [15], 4,1 x 117 nm
[107]. Trong khi chiều rộng các sợi cellulose được tạo ra từ gỗ thông là 30.000 –
75.000 nm. Những tập hợp dải vi sợi cellulose mòn có chiều dài thay đổi từ 1000
- 9000 nm làm thành cấu trúc lưới dày đặc, được ổn đònh bởi các liên kết hydro.
Thông thường BC có mức độ polymer hóa từ 2000 – 6000 và một vài trường hợp
đạt tới 16000 – 20000, trong khi mức polymer hóa ở cellulose thực vật là 13000
– 14000 [102].
Cấu trúc của BC phụ thuộc chặt chẽ vào điều kiện nuôi cấy [95,110]. Ở
điều kiện nuôi cấy tónh, vi khuẩn tổng hợp những màng cellulose trên bề mặt
nuôi cấy, tại ranh giới giữa bề mặt dòch lỏng và không khí giàu oxy. Các màng
BC được gọi là S-BC trên môi trường nuôi cấy tónh (S- BC: static BC). Các sợi
cellulose sơ cấp liên tục được đẩy ra từ những lỗ được xếp dọc trên bề mặt của
tế bào vi khuẩn, kết tinh lại thành các vi sợi và bò đẩy xuống sâu hơn trong môi
trường dinh dưỡng. Các dải cellulose từ môi trường tónh tạo nên các mặt phẳng
song song nhau nhưng không có tổ chức, có vai trò chống đỡ cho quần thể tế bào
Acetobacter xylinum. Các sợi S-BC kế nhau được tạo ra từ môi trường nuôi cấy

tónh nối với nhau và bẻ nhánh ít hơn các sợi A-BC được tạo ra từ môi trường
nuôi cấy chìm (A-BC : Agitated BC) [23,46]. A-BC được tạo ra dạng những sợi
nhỏ, các hạt hình sao và các sợi dài, chúng phân tán tốt trong môi trường. Các
sợi đan lưới với nhau trong môi trường lắc giống như mô hình kẻ ô, có hai hướng
song song và vuông góc [37,98].

7

Hình 2.4 Cấu trúc A-BC (a) và S-BC (b)[58].
Sự khác nhau về cấu trúc không gian ba chiều của hai dạng S-BC và A-BC
được quan sát rõ ràng hơn bằng kính hiển vi điện tử quét. Những sợi S-BC kéo
dài và chồng lên các sợi khác theo chiều đan chéo nhau. Những sợi A-BC thì rối
rắm và cong( hình 2.4) [102]. Ngoài ra bề mặt cắt ngang của sợi A-BC (100-
200nm) lớn hơn sợi S-BC (50-100 nm). Sự khác nhau về hình thái giữa hai loại
BC này làm mức độ kết tinh, kích cỡ kết tinh của chúng khác nhau [37].
Hai dạng kết tinh phổ biến của cellulose trong tự nhiên là cellulose I và
cellulose II, được phân biệt bởi các kỹ thuật phân tích bằng tia X, quang phổ và
tia hồng ngoại ( hình 2.5)[80]. Tùy vào điều kiện môi trường nuôi cấy và giống
vi khuẩn mà cellulose dạng nào chiếm ưu thế. Cellulose I có thể chuyển hóa
thành cellulose II, nhưng cellulose II không thể chuyển hóa thành cellulose I.

8

a) b)
Hình 2.5 Cấu trúc cellulose I (a)và cellulose II(b)[113,130]
Cellulose II là dạng sợi cellulose ổn đònh nhất về mặt nhiệt động lực học.
Các chuỗi
β
-1,4 glucan sắp xếp một cách ngẫu nhiên, đối song song và nối với
nhau bởi một số lượng lớn liên kết hydro. Cellulose II thường được tổng hợp

trong môi trường nuôi cấy chìm. Các sợi cellulose dạng này thường uốn cong, có
đường kính khoảng 100-200 nm. Sợi cellulose vừa được tổng hợp thường phân
bố khắp môi trường nuôi cấy hoặc chúng kết lại với nhau tạo thành các dạng hạt
nhỏ hay các hạt hình sao.
Acetobacter xylinum
tổng hợp được cả hai loại
cellulose I và cellulose II [36,48,72].
Trong phân tử cellulose có sự hiện diện của I
α
và I
β
,

do được cấu tạo bởi
glucose dạng
α
hay dạng
β
. Dạng I
β
bền về mặt nhiệt động học hơn. Glucose
dạng
α
và glucose dạng
β
là hai dạng đồng phân không gian của nhau. Hai
dạng này chỉ khác nhau ở sự đònh hướng của nhóm hydroxyl và có ở các
cellulose có nguồn gốc từ tảo, vi khuẩn, thực vật. BC có dạng I
α
nhiều hơn ở

