BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI




NGUYỄN THỊ HUYỀN

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH
LƯỢNG FELODIPIN TRONG VIÊN
NÉN GPKD BẰNG HPLC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ


HÀ NỘI - 2013



BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI


NGUYỄN THỊ HUYỀN

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH
LƯỢNG FELODIPIN TRONG VIÊN
NÉN GPKD BẰNG HPLC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:
PGS.TS Nguyễn Thị Kiều Anh
Nơi thực hiện:
1. Phòng phân tích, kiểm nghiệm và tương đương
sinh học – Viện công nghệ Dược phẩm Quốc gia



HÀ NỘI - 2013


LỜI CẢM ƠN
Trong suốt thời gian thực hiện đề tài, tôi may mắn nhận được yêu thương,
sự giúp đỡ tận tình của gia đình, thầy cô và bè bạn. Vì vậy, những trang đầu
của khóa luận này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới những người đã nhiệt tình
dạy dỗ, giúp đỡ tôi trong thời gian qua.
Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Nguyễn Thị
Kiều Anh, người trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tôi những kỹ năng cần thiết,
cách tư duy và hỗ trợ giúp tôi giải quyết những khó khăn khi thực hiện khóa
luận này.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô, anh chị ở Phòng phân tích, kiểm
nghiệm và tương đương sinh học - Viện công nghệ Dược phẩm quốc gia đã
giúp đỡ tận tình, tạo điều kiện tốt nhất cho tôi hoàn thành khóa luận.
Đồng thời, tôi xin trân trọng cảm ơn Ban giám hiệu, các thầy cô giáo, các
cán bộ trường Đại học Dược Hà Nội đã giảng dạy, chỉ bảo, dìu dắt tôi trong
suốt năm năm học tập tại trường.
Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới bố mẹ, bạn bè, những người thân yêu
đã động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập cũng như thời gian tôi

thực hiện đề tài này.
Mặc dù đã có nhiều cố gắng nhưng do còn nhiều hạn chế về mặt lý luận
và thực tiễn nên khóa luận có thể còn nhiều thiếu sót. Tôi rất mong được sự
góp ý của thầy cô giáo và các bạn để khóa luận này được hoàn thiện hơn.

Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2013
Sinh viên
Nguyễn Thị Huyề
n


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3
1.1. Đại cương về felodipin 3
1.1.1. Công thức và tính chất lý hóa 3
1.1.2. Dược động học 4
1.1.3. Tác dụng dược lý 4
1.1.4. Chỉ định 5
1.1.5. Chống chỉ định 5
1.1.6. Thận trọng 5
1.1.7. Tác dụng không mong muốn (ADR) 6
1.1.8. Liều lượng và cách dùng 6
1.1.9. Quá liều và xử trí 7
1.1.10. Tương tác thuốc 7
1.1.11. Một số chế phẩm felodipin trên thị trường 8
1.2. Một số nghiên cứu định lượng felodipin 9

1.3. Tổng quan về HPLC 11
1.3.1. Khái niệm và các thông số đặc trưng cho quá trình sắc ký . 11
1.3.2. Cấu tạo máy HPLC 14
1.3.3. Ứng dụng kỹ thuật của HPLC 14


CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1. Đối tượng và phương tiện nghiên cứu 16
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu 16
2.1.2. Phương tiện nghiên cứu 16
2.2. Nội dung nghiên cứu 17
2.3. Phương pháp nghiên cứu 18
2.3.1. Khảo sát điều kiện sắc ký 18
2.3.2. Thẩm định phương pháp 18
2.3.3. Ứng dụng phương pháp phân tích định tính, định lượng
felodipin trong viên nén felodipin giải phóng có kiểm soát 20

2.3.4. Phương pháp xử lý kết quả 20
PHẦN 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 21
3.1. Xây dựng điều kiện phân tích Felodipin bằng HPLC 21
3.1.1. Lựa chọn cột sắc ký 21
3.1.2. Lựa chọn bước sóng thích hợp 22
3.1.3. Khảo sát lựa chọn tốc độ dòng và pha động 23
3.1.4. Lựa chọn thể tích tiêm mẫu 25
3.2. Chuẩn bị mẫu 26
3.2.1. Chuẩn bị dung dịch chuẩn 26
3.2.2. Chuẩn bị dung dịch thử: 27
3.2.3. Chuẩn bị mẫu trắng: 27
3.3. Thẩm định phương pháp HPLC định lượng Felodipin 27

