ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
*



NGUYỄN TIẾN LUYỆN

XÁC ĐỊNH CHẤT CẤM SIBUTRAMINE
TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG GIẢM BÉO
BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC





HÀ NỘI – 2014

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
*


NGUYỄN TIẾN LUYỆN

XÁC ĐỊNH CHẤT CẤM SIBUTRAMINE
TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG GIẢM BÉO
BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC
Chuyên ngành : Hóa phân tích
Mã số : 60440118
Người hướng dẫn : TS. Lê Thị Hồng Hảo


HÀ NỘI – 2014
LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên cho em gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS. Lê Thị Hồng Hảo,
Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia – Bộ Y tế, đã giao đề
tài, hướng dẫn, đóng góp những ý kiến và tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ em
trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy cô giáo giảng dạy tại khoa Hoá
học, đặc biệt là các thầy cô trong bộ môn Hoá phân tích, đã cho em những
kiến thức quý giá, tạo điều kiện cho em được học tập và nghiên cứu trong thời
gian vừa qua.
Tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới ban lãnh đạo Viện kiểm
nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để
tôi được học tập và hoàn thành đề tài này.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các anh, chị và các bạn đồng nghiệp tại
labo Hóa – Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia đã giúp đỡ
tôi rất nhiều trong quá trình làm thực nghiệm.
Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè đã luôn động
viên, chia sẻ mọi khó khăn cùng tôi.










Hà Nội, năm 2014
Học viên



Nguyễn Tiến Luyện

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU – TỪ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
Chương 1. TỔNG QUAN 2
1.1. Giới thiệu về thực phẩm chức năng giảm béo 2
1.2. Thực trạng sử dụng thực phẩm chức năng giảm béo chứa sibutramine 3
1.3. Tổng quan về Sibutramine 4
1.3.1 Tính chất lý hóa của Sibutramine 4
1.3.2 Tính chất dược lý của Sibutramine 5
1.3.3 Một số phương pháp xác định sibutramine 7
1.3.3.1 Phương pháp sắc ký khí khối phổ GC-MS 7
1.3.3.2 Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ LC-MS/MS 8
1.3.3.3 Phương pháp điện di mao quản CE 10
1.3.3.4 Phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao HPTLC 11
1.3.3.5 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC 12
1.4 Tổng quan về HPLC 14
Chương 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.1 Đối tượng và mục tiêu nghiên cứu 17
2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 17
2.1.2 Mục tiêu nghiên cứu 17
2.2 Nội dung nghiên cứu 17
2.3 Phương pháp nghiên cứu 17
2.3.1 Phương pháp lấy mẫu 17
2.3.2 Phương pháp xử lý mẫu 18
2.3.3 Thẩm định phương pháp phân tích 19
2.4 Phương pháp xử lý số liệu 23
2.5 Hóa chất, thiết bị 23
2.5.1 Hóa chất 23
2.5.2 Thiết bị, dụng cụ 24
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN. 25
3.1 Tối ưu điều kiện tách và xác định Sibutramine bằng HPLC 26
3.1.1 Lựa chọn bước song hấp thụ ánh sáng 26
3.1.2 Lựa chọn một số điều kiện sắc ký 27
3.1.3 Khảo sát pha động 27
3.2 Khảo sát quy trình xử lý mẫu 33
3.2.1 Khảo sát dung môi chiết với viên nang cứng 34
3.2.2 Khảo sát dung môi chiết với viên nang mềm 35
3.2.3 Khảo sát thời gian chiết mẫu 36
3.2.4 Khảo sát quy trình loại béo trong mẫu thực phẩm chức năng 39
3.3 Thẩm định phương pháp phân tích 41
3.3.1 Độ đặc hiệu, độ chọn lọc 41
3.3.2 Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng 43
3.3.3 Khoảng tuyến tính 44
3.3.4 Độ lặp lại của hệ thống 46
3.3.5 Độ đúng của phương pháp 47
3.3.6 Độ lặp lại của phương pháp 49
3.4 Kết quả xác định sibutramine trong một số sản phẩm thực phẩm chức

năng giảm béo 51

Chương 4. KẾT LUẬN 56
TÀI LIỆU THAM KHẢO… 57
PHỤ LỤC 61
























DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU- TỪ VIẾT TẮT









Ký hiệu Tiếng anh Tiếng việt
AOAC
Association of Official
Analytical Community
Hiệp hội cộng đồng phân tích
chính thức
CE
Capillary Electrophoresis Điện di mao quản
ESI
Electrospray Ionization Ion hóa phun điện tử
FDA
Food and Drug Adminstration
Cục quản lý thực phẩm và
dược phẩm Hoa Kỳ
GC-MS
Gas Chromatography Mass
Spectrometry
Sắc ký khí khối phổ
HPLC
High Performance Liquid
Chromatography
Sắc ký lỏng hiệu năng cao

HPTLC
High Performance Thin Layer
Chromatography
Sắc ký lớp mỏng hiệu năng
cao
KN
ATVSTPQG
National institute for food
control
Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh
thực phẩm quốc gia
LC-MS/MS
Liquid Chromatography tandem
Mass Spectrometry
Sắc ký lỏng ghép khối phổ
hai lần
LOD
Limit of Detection Giới hạn phát hiện
LOQ
Limit of Quantification Giới hạn định lượng
R(%)
Recovery Hiệu suất thu hồi
SD
Standard Deviation Độ lệch chuẩn
DANH MỤC CÁC BẢNG


Tên bảng Trang
Bảng 1.1 Thử nghiệm lâm sàng dài hạn với sibutramine 4
Bảng 3.1 Thành phần hệ dung môi pha động 27

