Chuyển gen thực vật bằng vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens
1. Giới thiệu
Chuyển nạp gen (gene transformation) là kỹ thuật chuyển gen ngoại lai vào
genome cây trồng. Công nghệ gen thực vật diễn biến nỗi bật qua các móc thời
gian tạo ra những bước tiến ngày càng xa và khả năng ứng dụng cũng tăng theo:
Năm Những phát triển quan trọng
1980 Lần đầu tiên chuyển DNA vi khuẩn vào thực vật nhờ
Agrobacterium tumefaciens
1983 Marker chọn lọc, Ti-plasmid được loại bỏ các gen không cần thiết
1984 Biến nạp vào tế bào trần
1985 Kháng thuốc trừ cỏ
1986 Kháng virus
Lần đầu tiên đưa cây biến đổi gen ra đồng ruộng
1987 Kháng côn trùng
Biến nạp phi sinh học
1988 Điều khiển sự chín ở cà chua
1989 Kháng thể ở thực vật bậc cao
1990 Biến nạp phi sinh học ở ngô
Tính bất dục đực nhân tạo
1991 Thay đổi thành phần carbohydrate
Tạo alkaloid tốt hơn
1992 Thay đổi acid béo
Biến nạp phi sinh học ở lúa mỳ
Lần đầu tiên phân giải plastic nhờ cây biến đổi gen
Cà chua biến đổi gen FlavorSaver xuất hiện trên thị trường
1994 Lần đầu tiên hơn 10 gen được chuyển đồng thời vào thực vật
1998 Trên thế giới có 48 trong đó Mỹ có 35 loại thực vật biến đổi gen
được thị trường hóa
Lúa biến đổi gen với giá trị dinh dưỡng tốt hơn
Cây biến đổi gen được trồng trên diện tích hơn 40 triệu ha

1999 Cho đến nay khoảng 9000 thí nghiệm về cây biến đổi gen được
đưa ra đồng ruộng (ở EU: 1360)
Thành tựu kỹ thuật nuôi cấy mô và kỹ thuật tái tổ hợp AND cho phép người
ta thực hiện chuyển gen trên thực vật bậc cao, tạo ra những tính trạng di truyền
mới.
Cây được chuyển nạp gen mục tiêu được gọi là cây “transgenic”, với hai
phương pháp chuyển nạp gen: (1) chuyển nạp gen gián tiếp nhờ sự cải tiến
không ngừng hệ thống Ti-plasmid trên vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, và
(2) chuyển gen trực tiếp theo phương pháp PEG (polyethylene glycol), phương
pháp vi tiêm (microinjection), phương pháp mỡ lỗ bằng điện (electroporation),
phương pháp bắn gen (biolistic), phương pháp chuyển qua ống hạt phấn (pollen
tube pathway) và một và kỹ thuật khác.
Trong đó ba phương pháp được ứng dụng rộng rãi là chuyển gen bằng
Agrobacterium tumefaciens , tế bào trần và phi sinh học.
2. Chuyển gen bằng Agrobacterium tumefaciens
Agrobacterium tumefaciens là vi khuẩn gây bệnh ghẻ khối u trên cây, phát
sinh ung thư, tạo ra kết quả trực tiếp hình thành khối u để tổng hợp ra một loại
dinh dưỡng đặc biệt giúp cho vi khuẩn phát triển.
Gen Agrobacterium là nhóm genus có tính chất sinh sản trong đất, gram
âm, cùng họ với Rhizobium. Có bốn species đã được ghi nhận. Agrobacterium
tumefaciens tạo ra khối u trong tế bào tumor chưa được phân hóa và chưa được
tổ chức. một vài dòng của Agrobacterium tumefaciens không tạo khối u nhưng
kích thích sự tăng trưởng của teratomas (thẻ dị thường, khác thường). tuy nhiên
thực vật thuộc đơn tử diệp tỏ ra kháng đối với Agrobacterium, chỉ trừ một vài
loài của Asparagus.
Đặc điểm quan trọng của tế bào khối u là tăng trưởng không cần kích tố
thực vật trong môi trường nuôi cấy mô. Điều này ngược lại với tế bào cây bình
thường, do cần phải bổ sung auxin, cytokinin để duy trì sự tăng trưởng và sự
sống trong nuôi cấy. Sự tăng trưởng không phụ thuộc vào hormon của tế bào
khối u bị kích thích bởi Agrobacterium gợi cho chúng ta một ý tưởng: sẽ có sự

thay đổi hàm lượng hormon nội sinh. Sự thay đổi mức biến dạng dị hình này
trong cơ quan bi biến dạng dị hình được ghi nhận. Những khối u này là không
gian sống của vi khuẩn, một số chất dinh dưỡng (opine) có lợi cho vi khuẩn được
tạo ra, đây cũng chính là đặc tính của tế bào khối u. Trong mô bình thường
không có hình thành nhóm hóa học này. Những opine phổ biến là nopalin và
octopin.Về mặt hóa học opine là sản phẩm ngưng tụ của aminoacid với cetoacide
hoặc aminoacide với đường. Octopin được tạo nên từ amino acid là arginine và
pyruvate, còn nopalin được tạo nên từ arginine và -cetoglutaraldehyd. Công thức
cấu tạo của opine được trình bày ở hình 1.1.
Khả năng chuyển DNA của Agrobacterium tumefaciens được sử dụng trong
công nghiệp gen hiện đại. Để được quá trình này điều cần thiết là phải làm rõ sự
tương tác giữa Agrobacterium với thực vật.