PC. S-BC có nhiều dạng I
α
hơn A-BC [107]. Sự khác nhau về tỷ lệ I
α
giữa hai
loại S-BC và A-BC chi phối và ảnh hưởng đến chỉ số kết tinh. Chỉ số I
α
tỷ lệ
thuận với độ kết tinh . A-BC có chỉ số kết tinh thấp hơn S-BC [15,25,35,36 ].
Một phần đáng kể cellulose II có ở A-BC. Trong tự nhiên cellulose II chỉ được
tổng hợp ở một vài sinh vật (một số tảo, nấm mốc và vi khuẩn như Sarcina

9
ventriculi, Acetobacter xylinum) [23]. Hiện nay, sản phẩm công nghiệp của
cellulose II chủ yếu có được là dựa trên sự biến đổi hóa học cellulose thực vật.
2.1.2 Một số tính chất của cellulose vi khuẩn
Chung và Shyu(1999) đã nghiên cứu các tính chất của BC như độ cứng, độ
dính, độ dai và ảnh hưởng của dung dòch đường, muối và các chất gum (HM
pectin, LM pectin) lên tính chất của BC. Các mảnh BC có độ cứng là 3,68
kg/cm
2
. Độ cứng của các miếng BC giảm khi chúng được nhúng vào dung dòch
đường, HM pectin, LM pectin, carrageenan và độ cứng tăng lên khi được nhúng
vào dung dòch muối [22].
Sản phẩm của cellulose vi khuẩn có một số tính chất như sau:
- Độ bền hóa học, độ bền cơ học và sức căng cao.
- Khả năng giữ nước và độ ẩm cao, do đó có thể điều chỉnh độ xốp.
- Do khả năng S-BC hình thành sẵn màng, khi ứng dụng trong làm vải không
cần qua khâu dệt, làm giấy không cần qua khâu bột giấy.
- Có thể theo dõi, kiểm soát lý tính của cellulose do cấu trúc của cellulose vi

khuẩn có khả năng biến đổi trong quá trình nuôi cấy.
- Kiểm soát được kích thước, cấu trúc ( A-BC hay S-BC) và chất lượng của
cellulose (kiểm soát được cellulose kết tinh dò hình) trong quá trình nuôi cấy
tạo cellulose [84,89,102].
- Cellulose vi khuẩn là cellulose sinh học duy nhất được tổng hợp mà không
gắn lignin, có thể dễ dàng bò phân hủy bởi một số nhóm vi sinh vật. Vì vậy,
cellulose vi khuẩn được xem là nguồn vật liệu mới có nhiều ưu thế trong
tương lai[14,15,26].



10
2.2 Vi sinh vật sản sinh cellulose
2.2.1 Các nhóm vi sinh vật có khả năng sản sinh cellulose

Năm 1988, Jonas và Farah đã chứng minh cellulose được tổng hợp bởi một
số vi sinh vật. Nguồn cellulose được sản sinh bởi vi sinh vật được gọi chung là
Microbial cellulose (MC).
Bảng 2.1 Các vi sinh vật sản sinh cellulose

Giống Cấu trúc cellulose
Acetobacter
Lớp màng ngoại bào tạo thành các dải
Achromobacter
Sợi
Aerobacter
Sợi
Agrobacterium
Sợi ngắn
Alcaligen

Sợi
Pseudomonas
Các sợi không tách biệt
Rhizobium
Sợi ngắn
Sarcina
Cellulose dò hình
Zoogloea
Chưa xác đònh rõ cấu trúc

Vi sinh vật có khả năng sản sinh cellulose, tuy mỗi giống có thể cho cấu
trúc cellulose khác nhau, dưới dạng lớp màng hoặc dạng sợi. Bảng 2.1 trình
bày nhóm vi sinh vật sản sinh cellulose và đặc điểm cấu trúc cellulose tương
ứng với mỗi giống vi sinh vật. Trong số các vi khuẩn có khả năng sản sinh
cellulose, đáng chú ý nhất là Acetobacter xylinum sinh tổng hợp BC cao, đạt
hiệu quả cao nhất. Quá trình sinh tổng hợp và điều hòa tổng hợp cellulose ở các
giống đều có chung cơ chế, nhưng cấu trúc BC ở mỗi giống, thậm chí mỗi loài
thì khác nhau.