Bảng 3.2
Chương trình gradient của hệ pha động amoni acetat -
methanol
28
Bảng 3.3
Chương trình gradient của hệ pha động đệm phosphate -
methanol
30
Bảng 3.4
Kết quả khảo sát dung môi chiết sibutramine cho mẫu
viên nang cứng
34
Bảng 3.5
Kết quả khảo sát dung môi chiết sibutramine cho mẫu
viên nang mềm
35
Bảng 3.6 Kết quả khảo sát thời gian chiết mẫu 37
Bảng 3.7 Kết quả khảo sát dung môi loại béo 39
Bảng 3.8 Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính 44
Bảng 3.9
Độ lệch của từng điểm chuẩn dùng xây dựng đường
chuẩn
46
Bảng 3.10 Kết quả khảo sát độ lặp lại của hệ thống 47
Bảng 3.11 Độ thu hồi của phương pháp với viên nang mềm 47
Bảng 3.12 Độ thu hồi của phương pháp với viên nang cứng 48
Bảng 3.13 Độ lặp lại của phương pháp với viên nang cứng 50
Bảng 3.14 Độ lặp lại của phương pháp với viên nang mềm 50
Bảng 3.15
Kết quả phân tích sibutramine trong một số mẫu thực

phẩm chức năng giảm béo.
51


DANH MỤC CÁC HÌNH


Tên hình Trang
Hình 1.1 Công thức cấu tạo của sibutramine 4
Hình 1.2 Sơ đồ khối của một máy sắc ký lỏng hiệu năng cao. 14
Hình 2.1 Quy trình phân tích mẫu dự kiến 19
Hình 2.2 Thiết bị HPLC Shimadzu (LC 20AD) 25
Hình 3.1 Sắc ký đồ PDA của sibutramine 26
Hình 3.2 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn sibutramine với pha động 1 28
Hình 3.3 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp với pha động 1 29
Hình 3.4 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn sibutramine với pha động 2 29
Hình 3.5 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp với pha động 2 30
Hình 3.6 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn sibutramine với pha động 3 31
Hình 3.7 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp với pha động 3 31
Hình 3.8 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn sibutramine với pha động 4 32
Hình 3.9 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp với pha động 4 32
Hình 3.10
Biểu đồ biểu diễn diệu quả chiết sibutramine trong mẫu viên
nang cứng
34
Hình 3.11
Biểu đồ biểu diễn diệu quả chiết sibutramine trong mẫu viên
nang mềm
36
Hình 3.12

Sắc ký đồ phân tích mẫu trắng TPCN them chuẩn siêu âm
trong 5 phút
37
Hình 3.13
Sắc ký đồ phân tích mẫu trắng TPCN them chuẩn siêu âm
trong 10 phút
38
Hình 3.14
Sắc ký đồ phân tích mẫu trắng TPCN them chuẩn siêu âm
trong 15 phút
38
Hình 3.15
Sắc ký đồ phân tích mẫu trắng TPCN them chuẩn siêu âm
trong 20 phút
38
Hình 3.16
Sắc ký đồ phân tích mẫu trắng TPCN them chuẩn siêu âm
trong 25 phút
39
Hình 3.17 Sắc ký đồ phân tích mẫu TPCN nang mềm chưa loại béo 40
Hình 3.18 Sắc ký đồ phân tích mẫu TPCN nang mềm đã loại béo 40
Hình 3.19
Sắc ký đồ phân tích mẫu TPCN nang mềm thêm chuẩn
200µg/ml loại béo bằng n-Hexan (H
+
)
41
Hình 3.20 Sắc ký đồ dung dịch đánh giá độ phân giải 42
Hình 3.21 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn sibutramine 200µg/ml 42
Hình 3.22 Sắc ký đồ của dung dịch mẫu trắng TPCN giảm béo 43

Hình 3.23
Sắc ký đồ của dung dịch mẫu trắng TPCN thêm chuẩn
sibutramine 200µg/ml
43
Hình 3.24
Sắc ký đồ của dung dịch mẫu trắng TPCN thêm chuẩn
sibutramine 0,5 µg/ml

44
Hình 3.25
Sắc ký đồ của dung dịch mẫu trắng TPCN thêm chuẩn
sibutramine 0,2 µg/ml
44
Hình 3.26
Khoảng tuyến tính sự phụ thuộc giữa diện tích pic vào nồng
độ của sibutramine
45
Hình 3.27
Đường chuẩn sự phụ thuộc giữa diện tích pic vào nồng độ
của sibutramine
45
Hình 3.28 Biểu đồ phân tích mẫu thực tế

55





ĐẶT VẤN ĐỀ


Béo phì hiện không còn là vấn đề của riêng các nước phát triển mà
nay còn là vấn nạn của cả các nước đang phát triển. Báo cáo mới nhất của
WHO đã chỉ ra rằng khoảng 1,5 tỉ người trưởng thành có độ tuổi trên 20 được
xếp vào nhóm thừa cân. Trong số đó hơn 200 triệu nam giới và gần 300 triệu
nữ giới ở trạng thái đã béo phì. Theo ước tính đến năm 2015 sẽ có khoảng 2,3
tỉ người thừa cân và trên 700 triệu người béo phì. Một số liệu khác cho thấy
gần 43 triệu trẻ em dưới 5 tuổi đã bị thừa cân tính đến năm 2010 [25]. Chính
vì thế nhu cầu giảm béo cũng theo đó mà tăng lên. Phương pháp điều trị giảm
béo thường được áp dụng là ăn kiêng, kết hợp hoạt động thể lực. Nhưng
phương pháp này thường khó thực hiện và kém hiệu quả. Vì vậy, mọi người
thường tìm đến các loại thuốc giảm béo để tăng cường tác dụng giảm cân.
Nắm bắt được nhu cầu cấp thiết này, nhiều công ty sản xuất thực phẩm chức
năng đã chớp thời cơ đưa ra các sản phẩm phục vụ cho nhu cầu này. Để tăng
tác dụng của sản phẩm, các công ty đã không ngần ngại đưa vào sản phẩm các
chất có tác dụng nhanh và mạnh, nhằm tiêu thụ sản phẩm một cách nhanh
chóng. Trong nhóm các chất thường được cho thêm để tăng hiệu quả giảm
béo một cách bất hợp pháp có hoạt chất Sibutramine. Nó có tác động đến hệ
thần kinh trung ương, làm tăng lượng serotonin và noradrenalin trong não, từ
đó tạo cảm giác no và không thèm ăn. Chất này đã bị cấm sử dụng ở nhiều
nước trên thế giới, trong đó có Việt Nam [4], [12], [16]. Do đó việc phát hiện
được sibutramine có mặt trái phép trong thực phẩm chức năng giúp giảm béo
là một yêu cầu thực tiễn trong kiểm soát tính an toàn của loại sản phẩm này.
Xuất phát từ yêu cầu thực tiễn kể trên, chúng tôi đã nghiên cứu chọn đề tài
“Xác định hàm lượng chất cấm sibutramine trong thực phẩm chức năng giảm
béo bằng phương pháp HPLC”. Đây là phương pháp phân tích hiện đại, có độ
chính xác cao và có khả năng ứng dụng rộng rãi tại Việt Nam.