3.3.1. Độ thích hợp của hệ thống 27


3.3.2. Tính đặc hiệu 28

3.3.3. Độ tuyến tính 29
3.3.4. Độ chính xác 31
3.3.5. Độ đúng: 32
3.4. Ứng dụng định tính và định lượng Felodipin trong chế phẩm
33

3.5. BÀN LUẬN 36
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 38
TÀI LIỆU THAM KHẢO





DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ATC (Anatomical Therapeutic Chemical): Hệ thống phân loại thuốc
HPLC (High Performance Liquid Chromatography): Sắc ký lỏng hiệu năng
cao
HIV (Human Immuno-deficiency Virus): Virus gây suy giảm miễn dịch ở
người
MS (Mass spectrometry): Khối phổ
UV- VIS (Ultraviolet - Visible): Tử ngoại - khả kiến
PA (Pure for analysis): Độ tinh khiết phân tích
PVP: Polyvinyl pyrrolidone
ACN : Acetonitril

MetOH: Methanol
RSD (Relative standard deviation): Độ lệch chuẩn tương đối
r: Hệ số tương quan
SD (Standard deviation): Độ lệch chuẩn
SKD: Sinh khả dụng
t
1/2
: Thời gian bán thải
USP (The United States Pharmacopeia): Dược điển Mỹ
v/v: Thể tích/thể tích
v/v/v: Thể tích/thể tích/thể tích




DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. Các chế phẩm felodipin trên thị trường 8
Bảng 3.1. Kết quả khảo sát lựa chọn cột 21
Bảng 3.2. Kết quả khảo sát tỷ lệ pha động 24
Bảng 3.3. Cách pha các dung dịch chuẩn 27
Bảng 3.5. Kết quả khảo sát độ tuyến tính 30
Bảng 3.6. Kết quả xác định độ chính xác 31
Bảng 3.7. Kết quả đánh giá độ đúng 33
Bảng 3.8. Kết quả định lượng Felodipin trong viên giải phóng có kiểm soát 34









DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Công thức cấu tạo felodipin 3
Hình 1.3. Sơ đồ hệ thống HPLC 14
Hình 3.1. Sắc ký đồ của Felodipin phân tích bằng cột Zorbax SB 21
Hình 3.2. Sắc ký đồ của Felodipin phân tích bằng cột Eclipase XDB 22
Hình 3.3. Phổ hấp thụ tử ngoại của dung dịch Felodipin chuẩn 23
Hình 3.4. Sắc ký đồ của hệ pha động thứ 1 24
Hình 3.5. Sắc ký đồ của hệ pha động thứ 2 24
Hình 3.6. Sắc ký đồ của hệ pha động thứ 3 25
Hình 3.7. Sắc ký đồ của Felodipin (khảo sát điều kiện sắc ký) 26
Hình 3.8. Sắc ký đồ của mẫu trắng 29
Hình 3.9. Sắc ký đồ của mẫu chuẩn nồng độ 20µg/ml 29
Hình 3.10. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ 30
và diện tích pic 30
Hình 3.11. Sắc ký đồ của mẫu chuẩn 35
Hình 3.12. Sắc ký đồ của mẫu định lượng 35
1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Bệnh tim mạch là bệnh khá phổ biến, là gánh nặng sức khỏe chính yếu,
để lại nhiều tàn phế và là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên toàn thế
giới. Trong đó, tăng huyết áp (hay còn gọi là cao huyết áp) là bệnh rất tiêu
biểu và thường gặp nhất. Nếu không được chẩn đoán và điều trị có thể gây ra
các biến chứng và di chứng nặng nề như tai biến mạch não, suy thận… ảnh
hưởng xấu đến chất lượng cuộc sống người bệnh, trở thành gánh nặng cho gia
đình và cho xã hội. Do vậy, thuốc điều trị bệnh tim mạch cũng như tăng huyết
áp ngày càng chiếm tỷ trọng lớn, có vai trò quan trọng trong công tác chăm