11
Cấu trúc cellulose ở mỗi giống:
- Acetobacter thường tạo thành cellulose dạng lớp, màng, hoặc dạng nhũ
tùy thuộc vào kiểu lên men.
- Achromobacter, Aerobacter và Alcaligen thường tạo cellulose dạng sợi
dài khoảng 2-3 cm, có độ chòu lực khá bền.
- Rhizobium
cũng có khả năng sản sinh cellulose dạng sợi ngắn ( vài mm)
trong một số môi trường lên men chuyên biệt.
- Một số vi sinh vật khác như Pseudomonas, Sarcina, Zoogloea chưa xác

đònh rõ cấu trúc hoặc cấu trúc thường hay thay đổi (có thể dạng nhũ,
dạng dò hình hoặc các sợi không tách biệt).
Điểm khác biệt đáng kể về đặc tính vật lý của các sản phẩm cellulose vi
sinh vật ( MC) là chiều dài của chuỗi glucan, được đặc trưng bởi mức polymer
hóa. Ngoài ra còn có sự khác biệt về tính kết tinh và trạng thái kết tinh của MC.
Mỗi loại cellulose của các giống vi sinh vật khác nhau có trạng thái kết tinh
khác nhau, do đó có độ bền, độ hòa tan trong dung môi và độ chòu lực khác nhau
[14,15,36].
2.2.2 Đặc điểm chung Acetobacter - giống vi khuẩn sinh cellulose hiệu quả
cao
Giống vi khuẩn Acetobacter thuộc họ Pseudomonadaceae, phân bố rộng rãi
trong tự nhiên. Có thể phân lập được các giống vi khuẩn này từ không khí, đất,
nước, lương thực, thực phẩm, dấm, rượu, bia, hoa quả…. Có khoảng 20 loài thuộc
giống Acetobacter đã được phân lập và mô tả, trong đó có nhiều loài có ý nghóa
đáng kể.
+Đặc điểm hình thái của Acetobacter

Vi khuẩn Acetobacter bắt màu Gram âm (Gr
-
). Thông thường Acetobacter có
dạng hình que, kích thước thay đổi tuỳ theo loài (0.3 - 0.6 x 1.0 - 8.0 µm), có thể
di động (có tiêm mao đơn hoặc chu mao), hoặc không di động (không có tiêm

12
mao), hiếu khí bắt buộc, chòu được độ acid cao, tế bào đứng riêng rẽ hoặc kết
thành từng chuỗi, có khả năng tạo thành váng trên môi trường lỏng. Tùy điều
kiện môi trường nuôi cấy (nhiệt độ, thành phần môi trường nuôi cấy….), các vi
khuẩn Acetobacter có thể sinh ra các hình thái khác biệt (kéo dài hoặc phình to
ra).
Trên môi trường đặc, khuẩn lạc của vi khuẩn

Acetobacter
có hình dạng tròn,
đều, đường kính trung bình khoảng 1-3 mm. Trên môi trường lỏng, vi khuẩn
Acetobacter chỉ phát triển trên bề mặt môi trường, tạo thành những lớp màng
mỏng, trong suốt, có độ dày khác nhau. Màng này có chứa sợi cellulose giống
như sợi bông. Loại thứ hai có màng mỏng như giấy xelofan. Một số khác trên bề
mặt không nhẵn mà nhăn nheo hoặc tạo màng mỏng dễ vỡ bám trên thành bình.
-Khả năng tạo váng thay đổi tuỳ theo loài:
Acetobacter xylinum tạo thành váng hemicellulose khá dày và chắc.
Acetobacter orleanoe váng mỏng nhưng chắc.
Acetobacter pasteurianum váng khô và nhăn nheo.
Acetobacter suboxydans váng mỏng dễ tan rã.
Acetobacter curvum sinh ra acid acetic với nồng độ cao nhưng tạo váng
không chắc chắn [1,2,7 ].
+Đặc điểm sinh trưởng

Vi khuẩn phát triển trong phạm vi nhiệt độ 12-35
0
C, pH=3,0– 6,5, hiếu khí
tuyệt đối.
Vi khuẩn Acetobacter có khả năng sử dụng nguồn carbon khác nhau để sinh
trưởng và phát triển.
Đa số các loài Acetobacter có khả năng đồng hoá muối amon, có khả năng
phân giải pepton.