Chương 1. TỔNG QUAN

1.1. Giới thiệu về thực phẩm chức năng giảm béo
Thực phẩm chức năng giảm béo là những sản phẩm của quá trình chế
biến thực phẩm hay thảo dược đã được các nhà sản xuất nghiên cứu để bổ
sung và thay đổi một số thành phần dinh dưỡng có tác dụng tốt cho sức khoẻ.
Các loại thực phẩm chức năng giảm béo đa số được sản xuất dưới dạng viên
nén, viên nang, dạng bột, dạng cao hay dạng trà nhưng không được coi như
một loại thuốc chữa bệnh, đây có thể coi là một dạng thực phẩm giảm cân
nhanh. Hiện nay trên thị trường có rất nhiều loại thực phẩm chức năng giảm
béo giúp người béo phì lấy lại vóc dáng cân đối.
Để tăng tác dụng của sản phẩm, các công ty sản xuất đã đưa vào sản
phẩm các chất có tác dụng nhanh và mạnh, nhằm tiêu thụ sản phẩm một cách
nhanh chóng. Những chất giảm béo sử dụng đầu tiên gồm có nhóm các chất
cường adrenalin (phentermin, benzphetamin, phendimetrazin, mazindol,
diethylpropion, phenylpropanolamin) và nhóm chất cường serotonin
(fenfluramin, dexfenfluramin). Tuy nhiên, phenylpropanolamin - một tác
nhân thuộc nhóm cường adrenalin đã bị cấm lưu hành tại thị trường Mỹ vào
tháng 10 năm 2000 do các nghiên cứu cho thấy nó làm tăng nguy cơ tai biến
mạch máu não như xuất huyết đột quỵ khi nó được sử dụng như một chất
giảm cân ở phụ nữ [14]. Cũng như vậy, các chất cường serotonin mặc dù cũng
có hiệu quả trong việc hỗ trợ giảm cân nhưng chúng cũng đã bị cấm lưu hành
trên thị trường Mỹ từ tháng 9 năm 1997 do các nghiên cứu cho thấy nó làm
thay đổi van tim và tăng huyết áp động mạch phổi [15]. Sibutramine (thuộc
nhóm chất ức chế tái thu hồi serotonin-noradrenalin) chính thức được lưu
hành tại Mỹ từ tháng 2 năm 1998, sau đó nó đã được sử dụng cho điều trị béo
phì trong khoảng 40 quốc gia trên thế giới.
Sibutramine đã được chứng minh là có hiệu quả trong việc điều trị béo
phì. Một số nghiên cứu lâm sàn ngắn hạn cho thấy sibutramine có tác dụng
giảm cân có thể do sự kết hợp của giảm sự thèm ăn, gây cảm giác no và có thể

cảm ứng của sinh nhiệt. Hiệu quả ban đầu của nó làm giảm cân vì vậy nó
được coi như là một phương thức tiếp cận để giảm cân hiệu quả [21]. Tuy
nhiên sibutramine lại có những tác dụng phụ trầm trọng liên quan đến hệ thần
kinh trung ương, làm tăng nhịp tim, tăng huyết áp, thậm chí là nhồi máu cơ
tim [24], do đó nó đã bị cấm lưu hành trên nhiều thị trường như thị trường
châu Âu [12], Mỹ [16] và cả thị trường Việt Nam [4].
1.2 Thực trạng sử dụng thực phẩm chức năng giảm béo chứa
sibutramine
Theo Cơ quan Quản lý Dược phẩm và Thực phẩm Hoa Kỳ (FDA), các
sản phẩm thực phẩm chức năng giúp giảm béo có chứa một số thành phần hóa
chất khác không được nhà sản xuất công bố rõ ràng và sử dụng cao hơn mức
quy định. Các chất này gây độc cho hệ tim mạch, thận và gan của người nếu
sử dụng dài ngày, đồng thời rất nguy hiểm với người cao huyết áp, người mắc
bệnh động mạch vành, xung huyết, loạn nhịp tim, tăng nhãn áp, tai biến hoặc
đột quỵ.
Sibutramine được biết đến dưới dạng biệt dược Sibutral. Đây là loại
thuốc chỉ bán theo chỉ định của bác sĩ, làm giảm cảm giác thèm ăn, tác dụng
vào trung tâm nhận thức về đói và no ở não, thường được sử dụng như thuốc
chống trầm cảm, chán sống. Một thời gian sau khi uống, nó làm giảm trung
bình 5% trọng lượng cơ thể. Sibutramine được Cơ quan Quản lý Dược phẩm
và Thực phẩm Hoa Kỳ cấp phép từ tháng 11-1997. Được bán tại Pháp từ năm
2001 nhưng ngay lập tức, y học đã nhận ra những tác dụng phụ qua 2 trường
hợp tử vong tại Italia. Năm 2002, Italia cấm bán loại thuốc có chứa
Sibutramine. Đến năm 2007, Pháp cũng cấm bán. Năm 2009, các nhà khoa
học Mỹ nhận ra người uống Sibutramin còn có nguy cơ tự tử - là hiện tượng
thường xảy ra với những loại thuốc điều trị chứng chán đời.
Tại Singapore, Cơ quan Khoa học Y tế (HAS) cũng đã cấm lưu hành
Oxy Elite Pro. Tiến hành thí nghiệm, HAS nhận thấy Oxy Elite Pro có chứa
Sibutramine chứ không phải được chiết xuất từ thảo dược như lời quảng cáo.
Năm 2011, Cơ quan dược phẩm Thụy Sỹ đã phân tích các mẫu sản phẩm thảo