sóc sức khỏe cộng đồng.
Cùng với sự phát triển mạnh mẽ của công nghiệp dược phẩm trong và
ngoài nước trong nhiều năm gần đây, dạng bào chế viên tác dụng kéo dài đã
ra đời để phù hợp với đặc thù điều trị các bệnh tim mạch là phải sử dụng
thường xuyên, lâu dài mà giảm được số lần dùng thuốc, giảm tác dụng bất lợi
nhiều nhất như: viên nén giải phóng chậm, viên nén bao film giải phóng
chậm, viên nén giải phóng kéo dài, viên nén giải phóng có kiểm soát… Dược
điển của Anh, Mỹ chỉ có một số ít chuyên luận về viên tác dụng kéo dài, trong
khi đó Dược điển Việt Nam chưa có một chuyên luận riêng về dạng bào chế
này. Nhiều dược chất được dùng trong các dạng bào chế này như: diltiazem,
nicardipin, nifedipin, verapamil, …Trong đó, felodipin là một trong những
thuốc đang được sử dụng khá phổ biến ở Việt Nam trong mấy năm gần đây.
Chế phẩm viên nén felodipin 5 mg đang được nghiên cứu bào chế. Do đó, để
đánh giá đúng và kịp thời chất lượng chế phẩm nghiên cứu là yêu cầu bắt
buộc. Để góp phần phát triển một chế phẩm thuốc mới chúng tôi tiến hành
thực hiện đề tài: “Xây dựng phương pháp định lượng felodipin trong viên nén
giải phóng kéo dài bằng HPLC” với các mục tiêu sau:
2
 Xây dựng quy trình định tính và định lượng Felodipin trong viên
nén bằng HPLC
 Thẩm định quy trình phân tích đã xây dựng nhằm định tính và
định lượng Felodipin trong viên nén Felodipin 5 mg giải phóng kéo dài
bằng phương pháp HPLC.
















3
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Đại cương về felodipin
1.1.1. Công thức và tính chất lý hóa
Công thức cấu tạo:

Hình 1.1. Công thức cấu tạo Felodipin
Công thức phân tử: C
18
H
19
Cl
2
NO
4
Khối lượng phân tử: 384,3
Tên khoa học: Ethyl methyl 4-(2,3-dichlorophenyl)-1,4-dihydro-2,6-
dimethylpyridine-3,5-dicarboxylat [10], [17].
Mã ATC: C08C A02 [2]
Phân loại: Felodipin là thuốc chẹn kênh calci có tính chọn lọc cao trên mạch,
dùng trong điều trị tăng huyết áp và đau thắt ngực ổn định [2].
Tính chất lý hóa:

Bột hoặc tinh thể trắng đến vàng nhạt.
Không tan trong nước (19,17 mg/L ở 25°C), dễ tan trong aceton, tan được
trong methanol, ethanol, dicloromethan và tan nhẹ trong heptan.
Nhiệt độ nóng chảy dạng khan: 145
o
C [10], [15].
Độ ổn định và bảo quản: Các chế phẩm nên bảo quản kín, tránh ánh sáng, ở
nhiệt độ dưới 30
o
C [2], [17].
4
1.1.2. Dược động học
Hấp thu: Felodipin hấp thu gần như hoàn toàn qua đường tiêu hoá sau khi
uống nhưng chuyển hoá lần đầu ở gan và có sinh khả dụng tuyệt đối
(SKD) khoảng 15%. Nồng độ đỉnh trong huyết tương đạt được sau 3-5 giờ.
Thức ăn ảnh hưởng đến tốc độ hấp thu, không ảnh hưởng đến mức độ hấp
thu.
Phân bố: Liên kết với protein huyết tương xấp xỉ 99%, chủ yếu là albumin.
Thể tích phân bố ở trạng thái ổn định là 10 L/kg.
Chuyển hóa: Felodipin chuyển hoá mạnh qua gan. Các chất chuyển hóa được
xác định không có hoạt tính gây giãn mạch.
Thải trừ: Bài xuất chủ yếu (khoảng 70% liều dùng) qua nước tiểu dưới dạng
các chất chuyển hoá không hoạt tính, phần còn lại chưa chuyển hoá được đào
thải qua phân, ít hơn 0,5% liều dùng được bài tiết dưới dạng không đổi trong
nước tiểu. Thời gian bán thải (t
1/2
) của felodipin là 11-16 giờ. Felodipin có độ
thanh thải cao, trung bình 1200 mL/phút. Độ thanh thải giảm ở người cao tuổi
và bệnh nhân suy giảm chức năng gan. Không có nguy cơ tích lũy thuốc khi
điều trị kéo dài [2], [16].