13
Acetobacter đòi hỏi phải có một số vitamin nhất đònh như acid pantothenic
và các chất khoáng như K, Mg, Ca, Fe, S, P… ở dạng muối vô cơ và hợp chất
hữu cơ. Do đó bia, dòch thủy phân nấm men, nước mạch nha, nước trái cây… là
nguồn dinh dưỡng rất tốt cho sự phát triển của vi khuẩn Acetobacter.

Tính chất đặc trưng của Acetobacter là oxy hoá rượu thành acid acetic.
Ngoài khả năng lên men tạo acid acetic, một số loài
Acetobacter
còn tổng hợp
được vitamin B
1
, B
2
, oxi hoá propanol thành acid propionic, oxi hóa sorbit thành
đường sorbose dùng trong công nghiệp sản xuất vitamin C, oxy hoá glycerin
thành dioxyaceton, oxy hóa glucose thành acid gluconic [1,52 ].

2.2.3 Đặc điểm sinh học của vi khuẩn Acetobacter xylinum

- Phân loại
:
Theo khoá phân loại Bergey, A.xylinum thuộc:
Lớp: Schizomycetes.
Bộ:
Pseudomonadales.

Bộ phụ:
Pseudomonadieae.

Họ:
Pseudomonadaceae
[38].
- Hình thái:
Acetobacter xylinum có dạng hình que, thẳng hay hơi cong, có thể di động
hay không di động, không sinh bào tử. Chúng là vi khuẩn Gram âm, nhưng đặc

điểm nhuộm Gram có thể thay đổi do tế bào già đi hay do điều kiện môi trường.
Chúng có thể đứng riêng lẻ hay xếp thành chuỗi.
Khuẩn lạc của A.xylinum có kích thước lớn (đường kính khuẩn lạc đạt 2-
5mm), tròn, bề mặt nhầy và trơn bóng, phần giữa khuẩn lạc lồi lên, dày hơn và
sẫm màu hơn các phần xung quanh, rìa mép khuẩn lạc nhẵn [38,52,57 ].

- Đặc điểm sinh lý

14
Vi khuẩn A.xylinum phát triển ở nhiệt độ 25-35
o
C, pH = 4-6. Nhiệt độ và pH
tối ưu tùy thuộc vào giống. Ở 37
o
C, tế bào sẽ suy thoái hoàn toàn ngay cả trong
môi trường tối ưu.
A.xylinum có khả năng chòu được pH thấp, vì thế thường bổ sung thêm acid
acetic vào môi trường nuôi cấy để hạn chế sự nhiễm khuẩn lạ [1,3,48,52 ]ï.
- Đặc điểm sinh hóa
Các đặc điểm sinh hoá dùng đònh danh của A.xylinum bao gồm: Oxy hoá
ethanol thành acid acetic, CO
2
, H
2
O; Phản ứng catalase dương tính; Không tăng
trưởng trên môi trường Hoyer; Chuyển hoá glucose thành acid; Chuyển hoá
glycerol thành dihydroxyaceton; Không sinh sắc tố nâu; Tổng hợp cellulose [1].
Chi tiết xin xem chương 3.
2.2.4 Sinh tổng hợp cellulose ở vi khuẩn
Acetobacter xylinum


2.2.4.1 Cellulose tổng hợp ở màng tế bào vi khuẩn

Cellulose được tổng hợp trên các lỗ ở bề mặt tế bào có kích thước khoảng
3,5nm ( hình 2.6).


Hình 2.6 Cấu tạo một lỗ tiết cellulose[97].
Các lỗ này được sắp xếp thành một hàng dài, mỗi lỗ bao phủ một hạt có
kích thước 10 nm. Hạt này bao gồm những enzyme tổng hợp cellulose có liên
quan trong phản ứng polymer hóa (AcsAB) và một vài enzyme hỗ trợ có liên
quan đến những chức năng khác (AcsC, AcsD). Mỗi hạt trên sẽ sản xuất ra
A
csD
A
csAB
A
csC