dược giảm cân, kết quả cho thấy có tới 8/13 mẫu, trong đó có thuốc giảm cân
2Day Diet, 3X Slimming Power bị phát hiện chứa hoạt chất Sibutramine với
hàm lượng 21,5 mg, vượt quá 43% liều lượng cho phép sử dụng hằng ngày.
Tại Việt Nam, mặc dù Cục quản lý Dược – Bộ Y Tế đã ban hành Quyết
định số: 120/QĐ-QLD ngày 14/4/2011 về việc rút số đăng ký của thuốc do
phản ứng có hại, theo đó tất cả các thuốc có chứa hoạt chất Sibutramine ra
khỏi danh mục các loại thuốc được cấp số đăng ký thông hành trên thị trường
Việt Nam tuy nhiên, qua đợt kiểm tra mới đây của các cơ quan chức năng đã
phát hiện trên địa bàn thành phố Hà Nội vẫn đang hiện diện một số loại thuốc
và thực phẩm chức năng có chưa hoạt chất nguy hiểm này.
Theo thông tin từ Cục an toàn thực phẩm Bộ Y tế, rất nhiều trường hợp
sau khi sử dụng thực phẩm chức năng có chứa thành phần hoạt chất
Sibutramine đã phải nhập viện trong tình trạng sức khỏe và tính mạng bị đe
dọa. Hoạt chất Sibutramine có tác dụng giúp những người béo phì giảm cân,
nhưng lại đặc biệt nguy hiểm với người tiêu dùng, nhất là những người có tiền
sử bệnh huyết áp và tim mạch. Các sản phẩm này gây nhiều chứng rối loạn
nguy hiểm cho cơ thể chúng đe dọa sức khỏe và tính mạng người sử dụng.
Theo TS. Nguyễn Hùng Long, Phó cục trưởng Cục An toàn thực phẩm
Bộ Y tế phân tích: “Đối với người có tiền sử bệnh tim mạch, loại sản phẩm
này gây rối loạn và làm tăng nhịp tim. Như vậy, nó làm cho người mắc bệnh
về tim mạch sẽ thêm nặng. Thậm chí nếu sử dụng liều cao, nó còn có thể gây
rối loạn nặng nề hơn ở hệ thống tim mạch”. Cơ quan chức năng cảnh báo
rằng, thuốc giảm cân hay thực phẩm chức năng có chứa Sibutramine trên thị
trường hiện nay có hoạt chất rất độc hại và thực tế đã có nhiều người sử dụng
phải nhập viện trong tình trạng sức khỏe nguy kịch.

1.3. Tổng quan về sibutramine
1.3.1. Tính chất lý hóa của sibutramine
- Công thức phân tử: C
17

H
26
ClN (Khối lượng phân tử: 297,5 đvC)
- Công thức cấu tạo:








Hình 1.1: Công thức cấu tạo của sibutramine

- Danh pháp quốc tế: (+/-)-1-(p-chlorophenyl)-α-isobutyl-N,N-dimethyl-
cyclobutan-methylamin [5].
- Trong các chế phẩm chúng thường tồn tại ở dạng Sibutramine hydroclorid
monohydrat.

- Độ tan: Độ tan của sibutramine hydrochlorid monohydrat trong nước là 5,2
mg/mL. Sibutramine kiềm tan nhiều hơn trong alcol, độ tan tăng dần theo
độ dài mạch C từ methanol đến octhanol [5].
- Nhiệt độ nóng chảy: Sibutramine kiềm có nhiệt độ nóng chảy là 55,15
o
C và
enthalpy là 60,75 J/mol; Sibutramine hydroclorid monohydrat có nhiệt độ
nóng chảy ở 119
0
C [5].
- Sibutramine base hấp thụ ánh sáng trong vùng UV-VIS. Cực đại hấp thụ tại

bước sóng 225 nm [23].
1.3.2. Tính chất dược lý của Sibutramine
Sibutramine hấp thu tốt qua đường tiêu hóa (77%). Thời gian để thuốc
đạt nồng độ đỉnh trong huyết tương là 1 giờ và thời gian bán thải là 1,1 giờ.
Sibutramine phân bố nhanh chóng và rộng rãi đến các mô. Khi dùng đường
uống sibutramine bị chuyển hóa đáng kể khi qua gan lần đầu. Sibutramine
được chuyển hóa bởi cytochrom P450 CYP3A4 thành hai amin (gọi là chất
chuyển hóa có hoạt tính 1 và 2) với chu kỳ bán rã tương ứng là 14 giờ và 16
giờ. Nồng độ đỉnh trong huyết tương của chất chuyển hóa có hoạt tính 1 và 2
đạt được sau 3-4 giờ. Các chất chuyển hóa thải trừ chủ yếu qua nước tiểu
[13].
Sibutramine đã được đánh giá như một thuốc chống trầm cảm tiềm tàng
do các cơ chế đã được chứng minh là tác động đó cũng tương tự như các
thuốc chống trầm cảm ba vòng, chẳng hạn như amitriptylin. Tuy nhiên,
sibutramine không có tác dụng phụ của thuốc chống trầm cảm ba vòng bao
gồm buồn ngủ, tác dụng kháng acetylcholin thế đứng [21].
Sibutramine là một hoạt chất có tác động đến hệ thần kinh trung ương,
làm gia tăng lượng serotonin và noradrenalin trong não, từ đó tạo cảm giác no
và không thèm ăn [21].
Trong cơ thể, sibutramine chuyển hóa nhanh chóng thành các chất
chuyển hóa desmethyl: M1 (mono-desmethyl sibutramin) và M2 (di-
desmethyl sibutramin) và sibutramine tác động dược lý chủ yếu thông qua 2
chất chuyển hóa này để gây ra tác dụng giảm cân [11], [8].
Thử nghiệm lâm sàng đã chứng minh sibutramine có hiệu quả như một
chất giảm cân với liều lượng khác nhau, từ 10 đến 20 mg/ngày [21].