1.1.3. Tác dụng dược lý
Tác dụng hạ áp động mạch: Felodipin là thuốc chẹn kênh calci chậm có tính
chất chọn lọc thuộc nhóm dihydropyridin. Felodipin làm giảm trương lực
động mạch (nhất là trên tiểu động mạch), dẫn đến tác dụng giãn mạch gây hạ
huyết áp. Do tính chất chọn lọc cao đối với cơ trơn thành tiểu động mạch nên
felodipin ở liều điều trị không gây tác dụng trực tiếp đến tim, đặc biệt đến tính
co bóp cơ tim hoặc tính dẫn truyền. Felodipin không gây hạ huyết áp thế đứng
vì thuốc không ảnh hưởng đến cơ trơn tĩnh mạch hoặc cơ chế kiểm soát hệ
giao cảm. Felodipin có tác dụng thải natri và lợi tiểu nhẹ do giảm tái hấp thu
5
natri và nước qua ống thận, do đó không gây ứ dịch và muối ở bệnh nhân khi
điều trị lâu dài.
Tác dụng chống đau thắt ngực: Felodipin cải thiện sự cân bằng trong cung
và cầu oxygen của cơ tim. Lưu lượng động mạch vành cũng như lượng cung
cấp oxygen cho cơ tim tăng lên nhờ giãn mạch vành. Felodipin giảm huyết áp
toàn thân nên làm giảm hậu gánh thất trái, do đó giảm nhu cầu oxygen của cơ
tim. Felodipin làm tăng khả năng gắng sức và giảm số cơn đau thắt ngực ở
người bệnh đau thắt ngực ổn định.
Cũng như các thuốc chẹn calci khác, felodipin không ảnh hưởng đến chuyển
hoá glucid và lipid và không làm thay đổi tỷ lệ thành phần giữa các lipid
huyết tương, nên có thể dùng cho người bị đái tháo đường hoặc bệnh gút [2],
[3].
1.1.4. Chỉ định
Điều trị tăng huyết áp.
Điều trị dự phòng cơn đau thắt ngực ổn định [2].
1.1.5. Chống chỉ định
Quá mẫn với dihydropyridin.
Nhồi máu cơ tim cấp.
Suy tim mất bù hoặc chưa kiểm soát được.
Đau thắt ngực không ổn định.

Phụ nữ có thai.
Không dùng felodipin cho trẻ em vì hiệu quả và khả năng dung nạp thuốc ở
trẻ em chưa được xác định [2].
1.1.6. Thận trọng
Thận trọng khi dùng felodipin cho người cao tuổi do nhạy cảm với tác dụng
của thuốc ở liều thông thường. Liều dùng không được vượt quá 5 mg/ngày.
6
Với người suy gan nặng: liều tối đa là 5 mg/ngày.
Cần phải ngừng felodipin nếu sau khi bắt đầu điều trị thấy xuất hiện cơn đau
thắt ngực hoặc bệnh đau thắt ngực nặng lên hoặc có sốc tim.
Giống các chất giãn tiểu động mạch khác, felodipin trong một số hiếm trường
hợp có thể gây tình trạng tụt áp đáng kể, mà tình trạng này ở người nhạy cảm
có thể gây thiếu máu cục bộ cơ tim.
Không uống thuốc với nước ép bưởi [2].
1.1.7. Tác dụng không mong muốn (ADR)
Tác dụng không mong muốn thường gặp nhất liên quan đến tác dụng giãn
mạch của thuốc: nhức đầu, mặt đỏ bừng hoặc cảm giác nóng bừng, phù ngoại
biên. Hầu hết các phản ứng này tùy thuộc liều dùng, xảy ra lúc bắt đầu điều trị
hoặc sau khi tăng liều, thường thoáng qua và giảm dần theo thời gian.
Giống các dẫn chất dihydropyridin khác, hiện tượng phù mắt cá chân liên
quan đến tác dụng giãn mạch có thể gặp khi dùng felodipin.
Ở người bệnh mạch vành, felodipin có thể gây đau ngực khoảng 15-20 phút
sau khi uống thuốc, khi đó phải ngừng thuốc ngay tức thì [2], [16].
1.1.8. Liều lượng và cách dùng
Điều trị tăng huyết áp: Liều dùng cần điều chỉnh theo đáp ứng của người
bệnh và sự dung nạp thuốc sau khoảng 2 tuần sử dụng. Liều khởi đầu ở người
lớn là 5 mg/lần/ngày. Tùy theo đáp ứng của người bệnh, có thể giảm liều tới
2,5 mg/ngày hoặc tăng liều lên 10 mg/ngày. Nếu liều 10 mg/ngày không đủ
để kiểm soát huyết áp, có thể phối hợp với một thuốc chống tăng huyết áp
khác như thuốc chẹn bêta. Đối với bệnh nhân lớn tuổi nên cân nhắc dùng liều