COOH COOH COOH COOH
HC NH CH HC CH CH
CH
2
CH
3
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH

2
CH
2
COOH
NH NH
C C
H2N NH H2N NH
Octopin Nopalin
Hình 1.1 Công thức cấu tạo của opine.
2.1 Ti – plasmid
Chức năng của plasmid đã được ghi trên bản đồ là khả năng của nhiều
dòng khác nhau. Agrobacterium tumefaciens kích thích tạo khối u để tổng
hợp các opine. Ti-plasmid thể hiện tính chất chuyên biệt đối với một opine
nào đó mà thôi. Thí dụ Ti-plasmid của dòng C58 Agrobacterium tumefaciens
mã hóa đối với nopaline và dị hóa nopaline nhưng không phân giải được
octopine, nó được xếp vào nhóm plasmid có dạng nopaline.
Việc sử dụng A. tumefaciens đã bắt đầu từ 1907, khi người ta phát
hiện vi khuẩn này có khả năng tạo nên khối u ở cây hai lá mầm bị thương,
được gọi là khối u cổ rễ (Hình 1.2). Trong những năm bảy mươi người ta
tìm thấy trong các chủng A. tumefaciens tạo khối u có một plasmid rất lớn
có kích thước 200 đến 800 kb. Qua những thí nghiệm chuyển đến những
chủng không độc (không có plasmid này), đã khẳng định plasmid này cần
thiết cho việc tạo khối u. Vì vậy, plasmid này được gọi là Ti-plasmid (tumor
inducing-plasmid).
Ti-plasmid mang các gen mã hóa cho protein phân giải opine, nhận biết
những tế bào thực vật bị thương, cắt và vận chuyển đoạn được gọi là T-DNA. T-
DNA là một phần của Ti-plasmid, được chuyển vào thực vật (transfer-DNA). Trên
đó định vị những gen tạo khối u và tổng hợp opine. T-DNA được giới hạn bởi hai
vùng, bờ trái và bờ phải (LB : left border và RB: right border). Các bờ này gồm
một trình tự lặp lại của 25 bp, là trình tự nhận biết cho việc cắt T-DNA.

Hình 1.2. Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. a: Dưới kính hiển vi điện tử. b:
Khối u ở cây và từ khối u này xuất hiện chồi một cách tự nhiên.
Một số loài vi khuẩn A.tumefaciens chứa Ti-plasmid của loại octopin và
loại khác của nopalin. Một sự khác biệt khác của các loại plasmid ở
Agrobacterium là Ti-plasmid của loại nopalin chứa một bản copy của T-DNA,
ngược lại pasmid octopin chứa ba.
2.2 Chức năng của T-DNA
Phân tích di truyền và ứng dụng kỹ thuật lập bản đồ liên kết gen cho phép
chúng ta hiểu được chức năng của vùng mang T-DNA, vùng này được thể hiện
theo sự liên hợp nhất. T-DNA được đưa vào DNA thực vật trong nhân tế
bào. Vị trí gắn vào thường là ngẫu nhiên, tuy nhiên thường là những vùng có khả
năng sao chép. Sự tổng hợp opine được điều khiển bởi T-DNA. Những enzime
như: octopine synthase, nopaline synthase được mã hóa trên T-DNA tại những
loci: osc và nos theo thứ tự. có những vùng của T-DNA khá quen thuộc với cả hai
plasmid: octopine và nopaline.
2.3 Qua trình chuyển nạp
Quá trình lây nhiễm được mô tả ở hình 1.3. Khối u được tạo nên là do
phytohormone (auxin và cytokinin) được tạo ra ở trong tế bào thực vật bị nhiễm,
chúng kích thích sự phân chia tế bào và tạo nên mô không phân hóa. Điều kiện
cho việc chuyển T-DNA vào thực vật trước hết là tế bào bị thương. Khi tế bào bị
thương chúng tiết ra các hợp chất phenol (acetosyringon), chất có vai trò quan
trọng trong việc nhận biết và sự gắn kết giữa vi khuẩn và tế bào thực vật.
Bị thương
Nhiễm sắc thể
của vi khuẩn
Ti-plasmid
với T-DNA
Agrobacterium
Nhiễm sắc thể trong nhân tế bào thực vật
Agrobacterium

Tế bào thực vật
Agrobacterium
trong khối u
Agrobacterium
trong khối u
T-DNA của vi khuẩn trong DNA nhân của tế bào thực vật