Bảng 1.1: Thử nghiệm lâm sàng dài hạn với sibutramine
Thời gian
thử nghiệm
Liều

( mg/ngày)
Chế độ ăn
Cân nặng được giảm
(kg)
6 tháng 10 30 kcal/kg
S=7,52
pl= 3,56

6 tháng 15 30 kcal/kg
S=10,27
pl=1,26
1 năm 10
220 – 800
kcal/ngày
S= 5,2
b

pl= 0,5
1 năm 10 và 15
Chế độ ăn
theo lời
khuyên
S (10)= 4
S(15)= 6
pl=1,6
1 năm 20 NR
S= 4,4
e

pl= 0,5

2 năm 10 – 20
600
kcal/ngày
S=10
pl = 4,7
S: Sibutramine, pl: placebo, NR: không có báo cáo
a= ± SD; b: P=0,004; e: P < 0,05 với placebo
Tác dụng không mong muốn: Sibutramine đồng thời cũng kích thích
quá mức hệ thần kinh trung ương và ảnh hưởng một vài khía cạnh như bồn
chồn, khô miệng, đau đầu, tê liệt và những dị cảm (Cảm giác khác thường
như bị châm chích, kiến bò) có thể xảy ra. Hơn thế nữa, nó còn liên quan đến
tăng nguy cơ tim mạch như tăng áp lực máu, nhịp tim và thường tăng nguy cơ
đau tim cũng như đột quỵ [20]. Do những nguy cơ này, sibutramine đã bị cấm
lưu hành trên thị trường châu Âu từ ngày 21/1/2010 [12]. Từ tháng 8 năm
2010, Mỹ đã chống chỉ định mới cho các bệnh nhân trên 65 tuổi do các tác
dụng phụ thực tế qua các nghiên cứu lâm sàng của sibutramine [17]. Tại Việt
Nam, các chế phẩm chứa sibutramine đã bị rút số đăng ký lưu hành theo
Quyết định số 120/QĐ-QLD ngày 14/4/2011 của Cục quản lý Dược – Bộ Y tế
[4]. Tuy nhiên, do nhu cầu giảm béo của những người thừa cân nên hiện nay,
nhiều loại thuốc giảm béo dưới mác thực phẩm chức năng có chứa
sibutramine vẫn được bán tràn lan trên thị trường.

1.3.3. Một số phương pháp xác định Sibutramine
Trên thế giới, đã có rất nhiều nghiên cứu đưa ra các phương pháp xác
định sibutramine với nhiều kỹ thuật phân tích khác nhau như: Sắc ký khí khối
phổ GC-MS [22], Sắc ký lỏng khối phổ LC-MS/MS [10]; Điện di mao quản
CE [28]; Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao HPTLC [7]; Sắc ký lỏng hiệu năng
cao HPLC [23], [7], [6], [26];
1.3.3.1 Phương pháp sắc ký khí khối phổ GC-MS
Trong phương pháp sắc ký khí khối phổ, sau khi qua cột tách, các hợp

chất hữu cơ trung hoà bị ion hoá thành các ion phân tử hay ion mảnh của phân
tử mang điện dương hoặc âm, các gốc tự do trong điều kiện áp suất thấp. Sau
đó, các ion đựơc đưa sang bộ phận tách theo khối lượng. Từ các tín hiệu thu
được, dựa vào khối lượng ion phân tử, dựa vào đồng vị, dựa vào các mảnh ion
phân tử, dựa vào cơ chế tách và dựa vào ngân hàng dữ liệu các ion và mảnh
ion, người ta định tính và định lượng được chất phân tích một cách chính xác.
Tác giả Sabina Strano-Rossi và cộng sự [22] đã phát triển phương pháp
sắc ký khí khối phổ sibutramine trong các mẫu viên nén, viên nang, trà túi.
Mẫu được hòa trong nước, kiềm hóa bằng Natri carbonat đến pH =10. Chiết
bằng methyl chloride, làm khô, bốc hơi dung môi rồi phân tích bằng GC-MS.
Quá trình tách sắc ký khí được thực hiện trên cột HP-5-MS (30m × 0,25mm),
chương trình nhiệt độ bắt đầu ở 110
o
C, tăng 10
o
C/phút đến 280
o
C và duy trì
trong 3 phút, sử dụng khí mang He với tốc độ 0,6 ml/phút, phổ khối thu được
trong khoảng khối lượng 40-400 a.m.u.
Đây là một phương pháp phân tích hiện đại, được sử dụng có hiệu quả
cao, độ phân giải và độ nhạy cao, tiết kiệm dung môi. Tuy nhiên, chi phí cho
thiết bị rất lớn, quy trình chiết mẫu phức tạp chưa phổ biến cho các phòng thí
tại Việt Nam nên việc ứng dụng khó khăn.
1.3.3.2 Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ LC-MS/MS
Đây là một phương pháp nhanh, nhạy và được phát triển nhiều hiện
nay. Sau khi qua cột tách, chất phân tích được hóa hơi, các hợp chất hữu cơ
trung hoà bị ion hoá thành các ion phân tử hay ion mảnh của phân tử mang
điện dương hoặc âm, các gốc tự do. Sau đó, các ion đựơc đưa sang bộ phận
tách theo khối lượng. Từ các tín hiệu thu được, dựa vào khối lượng ion phân

tử, dựa vào đồng vị, dựa vào các mảnh ion phân tử, dựa vào cơ chế tách và
dựa vào ngân hàng dữ liệu các ion và mảnh ion, người ta định tính và định
lượng được chất phân tích một cách chính xác.
Nhóm tác giả thuộc trường đại học Fudan, Thượng Hải [10] đã phát
triển phương pháp sắc ký lỏng khối phổ ion hóa phun điện tử (LC-ESI/MS)
để xác định đồng thời sibutramine và các chất chuyển hóa trong huyết tương.
Mẫu được chiết từ huyết tương bằng tert-butyl ether, thêm chất chuẩn nội
propranolol hydroclorid, bay hơi dung môi và hòa cặn trong pha động, phân
tích trên thiết bị LC-ESI/MS. Điều kiện sắc ký: cột ODS MS với pha động
acetonitril chứa 0,1% trifloacetic acid. Khoảng tuyến tính của sibutramine
trong khoảng 0,328-32,8 ng/ml trên nền mẫu huyết tương và độ chụm dưới
19,9%. Phương pháp có độ nhạy và độ chụm phù hợp để ứng dụng trong các
nghiên cứu dược động học.
Tác giả Sabina Strano-Rossi và cộng sự đã phát triển phương pháp sắc
ký lỏng khối phổ phân giải cao LC-HRMS để nhận biết và định lượng đồng
thời các chất kích thích (ephedrines, cafein), các chất giảm cân (phentermine,
phendimetrazine, phenmetrazine, fenfluramine, benfluorex, mephentermine,
fencanfamine, sibutramine) và các chất cường dương nhóm PDE5 (sildenafil,
vardenafil, tadalafil) trong thực phẩm chức năng sử dụng phổ khối Orbitrap.
Detector khối phổ với khả năng phân giải 100.000 (FWHM tại m/z 200) hoạt
động ở chế độ full scan và chế độ ion hóa phun điện tử ESI. Các chất phân
tích được nhận biết dựa vào thời gian lưu, phổ khối, và tỉ lệ tương quan của
các đồng vị. Giới hạn phát hiện của các chất từ 1-25 ng/g, giới hạn định lượng
là 50ng/g. Phương pháp có độ tuyến tính cho tất cả các chất trong khoảng 50-
2000 ng/g với hệ số tương quan >0,99. Phương pháp có độ chụm tốt, hệ số
biến thiên CV % luôn thấp hơn 15%. Các tác giả đã ứng dụng phương pháp
để phân tích 36 mẫu thực phẩm chức năng, phát hiện sự có mặt của
ephedrine/pseudoephedrine trong 4 mẫu, cafein trong 8 mẫu, sildenafil trong
4 mẫu.
Nhóm tác giả Ying Shi, Chengiun và cộng sự đã phát triển phương