khởi đầu 2,5 mg/ngày.
Liều duy trì thông thường là 2,5 - 10 mg/ngày, uống một lần vào buổi sáng.
7
Dự phòng cơn đau thắt ngực ổn định: Liều dùng là 10 mg/ngày uống một
lần. Nên bắt đầu với liều 5 mg/lần/ngày trong tuần đầu, sau đó tăng liều lên
10 mg/ngày.
Liều dùng cần được điều chỉnh ở người bệnh cao tuổi hoặc suy gan nặng.
Liều khởi đầu thông thường là 2,5 mg/ngày, liều tối đa 5 mg/ngày.
Cách dùng: Dùng đường uống, thuốc nên được uống cùng bữa ăn nhẹ (không
có nhiều chất béo hay carbohydrat). Với các dạng bào chế giải phóng kéo dài,
chỉ được nuốt nguyên viên cùng với nước, không nhai vỡ, không chia nhỏ
viên thuốc [2].
1.1.9. Quá liều và xử trí
Triệu chứng: Gây giãn mạch ngoại vi quá mức kèm theo tụt huyết áp và đôi
khi chậm nhịp tim.
Xử trí: Khi xuất hiện tụt huyết áp trầm trọng, cần điều trị triệu chứng. Trường
hợp chậm nhịp tim và tắc nghẽn dẫn truyền: Atropin 0,5-1 mg tiêm tĩnh mạch
ở người lớn (20-50 mcg/kg ở trẻ em), truyền dịch (glucose, muối sinh lý hoặc
dextran) [2].
1.1.10. Tương tác thuốc
Thuốc ức chế hoặc cảm ứng men cytochrome P450 3A4 ảnh hưởng đáng kể
đến nồng độ felodipin trong huyết tương, nên cần tránh dùng đồng thời.
Các thuốc cảm ứng men làm giảm nồng độ felodipin trong huyết tương như:
Carbamazepin, phenobarbital, phenytoin, oxacarbazepin, primidon, rifampicin
Các thuốc ức chế men làm tăng nồng độ felodipin trong huyết tương như:
Cimetidin, erythromycin, thuốc kháng nấm nhóm azol (itraconazol,
ketoconazol), thuốc ức chế men HIV-protease và một số flavonoid trong dịch
bưởi
Do đó, cần thiết phải theo dõi biểu hiện lâm sàng và điều chỉnh liều felodipin
trong và sau khi kết hợp với các thuốc trên [2], [3].

8
1.1.11. Một số chế phẩm felodipin trên thị trường
Bảng 1.1. Các chế phẩm felodipin trên thị trường [3], [8]
Chế phẩm Hàm lượng Dạng bào chế
Hãng
sản xuất
Nước
sản xuất
Efelo-5
5mg
Viên nén giải
phóng chậm
Aegis Ltd.
Cộng hòa
Sip
Felodil ER
5mg
Viên nén bao
film giải phóng
chậm
Korea United
Pharm. Inc.
Hàn Quốc
Felodipin
STADA
retard
5mg, 10mg
Viên nén giải
phóng chậm
Stadapharm

GmbH
Đức
Felodipin
STADA
retard
2,5mg, 5mg,
10mg
Viên bao film
giải phóng chậm
Stada-VN J.V

Việt Nam
(sx nhượng
quyền)
Felutam CR
5mg
Viên nén giải
phóng có kiểm
soát
Vellpharm
VN
Việt Nam
(sx nhượng
quyền)
Flodicar MR

5mg
Viên nén bao
film giải phóng
kéo dài

Pymepharco Việt Nam
Plendil
2,5mg, 5mg,
10mg
Viên nén giải
phóng kéo dài
AstraZeneca
AB
Thụy Điển
Plendil Plus
Felodipin 5mg
Metoprolol
50mg
Viên nén giải
phóng kéo dài
AstraZeneca
AB
Thụy Điển
9
1.2. Một số nghiên cứu định lượng felodipin
• Fusun Gedil, Osman Ustun, Okan Atay nghiên cứu định lượng Felodipin
trong chế phẩm (cụ thể thử trên viên Plendil® của hãng AstraZeneca - Thụy
Điển) bằng phương pháp quang phổ UV-VIS và phương pháp HPLC. Phương
pháp quang phổ hấp thụ UV-VIS được tiến hành đo quang ở hai bước sóng
234 nm và 360 nm, xây dựng khoảng nồng độ tuyến tính của felodipin tương
ứng lần lượt là 4-24 µg/ml và 8-60 µg/ml. Phương pháp được thẩm định về độ
đúng cho lượng tìm lại lần lượt là 100,2 ± 0,71%, 99,6 ± 0,98% và RSD%
tương ứng là 0,73% và 1,01% bằng cách thêm chuẩn nằm trong khoảng tuyến
tính [12].
• Định lượng felodipin trong môi trường khan là hỗn hợp chứa: 2-methyl-2-

propanol và acid perchloric, dùng dung dịch Cerium sulphat 0,1 M làm dung
dịch chuẩn độ, chỉ thị phát hiện là ferroin R (1ml dung dịch Cerium sulphat
0,1 M tương đương 19,221 mg Felodipin) [10].
• Martin Ahnoff và cộng sự (2004) đã xác định felodipin trong huyết tương
người bằng sắc ký khí mao quản sử dụng detector bắt điện tử - ECD.
Felodipin trong huyết tương được chiết với toluen mà không cần làm sạch,
sắc ký trên cột mao quản silica phủ CPtmSil8 hoặc CPtmSil5 (25m×0,32mm).
Kết quả thu được đường chuẩn tuyến tính trong khoảng nồng độ 2 – 10
nmol/l, độ lặp lại của phương pháp với RSD % là 4 - 8% (2 nmol/l), 2 - 4%
(40 nmol/l). Kết quả nghiên cứu cho thấy phương pháp đảm bảo độ chính xác,
độ ổn định và đặc hiệu cao, có thể xác định felodipin trong mẫu huyết tương
có nồng độ 1 nmol/l trở lên mà không cần làm sạch trong quá trình chiết đồng
thời quá trình oxy hóa felodipin trong bộ phận tiêm và cột được giảm thiểu
[9].
• Phương pháp dùng nhiều nhất định lượng Felodipin là bằng HPLC. Một số
nghiên cứu:
10
− Năm 2012, P. Santhosh Kumar và cộng sự tiến hành phân tích định tính
và phân tích định lượng Felodipin trong viên nén bằng sắc ký lỏng hiệu năng
cao sử dụng detector mảng diod. Sắc ký trên cột Waters Symmetry C18 (4,5 ×
250 mm, 5µm), pha động là acetonitril: nước (80:20 v/v), bước sóng phát hiện
234 nm và thời gian phân tích là 10 phút [13].
− Fusun Gedil (Ustun) và cộng sự tiến hành phân tích định lượng Felodipin
trong chế phẩm bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao sử dụng chất chuẩn nội
dilsulfiram, sắc ký ở nhiệt độ phòng trên cột Luna C18 (4,5 × 250 mm, 5µm),
pha động là methanol: dung dịch đệm phosphat 0,055 M pH=3,0±0,1 (83:17
v/v), detector UV phát hiện ở bước sóng 275 nm, thể tích tiêm mẫu 20 µl. Kết
quả cho thấy thời gian lưu của Felodipin là 12,52 phút và của chất chuẩn nội
là 9,64 phút [12].
− Margareth Gabrielsson và cộng sự tiến hành phân tích định lượng 4 chất

chuyển hóa axit cacboxylic của felodipin trong huyết tương bằng HPLC. Sau
khi lấy huyết tương chứa 4 chất chuyển hóa,thêm chất chuẩn nội rồi thực hiện
chiết lỏng - lỏng và pha rắn, detector UV phát hiện ở 220 nm, cột sắc ký
LiChrospher 60 RP (4 x 250 mm, 5 µm) và cột bảo vệ: cyano Brownlee
guard (3,2 x 15 mm, 7 µm), pha động là methanol: dung dịch đệm phosphat
0,0 5M pH 3,5 (45:80 v/v), tốc độ dòng: 1,15ml/phút, giới hạn phát hiện của
các chất chuyển hóa là 20 nmol/l [11].
− Luis H. Miglioranca và cộng sự (2005) đã định tính và định lượng
felodipin trong huyết tương người bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng
cao ghép khối phổ kép (LC-MS/MS) sử dụng nimodipin làm chuẩn nội.
Felodipin trong huyết tương (0,5 ml) được chiết theo quy trình chiết lỏng -
lỏng bằng hỗn hợp dung môi diethyl ether/hexan (80:20 v/v), mà không cần
làm sạch. Sắc ký ở nhiệt độ phòng trên cột C18 (4,6 x 100 mm, 3µm), pha
động acetonitril : nước (80:20 v/v) chứa 10 mM acid formic, tốc độ dòng
11
0,8mL/phút, thể tích tiêm mẫu 40 µl, thời gian phân tích 5 phút. Felodipin và
chuẩn nội được phát hiện bằng detector MS/MS theo kỹ thuật ghi phổ MRM
(Multiple Reaction Monitoring), chế độ ion hóa bằng phun điện tử ion dương
nghiên cứu cho thấy phương pháp đảm bảo độ đúng và chính xác để định
lượng felodipin trong huyết tương người [14].
− Định lượng felodipin trong chế phẩm viên nén felodipin giải phóng kéo
dài bằng HPLC detector UV phát hiện ở bước sóng 362 nm, pha động là
Acetonitril: dung dịch đệm NaH
2
PO
4
pH 3 ± 0,05: Methanol (2:2:1 v/v/v), cột
C18 (4,6 ×150 mm, 5 µm), tốc độ dòng là 1 ml/phút [17].
1.3. Tổng quan về HPLC
1.3.1. Khái niệm và các thông số đặc trưng cho quá trình sắc ký