pháp sắc ký lỏng khối phổ ion hóa phun điện tử (HPLC-ESI-MS/MS) để xác
định đồng thời 8 chất cấm (ephedrine, norpseudoephedrine, fenfluramine,
sibutramine, clopamide, emodin, rhein, and chrysophanol) trong thực phẩm
chức năng giảm cân. Các chất phân tích được chiết ra khỏi nền mẫu bằng
phương pháp chiết siêu âm với dung dịch 70% methanol, ly tâm và tiêm vào
hệ thống sắc ký. Các chất được tách trên cột sắc ký Hypersil Gold column
(2.1 mm × 150 mm, 5 μm) sử dụng chương trình rửa giải gradient, pha động
gồm hỗn hợp dung dịch đệm amoni format (pH 3,50) và acid formic 0,02% và
methanol, tốc độ dòng 0,25ml, nhiệt độ buồng cột 25
o
C. Nhận biết định tính
các chất dựa vào các ion đặc trưng và thời gian lưu sử dụng chế độ SRM.
Clenbuterol và ibuprofen được sử dụng làm nội chuẩn lần lượt cho chế độ ion
dương và ion âm. Hiêu suất thu hồi cho 3 khoảng nồng độ khác nhau từ 80,2
– 94,5%. Giới hạn phát hiện từ 0,03 – 0,66 mg/kg (ngoại trừ chrysophnol 1,6
mg/kg). Phương pháp đã được ứng dụng để xác định chất cấm trong 4 loại
thực phẩm chức năng giảm cân. Các kết quả thống kê cho thấy sibutramin và
hoặc fenfluramine là thành phần chất cấm chín trong các sản phẩm với hàm
lượng lần lượt là 6,1 – 1,3 × 10
3
mg/kg and 1,9 – 9,7 × 10
3
mg/kg.
Tác giả Ramakrishna và các cộng sự, đã phát triển phương pháp sắc ký
lỏng 2 lần khối phổ LC-MS/MS để xác định sibutramine trong mẫu huyết
tương người. Phương pháp có độ chọn lọc và hiệu suất thu hồi cao. Sử dụng
chiết lỏng – lỏng và chất phân tích tách bằng chế độ đẳng dòng isocractic trên
cột sắc ký pha đảo. Sau đó được phân tích trên thiết bị MS/MS. Khoảng tuyến
tính của sibutramine trong khoảng 30 – 6000 pg/ml trên nền mẫu huyết tương
người. Phương pháp có giới hạn phát hiện là 30 pg/ml với độ lệch chuẩn dưới

4%. Thời gian phân tích cho mỗi lần là 3,2 phút và có thể phân tích hơn 250
mẫu huyết tương người mỗi ngày. Phương pháp đã được thẩm định và được
sử dụng phân tích sibutramine trong các mẫu huyết tương người cho ứng
dụng trong việc kết hợp với một chế độ ăn uống để giảm cân.
Tác giả Li Ding và cộng sự đã phát triển phương pháp sắc ký lỏng khối
phổ phun điện tử (LC-ESI-MS) có độ nhạy và đọ chính xác cao để xác định
sibutramine và 2 chất chuyển hóa N-desmethyl của nó trong huyết tương
người sử dụng phenoprolamine hydrochloride làm nội chuẩn. Sau khi kiềm
hóa với natri bicarbonate, các mẫu huyết tương được chiết với cyclohexane và
tiêm vào hệ thống HPLC, quá trình tách trên cột pha đảo C18 với pha động
đệm acetat 10mM (pH 3,5) và methanol (25/75). Các chất phân tích được xác
định sử dụng chế độ ion hóa phun điên tử trong detector khối phổ 1 tứ cực.
Lc-ESI-MS được thực hiện trong chế độ chọn lọc ion (SIM) sử dụng các ion
đặc trưng m/z = 228 cho sibutramine, m/z = 266 cho N-mono-
desmethysibutramine (chất chuyển hóa 1), m/z = 252 cho N-di-
desmethylsibutramine (chất chuẩn hóa 2) và m/z = 344 cho nội chuẩn. Các
đường chuẩn tuyến tính trong khoảng 0,05 – 20 µg/L cho sibutramine, 0,02 -
20 µg/L cho chất chuyển hóa 1 và 0,1 – 30 µg/L cho chất chuyển hóa 2. Giá
trị độ lặp lại trong ngày nhỏ hơn 7,6% cho sibutramine, 8,9 % cho chất
chuyển hóa 1 và 5,5% cho chất chuyển hóa 2. Giá trị độ lặp lại giữa các ngày
là nhỏ hơn 11,8% cho sibutramine, 12,7% cho chất chuyển hóa 1 và 9,4% cho
chất chuyển hóa 2. Hiệu suất chiết các mẫu huyết tương lần lượt cho
sibutramine, chất chuyển hóa 1 và chất chuyển hóa 2 là 90,2%, 90,9% và
91,0%. Phương pháp được ứng dụng thành công để nghiên cứu dược động
học của sibutramine và các chất chuyển hóa cho những người tình nguyện
nam ở Trung Quốc.
Đây là phương pháp phân tích hiện đại, có độ nhạy và độ chính xác
cao. Tuy nhiên, đây là một phương pháp khó, thiết bị phức tạp, đắt tiền và
không phải phòng thí nghiệm nào cũng có điều kiện để thực hiện phương
pháp này.