a. Khái niệm
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (còn gọi là sắc ký lỏng áp suất cao - High
Pressure) là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự phân tách các chất trên
một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng dưới áp
suất cao. Sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay loại
cỡ là tùy thuộc vào pha tĩnh sử dụng. Khi phân tích sắc ký các chất được hòa
tan trong dung môi thích hợp và đa số sự phân tách đều xảy ra ở nhiệt độ
thường nên các thuốc không bền với nhiệt không bị phân hủy khi sắc ký. Sắc
ký được hoàn thành trong một thời gian rất ngắn (khoảng 30 phút) [4], [5],
[7].
b. Các thông số đặc trưng cho quá trình sắc ký [4], [5], [7].
• Thời gian lưu t
R
: là khoảng thời gian từ lúc tiêm mẫu vào cột đến khi
chất tan được rửa giải ra khỏi cột ở điểm có nồng độ cực đại. Trên cùng một
điều kiện HPLC đã chọn, thời gian lưu của mỗi chất là hằng định. Vì vậy, có
thể dung thời gian lưu để phát hiện định tính các chất.
12
Thời gian lưu phụ thuộc vào các yếu tố:
- Bản chất, thành phần, tốc độ pha động.
- Bản chất sắc ký của pha tĩnh, kích thước, độ xốp, cấu trúc xốp…
- Cấu tạo và bản chất của phân tử chất tan, các nhóm thế.
- Trong một số trường hợp còn phụ thuộc pH pha động, nồng độ chất tạo
phức, nếu các yếu tố này có ảnh hưởng đến các cân bằng động trong
quá trình sắc ký.
• Hệ số phân bố K: là đại lượng đặc trưng cho sự phân bố của chất tan
giữa pha động và pha tĩnh
 =
C
s

C
M

Trong đó: Cs: là nồng độ mol của chất tan trong pha tĩnh
C
M
: là nồng độ mol của chất tan trong pha động
K càng lớn sự di chuyển của chất tan qua pha tĩnh càng chậm. Nếu các chất
trong hỗn hợp có hằng số K khác nhau càng nhiều thì khả năng tách diễn ra
càng dễ dàng hơn.
• Hệ số dung lượng k’
k’ =K×


=



Bằng thực nghiệm k’ có thể tính theo công thức
k’=t’
R
/t
o
= (t
R
-t
o
)/t
o
Trong đó:

K: hệ số phân bố
Q
m
: lượng chất trong pha động
V
S
: thể tích pha tĩnh
t
R
: thời gian lưu
Vm: thể tích pha động
t’
R
: thời gian lưu hiệu chỉnh
Q
S
: lượng chất trong pha tĩnh
t
o
: thời gian chết
chọn cột, pha động… sao cho k’ nằm trong khoảng tối ưu: 1≤ k’ ≤8
13
• Hệ số đối xứng của pic F
F=

2

Trong đó:
W: chiều rộng pic đo ở 1/20 chiều cao pic
a: Khoảng cách từ đường vuông góc hạ đỉnh đến mép đường cong phía trước

tai vị trí 1/20 chiều cao pic
• Số đĩa lý thuyết và hiệu lực cột N và chiều cao của đĩa H

Trong đó:
W: chiều rộng đo đáy pic
W
1/2
: chiều rộng pic đo ở nửa chiều cao pic
Nếu gọi L là chiều dài cột sắc ký thì chiều cao của đĩa lý thuyết được tính
bằng công thức:
H =



• Độ phân giải R
S


Với:
t
RB
, t
RA
: thời gian lưu của 2 pic liền kề nhau (B và A)
W
B
, W
A
: độ rộng pic ở các đáy pic
W

1/2B
, W
1/2A
: độ rộng pic đo ở nửa chiều cao pic
Các giá trị t
RB
, t
RA
, W
B
, W
A
, W
1/2B
, W
1/2A
tính theo cùng một đơn vị
Yêu cầu R
S
>1, giá trị tối ưu R
S
=1,5
14
1.3.2. Cấu tạo máy HPLC

Hình 1.3. Sơ đồ hệ thống HPLC
Trong đó:
1- Bình chứa pha động
5- Cột sắc ký (pha tĩnh)
2- Bộ phận khử khí

6- Detector

3- Bơm cao áp
7- Hệ thống máy tính có phần mềm
ghi nhận tín hiệu,xử lý dữ liệu và điều
khiển hệ thống
4- Bộ phận tiêm mẫu
8- In dữ liệu
1.3.3. Ứng dụng kỹ thuật của HPLC
Các phương pháp định lượng bằng sắc ký đều dựa trên nguyên tắc: nồng độ
của chất phân tích tỷ lệ với diện tích pic hay chiều cao pic của nó.
Có 4 phương pháp định lượng sử dụng trong sắc ký:
− Phương pháp chuẩn ngoại
− Phương pháp thêm chuẩn
−
Phương pháp chuẩn nội
− Phương pháp chuẩn hóa diện tích
Trong khuôn khổ của khóa luận, tôi xin trình bày cụ thể về phương pháp
chuẩn ngoại - chuẩn hóa nhiều 1 điểm và chuẩn hóa nhiều điểm.

15
− Chuẩn hóa 1 điểm: chọn nồng độ chất phân tích trong mẫu chuẩn xấp xỉ
với nồng độ chất phân tích trong của mẫu thử. Tính nồng độ của mẫu thử theo
công thức:
Cx=Cs



Ở đây:
Cx: nồng độ mẫu thử

Cs: nồng độ chất chuẩn
Sx (Hx): diện tích (chiều cao) của pic mẫu thử
Ss (Hs): diện tích (chiều cao) của pic mẫu chuẩn
− Chuẩn hóa nhiều điểm: chuẩn bị một dãy chuẩn với các nồng độ chất chuẩn
tăng dần, tiến hành sắc ký. Vẽ đồ thị chuẩn biểu diễn sự tương quan giữa diện
tích S (hoặc chiều cao H) pic với nồng độ của chất chuẩn (C)
Sử dụng đoạn tuyến tính của đường chuẩn để tính toán nồng độ của chất cần
xác định. Có thể tính toán theo 2 cách:
 Áp dữ kiện diện tích (hoặc chiều cao) pic của chất thử vào đường chuẩn
sẽ suy ra nồng độ của nó
 Xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính mô tả quan hệ giữa diện tích
(hoặc chiều cao) pic với nồng độ của chất cần xác định
Y=a+bCx
Trong đó:
Y: diện tích pic
b: độ dốc của đường chuẩn
a: giao điểm của đường chuẩn
Cx: nồng độ chất thử
Dựa vào phương trình hồi quy này ta tính được nồng độ chất thử:
Cx=
−

[5]

16
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU
2.1. Đối tượng và phương tiện nghiên cứu
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
a. Chế phẩm thử: Viên nén felodipin giải phóng có kiểm soát (chứa 5mg

felodipin) - sản phẩm nghiên cứu của Bộ môn Bào chế trường Đại học Dược
Hà Nội.
b. Thành phần công thức của 1 viên
Thành phần
Hàm lượng
(mg)
Thành phần
Hàm lượng
(mg)
Lớp dược chất

Lớp đẩy

Felodipin
5
Gôm xanthan
40
PVPK30
5
Metholose
20
Crospovidon
40
NaCl
20
NaCl
30
Avicel PH101
40
Lactose

40
PVP K30
10
Aerosil
0,5%
Sắt ferric
0,1


Aerosil
0,5%
Ngoài ra, còn có màng bao, chất hóa dẻo dibutyl phathalat.
Các thành phần đều đạt tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam III.
2.1.2. Phương tiện nghiên cứu
a. Dung môi và hóa chất
− Chất chuẩn: chuẩn nguyên liệu Felodipin (đạt tiêu chuẩn Dược điển Việt
Nam III, hàm lượng 100%)
− Acetonitril, methanol dùng cho HPLC của Merck - Đức
− Nước cất dùng cho HPLC (cất 2 lần)
− Kali dihydrophosphat, acid phosphoric PA của Merck – Đức
− Các tá dược có trong thành phần của viên tạo nền placebo.