1.3.3.3 Phương pháp điện di mao quản (CE)
Đây là phương pháp tách các chất phân tích là các ion hoặc các chất
không ion nhưng có mối liên hệ chặt chẽ với các ion trong một ống mao quản
hẹp chứa đầy dung dịch đệm, đặt trong điện trường. Do độ linh độ điện di của
các ion khác nhau, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi
nhau.
Nhóm tác giả Yang Li và các cộng sự [28] đã phát triển phương pháp
điện di mao quản hiệu năng cao để xác định đồng thời 07 hoạt chất trong mẫu
thực phẩm chức năng là fenfluramin, pseudoephedrine, norpseudoephedrine,
amfepramone, sibutramine, sildenafil và strychnine. Sử dụng hỗn hợp đệm
của natri tetraborate 20 mM, natri dodecyl sulfat 10 mM và acetonitrile 5%
(pH = 9,0) và phân tích được thực hiện tại một bước sóng phát hiện 195 nm
dưới một điện áp tách 17 kV ở 25°C. Với giới hạn vi tuyến tính là 100 mg/l,
với hệ số tương quan R lớn hơn 0,998. Độ lệch chuẩn tương đối dao động từ
4,5% và 7,9% (n = 7). Và độ thu hồi trung bình trong khoảng 79,6% -112,0%.
Các giới hạn phát hiện (S/N = 3) nằm trong khoảng 0,16 và 0,65 mg/l.
Phương pháp phân tích tương đối đơn giản, nhanh chóng, chọn lọc và chính
xác. Phương pháp đã được áp dụng thành công cho việc xác định 7 hoạt chất
trong mẫu thực phẩm chức năng.

1.3.3.4 Phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao HPTLC
Đây là một kỹ thuật tách các chất được tiến hành khi cho pha động di
chuyển qua pha tĩnh trên đó đã đặt hỗn hợp các chất cần tách. Pha tĩnh là chất
hấp phụ được chọn phù hợp theo từng yêu cầu phân tích, được trải thành lớp
mỏng đồng nhất và được cố định trên các phiến kính hoặc phiến kim loại. Pha
động là một hệ dung môi đơn hoặc đa thành phần được trộn với nhau theo tỷ
lệ phù hợp cho từng chất cần phân tích. Trong quá trình di chuyển qua lớp
hấp phụ, các cấu tử trong hỗn hợp mẫu thử nghiệm được di chuyển trên lớp

mỏng, theo hướng pha động, với những tốc độ khác nhau. Kết quả, thu được
một sắc ký đồ trên lớp mỏng. Cơ chế của sự tách có thể là cơ chế hấp phụ,
phân bố, trao đổi ion, sàng lọc kích thước phân tử hay sự phối hợp đồng thời
của nhiều cơ chế tùy thuộc vào tính chất của chất làm pha tĩnh và dung môi
pha động.
Tác giả Etil Ariburnu và cộng sự đã phát triển phương pháp HPTLC để
xác định sibutramine được bổ sung trái phép trong các sản phẩm giảm cân tự
nhiên. Sau khi chiết trong hỗn hợp Acetonitril và nước, chất phân tích được
tách HPTLC sử dụng bản mỏng thủy tinh phủ silicagel 60 F
254
, pha động n-
hexan-aceton-amoniac (10:1:0,1). Quét phổ ở bước sóng 225 nm. Nguồn bức
xạ là đèn deuteri phát ra một quang phổ UV liên tục từ 200 nm và 400 nm, tốc
độ quét 10 mm/giây. Đường chuẩn HPTLC tuyến tính trong khoảng 250-2000
ng/spot
-1
. Phương pháp được thẩm định về độ đúng, độ chụm, khoảng tuyến
tính, độ thu hồi và độ ổn định giữa các ngày đạt yêu cầu.
Nhóm nghiên cứu tại phòng thí nghiệm của hãng Camag cũng đã
nghiên cứu phát triển phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao ghép nối
detector khối phổ (HPTLC-MS) để xác định sibutramine cho trái phép vào
các sản phẩm giảm cân có nguồn gốc thảo dược. Mẫu được chiết với
methanol, lắc, rung siêu âm, ly tâm, lọc và chấm sắc ký lớp mỏng sử dụng
bản mỏng silicagel 60 GF
254
(20x10). Quá trình khai triển sắc ký tự động
trong buồng khai triển ADC2 với pha động toluene-methanol (9:1), bão hòa
dung môi 20 phút, độ ẩm được kiểm soát bằng dung dịch bão hòa MgCl
2
, thời

gian sấy khô 5 phút. Quá trình nhận biết và định lượng sắc ký sử dụng phổ
khối Q-trap chế độ ESI. Các mảnh phổ đặc trưng: 280,2 -> 125,0 và 280,2 ->
139,0.
Đây là phương pháp phân tích hiện đại, có độ chính xác cao. Tuy nhiên,
phương pháp có sử dụng nhiều dung môi hữu cơ rất độc hại, chi phí lớn. Hơn
nữa, đây là thiết bị không phổ biến cho các phòng thí nghiệm tại Việt Nam
nên khó ứng dụng rộng rãi.
1.3.3.5 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC
Sibutramine hấp thụ ánh sáng trong vùng tử ngoại. Sau khi qua cột
tách, nó được phát hiện bởi detector UV, độ hấp thụ tỉ lệ với nồng độ là cơ sở
cho sự định lượng.
Tác giả A.P. SuThar và cộng sự [23] đã phát triển và thẩm định phương
pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo để phân tích định lượng sibutramine
hydrochloride monohydrate trong các mẫu viên nang. Quá trình tách sắc ký
được thực hiện trên cột Phenyl Hypersil (C-18, 250 x 4,6 mm, 5μm), pha
động Acetonitrile: Amonium dihydrogen phosphat pH = 6,0 với detector UV
225 nm. Giới hạn phát hiện của phương pháp là 0,09 µg/mL, giới hạn định
lượng là 0,26 µg/mL. Hiệu suất thu hồi trong khoảng 99,87-100,45%.
Tác giả Etil Ariburnu và cộng sự [7] đã so sánh phương pháp HPLC và
HPTLC để xác định sibutramine được bổ sung trái phép trong các sản phẩm
giảm cân tự nhiên. Quá trình tách HPTLC được thực hiện trên bản mỏng thủy
tinh phủ silicagel 60 F
254
, sử dụng pha động n-hexan-aceton-amoniac
(10:1:0,1). Quá trình phân tích trên HPLC sử dụng cột Phenyl (5,0µm,
150mm×4,6mm, i.d), pha động Acetonitrile: Nước: Acid formic (pH 3,0;
0,19M) (45:55:0,78; v:v:v), detector huỳnh quang, E
x
= 316nm, E
m

= 225nm.
Đường chuẩn HPTLC tuyến tính trong khoảng 250-2000ng/spot
-1
, đường
chuẩn HPLC trong khoảng 5-200µg/ml. Cả 2 phương pháp đều được thẩm
định về độ đúng, độ chụm, khoảng tuyến tính, độ thu hồi và độ ổn định giữa
các ngày. Các phương pháp đều hiệu quả cho phân tích hàng ngày trong các
sản phẩm bổ sung trái phép sibutramine.
Nhóm nghiên cứu thuộc trường đại học Dược, Bucharest, Rumani [6]
đã phát triển phương pháp HPLC để xác định đồng thời sibutramine và
phenolphthalein trong các sản phẩm giảm cân có nguồn gốc thảo dược. Các
điều kiện sắc ký bao gồm: Cột CN Nucleosil (100-5 CN, 125 x 4,6 mm), pha
động Acetonitrile: Kali dihydrogen phosphat pH = 4,0 (35:65, v:v), detector
DAD ở 225 nm. Nhóm tác giả đã tìm thấy hàm lượng trung bình của
sibutramine là 24,71 mg/viên, phenolphthalein là 48,20 mg/viên.
Tác giả Zhou Yu và cộng sự [26] đã phát triển một phương pháp
HPLC-DAD đơn giản để xác định đồng thời 4 chất được bổ sung trái phép
trong thực phẩm chức năng: orlistat, cetilistat, sibutramine và rimonabant.
Các chất phân tích được tách và định lượng bằng HPLC-DAD tại bước sóng
222 nm. Quá trình tách được thực hiện trên cột C18 với chương trình rửa giải
gradient gồm acetonitril và acid phosphoric 0,02 mol/L. Hiệu suất thu hồi
trong khoảng 96,1-97,2%. Độ lặp lại trong ngày và độ tái lập giữa các ngày
<1%. Giới hạn phát hiện là 189 ng/mL và đường chuẩn tuyến tính với hệ số
tương quan R
2
>0,999. Phương pháp với nhiều ưu điểm: đơn giản, nhanh, dễ
dàng áp dụng và có thể sử dụng để phân tích hàng ngày.
Tác giả E.Deconinck và cộng sự đã phát triển và thẩm định phương
pháp sắc ký lỏng siêu hiệu năng UHPLC để phát hiện và định lượng các chất
cấm trong thực phẩm chức năng giảm cân, bao gồm: sibutramine, modafinil,

ephedrine, nor-ephedrine, metformin, theophyllin, caffeine, diethylpropion
and orlistat. Quá trình tách sắc ký sử dụng cột Vision HT C18-B
(2 mm × 100 mm, 1.5 μm), rửa giải gradient với pha động là đệm acetat pH
5,0 và acetonitril. Các đường chuẩn tuyến tính cho tất cả các chất trong
khoảng nghiên cứu. Độ chệch và độ lệch chuẩn tương đối lần lượt nhỏ hơn
3% và 1,5% cho tất cả các chất.
Trong các kỹ thuật phân tích đã được ứng dụng để phân tích
sibutramine, HPLC là kỹ thuật phổ biến nhất, dễ áp dụng và có độ chính xác
cao. Ngoài ra thiết bị HPLC được trang bị rộng rãi tại các phòng thí nghiệm ở
Việt Nam. Vì vậy, chúng tôi đã lựa chọn phương pháp HPLC được lựa để
phân tích sibutramine trong thực phẩm chức năng giảm béo.

1.4. Tổng quan về HPLC
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance Liquid Chromatography
– HPLC) là kỹ thuật tách sắc ký trong đó các chất phân tích hòa tan trong pha
động là chất lỏng và di chuyển qua cột chứa các hạt pha tĩnh. Tùy thuộc vào
ái lực của chất phân tích với pha động và pha tĩnh mà các chất di chuyển với
tốc độ khác nhau, do đó thứ tự rửa giải khác nhau. Thành phần pha động đưa
chất phân tích ra khỏi cột được thay đổi để rửa giải các chất với thời gian hợp
lý [1]


Hình 1.2. Sơ đồ khối của một máy sắc ký lỏng hiệu năng cao.
a. Hệ thống cung cấp pha động:
- Nguốn cấp pha động: pha động trong sắc ký lỏng thường là 2 dung môi
hòa tan vào nhau để có khả năng tách với độ phân giải phù hợp, được chứa
trong bình thủy tinh hoặc thép không rỉ.
- Bộ phận loại khí (degasser): trước khi sử dụng cần lọc (màng lọc 0,45 µm)
và đuổi khí hòa tan trong pha động để tránh việc khí hòa tan có thể làm biến
dạng pic, giảm hiệu lực cột, làm nhiễu đường nền. Có thể loại khí hòa tan

bằng cách: chạy siêu âm, sục khí trơ….
- Bộ phận trộn pha động (mixer): trộn các dung môi ở áp suất thấp hoặc áp
suất cao
- Bơm: về mặt kết cấu có 3 loại thường gặp: Bơm đẩy một pittong, bơm làm
đầy nhanh và bơm kép đẩy kéo.
b. Bộ phận tiêm mẫu:
- Mẫu lỏng hoặc dung dịch được tiêm thẳng vào pha động cao áp ngay ở đầu
cột mà không cần dừng dòng bằng một van tiêm có vòng chứa mẫu. Vòng
chứa mẫu có dung tích khác nhau: thường dùng loại 0,50÷20 µL. Có vòng
chứa mẫu lớn hơn.
- Ngoài ra, đôi khi người ta tiêm mẫu bằng bơm tiêm qua tấm đệm ở đầu cột.
Khi tiêm phải dừng dòng và áp suất trong cột không cao. Cách tiêm này có độ
lặp lại thấp, sai số lớn hơn so với khi dùng van tiêm.
- Hiện nay hay dùng van tiêm mẫu vì có ưu điểm là sẽ dễ dàng tự động hóa,
cột không bị tắc hay bị làm bẩn bởi các mảnh của vách ngăn, thể tích đưa vào